Η κερσετίνη βελτιώνει την κατάσταση οξειδοαναγωγής του μυοκαρδίου σε αρουραίους με διαβήτη τύπου 2

Για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστεtina.xiang@wecistanche.com

Σκοπός. Τα αναδυόμενα στοιχεία το δείχνουνοξειδωτικό στρεςσυνδέεται στενά με την παθογένεση της καρδιαγγειακής νόσου στον σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2). Η παρούσα μελέτη είχε στόχο να αξιολογήσει την επίδραση του πιο άφθονου φλαβονοειδούς στην ανθρώπινη διατροφήκερσετίνη(Q) σχετικά με την κατάσταση οξειδοαναγωγής του μυοκαρδίου σε αρουραίους με ΣΔ2.

Μέθοδοι. Ο ΣΔ2 προκλήθηκε σε αρσενικούς αρουραίους Wistar με δίαιτα υψηλής θερμιδικής αξίας (για 14 εβδομάδες) και δύο ενέσεις στρεπτοζοτοσίνης (25 mg/kg σωματικού βάρους) που εφαρμόστηκαν σε τέσσερις εβδομάδες δίαιτας, μία φορά την εβδομάδα για δύο εβδομάδες. Το Q χορηγήθηκε ενδογαστρικά με καθετηριασμό σε δόση 10 ή 50 mg/kg σωματικού βάρους για 8 εβδομάδες ξεκινώντας από την 8η ημέρα μετά την τελευταία ένεση στρεπτοζοτοκίνης. Οι αρουραίοι ελέγχου έλαβαν κιτρικό ρυθμιστικό και επτά ημέρες μετά την τελευταία ένεση STZ, μετρήθηκαν τα βασικά επίπεδα γλυκόζης σε όλα τα ζώα.

Αποτελέσματα. Η χορήγηση Q αύξησε την ευαισθησία στην ινσουλίνη σε διαβητικούς αρουραίους με πιο έντονη επίδραση σε δόση 50 mg/kg σωματικού βάρους. εξαρτώμενο τρόπο και ομαλοποίησε τη δραστηριότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων (δισμουτάση υπεροξειδίου, υπεροξειδάση γλουταθειόνης, αναγωγάση γλουταθειόνης) στα καρδιακά μιτοχόνδρια ανεξάρτητα από τη δόση που χρησιμοποιήθηκε. Επιπλέον, το Q και στις δύο δόσεις απέτρεψε την ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στους αρουραίους με ΣΔ2καρδιομυοκύτταραμειώνοντας τις δραστηριότητες της οξειδάσης NADPH και της οξειδάσης της ξανθίνης.

συμπεράσματα. Τα ευρήματα δείχνουν ότι το Q και στις δύο δόσεις 10 mg/kg και 50 mg/kg μπορεί να προστατεύσει από την ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στα καρδιομυοκύτταρα σε διαβητικούς αρουραίους. Τα παρόντα δεδομένα δείχνουν ότι η χρήση του Q μπορεί να συμβάλει στη βελτίωση του καρδιαγγειακού κινδύνου σε ασθενείς με ΣΔ2.

Λέξεις-κλειδιά: κερκετίνη, σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, καρδιομυοκύτταρα, οξειδωτικό στρες

ΔιαβήτηςΟ σακχαρώδης (DM) είναι μια από τις ταχύτερα αναπτυσσόμενες παγκόσμιες καταστάσεις έκτακτης ανάγκης υγείας του 21* αιώνα. Σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Διαβήτη, 463 εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο είχαν διαβήτη το 2019 και ο αριθμός αυτός υπολογίζεται ότι θα φτάσει τα 700 εκατομμύρια μέχρι το έτος 2045. Το ΣΔ σχετίζεται με ένα ευρύ φάσμα καρδιαγγειακών παθήσεων που συλλογικά αυξάνουν τον κίνδυνο καρδιαγγειακού θανάτου κατά 132 ποσοστό σε διαβητικούς σε σύγκριση με άτομα χωρίς ΣΔ (IDF Diabetes Atlas 2019).

Το ΣΔ είναι γνωστό ότι προκαλεί συγκεκριμένες αλλαγές στη δομή και τη λειτουργία του μυοκαρδίου ανεξάρτητα από τη στεφανιαία νόσο ή η υπέρταση ορίζεται συνήθως ως διαβητική μυοκαρδιοπάθεια (DCM). Το DCM εκδηλώνεται με διαστολική δυσλειτουργία ακολουθούμενη από ανωμαλίες στη συστολική λειτουργία, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε καρδιακή ανεπάρκεια (Liu et al.2014). Είναι επίσης γνωστό ότι οι μεταβολικές διαταραχές στα καρδιομυοκύτταρα στο DCM (υπερτροφία, φλεγμονή, απόπτωση, ίνωση) συνδέονται στενά με την ανάπτυξη οξειδωτικού στρες (Kayama et al.2015).

Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), συμπεριλαμβανομένων των ανιόντων υπεροξειδίου, της ρίζας υδροξυλίου και του υπεροξειδίου του υδρογόνου είναι κρίσιμα μόρια σηματοδότησης με σημαντικούς ρόλους τόσο στην καρδιακή φυσιολογία όσο και στην ασθένεια. Τόσο οι κυτοσολικές πηγές, συμπεριλαμβανομένων των οξειδασών NADPH (NOX), της οξειδάσης της ξανθίνης (XO), των κυκλοοξυγενασών και των ενζύμων του κυτοχρώματος P450, όσο και οι μιτοχονδριακές πηγές, όπως η αναπνευστική αλυσίδα και οι μονοαμινοξειδάσες, συμβάλλουν στην ενδοκυτταρική δεξαμενή ROS. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το καρδιακό σήμα ROS ρυθμίζει την ανάπτυξη της καρδιάς και την ωρίμανση των καρδιομυοκυττάρων, τον χειρισμό του καρδιακού ασβεστίου, τη σύζευξη διέγερσης-σύσπασης και τον αγγειακό τόνο. Ωστόσο, οι παθολογικές καταστάσεις της μη ρυθμιζόμενης παραγωγής ROS οδηγούν σε αυξημένα επίπεδα ROS, τα οποία μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμαοξειδωτικό στρεςμέσω οξειδωτικής βλάβης του DNA, των πρωτεϊνών και των λιπιδίων, καθώς και της δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων και του κυτταρικού θανάτου (Peoples et al. 2019). Πράγματι, η απορρυθμισμένη παραγωγή ROS και το οξειδωτικό στρες έχουν εμπλακεί σε πολλές καρδιακές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης της διαβητικής μυοκαρδιοπάθειας (Ritchie and Abel 2020).

Η υπερβολική παραγωγή ROS από τα μιτοχόνδρια μπορεί να επηρεάσει άμεσα τη συσταλτική λειτουργία του μυοκαρδίου με οξειδωτική τροποποίηση των ενζύμων και των διαύλων ιόντων που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κύκλου διέγερσης-χαλάρωσης (Brown and Griendling 2015; Bai et al. 2016). Το ROS διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των καρδιομυοκυττάρων και ενεργοποιεί τους ινοβλάστες και τις μεταλλοπρωτεϊνάσες θεμέλιας ουσίας, που οδηγούν σε υπερτροφία και αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου με αποτέλεσμα τον σχηματισμό καρδιακής ανεπάρκειας (DOria et al.2020). Ως εκ τούτου, προτείνεται ότι η φαρμακολογική δράση που στοχεύει στη μείωση της υπερπαραγωγής ROS μπορεί να είναι αποτελεσματική για την πρόληψη και τη διόρθωση των διαβητικών καρδιαγγειακών επιπλοκών.

Επί του παρόντος, έχει διαπιστωθεί ότι η διατροφική πρόσληψη φυσικών πολυφαινολών, ιδιαίτερα φλαβονοειδών, μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο διαβήτη και καρδιαγγειακών παθήσεων και οι προστατευτικοί μηχανισμοί μπορεί όχι μόνο να εξαρτώνται από τις αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις των φλαβονοειδών, αλλά και να περιλαμβάνουν ιδιότητες που επηρεάζουν τη γλυκαιμία, τη χρήση γλυκόζης και την έκκριση ινσουλίνης (Ghorbaniet al.2019; Lutz et al.2019).

Κερσετίνη(Q;3,5,7,34-πενταϋδροξυ φλαβόνη) είναι το πιο άφθονο φλαβονοειδές στην ανθρώπινη διατροφή. Υπάρχει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών λειτουργιών του Q, συμπεριλαμβανομένων των επιδράσεων σε μονοπάτια που εμπλέκονται στη φλεγμονή, τον διαβήτη και τις καρδιαγγειακές παθήσεις (Zahedi et al. 2013). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει τους μηχανισμούς των αντιδιαβητικών επιδράσεων του Q, μεταξύ των οποίων

μειωμένη υπεροξείδωση λιπιδίων, αυξημένη δραστηριότητα αντιοξειδωτικών ενζύμων (π.χ. υπεροξειδική δισμουτάση, SOD, υπεροξειδάση γλουταθειόνης, GPX, καταλάση, CAT), μειωμένη απορρόφηση γλυκόζης στο έντερο λόγω αδρανοποίησης του μεταφορέα GLUT2 και άλλων (Shi et al.2019; Salehi et al.2020). Η καρδιοπροστατευτική δράση του Q σε διαφοροποιημένακαρδιομυοκύτταρα, λόγω της αδρανοποίησης της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης και των σηματοδοτικών οδών πρωτεϊνικής κινάσης Β, έχει επίσης αποδειχθεί (Daubney et al.2015).

Μελλοντική έρευνα αφιερωμένη στην κατανόηση των μηχανισμών καρδιοπροστατευτικής δράσης στον διαβήτη θα μπορούσε να συμβάλει στη βελτίωση της φροντίδας του διαβήτη.

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετήσει την επίδραση της κερκετίνης στην οξειδοαναγωγική κατάσταση των καρδιομυοκυττάρων σε αρουραίους με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2).

Υλικά και μέθοδοι

Χημικά. Όλα τα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ποιότητας αναλυτικού αντιδραστηρίου και αγοράστηκαν από τη Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO, ΗΠΑ). Η κερσετίνη χορηγήθηκε από το PJSCSICBorshchahivskiy Chemical-Pharmaceutical Plant (Κίεβο, Ουκρανία) και περιείχε τουλάχιστον το 96,5 τοις εκατό της δραστικής ουσίας.

