Τα καρκινικά κύτταρα αποτυγχάνουν να παρουσιάσουν επίτοπους περιορισμένους με MHC-II που προέρχονται από ογκογονίδια σε CD4+ Τ κύτταρα
Oct 09, 2023
Τα CD{0}} Τ κύτταρα παίζουν κρίσιμο ρόλο στην αντικαρκινική ανοσία μέσω της αναγνώρισης των πεπτιδικών αντιγόνων που παρουσιάζονται σε MHC κατηγορίας II (MHC-II). Αν και ορισμένοι συμπαγείς καρκίνοι μπορούν να προκληθούν για να εκφράσουν το MHC-II, ο βαθμός στον οποίο αυτό επιτρέπει την άμεση αναγνώριση από τα ειδικά για τον όγκο CD4+ Τ κύτταρα είναι ασαφής. Απομονώσαμε και χαρακτηρίσαμε υποδοχείς αντιγόνων Τ κυττάρων (TCR) από φυσικά εκκινημένα CD4+ Τ κύτταρα ειδικά για 2 ογκοπρωτεΐνες, τον HPV-16 E6 και την ενεργοποιητική μετάλλαξη KRASG12V, από ασθενείς με καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων κεφαλής και τραχήλου και το αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου, αντίστοιχα, και προσδιόρισαν την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν αυτόλογα ή ταιριασμένα με αντιγόνο ανθρώπινα λευκοκύτταρα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν αντιγόνο. Βρήκαμε και στις δύο περιπτώσεις ότι τα TCR ήταν ικανά να αναγνωρίσουν φορτωμένα με πεπτίδια κύτταρα-στόχους που εκφράζουν τα σχετικά MHC-II ή Β κύτταρα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs) όταν τα αντιγόνα εκφράστηκαν ενδογενώς και κατευθύνονταν στην ενδοσωμική οδό, αλλά απέτυχαν να αναγνωρίσουν τον όγκο κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη πηγής ακόμη και μετά την επαγωγή της επιφανειακής έκφρασης MHC-II από την IFN- ή μεταγωγή με CIITA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η εκκίνηση και η λειτουργική αναγνώριση τόσο μιας πυρηνικής (Ε6) όσο και μιας σχετιζόμενης με μεμβράνη ογκοπρωτεΐνης (KRAS) περιορίζονται κυρίως σε διασταυρούμενη παρουσίαση APC και όχι μέσω άμεσης αναγνώρισης κυττάρων όγκου που προκαλούνται να εκφράζουν MHC-II.
Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό
Εισαγωγή
Ο κακοήθης μετασχηματισμός των σωματικών κυττάρων ξεκινά από τη δράση ενεργοποιημένων ογκογονιδίων που απορυθμίζουν τις οδούς ανάπτυξης των κυττάρων και οδηγούν σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό (1). Στην περίπτωση των καρκίνων που σχετίζονται με τον HPV, η έκφραση των πρώιμων γονιδίων του HPV Ε6 και Ε7 συμβάλλει στην ογκογένεση αναστέλλοντας τα ογκοκατασταλτικά γονίδια p53 και Rb, αντίστοιχα (2). Εναλλακτικά, η συστατική ενεργοποίηση ογκογονιδίου μπορεί να συμβεί μέσω σωματικής μετάλλαξης σε γονίδια που ρυθμίζουν τις οδούς ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού των κυττάρων, όπως η οικογένεια RAS. Πράγματι, ενεργοποιητικές μεταλλάξεις KRAS όπως το KRASG12V απαντώνται συνήθως σε ασθενείς με καρκίνους του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του πνεύμονα (3). Αν και τα ογκογονίδια προάγουν τη νόσο, μπορούν επίσης να παρέχουν στόχους για το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Τα τελευταία χρόνια, ο ρόλος του ανοσοποιητικού συστήματος στον έλεγχο των καρκίνων που σχετίζονται με τον HPV έχει γίνει ευρέως αναγνωρισμένος. Τα CD8+ και CD4+ Τ κύτταρα που αναγνωρίζουν τους HPV E6 και E7, καθώς και άλλες πρωτεΐνες HPV, έχουν ταυτοποιηθεί τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και στα λεμφοκύτταρα που διεισδύουν στον όγκο (TILs) από ασθενείς με σχετιζόμενο με τον HPV καρκίνους (4–6). Οι ανοσοθεραπείες που στοχεύουν αυτά τα αντιγόνα, συμπεριλαμβανομένων των θεραπευτικών εμβολίων κατά του καρκίνου και της θετικής κυτταρικής θεραπείας (ACT) με TILs ή TCR-μηχανικά κύτταρα, αποτελούν ενεργό τομέα προκλινικής και κλινικής έρευνας (2). Οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων έναντι των ογκογόνων μεταλλάξεων έχουν επίσης περιγραφεί ευρέως (7-9). Επιπλέον, υπάρχουν άμεσες κλινικές ενδείξεις ότι το ACT με TIL που στοχεύει το μεταλλαγμένο KRAS μπορεί να προάγει αντικειμενικές αποκρίσεις (10). Αν και τα CD{23}} Τ κύτταρα που αναγνωρίζουν επιτόπους που προέρχονται από ογκογονίδια μεσολαβούν στην άμεση κυτταροτοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων (11-13), ο ρόλος των CD{26}} Τ κυττάρων στην αντικαρκινική ανοσία είναι λιγότερο καλά κατανοητός. Πρόσφατες μελέτες έχουν επισημάνει ένα υποσύνολο CD4+ Τ κυττάρων που εκφράζουν κυτταροτοξικούς δείκτες, όπως το granzyme B (GrzmB), σε ανθρώπινους καρκίνους (14, 15). Οι ειδικότητες αντιγόνου αυτών των κυττάρων, ωστόσο, και ως εκ τούτου το θεραπευτικό δυναμικό τους, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Επιπλέον, προκειμένου αυτά τα κυτταροτοξικά CD4+ Τ κύτταρα να αναγνωρίσουν και να σκοτώσουν κύτταρα όγκου, όχι μόνο το καρκινικό κύτταρο πρέπει να εκφράζει το MHC-II, αλλά και τα σχετικά αντιγόνα πρέπει να κατευθύνονται στην κατάλληλη οδό παρουσίασης. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την ικανότητα των CD{32}} Τ κυττάρων που είναι ειδικά για τις ογκοπρωτεΐνες HPV-16 E6 και KRASG12V να αναγνωρίζουν καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν αντιγόνο. Αν και και οι δύο TCR ήταν σε θέση να αναγνωρίσουν άμεσα ενδογενώς επεξεργασμένα και παρουσίασαν αντιγόνα που κατευθύνονται στο ενδοσωμικό διαμέρισμα των HLA-ταιριασμένων κυττάρων Β, κανένας δεν ήταν ικανός να αναγνωρίσει κύτταρα όγκου που εκφράζουν αντιγόνο με επαγόμενη έκφραση του MHC-II. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι μόνο ορισμένα αντιγόνα παρουσιάζονται απευθείας στα καρκινικά κύτταρα MHC-II+, τα οποία μπορεί να περιορίσουν τη δεξαμενή των CD{42}} Τ κυττάρων ικανών να αναγνωρίζουν και να εξαλείφουν άμεσα τα καρκινικά κύτταρα.
Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα
Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity
【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Αποτελέσματα
Προσδιορισμός αποκρίσεων των HPV-16 Ε6-ειδικών CD4+ και CD8+ Τ-κυττάρων από TILs του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος κεφαλής και τραχήλου. Εξετάσαμε μια σειρά από μεμονωμένες καλλιέργειες TIL που απομονώθηκαν από θραύσματα όγκου 2 έως 4 mm από ασθενή (Hu-56) με HPV-16+ καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων κεφαλής και τραχήλου (HNSCC) (Συμπληρωματικός Πίνακας 1, συμπληρωματικό υλικό διαθέσιμο στο διαδίκτυο με αυτό το άρθρο. επικαλυπτόμενα 15-μερή που εκτείνονται σε όλο το μήκος των πρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Συγκεκριμένα, τα θραύσματα TIL 12 και 29 δημιούργησαν έναν σημαντικό αριθμό κηλίδων πάνω από το φόντο όταν επαναδιεγέρθηκαν με τη δεξαμενή πεπτιδίων Ε6 και περιείχαν και CD{4+ και CD8+ Τ κύτταρα (Εικόνα 1Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α). Για να αναγνωρίσουμε τις σχετικές υποομάδες Τ κυττάρων, αναλύσαμε αυτές τις καλλιέργειες TIL χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία έκκρισης κυτοκίνης. Αυτό το αποκαλυπτόμενο θραύσμα TIL 29 (F29) περιείχε Ε6-αντιδραστικά CD8+ Τ κύτταρα, ενώ το θραύσμα 12 (F12) περιείχε και CD4+ και CD8+ Τ κύτταρα ικανά αναγνωρίζοντας τη δεξαμενή πεπτιδίων Ε6 (Εικόνα 1Β). Κανένα από τα CD4+ Τ κύτταρα δεν παρήγαγε IL-5 ως απόκριση στην επαναδιέγερση Ε6, επικυρώνοντας έναν φαινότυπο που μοιάζει με Th. Για να προσδιορίσουμε την κλωνικότητα TCR των Ε6-ειδικών TIL, ταξινομήσαμε μεμονωμένα κύτταρα CD4+ Τ που εκκρίνουν IFN από F12 και CD8+ Τ κύτταρα από F12 και F29. Η αλληλουχία TCR αποκάλυψε ένα μόνο TCR που εκφράζεται από IFN- εκκρίνοντας CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα (n=31 από 31 κύτταρα με αλληλουχία), καθώς και έναν μόνο κλώνο TCR που μοιράζεται από το CD που εκκρίνει IFN{{53 }} Τ κύτταρα και από τα δύο F12 και F29 (n=40 από 41 και 37 από 38 κύτταρα αλληλουχήθηκαν, αντίστοιχα) (Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα μονοκλωνικά CD{{4+ και τα CD{{{8+ Τ-λεμφοκύτταρα που αντιδρούν στο E6 είναι παρόντα εντός των TIL από αυτόν τον ασθενή. HLA-A*02:01-περιορισμένα CD8+ Τ κύτταρα από TILs αναγνωρίζουν το E6 που παρουσιάζεται από μια κυτταρική γραμμή όγκου που προέρχεται από ασθενή. Τα TIL από το F29 παρήγαγαν IFN- όταν επαναδιεγέρθηκαν με το πεπτίδιο Ε629-38, υποδηλώνοντας ότι το F29 TCR αναγνώρισε αυτόν τον περιορισμένο επίτοπο HLA-A*02:01 που περιγράφηκε προηγουμένως (Συμπληρωματικό Σχήμα 1Β) (11). Αυτό επιβεβαιώθηκε από μελέτες δέσμευσης τετραμερούς χρησιμοποιώντας E629-38/HLA-A*02:01 για την επισήμανση κυττάρων J76 με ανεπάρκεια TCR που εκφράζουν ανθρώπινο CD8 και χρησιμοποιώντας ένα E{87}}-ειδικό TCR ως θετικό έλεγχος (Εικόνα 2Α) (11). Και οι δύο TCR εμφάνισαν παρόμοια επίπεδα λειτουργικής απληστίας, όπως αποδεικνύεται από την ανοδική ρύθμιση του δείκτη οξείας ενεργοποίησης CD69 στο J76 μετά από διέγερση με αυτόλογες Β λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (B-LCLs) με παλμικές τιμές με τιτλοδοτημένες συγκεντρώσεις πεπτιδίου Ε629-38 (Εικόνα 2, Β και Γ). Αυτά τα δεδομένα επικυρώνουν την παρουσία ενός κλώνου CD8+ Τ κυττάρων ειδικού για έναν γνωστό επίτοπο του Ε6 με παρόμοια λειτουργικά χαρακτηριστικά με ένα TCR που έχει δοκιμαστεί σε κλινικό περιβάλλον (16). Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε εάν το Ε{98}}ειδικό CD8+ TCR θα μπορούσε να αναγνωρίσει ενδογενώς εκφραζόμενα αντιγόνα και ως εκ τούτου να μεσολαβήσει στην αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα. Για να το κάνουμε αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια καλά χαρακτηρισμένη γραμμή όγκου HLA-A*02:{01+ HPV-16+, CaSki, καθώς και μια αυτόλογη κυτταρική σειρά όγκου, HNSCC-56, που δημιουργήθηκε μέσω κυτταρικός επαναπρογραμματισμός πρωτογενούς ιστού όγκου όπως περιγράφηκε προηγουμένως (17) για in vitro προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας. Η ανάλυση RNA-Seq επικύρωσε την έκφραση των πρώιμων γονιδίων του HPV-16, συμπεριλαμβανομένου του Ε6, τόσο από το δείγμα πρωτογενούς όγκου όσο και από την αυτόλογη κυτταρική σειρά (Συμπληρωματικό Σχήμα 1C). Πρωτογενή ανθρώπινα CD{111}} Τ κύτταρα που εκφράζουν το F29 TCR θα μπορούσαν να μεσολαβήσουν στη θανάτωση κυττάρων τόσο του CaSki όσο και του HNSCC-56 σε ένα εύρος αναλογιών τελεστή προς στόχο in vitro (Εικόνα 2, D και E). Μαζί, αυτά τα δεδομένα επικυρώνουν ότι το F29 TCR αναγνωρίζει ενδογενώς εκφρασμένο αντιγόνο Ε6. Αναγνώριση ενός HLA-DQ-περιορισμένου, Ε{120}}ειδικού CD4+ κυττάρου Τ από TIL. Για την επέκταση των Ε{122}}συγκεκριμένων TIL για περαιτέρω λειτουργική ανάλυση, χρησιμοποιήσαμε το πρωτόκολλο καλλιέργειας ταχείας επέκτασης που περιγράφηκε προηγουμένως με OKT-3 και ακτινοβολημένα αλλογενή PBMC για να επεκτείνουμε τα TIL από το F12. Αν και η πρωτογενής καλλιέργεια F12 περιείχε αρχικά και CD8+ και CD{4+ Τ κύτταρα με αντιδραστικότητα Ε6, το τελικό κυτταρικό προϊόν μετά από ταχεία επέκταση περιείχε 99% CD4+ Τ κύτταρα, εκ των οποίων περίπου 38,33 % έδειξε αντιδραστικότητα έναντι του Ε6, όπως αποδεικνύεται με ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης για IFN- (Εικόνα 3Α).