Πειραματικό σχέδιο. Η παρούσα μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή βιοηθικής του "V. Dani-levsky Institute for Endocrine Pathology Problems of National Academy of Medical Sciences of Ukraine" (Kharkiv, Ουκρανία) και πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Σύμβαση για την Προστασία των Σπονδυλωτών Ζώων Χρησιμοποιείται για Πειραματικούς και Άλλους Επιστημονικούς Σκοπούς (Στρασβούργο, 1986).

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε 32 αρσενικούς αρουραίους Wistar (12-εβδομάδων, 200-230 g σωματικού βάρους, σ.β.), οι οποίοι στεγάστηκαν σε κλουβιά Plexiglas (3 ζώα ανά κλουβί) σε θερμοκρασία 22±1 βαθμός C σε έναν σταθερό κύκλο 12-ώρας φωτός/σκότους.

Χρησιμοποιήθηκε το ζωικό μοντέλο του ΣΔ2 που προκλήθηκε από δίαιτα υψηλής θερμιδικής αξίας σε συνδυασμό με πολλαπλές ενέσεις στρεπτοζοτοκίνης χαμηλής δόσης (STZ). Το μοντέλο παρέχει την ανάπτυξη δύο κύριων χαρακτηριστικών του ΣΔ2: η δίαιτα με πολλές θερμίδες προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη και η χαμηλή δόση STZ προκαλεί μια ήπια διαταραχή της έκκρισης ινσουλίνης. Έτσι, το μοντέλο μιμείται τη φυσική ιστορία των γεγονότων της νόσου (από την αντίσταση στην ινσουλίνη έως τη δυσλειτουργία των κυττάρων) καθώς και τα μεταβολικά χαρακτηριστικά του ανθρώπινου ΣΔ2 (Skovso 2014).

Οι άθικτοι αρουραίοι ελέγχου (n=8) τράφηκαν με τυπική δίαιτα για 14 εβδομάδες. Οι πειραματιζόμενοι αρουραίοι (n=24) τράφηκαν με δίαιτα υψηλής θερμιδικής αξίας που περιείχε 15 τοις εκατό λαρδί, 25 τοις εκατό σακχαρόζη, 1 τοις εκατό χολικά άλατα και 59 τοις εκατό τυπική τροφή για 14 εβδομάδες. Τα ζώα είχαν ελεύθερη πρόσβαση στο νερό. Σε τέσσερις εβδομάδες, οι πειραματικοί αρουραίοι έλαβαν ενδοπεριτοναϊκά (.p. ένεση STZ (25 mg/kg σωματικού βάρους) μία φορά την εβδομάδα για δύο εβδομάδες (Lin et al. 2010). Οι αρουραίοι ελέγχου έλαβαν κιτρικό ρυθμιστικό ακολουθώντας το ίδιο σχήμα. Επτά ημέρες μετά την τελευταία ένεση STZ, η βασική γλυκόζη μετρήθηκε σε όλα τα ζώα και οι πειραματιζόμενοι αρουραίοι χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: διαβητικούς αρουραίους που δεν έλαβαν θεραπεία (Διαβήτης, n{=8) και διαβητικούς αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με Qin σε δόση 10 mg/kg σωματικού βάρους (Διαβήτης συν Q10,n=8)ή 50 mg/kg σωματικού βάρους (Διαβήτης συν Q50, n=8) μία φορά την ημέρα ενδογαστρικά με καθετηριασμό για 8 εβδομάδες μετά την πρόκληση διαβήτη. Οι διαβητικοί αρουραίοι που δεν έλαβαν θεραπεία έλαβαν οχήματα μαζί με το ίδιο σχήμα .

Τα ζώα θυσιάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο της επιτροπής δεοντολογίας.

Μέτρηση ομοιόστασης γλυκόζης. Η δοκιμασία ενδοπεριτοναϊκής ανοχής στην ινσουλίνη (IPITT) διεξήχθη σε επίμυες που είχαν νηστέψει όλη τη νύχτα. Οι συγκεντρώσεις γλυκόζης στο αίμα μετρήθηκαν αρχικά στη βασική κατάσταση ({{0}} min), και στη συνέχεια στα ζώα δόθηκε ani. Π. ένεση ινσουλίνης 0,25 U/kg σωματικού βάρους (Actrapid, Novo Nordisk, Agsvaerd, Δανία) ακολουθούμενη από ενδοπεριτοναϊκή ένεση γλυκόζης (2 g/kg) (Bowe et al.2014). Στη συνέχεια, τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα της ουράς μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή γλυκόζης Eksan-G (Analita Firm Joint Stock Company Ltd., Vilnius, Republic of Lithuania) στα 15, 30, 60, 90 και 120 λεπτά μετά το φορτίο γλυκόζης.

Απομόνωση μιτοχονδρίων. Τα μιτοχόνδρια απομονώθηκαν με συμβατικές διαδικασίες. Η πρόσφατα αποκομμένη καρδιά αρουραίου ομογενοποιήθηκε σε ένα μέσο που περιείχε {{0}}.18 Μ KCl, 10 mM EDTA, 0,5 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA), 10 mM HEPES, pH 7,4. Τα ομογενοποιημένα προϊόντα καθαρίστηκαν από τα υπολείμματα και πυρήνων με δύο φορές φυγοκέντρηση στα 500 g (10 λεπτά στους 4 βαθμούς). Τα μιτοχόνδρια σφαιροποιήθηκαν από τα υπερκείμενα στα 10000 g (15 λεπτά στους 4 βαθμούς) και επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό απομόνωσης.

Τα κλάσματα μετά το μιτοχονδριακό υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των δράσεων XO και NOX. Για την απομάκρυνση του EDTA και της λευκωματίνης, τα μιτοχονδριακά σφαιρίδια φυγοκεντρήθηκαν στα 10000 g (15 λεπτά, 4 βαθμοί) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης που περιείχε 0,18 Μ KCl και 10 mM HEPES (pH7,4) δύο φορές (DiLisa et al.1994) .

Φασματοφωτομετρία. Όλη η φασματοφωτομετρία διεξήχθη χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης UV-VIS Shimadzu UV-1800 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Ιαπωνία).

Μέτρηση προηγμένων πρωτεϊνικών προϊόντων οξείδωσης (AOPP). Ο προσδιορισμός των επιπέδων AOPP πραγματοποιήθηκε με την τροποποιημένη μέθοδο του Witko-Sarsat και των συνεργατών του (Sagor et al.2015). Τα μιτοχόνδρια της καρδιάς (0.2 mg πρωτεΐνης) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,1 τοις εκατό Triton-X100 και αραιώθηκαν σε διάλυμα PBS(pH7,4). KI (1,16 Μ) προστέθηκε στο μέσο της ανάλυσης, ακολουθήθηκε 2 λεπτά αργότερα με την προσθήκη παγόμορφου οξικού οξέος. Η απορρόφηση του μίγματος της αντίδρασης διαβάστηκε αμέσως στα 340 nm έναντι του τυφλού. Οι συγκεντρώσεις AOPP εκφράστηκαν ως πρωτεΐνη T/mg χλωραμίνης ισοδύναμου nmol.

Μέτρηση της ενζυμικής δραστηριότητας. Η δραστικότητα NOX εξετάστηκε ως εξαρτώμενη από NADPH παραγωγή Ο2 από μετα-μιτοχονδριακό υπερκείμενο κλάσμα χρησιμοποιώντας αναγωγή σιδηροκυτοχρώματος c που μπορεί να ανασταλεί από SOD (Li et al. 2002). Το μεταμιτοχονδριακό κλάσμα του ομογενοποιήματος της καρδιάς (1 mg πρωτεΐνης) συμπληρώθηκε με 10 mM Tris-HCl (pH7,8), 500 μMcytochrome c, 100 μM NADPH, επωάστηκε στους 37 βαθμούς C για 30 λεπτά με ή χωρίς 200 U/ml SOD. Η μείωση του κυτοχρώματος μετρήθηκε με ανάγνωση της απορρόφησης στα 550 nm (8=21 mM-1 cm-).

Η δραστικότητα XO προσδιορίστηκε σε διάλυμα PBS (pH7,4) ισορροπημένου αέρα που περιείχε ένα μεταμιτοχονδριακό κλάσμα του ομογενοποιήματος της καρδιάς (1 mg πρωτεΐνη) στους 37 βαθμούς μετά την προσθήκη ξανθίνης (τελική συγκέντρωση 360μM) με μέτρηση της παραγωγής ουρικού οξέος από την αλλαγή σε απορρόφηση στα 295nm (e=9500M-'cm-') (Lee et al.2014).

Η δραστηριότητα Mn-SOD στο μιτοχονδριακό εναιώρημα ανιχνεύθηκε με την αναστολή της μείωσης του νιτρομπλε τετραζολίου (NBT) που προκλήθηκε από το σύστημα ξανθίνης-XO ως γεννήτρια Ο2 και η απορρόφηση τελικά προσδιορίστηκε στα 560 nm. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε μιτοχόνδρια καρδιάς (0.02 mg πρωτεΐνης),0.05Μ ανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα (pH10.2), 0.1 mM EDTA, 0.1 mM ξανθίνη, 25μM NBT,1 mU/ml XO. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε αυθαίρετες μονάδες (au) δραστικότητας SOD ανά mg πρωτεΐνης. Το One aume σημαίνει την ποσότητα του ενζύμου που προκαλεί 50 τοις εκατό αναστολή του ρυθμού μείωσης του NBT (Wang et al. 2018).

Η δραστηριότητα της αναγωγάσης της γλουταθειόνης (GR) μετρήθηκε παρακολουθώντας την οξείδωση του NADPH στα 340 nm στην αντίδραση της αναγωγής της οξειδωμένης γλουταθειόνης (GSSG). Για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση, μιτοχόνδρια από την καρδιά (0.1 mg πρωτεΐνης) επωάστηκαν για 10 λεπτό στους 37 βαθμούς σε ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης που περιέχει 20 mM Tris-HCl (pH7,4) 0,25 mM EDTA, 10 μM FAD, 3 mM GSSG και 0,1 mM NADPH (Raza and John 2004).