Φυτό κινέζικου βότανο cistanche-Antitor
Εκτός από την IFN-, τα διεγερμένα Ε6-ειδικά CD4+ TILs θα μπορούσαν να εκκρίνουν TNF- αλλά όχι IL-2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2Α). Αν και η συνολική συχνότητα των κυττάρων GrzmB+ δεν αυξήθηκε με τη διέγερση με αντιγόνο, η θυρίδα στα κύτταρα που εκκρίνουν TNF αποκάλυψε ότι τα E{8}}ειδικά CD4+ TIL περιείχαν περισσότερο αποθηκευμένο ενδοκυτταρικό GrzmB από τα μη ειδικά TIL (Συμπληρωματικό Σχήμα 2Β ). Τα IFN--εκκρίνοντα CD4+ TIL εξέφρασαν επίσης τον συνανασταλτικό δείκτη προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 1 (PD-1), σύμφωνα με τις δημοσιευμένες υπογραφές των αντιδρώντων στον όγκο CD4+ TILs (Συμπληρωματικό Σχήμα 2C) ( 18, 19). Τα Ε{20}}ειδικά CD4+ TIL επέδειξαν υψηλή λειτουργική απληστία επειδή αυτά τα κύτταρα μπορούσαν να εκκρίνουν κυτοκίνες σε συγκεντρώσεις πεπτιδίου μικρότερες από 1 ug/mL (Εικόνα 3Β). Για να προσδιορίσουμε την ειδικότητα της καλλιέργειας F12 TIL, παλμοποιήσαμε αυτόλογα B-LCL με μεμονωμένα πεπτίδια που αντιστοιχούν σε καθένα από τα 37 πεπτίδια που περιέχονται στην αρχική ομάδα Ε6 (Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Τα CD{29}} TIL από το F12 εκκρίνουν IFN- όταν διεγείρονται με πεπτίδια Ε61-15 και Ε65-19, τα οποία μοιράζονται μια αλληλουχία πυρήνα 11-αμινοξέων (Συμπληρωματικό Σχήμα 2D). Πειράματα συγκαλλιέργειας παρουσία Abs που αναστέλλουν το HLA αποκάλυψαν σημαντικά μειωμένη έκκριση IFN από τα TIL όταν τα B-LCL αποκλείστηκαν με Abs αντι-HLA-DQ αλλά όχι με Abs αντι-HLA-DR ή ισοτύπου ελέγχου (Εικόνα 3C). Για να προσδιορίσουμε ποια αλληλόμορφα HLA-DQ είναι υπεύθυνα για την παρουσίαση αυτού του επιτόπου, παλμώσαμε B-LCL που εκφράζουν γνωστά αλληλόμορφα HLA-DQ (Συμπληρωματικός Πίνακας 4) με Ε61-15 και βρήκαμε ότι κύτταρα KAS011 που εκφράζουν HLA-DQA1*01 :02 και DQB1*05:02, αλλά όχι τα Hu-195 B-LCL που εκφράζουν DQA1*05:05 και DQB1*03:01, θα μπορούσαν να παρουσιάσουν αντιγόνο στα TILs με συγκρίσιμο τρόπο με αυτόλογο Hu{{{63} } B-LCL (Εικόνα 3D). Τέλος, επιδιώξαμε να επαληθεύσουμε ότι η ακολουθία TCR που προσδιορίστηκε προηγουμένως ήταν πράγματι υπεύθυνη για την αναγνώριση Ε6. Η έκφραση του F12 TCR σε πρωτογενή ανθρώπινο υγιή δότη CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα ήταν επαρκής για την προώθηση της αναγνώρισης του πεπτιδίου Ε61-15, όπως αποδεικνύεται από την ανοδική ρύθμιση των CD69 και PD{-1 (Εικόνα 3Ε ). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν την ταυτοποίηση ενός HLA-DQ-περιορισμένου επίτοπου του Ε6 που αναγνωρίζεται από μονοκλωνικά CD4+ TILs. Τα Ε6-ειδικά CD4+ Τ κύτταρα δεν αναγνωρίζουν ούτε σκοτώνουν αυτόλογα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το MHC-II. Πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει γενετικές υπογραφές κυτταροτοξικών CD4+ TIL σε ορισμένους ανθρώπινους καρκίνους (14, 15). Ωστόσο, είναι άγνωστο εάν τα κυτταροτοξικά CD{4+ Τ κύτταρα παίζουν ρόλο στους καρκίνους που προκαλούνται από τον HPV. Για να προσδιορίσουμε εάν τα Ε6-συγκεκριμένα CD4+ Τ κύτταρα από TIL θα μπορούσαν να αναγνωρίσουν άμεσα το HNSCC-56, ερευνήσαμε πρώτα την κατάσταση έκφρασής του MHC-II. Αν και τα καρκινικά κύτταρα δεν εξέφρασαν ανιχνεύσιμη επιφάνεια MHC-II σε καλλιέργεια, η θεραπεία με IFN- για 72 ώρες ήταν αρκετή για να προκαλέσει ανοδική ρύθμιση του MHC-II (Εικόνα 4Α). Στη συνέχεια, καλλιεργήσαμε HNSCC-56 με CD4+ F12 TIL. Είναι σημαντικό ότι τα κύτταρα όγκου MHC-II+ που είχαν προετοιμαστεί με IFN- δεν ήταν σε θέση να διεγείρουν CD4+ TILs όπως μετρήθηκαν με έκκριση IFN- (Εικόνα 4Β).