Η εκτίμηση της δραστικότητας της GPX έγινε με βάση την ικανότητα του ενζύμου να καταλύει την αποικοδόμηση του υδροϋπεροξειδίου του τριτβουτυλίου χρησιμοποιώντας ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) ως υπόστρωμα. Το μείγμα αντίδρασης (pH7.0) περιείχε μιτοχόνδρια καρδιάς (0.1 mg πρωτεΐνης), 0.56 mM NADPH, 1.0 U/ml GR, 7.5 mM νατρίου αζίδιο, 5 mM GSH, 5 mM EDTA και 0,05 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό. Υδροϋπεροξείδιο τριτ-βουτυλίου (23 mM) προστέθηκε για να ξεκινήσει η αντίδραση. Ο ρυθμός σχηματισμού GSSG προσδιορίστηκε με αντίδραση GR από μια μείωση στην απορρόφηση των ανιχνευτών στα 340 nm (Antunes et al.2002).

Μέτρηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη στα δείγματα. Η μιτοχονδριακή πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Lowry που τροποποιήθηκε από τον Miller, με το BSA ως πρότυπο (Lowry et al. 1951, Miller 1959).

Στατιστική ανάλυση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος±τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Το τεστ Shapiro-Wilk χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της κανονικότητας της κατανομής των δεδομένων. Για πολλαπλές συγκρίσεις δεδομένων με κανονική κατανομή, πραγματοποιήθηκε παραμετρική μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Student-Newman-Keuls για τον έλεγχο των διαφορών στους μέσους όρους. Οι τιμές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές στο p<>

Αποτελέσματα

Αποκαλύψαμε ότι το επίπεδο της βασικής γλυκόζης σε αρουραίους που τρέφονταν με δίαιτα υψηλής θερμιδικής αξίας και έλαβαν ένεση STZ ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό,τι στην ομάδα ελέγχου (Πίνακας 1）. Επιπλέον, οι περιοχές κάτω από τις γλυκαιμικές καμπύλες (AUC) που λήφθηκαν κατά τη διάρκεια του IPITT ήταν σχεδόν Τρεις φορές μεγαλύτερη σε διαβητικά ζώα σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου (Πίνακας 1, Εικόνα 1) Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν την ανάπτυξη σχετικής ανεπάρκειας ινσουλίνης και αντίστασης στην ινσουλίνη σε πειραματικούς αρουραίους.

Η χορήγηση του Q δεν είχε σημαντική επίδραση στη βασική υπεργλυκαιμία των διαβητικών ζώων. Ωστόσο, το Q επηρέασε την ευαισθησία στην ινσουλίνη σε αρουραίους με διαβήτη 2 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, μειώνοντας την AUC IPITT κατά 27 τοις εκατό στην πειραματική ομάδα που έλαβε 10 mg/kg του φαρμάκου και κατά 41 τοις εκατό στην ομάδα που έλαβε 50 mg/kg Q σε σύγκριση σε ζώα που λαμβάνουν όχημα (Πίνακας 1, Εικόνα 1).

Το επίπεδο AOPP στα μιτοχόνδρια της καρδιάς πειραματικών αρουραίων αυξήθηκε κατά 66 τοις εκατό επιβεβαιώνοντας την ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στον ΣΔ2 (Εικόνα 2). Η χορήγηση είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της συσσώρευσης AOPP στην καρδιά των διαβητικών ζώων ανάλογασχετικά με τη δόση του φαρμάκου. Στην πειραματική ομάδα που έλαβε 50 mg/kg Q, η συγκέντρωση του AOPP μειώθηκε στο επίπεδο της ομάδας ελέγχου, υποδηλώνοντας αντιοξειδωτικές ιδιότητες του Q (Εικόνα 2).

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, το οξειδωτικό στρες στα μιτοχόνδρια της καρδιάς των αρουραίων με T2DM συνοδεύτηκε από την επαγόμενη δραστηριότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων -Mn-SOD, GPO και GR. Η χορήγηση Q και στις δύο δόσεις ομαλοποίησε τις δραστηριότητες των μελετηθέντων αντιοξειδωτικών ενζύμων σε διαβητικά ζώα στο επίπεδο της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 3).

Βρέθηκε ότι ο διαβήτης 2 συσχετίστηκε με 65 τοις εκατό και 52 τοις εκατό αύξηση των δραστηριοτήτων NOX και XO, δύο πρωταρχικών κυτταροπλασματικών πηγών Ο2 στα καρδιομυοκύτταρα, αντίστοιχα, στο μεταμιτοχονδριακό κλάσμα του ομογενοποιήματος της καρδιάς των πειραματικών αρουραίων (Εικόνα 4). Η χρήση του Q οδήγησε στην ομαλοποίηση των δραστηριοτήτων NOX και XO στην καρδιά των διαβητικών ζώων ανεξάρτητα από τη δόση (Εικόνα 4).

Συζήτηση

Προς το παρόν, το οξειδωτικό στρες που ορίζεται ως η συνεχής αύξηση των ελεύθερων ριζών λόγω ανισορροπίας στην παραγωγή και χρήση τους θεωρείται ότι είναι ένας παγκόσμιος μηχανισμός που συνδυάζει τις διάφορες παθογενετικές οδούς των διαβητικών καρδιαγγειακών επιπλοκών (Huynh et al.2014).

Το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την υπεργλυκαιμία παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στην παθογένεση του ΣΔ2 (Shah and Brownlee 2016). Τα κύρια παθολογικά χαρακτηριστικά του ΣΔ2 είναι η μειωμένη έκκριση ινσουλίνης και η μειωμένη ευαισθησία στην ορμόνη στους περιφερικούς ιστούς. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης μας, η αντίσταση στην ινσουλίνη διαμορφώθηκε σε αρουραίους χρησιμοποιώντας δίαιτα υψηλής θερμιδικής αξίας. Κατά τη διάρκεια τεσσάρων εβδομάδων, οι αρουραίοι που έλαβαν δίαιτα με υψηλή περιεκτικότητα σε θερμίδες. Π. ενίεται με STZtoreπαράγει σχετική ανεπάρκεια ινσουλίνης. Τα αυξημένα επίπεδα βασικής γλυκαιμίας και η αυξημένη AUC στο IPITT έδειξαν την ανάπτυξη ανεπάρκειας ινσουλίνης και αντίστασης στην ινσουλίνη σε ζώα-μοντέλα.

Η χορήγηση του Q δεν επηρέασε τα επίπεδα της βασικής υπεργλυκαιμίας των διαβητικών αρουραίων, αλλά βελτίωσε την ευαισθησία στην ινσουλίνη με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματα συμφωνούν με δεδομένα από άλλες μελέτες σχετικά με την ικανότητα του Q να μειώνει την αντίσταση στην ινσουλίνη (Shi et al. 2019). Το Q αυξάνει τη χρήση της γλυκόζης στους περιφερικούς ιστούς και μειώνει την παραγωγή γλυκόζης στο ήπαρ. Το φλαβονοειδές αναφέρεται ότι ενεργοποιεί έναν ανεξάρτητο από την ινσουλίνη μηχανισμό που περιλαμβάνει την εξαρτώμενη από AMP πρωτεϊνική κινάση, η οποία διεγείρει τη μετατόπιση του μεταφορέα γλυκόζης GLUT4 στην πλασματική μεμβράνη των σκελετικών μυών και ρυθμίζει προς τα κάτω τα βασικά ένζυμα γλυκονεογένεσης στο ήπαρ (φωσφοενόλη-πυρουβική καρβοξυκινάση και καρβοξυκινάση 6}}φωσφατάση) (Eid and Haddad 2017). Η βελτίωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη από το Q μπορεί επίσης να οφείλεται στην ικανότητά του να αυξάνει την έκφραση της αδιπονεκτίνης στον λευκό λιπώδη ιστό ανεξάρτητα από την έκφραση των υποδοχέων που ενεργοποιούνται από τον πολλαπλασιαστή υπεροξισωμάτων (Wein et al. 2010).

Η αντιδιαβητική δράση του Q μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί με τη μείωση της απορρόφησης της γλυκόζης στο έντερο μέσω της αδρανοποίησης του μεταφορέα γλυκόζης GLUT2 (Gaueret al.2018) και της αναστολής της δραστηριότητας των εντερικών γλυκοσιδασών (Pereira et al. 2011). Επιπλέον, το Q έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει το ένζυμο 1l-υδροξυστεροειδούς αφυδρογονάση-1, το οποίο παίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη της παχυσαρκίας και του διαβήτη 2 επηρεάζοντας τη δράση των γλυκοκορτικοειδών ορμονών στο ήπαρ, τον λιπώδη ιστό και το πάγκρεας -κελιά (Torres-Piedra et al.2010).

Υποτίθεται ότι τόσο η ανάπτυξη όσο και η εξέλιξη των διαβητικών επιπλοκών οφείλονται στην αύξηση της παραγωγής ROS (Kayama et al. 2015). Στα καρδιομυοκύτταρα, τα ROS παράγονται από μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (ETC), NOX και XO (Tsutsui et al.2011). Μπορεί να υποστηριχθεί ότι τα μιτοχόνδρια είναι οι κύριοι παράγοντες που συνεισφέρουν το οξειδωτικό στρες στον ΣΔ2 (Shah and Brownlee 2016). Η ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στα μιτοχόνδρια συνοδεύεται από διακοπή των οδών σηματοδότησης ευαίσθητων στην οξειδοαναγωγή, μειωμένη οξειδωτική φωσφορυλίωση και παραγωγή ATP, βλάβη του μιτοχονδριακού DNA και, κατά συνέπεια, περαιτέρω αύξηση της παραγωγής ROS. Ως αποτέλεσμα, ο παθογόνος καταρράκτης μοριακών γεγονότων, που ενισχύεται, οδηγεί στην εκτόξευση προαποπτωτικών οδών σηματοδότησης και κυτταρικό θάνατο. Δεδομένης της σημασίας των μιτοχονδρίων στον κυτταρικό μεταβολισμό, η δυσλειτουργία τους μπορεί να οδηγήσει σε διάφορες ασθένειες συμπεριλαμβανομένης της καρδιαγγειακής παθολογίας. Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία εμφανίζεται σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο, μυοκαρδιοπάθεια, καρδιακή ανεπάρκεια, εγκεφαλικό επεισόδιο και ΣΔ2 (Bai et al.2016).