Εικόνα 1. Αναγνώριση Ε6-αντιδρών CD4+ και CD8+ TIL από HPV-16+ HNSCC. (ΕΝΑ)
Εικόνα 2. Λειτουργικά χαρακτηριστικά ενός HLA-A*02:01-περιορισμένου, E{4}}ειδικού TCR από Hu-56 TIL. (ΕΝΑ)
Ωστόσο, κυτταρικές σειρές όγκου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με IFN και παλμοποιήθηκαν με E61-15 πριν από την προσθήκη TILs ήταν σε θέση να διεγείρουν μια απόκριση Τ κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η επιφανειακή έκφραση των περιοριστικών αλληλόμορφων HLA-DQ σε μια κυτταρική σειρά που εκφράζει ενδογενώς Το Ε6 δεν ήταν αρκετό για την αναγνώριση του όγκου αλλά απαιτούσε εξωγενή φόρτωση του πεπτιδίου στόχου. Η ίδια απαίτηση φόρτωσης εξωγενούς πεπτιδίου στόχου παρατηρήθηκε με κύτταρα όγκου που έχουν μετατραπεί από CIITA (HNSCC-56 CIITA), τα οποία εκφράζουν ιδιοσυστατικά υψηλά επίπεδα επιφανειακής MHC-II (Εικόνα 4Β). Για να ελέγξουμε εάν τα CD4+ TIL θα μπορούσαν να αναγνωρίσουν μια ενδογενώς επεξεργασμένη και παρουσιαζόμενη εκδοχή του επιτόπου Ε6 σε ένα APC, μεταγωγήμε ρετροϊικά αυτόλογα B-LCL με μια κατασκευή έκφρασης που κωδικοποιεί τα πρώτα 50 αμινοξέα του Ε6 συντηγμένα με το MHC- Διαμεμβρανική περιοχή I (E6-MITD), η οποία επάγει τον εντοπισμό της συντηγμένης αλληλουχίας αμινοξέων στη μεμβράνη πλάσματος και υποστηρίζει την παρουσίαση στο MHC-II μέσω ενδοσωμικής διακίνησης (20). Τα B-LCL που εκφράζουν το κατασκεύασμα E6-MITD θα μπορούσαν να διεγείρουν Ε6-ειδικά CD4+ TILs, υποδεικνύοντας ότι ο επίτοπος πεπτιδίου που αναγνωρίζεται από αυτά τα TIL μπορεί να υποβληθεί σε φυσική επεξεργασία και να παρουσιαστεί στο MHC-II όταν κατευθύνεται στην κατάλληλη οδό (Εικόνα 4Γ).
Σχήμα 3. Λειτουργικά χαρακτηριστικά κλωνικά επεκτεινόμενων, περιορισμένων σε HLA-DQ, Ε6-ειδικών CD4+ TIL. (ΕΝΑ)
Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε εάν τα F12 E6-ειδικά CD4+ TILs ήταν ικανά για άμεση κυτταροτοξικότητα όγκου. Σε συμφωνία με τα δεδομένα από τις αναλύσεις αναγνώρισής μας, τα E{3}}ειδικά CD4+ TIL δεν μπόρεσαν να περιορίσουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων HNSCC-56, τα οποία δεν εκφράζουν MHC-II (Εικόνα 4D) . Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα HNSCC-56 CIITA αναπτύχθηκαν επίσης χωρίς αναστολή παρουσία CD4+ TILs. Ωστόσο, η ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων HNSCC-56 CIITA με παλμό με πεπτίδιο Ε61-15 αναστέλλεται με τρόπο δοσοεξαρτώμενο από τελεστικά κύτταρα. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι παρόλο που το HNSCC-56 μπορεί να παρουσιάσει επιτόπους Ε6 στα CD8+ Τ κύτταρα, τα E{16}}ειδικά CD4+ TIL δεν μπορούν να αναγνωρίσουν άμεσα και να λύσουν το MHC- II+ αυτόλογα καρκινικά κύτταρα. Τα γονίδια που εμπλέκονται στην παρουσίαση αντιγόνου μεταλλάσσονται συχνά σε καρκίνους, γεγονός που μπορεί να εμποδίσει την αναγνώριση από τα Τ κύτταρα (21). Για να προσδιορίσουμε εάν τα καρκινικά κύτταρα HNSCC-56 περιείχαν σωματικές μεταλλάξεις που αποκλείουν την παρουσίαση αντιγόνου στο MHC-II, πραγματοποιήσαμε αλληλουχία ολόκληρου του εξώματος των καρκινικών κυττάρων και των PBMCs από το Hu{-56 ως δείγμα αναφοράς. Από τις 104 ταυτοποιημένες μη συνώνυμες σωματικές μεταλλάξεις, δεν υπήρχαν εμφανείς μεταλλάξεις σε συστατικά της οδού παρουσίασης MHC-II, συμπεριλαμβανομένων των HLADMA, HLADMB και CD74 (Συμπληρωματικός Πίνακας 5). Προσδιορισμός ενός HLA-DRB5*01:01-περιορισμένου, ειδικού για το KRASG12V TCR από το αίμα ενός ασθενούς με αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου. Μετά από αυτά τα αποτελέσματα, ξεκινήσαμε να προσδιορίσουμε εάν η αδυναμία των καρκινικών κυττάρων να παρουσιάσουν αντιγόνο στο MHC-II ήταν αληθής για άλλα ογκογονίδια. Δεδομένου ότι τα κυκλοφορούντα Τ-κύτταρα ειδικά για τον όγκο έχουν εντοπιστεί σε ανθρώπους ασθενείς με καρκίνο (8, 22), διεγείραμε τα PBMC από έναν ασθενή (Hu-66) με αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου (Συμπληρωματικός Πίνακας 1) με μια ομάδα πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε κοινές ογκογόνες μεταλλάξεις (Συμπληρωματικός Πίνακας 6) για 14 ημέρες πριν από την επαναδιέγερση με μεμονωμένα πεπτίδια για τον εντοπισμό σχετικών αποκρίσεων Τ κυττάρων με ELISPOT. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν την παρουσία μιας απόκρισης Τ-κυττάρων που στρέφεται κατά του KRASG12V, όπως αποδεικνύεται από έναν αυξημένο αριθμό κηλίδων IFN στο φόντο ως απόκριση στα αμινοξέα KRASG12V 1-15 (Εικόνα 5Α). Για να αναγνωρίσουμε τα σχετικά TCR που σχετίζονται με αυτήν την απόκριση, χρησιμοποιήσαμε και πάλι τον προσδιορισμό έκκρισης κυτοκίνης για να ταξινομήσουμε τα κύτταρα που εκκρίνουν IFN. Η δοκιμασία έκκρισης κυτοκίνης αποκάλυψε ειδική παραγωγή IFN- από CD4+ Τ κύτταρα σε απόκριση σε επαναδιέγερση με KRASG12V (Εικόνα 5Β). Συγκρίνοντας τις αλυσίδες TCR από ταξινομημένα κύτταρα που εκκρίνουν IFN με εκείνες που υπάρχουν σε μη διογκωμένα PBMC από αυτόν τον ασθενή αποκάλυψε έναν μόνο κλωνότυπο TCR που υπήρχε με την υψηλότερη συχνότητα μεταξύ των δύο πληθυσμών (Εικόνα 5C και Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η συχνότητα αυτού του κλώνου Τ κυττάρων επεκτάθηκε κατά την έναρξη στα PBMCs, υποδηλώνοντας μια φυσικά προκύπτουσα in vivo απόκριση και όχι in vitro εκκίνηση στην καλλιέργεια επέκτασης μας. Για να επαληθεύσουμε την εξειδίκευση του αντιγόνου αυτού του TCR, το εκφράσαμε σε πρωτογενή ανθρώπινα CD4+ Τ κύτταρα με μεταγωγή ρετροϊού και καλλιεργήσαμε αυτά τα κύτταρα με αυτόλογα B-LCL που παλμοποιούνται είτε με το μεταλλαγμένο KRASG12V είτε με αντίστοιχο πεπτίδιο WT. Τα κατασκευασμένα Τ κύτταρα εκκρίνουν IFN- όταν διεγέρθηκαν με το μεταλλαγμένο, αλλά όχι WT, πεπτίδιο KRAS, επιβεβαιώνοντας ότι αυτός ο TCR είναι ειδικός για το KRASG12V (Εικόνα 5D). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματά μας από το E6 TCR, τα κατασκευασμένα Τ κύτταρα που εκφράζουν το ειδικό για το KRASG12V TCR ήταν επίσης σε θέση να αναγνωρίσουν B-LCL που εκφράζουν ένα θραύσμα του KRASG12V, αλλά όχι το WT KRAS, που κατευθύνεται στο ενδοσώμα με συμπερίληψη ενός MITD, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτό Το TCR αναγνωρίζει το ενδογενώς επεξεργασμένο και παρουσιαζόμενο αντιγόνο (Εικόνα 5Δ).
Εικόνα 4. Τα αυτόλογα κύτταρα όγκου δεν παρουσιάζουν ενδογενή Ε61-15 σε MHC-II σε CD4+ Τ κύτταρα. (ΕΝΑ)
Εικόνα 5. Αναγνώριση ενός HLA-DRB5*01:01-περιορισμένου, ειδικού για το KRASG12V TCR από το αίμα ενός ασθενούς με αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου. (ΕΝΑ)
Για να αναγνωρίσουμε το περιοριστικό αλληλόμορφο HLA, επαναλάβαμε αυτά τα πειράματα διέγερσης πεπτιδίων χρησιμοποιώντας B-LCL που εκφράζουν διαφορετικούς συνδυασμούς γονιδίων HLA. Τα B-LCL που εκφράζουν τον κοινό απλότυπο HLA-B7-DR15-DQ6 θα μπορούσαν να διεγείρουν τα τροποποιημένα Τ κύτταρα, ενώ τα B-LCL χωρίς αυτά τα αλληλόμορφα δεν μπορούσαν (Εικόνα 5Ε). Τελικά, η διέγερση αυτών των κυττάρων από το IHW03304 με παλμικό πεπτίδιο, μια κυτταρική σειρά DAP3 ποντικού που έχει διαμολυνθεί με ανθρώπινο HLA-DRB5*01:01, επαλήθευσε αυτό ως το περιοριστικό μόριο HLA (Εικόνα 5F). Τα καρκινικά κύτταρα MHC-II+ NCI-H2444 και DAN-G δεν παρουσιάζουν επίτοπο προερχόμενο από KRASG12V στα CD4+ Τ κύτταρα. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να παρουσιάζουν άμεσα επιτόπους που προέρχονται από το KRASG12V στο MHC-II. Για να δημιουργήσουμε HLA-ταιριασμένες κυτταρικές σειρές MHC-II+ για αυτές τις μελέτες, μετατρέψαμε τις κυτταρικές σειρές KRASG12V+ NCI-H2444 και DAN-G, που προέρχονται από ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα και του παγκρέατος, αντίστοιχα, με CIITA και μια κατασκευή που κωδικοποιεί HLA-DRB5*01: 01 με ένα περικομμένο γονίδιο αναφοράς CD34 (Εικόνα 6Α). Σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματά μας, τα καρκινικά κύτταρα MHC-II+ που εκφράζουν το περιοριστικό αλληλόμορφο HLA δεν ήταν σε θέση να διεγείρουν Τ-κύτταρα κατασκευασμένα με TCR εκτός εάν τα κύτταρα-στόχοι πρώτα παλμοποιηθούν με εξωγενές πεπτίδιο (Εικόνα 6Β). Είναι σημαντικό ότι δεν υπήρχαν καταχωρημένες σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια παρουσίασης MHC-II (δηλαδή, HLADMA, HLADMB, CD74) είτε για το NCI-H2444 είτε για το DAN-G σε δημόσια διαθέσιμα δεδομένα αλληλουχίας (23). Τα κύτταρα NCI-H2444 CIITA αναπτύχθηκαν χωρίς αναστολή παρουσία Τ-λεμφοκυττάρων που έχουν σχεδιαστεί με TCR, ενώ τα κύτταρα NCI-H2444 CIITA με παλμό με πεπτίδιο KRASG12V παρουσίασαν καθυστερημένη ανάπτυξη όγκου (Εικόνα 6C). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν για HNSCC-56, τα CD8+ Τ κύτταρα που εκφράζουν ένα περιορισμένο HLA-A*03:01–, ειδικό για KRASG12V TCR (24) ήταν σε θέση να αναγνωρίσουν κύτταρα NCI-H2444 αλλά όχι Κύτταρα CaSki, τα οποία εκφράζουν HLA-A*03:01 αλλά όχι KRASG12V (Εικόνα 6D). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ένα ξεχωριστό ογκογονίδιο που υπάρχει στο κυτταρόπλασμα δεν μπορεί επίσης να παρουσιαστεί από κύτταρα όγκου MHC-II+ παρά το γεγονός ότι παρουσιάζεται αποτελεσματικά στο MHC-I. Η έκφραση συνανασταλτικών προσδεμάτων όπως ο συνδέτης προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 1 (PD-L1) από καρκινικά κύτταρα περιορίζει τη σηματοδότηση TCR στα Τ κύτταρα (25). Για να προσδιορίσουμε εάν αυτός ο μηχανισμός μπορεί να εμποδίζει την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων MHC-II+ από τα CD{4+ Τ κύτταρα, καλλιεργήσαμε CD{4+ Τ κύτταρα που εκφράζουν το ειδικό για KRASG12V TCR ή το E6-ειδικό F12 TCR με NCI-H2444 CIITA και HNSCC-56 CIITA, αντίστοιχα, με ή χωρίς αντι-PD-L1-blocking Abs. Ο αποκλεισμός των αλληλεπιδράσεων PD-L1/PD-1 δεν ήταν επαρκής για την προώθηση της αναγνώρισης κυττάρων όγκου (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Ομοίως, η προσθήκη του αντι-CD28 αγωνιστή Ab δεν ρυθμίζει την αναγνώριση των κυττάρων όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έλλειψη παρουσίασης αντιγόνου, και όχι η παρουσία ή η απουσία συνανασταλτικών ή συνδιεγερτικών σημάτων, αντίστοιχα, ευθύνεται για αυτόν τον φαινότυπο. Ορισμένες μελέτες προτείνουν ότι οι ενδογενείς πρωτεΐνες που εσωτερικεύονται από την πλασματική μεμβράνη φορτώνονται κατά προτίμηση στο MHC-II για παρουσίαση, σε σύγκριση με άλλα υποκυτταρικά διαμερίσματα (26). Αν και οι πρωτεΐνες KRAS συνδέονται συχνά με μεμβράνες μέσω τροποποιήσεων λιπιδίων, δεν εκφράζουν μια διαμεμβρανική περιοχή και αυτές οι αλληλεπιδράσεις δεν είναι σταθερές (3, 27). Σκεφτήκαμε, επομένως, ότι η αγκύρωση του ανοσογονικού θραύσματος του KRASG12V στην πλασματική μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων μπορεί να επιτρέψει την άμεση αναγνώριση αντιγόνου από τα CD{103}} Τ κύτταρα. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το κατασκεύασμα KRASG12V-MITD, όπως αποδεικνύεται από την έκφραση ενός ανταποκριτή EGFP συνδεδεμένου με P2A, δεν ήταν παρομοίως σε θέση να διεγείρουν Τ κύτταρα CD{109}} που έχουν σχεδιαστεί με TCR (Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο εντοπισμός του υποκυτταρικού ογκογονιδίου δεν είναι ο μοναδικός καθοριστικός παράγοντας της άμεσης παρουσίασης του MHC-II από τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση του αντιγόνου δεν είναι επαρκής για την προώθηση της παρουσίασης του MHC-II. Τα αποτελέσματά μας μέχρι στιγμής υποδηλώνουν ότι τα ειδικά για τον όγκο CD4+ Τ κύτταρα μπορεί να είναι πιο πιθανό να αναγνωρίσουν τα αντιγόνα που παρουσιάζονται από τα APC παρά από τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα. Επομένως, αξιολογήσαμε την ικανότητα των HLADRB5*01:{01+ DC να παρουσιάζουν αντιγόνα που προέρχονται από εξωγενείς πρωτεΐνες. Τα ταιριασμένα με HLA DCs που δημιουργήθηκαν in vitro ήταν ικανά να διεγείρουν TCR-μηχανικά CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα που εκφράζουν το ειδικό για το KRASG12V TCR όταν τα ανώριμα DC είτε παλμοποιήθηκαν με το πεπτίδιο KRASG12V 20-μερές ή τροφοδοτήθηκαν με πλήρη πρωτεΐνη KRASG12V αλλά όχι πρωτεΐνη KRAS WT (Εικόνα 6Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αν και το TCR δεν μπορεί να αναγνωρίσει ενδογενή αντιγόνα που παρουσιάζονται από κύτταρα όγκου, μπορεί να αναγνωρίσει διασταυρούμενα παρουσιαζόμενα εξωγενή αντιγόνα στο πλαίσιο των DCs.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Συζήτηση
Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί εάν τα TCR που απομονώθηκαν από φυσικά εκκινημένα Τ κύτταρα που ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο μπορούσαν να αναγνωρίσουν κύτταρα όγκου που εκφράζουν ογκογονίδια. Όσον αφορά την κατηγορία I (HLA-A*02:01)–περιορισμένη, HPV-16 E629-38 TCR που λήφθηκε από HNSCC TIL, η αναγνώριση επιβεβαιώθηκε, ίσως χωρίς έκπληξη, και για την κυτταρική σειρά αυτόλογου όγκου και ένα καλά χαρακτηρισμένο καρκινικό κύτταρο με αντιστοιχία HLA και έκφραση Ε6-, το CaSki (σημαντικά, βλέπε Εικόνα 2). Τα ίδια TIL (Εικόνα 1) περιείχαν επίσης σημαντικό αριθμό Ε6-ειδικών CD4+ Τ κυττάρων που παράγουν IFN (Εικόνα 3), τα οποία, αντίθετα, δεν αναγνώρισαν Ε6- που εκφράζουν κύτταρα όγκου, ακόμη και όταν προκλήθηκαν να εκφράσουν άφθονη επιφανειακή MHC τάξης II του σωστού παρουσιαζόμενου αλληλόμορφου (DQA1*01:02/DQB1*05:02) με θεραπεία με IFN ή μεταγωγή CIITA (Εικόνα 4). Η έκφραση CIITA επάγει όχι μόνο την επιφανειακή έκφραση των πρωτεϊνών MHC-II αλλά επίσης και τα μόρια HLA-DM και αμετάβλητης αλυσίδας, τα οποία απαιτούνται για την επεξεργασία και την παρουσίαση αντιγόνου (28). Τα ταιριασμένα με HLA Β κύτταρα, αντίθετα, αναγνωρίστηκαν από αυτό το TCR όταν το αντιγόνο κατευθύνθηκε στην οδό MHC-II. Παρόμοια κατάσταση παρατηρήθηκε στην περίπτωση ενός ειδικού για το KRASG12V, HLA-DRB5*01:01-περιορισμένου TCR, το οποίο μπορούσε να αναγνωρίσει κύτταρα Β που ταιριάζουν με HLA, αλλά όχι κύτταρα όγκου που εκφράζουν