Στη μελέτη μας, η ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στα μιτοχόνδρια της καρδιάς των διαβητικών αρουραίων αποδεικνύεται από τη συσσώρευση AOPP. Η συγκέντρωση του AOPP είναι ένας σχετικά νέος δείκτης οξειδωτικού στρες, ο οποίος αντανακλά τη συνολική κατάσταση οξειδοαναγωγής των πρωτεϊνών στα κύτταρα και τους ιστούς. Το AOPP αναφέρεται ότι είναι αυξημένο σε ασθενείς με ΣΔ, καρδιαγγειακές παθήσεις, υπέρταση, αθηροσκλήρωση (Conti et al.2019) και το επίπεδο συσχετίζεται με την αντίσταση στην ινσουλίνη και την παρουσία σοβαρών διαβητικών επιπλοκών (Gradinaru et al. 2013, Taylor et al. 2015). Οι οξειδωτικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών παίζουν βασικό ρόλο στην ανάπτυξη διαβητικής δυσλειτουργίας του μυοκαρδίου. Αλλαγές οξειδοαναγωγής στις πρωτεϊνικές δομές μπορεί να οδηγήσουν σε διάσταση καταλυτικών υπομονάδων ενζύμων, ξεδίπλωμα, συσσωμάτωση ή κατακερματισμό πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη συσταλτικότητα, σύζευξη διέγερσης-συστολής, αναδίπλωση πρωτεΐνης, αντιοξειδωτική άμυνα, μεταβολισμό και χειρισμό Ca2* στη διαβητική καρδιά (Varga et al. 2015). Έχει επίσης βρεθεί ότι το AOPP επάγει προαποπτωτική σηματοδότηση σε καρδιομυοκύτταρα που οδηγεί στην ανάπτυξη DCM (Zhang et al.2016).

Σε ζώα που έλαβαν θεραπεία με Q σε δόση 10 mg/kg, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του AOPP στα μιτοχόνδρια της καρδιάς, ενώ μια δόση 50 mg/kg Q κανονικοποίησε πλήρως αυτόν τον δείκτη σε σύγκριση με αρουραίους που έλαβαν φορέα.

Η αντιοξειδωτική δράση του Q στα μιτοχόνδρια μπορεί να περιλαμβάνει αρκετούς κύριους μηχανισμούς. Τα φλαβονοειδή έχουν την ικανότητα να καθαρίζουν τα ROS λόγω της υδροξυλικής διαμόρφωσης του δακτυλίου Β στη δομή (Kumar and Pandey 2013). Η άμεση σάρωση του Ο, που δημιουργείται στο μιτοχονδριακό σύμπλεγμα II του ETC σε απομονωμένα μιτοχόνδρια καρδιάς αρουραίου έχει δειχθεί για το Q (Dudy-lina et al. 2019). Επιπλέον, τα φλαβονοειδή μπορούν να εξασθενήσουν το σχηματισμό ROS στα μιτοχόνδρια μέσω της αναστολής των συμπλόκων I και III του ETC. Η αναστολή Q της δραστηριότητας του συμπλέγματος Ι μείωσε σημαντικά την παραγωγή H2O2 σε μεμονωμένα μιτοχόνδρια καρδιάς αρουραίου (Lagoa et al.2011). Επιπλέον, η μείωση της δημιουργίας μιτοχονδριακών ROS από φλαβονοειδή βρέθηκε να σχετίζεται με ιδιότητες μερικής αποσύνδεσης, ιδιαίτερα στα καρδιακά μιτοχόνδρια (Bernatoniene et al.2014). Επιπλέον, τα φλαβονοειδή έχει αποδειχθεί ότι διεγείρουν τη μιτοχονδριακή βιογένεση μέσω της επαγωγής του μεταγραφικού συν-ενεργοποιητή PGC-la και του ανοδικού ρυθμιστή του SIRT1. Το τελευταίο οδηγεί σε διέγερση μιας σειράς μεταγραφικών παραγόντων (NRF1, NRF2 και που σχετίζονται με τα οιστρογόνα-a), που εμπλέκονται στη ρύθμιση του ενεργειακού μεταβολισμού και στη διατήρηση της ομοιόστασης στα μιτοχόνδρια (Kicinska and Jarmuszkiewicz 2020).

Ως αποτέλεσμα του πειράματός μας, η αύξηση του οξειδωτικού στρες στα μιτοχόνδρια της καρδιάς των διαβητικών αρουραίων συνοδεύτηκε από επαγωγή της δραστηριότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων-Mn-SOD, GPO και GR. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι ένας κύριος μηχανισμός στην κυτταρική άμυνα έναντι του οξειδωτικού στρες είναι η ενεργοποίηση της εξαρτώμενης οδού σηματοδότησης Keapl/Nrf-2-, η οποία ελέγχει την έκφραση γονιδίων των οποίων τα πρωτεϊνικά προϊόντα εμπλέκονται στην αποτοξίνωση και την εξάλειψη αντιδραστικά οξειδωτικά (Nguyen et al. 2009). Από αυτή την άποψη, η παρατηρούμενη επαγωγή αντιοξειδωτικών ενζύμων στην καρδιά των πειραματόζωων είναι η εφαρμογή αρνητικής ανατροφοδότησης με στόχο τη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης.

Η χορήγηση του Q και στις δύο δόσεις οδήγησε σε μείωση της δραστηριότητας των Mn-SOD, GPO και GR στα καρδιακά μιτοχόνδρια των πειραματόζωων σε τιμές στατιστικά αδιάφορες από την ομάδα ελέγχου. Αν και το Q είναι γνωστό ότι επάγει τη δραστηριότητα των παραπάνω ενζύμων (Shi et al.2019), τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αντιοξειδωτική δράση του Q στα καρδιομυοκύτταρα στον ΣΔ2 γίνεται περισσότερο από την ικανότητά του να αποτρέπει την υπερπαραγωγή ROS και κατά συνέπεια την ανάπτυξη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, παρά με διέγερση του αντιοξειδωτικού αμυντικού συστήματος. Προηγουμένως, είχε αποδειχθεί ότι η χρήση Q αυξάνει την οξειδωτική ικανότητα των μιτοχονδρίων και τη δραστηριότητα ορισμένων ενζύμων του κύκλου Krebs στην καρδιά των αρουραίων με T2DM (Gorbenko et al.2019).

Όπως σημειώθηκε παραπάνω, τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια, αλλά όχι η μόνη πηγή ROS στα καρδιομυοκύτταρα. Ο δεύτερος σημαντικός παράγοντας στην ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στη διαβητική καρδιά είναι το NOX, με τα NOX2 και NOX4 ως τις κύριες ισομορφές του μυοκαρδίου. Η κύρια λειτουργία του NOX είναι να παράγει ROS. Το NOX2 εντοπίζεται στη μεμβράνη του πλάσματος και συμμετέχει στην ενδοκυτταρική οξειδοαναγωγική σηματοδότηση του υποδοχέα της αγγειοτενσίνης II και άλλων, ενώ το NOX4 έχει ιδιαίτερα σήμα μιτοχονδριακού εντοπισμού και παρουσιάζει συστατική δραστηριότητα (Cave et al. 2005). Έχει αποδειχθεί ότι η επώαση καρδιομυοκυττάρων αρουραίου με πρώιμες γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες διέγειρε την παραγωγή ROS μέσω ενεργοποίησης του NOX2 που εξαρτάται από την κινάση πρωτεΐνης C(PKC) (Zhang et al. 2006). Επιπλέον, η καρδιακή υπερτροφία, η ίνωση και η απόπτωση βρέθηκε ότι σχετίζονται με ρυθμισμένο προς τα πάνω NOX2 στην καρδιά ποντικών με ΣΔ τύπου 1 και τύπου 2 (Ritchie et al.2007; Huynh et al.2013). Μια πρόσθετη πηγή ROS στα καρδιομυοκύτταρα είναι το XO, το οποίο καταλύει την οξείδωση της υποξανθίνης και της ξανθίνης σε ουρικό οξύ χρησιμοποιώντας το Ο, ως υποδοχέα ηλεκτρονίων και παράγοντας Ο, και Η2Ο2, στη διαδικασία. Αν και η συμβολή της αντίδρασης XO στην ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στο διαβήτη δεν έχει μελετηθεί αρκετά, οι αναστολείς XO φάνηκε να βελτιώνουν την καρδιαγγειακή δυσλειτουργία στο μοντέλο καρδιακής ανεπάρκειας που προκαλείται από βηματοδότηση (Amado et al. 2005). Στη μελέτη μας, ο διαβήτης 2 οδήγησε σε σημαντική αύξηση στις δραστηριότητες NOX και XO στην καρδιά πειραματικών αρουραίων. Ταυτόχρονα, η χορήγηση Q ανεξάρτητα από τη δόση ομαλοποίησε τη δραστηριότητα των ενζύμων. Μέχρι σήμερα, αρκετές μελέτες έχουν δείξει την ικανότητα του Q να αναστέλλει τη δραστηριότητα του NOX τόσο μειώνοντας τις εκφράσεις των υπομονάδων του όσο και εμποδίζοντας την ενεργοποίησή του μέσω εξωκυτταρικών ερεθισμάτων. Ο δεύτερος μηχανισμός θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί με τη μείωση της φωσφορυλίωσης της ρυθμιστικής υπομονάδας p47phox λόγω της ανασταλτικής επίδρασης των φλαβονοειδών στην PKC (Redondo et al.2012; Jimenez et al. 2015). Επιπλέον, το Ο και οι μεταβολίτες του είναι γνωστό ότι αναστέλλουν τη δραστηριότητα του XO με επιλεκτικό τρόπο, σχηματίζοντας τη συζευγμένη δομή τριών δακτυλίων με την ενεργό θέση και ειδικές αλληλεπιδράσεις δεσμού υδρογόνου με καταλυτικά σχετικά υπολείμματα του ενζύμου (Taka-Hama et al. 201l· Cao et al.2014).

Συνοπτικά, η μελέτη μας έδειξε ότι το Q με δοσοεξαρτώμενο τρόπο μείωσε την οξείδωση των ελεύθερων ριζών στα μιτοχόνδρια του μυοκαρδίου των αρουραίων με ΣΔ2, περιορίζοντας έτσι τον σχηματισμό AOPP. Επιπλέον, το Q σε δόση τόσο 10 mg/kg όσο και 50 mg/kg απέτρεψε την ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στην καρδιά των διαβητικών αρουραίων μειώνοντας τις δραστηριότητες NOX και XO. Τα ληφθέντα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η χρήση του Q μπορεί να συμβάλει στη βελτίωση του καρδιαγγειακού κινδύνου στον ΣΔ2.