MHC-II, όταν το αντιγόνο κατευθύνθηκε στο Μονοπάτι παρουσίασης MHC-II. Και οι δύο TCR διέθεταν επαρκή λειτουργική απληστία για να μεσολαβήσουν στην αναγνώριση ενδογενώς εκφραζόμενων αντιγόνων υπό τις συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω, και αμφότεροι θα μπορούσαν να μεσολαβήσουν στην κυτταροτοξικότητα των φορτωμένων με πεπτίδιο κυττάρων-στόχων. Αυτή η τελευταία παρατήρηση αντικατοπτρίζει την περίσταση που παρουσιάζεται σε αρκετές αναφορές για κυτταροτοξικά CD4+ Τ κύτταρα, αν και τα δεδομένα μας επεκτείνουν το πλαίσιο αυτής της παρατήρησης δείχνοντας ότι η ενδογενής έκφραση του αντιγόνου πηγής και η επαγωγή του MHC-II από την IFN- είναι απίθανη για να δώσει έναν φυσιολογικό στόχο σε κύτταρα όγκου που προέρχονται από επιθηλιακά για TCRs έναντι πυρηνικών ή σχετιζόμενων με τη μεμβράνη αντιγόνων. Πρόσφατες μελέτες για τον καρκίνο της ανθρώπινης ουροδόχου κύστης και το μελάνωμα εντόπισαν γενετικές υπογραφές που αντιστοιχούν σε κυτταροτοξικά CD{42}} Τ κύτταρα μεταξύ των TIL (14, 15). Λειτουργικά, αυτά τα κυτταροτοξικά CD4+ TILs είναι ικανά για άμεση αναγνώριση όγκων που εξαρτάται από το MHC-II, οδηγώντας τελικά σε λύση στόχου από τα granzymes με τρόπο παρόμοιο με τους αντίστοιχους CD{8+. Ωστόσο, η θεραπευτική μετάφραση αυτών των ευρημάτων μπορεί να περιοριστεί από το γεγονός ότι λίγοι συμπαγείς όγκοι εκφράζουν MHC-II. Πράγματι, τα αποτελέσματα 2 ανεξάρτητων μελετών πρότειναν ότι μόνο το ένα τρίτο περίπου των ασθενών με μελάνωμα έχουν κύτταρα όγκου MHC-II+ και η συχνότητα αυτών των κυττάρων εντός του όγκου είναι συχνά μικρότερη από 10% (15, 29). Αντίθετα, η κυρίαρχη κυτταρική πηγή του MHC-II στο μικροπεριβάλλον του όγκου φαίνεται να είναι τα διεισδυτικά λευκοκύτταρα (26).
Εικόνα 6. Τα καρκινικά κύτταρα MHC-II+ KRASG12V+ δεν παρουσιάζουν επίτοπους προερχόμενους από το KRASG12V στα CD4+ Τ κύτταρα. (ΕΝΑ)
Αν και ορισμένα κύτταρα στερεού όγκου εκφράζουν είτε συστατικό είτε επαγώγιμο MHC-II, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι παρά την παρουσία ειδικών για το ογκογονίδιο CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων μεταξύ TILs και PBMCs, αυτά τα κύτταρα δεν μπορούν να αναγνωρίσουν άμεσα και να λύσουν το αντιγόνο που εκφράζει MHC-II+ καρκινικά κύτταρα, ενώ επίτοποι από την ίδια πρωτεΐνη μπορεί να παρουσιαστούν αποτελεσματικά σε CD8+ Τ κύτταρα σε MHC-I (13). Αυτό υποδηλώνει ότι η απλή έκφραση ενός αντιγόνου στόχου μπορεί να μην είναι αρκετή για την αναγνώριση από τα CD{10}} Τ κύτταρα για την υποομάδα όγκων που εκφράζουν MHC-II. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα φαίνεται να είναι συνεπή σε πολλούς τύπους όγκων, επειδή οι κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνουν εκείνες που προέρχονται από HNSCC, αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και καρκίνο του παγκρέατος. Σε 2 μελέτες (30, 31) έχει αναφερθεί άμεση αναγνώριση CD{12}} Τ κυττάρων κυτταρικών σειρών μελανώματος που εκφράζουν το MHC-II φυσικά ή μετά από μεταγωγή με CIITA. Ωστόσο, και στις δύο αυτές μελέτες, ένα σημαντικό κλάσμα των TCR που δοκιμάστηκαν δεν αναγνώρισαν άμεσα καρκινικά κύτταρα. Δεν είναι σαφές εάν αυτοί οι TCR αντιπροσωπεύουν κλωνότυπους «παρευρισκόμενους» που δεν αναγνωρίζουν αντιγόνα όγκου ή ειδικούς για όγκο TCR που δεν είναι σε θέση να αναγνωρίσουν το συγγενές αντιγόνο τους λόγω ελλείψεων παρουσίασης αντιγόνου όπως αυτές που επισημαίνονται σε αυτή τη μελέτη. Oliveira et al. (31) απέδειξε ότι η άμεση αναγνώριση από τα CD{19}} Τ κύτταρα περιορίστηκε σε 2 μελανώματα με εξαιρετικά υψηλά φορτία μετάλλαξης όγκου, υποδηλώνοντας ότι αυτός ο φαινότυπος μπορεί να επιφέρει πρόσθετες απαραίτητες αλλαγές που επιτρέπουν την παρουσίαση αντιγόνων όγκου στο MHC-II. Αν και η προσάρτηση ενός MITD στο ανοσογονικό θραύσμα του KRASG12V δεν είχε ως αποτέλεσμα την άμεση αναγνώριση των κυττάρων όγκου από τα CD4+ Τ κύτταρα, οι μελέτες έχουν περιγράψει μια προκατάληψη για ενδογενή πεπτίδια που προέρχονται από πρωτεΐνες δεσμευμένες στη μεμβράνη που εκλούονται από MHC-II, πιθανώς λόγω ανακύκλωσης μεμβράνης (26, 32). Το αντιγόνο του μελανώματος Trp1 υπάρχει στην πλασματική μεμβράνη, το οποίο μπορεί να διευκολύνει την άμεση παρουσίαση σε CD4+ Τ κύτταρα από κύτταρα όγκου Β16 (33). Ένα άλλο αντιγόνο που σχετίζεται με το μελάνωμα, το gp100, παρουσιάζεται από κύτταρα όγκου στα CD{34}} Τ κύτταρα με τρόπο που εξαρτάται από τη διαμεμβρανική περιοχή του gp100 (34). Σε πρόσφατη εργασία που διερευνά τον ρόλο των ειδικών για νεοαντιγόνο CD4+ Τ κυττάρων σε ένα μοντέλο σαρκώματος ποντικού, επίτοποι που προέρχονται από μια μεταλλαγμένη υπομονάδα ιντεγκρίνης, επίσης μια πρωτεΐνη δεσμευμένη στη μεμβράνη, εκλούστηκαν από το MHC-II σε όγκο που μεταδόθηκε από CIITA κύτταρα (35). Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι παρόλο που οι πρωτεΐνες που συνδέονται με τη μεμβράνη μπορεί να διακινούνται κατά προτίμηση σε ενδοσώματα για άμεση παρουσίαση στο MHC-II, η παρουσία μιας ανοσογονικής μεμβρανικής πρωτεΐνης από μόνη της δεν είναι επαρκής για την προώθηση αυτής της παρουσίασης. Άλλες μη κλασικές οδοί παρουσίασης έχουν περιγραφεί που μπορεί να επιτρέψουν σε κυτταροπλασματικές ή πυρηνικές πρωτεΐνες πρόσβαση στο MHC-II, συμπεριλαμβανομένης της σχετιζόμενης με την αυτοφαγία παρουσίασης ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών και μεταφορέα που σχετίζεται με την επεξεργασία αντιγόνου – εξαρτώμενη από την παρουσίαση σε CD4+ Τ κύτταρα, με αποτέλεσμα αντιγονική Τα πεπτίδια πιθανώς μεταφέρονται από το MHC-I στο MHC-II κατά την ανακύκλωση της μεμβράνης (36, 37). Έχει αναφερθεί άμεση εξαρτώμενη από το MHC-II αναγνώριση αυτόλογων καρκινικών κυττάρων από CD4+ Τ κύτταρα ειδικά για επιτόπους Ε7 (38, 39). Ωστόσο, αυτές οι μελέτες αφορούσαν αμφότερες τις πρωτεΐνες Ε7 που εκφράζονται από λιγότερο διαδεδομένους ογκογόνους υποτύπους HPV (δηλαδή, HPV{-33 και HPV{-59) που παρουσιάζονται από καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας σε μόρια HLA-DR. Είναι, επομένως, πιθανό ο υποτύπος του HPV, η ιστολογία του όγκου και τα περιοριστικά αλληλόμορφα HLA να είναι επίσης σχετικοί παράγοντες στη διαφορική παρουσίαση των πυρηνικών αντιγόνων HPV στα καρκινικά κύτταρα MHC-II+. Αν και τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι η άμεση κυτταροτοξικότητα του όγκου δεν είναι ένας πιθανός μηχανισμός των ειδικών για E6- και KRASG12V CD{{4+ Τ κυττάρων, άλλοι αντικαρκινικοί μηχανισμοί των CD{4+ Τ κυττάρων έχουν περιγραφεί και Η θετική μεταφορά των ειδικών για τον όγκο CD4+ Τ κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο έχει δείξει αντικαρκινική δράση (7, 40, 41). Ως εκ τούτου, οι περιορισμένοι TCRs MHC-II, όπως αυτοί που προσδιορίζονται σε αυτή τη μελέτη, μπορεί να είναι χρήσιμοι για την ACT σε ασθενείς ανθρώπους, δεδομένης της στόχευσης τέτοιων TCR σε επιτόπους που προέρχονται από ογκοπρωτεΐνες οδηγούς περιορισμένες σε απλότυπους HLA που εκτιμώνται στο 1,27% και στο 16,10% του λευκού των ΗΠΑ. πληθυσμό, αντίστοιχα, για HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 και HLA-DRB5*01:01 (42). Συγκεκριμένα, τα CD{4+ Τ κύτταρα βοηθούν στην εκκίνηση των ειδικών για τον όγκο CD{8+ Τ κυττάρων αδειοδοτώντας τα DC που φέρουν αντιγόνο με τρόπο που εξαρτάται από το CD40L (43-45). Αποδεικνύουμε ότι ο ειδικός για το KRASG12V TCR που προσδιορίστηκε σε αυτή τη μελέτη αναγνωρίζει διασταυρούμενα αντιγόνα στο πλαίσιο των DCs, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα κύτταρα μπορεί να είναι σε θέση να συμβάλλουν στην αντικαρκινική ανοσία μέσω αυτής της λειτουργίας. Τα CD{100}} Τ κύτταρα μπορεί επίσης να παρέχουν τοπική βοήθεια για CD{101}} Τ κύτταρα εντός όγκων εκκρίνοντας κυτοκίνες όπως IL{102}} και IFN-, υποστηρίζοντας την επιβίωση των CD{104}} Τ κυττάρων και στρατολόγηση στον όγκο (46). Επιπλέον, τα CD{106}} TILs μπορεί να αναγνωρίζουν αντιγόνα στο μικροπεριβάλλον του όγκου σε μυελοειδή κύτταρα όπως τα μακροφάγα. Πράγματι, προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι απουσία MHC-II σε καρκινικά κύτταρα, τα μεταφερόμενα υιοθετητικά Trp1 CD{109}} Τ κύτταρα εξακολουθούν να μπορούν να ασκήσουν αντικαρκινική ανοσία εξαρτώμενη από την IFN- και να συσχετίζονται με αυξημένη κυτταροτοξική δραστηριότητα των μακροφάγων (47). Ωστόσο, αυτό το φαινόμενο φαίνεται να εξαρτάται από την έκκριση αντιγόνου όγκου, η οποία θα μπορούσαμε επίσης να υποθέσουμε ότι είναι ελάχιστη στην περίπτωση των περισσότερων ογκογονιδίων. Συνολικά, η μελέτη μας υπογραμμίζει την επιλεκτικότητα της άμεσης παρουσίασης ενδογενών αντιγόνων από καρκινικά κύτταρα MHC-II+ και καταδεικνύει ότι ούτε η έκφραση CIITA ούτε η παρουσία ενός δεσμευμένου στη μεμβράνη αντιγόνου επαρκούν από μόνα τους για να προάγουν την άμεση αναγνώριση καρκινικών κυττάρων από CD{{115} } Τ κύτταρα. Απαιτούνται περισσότερες μελέτες για να χαρακτηριστεί ποια αντιγόνα μπορούν να παρουσιαστούν απευθείας από τα καρκινικά κύτταρα MHC-II+ υπό ποιες συνθήκες για την πλήρη κατανόηση των εξαρτώμενων από το πλαίσιο ρόλους των CD{119}} Τ κυττάρων στον καρκίνο.
φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα
Μέθοδοι
Κυτταρικής καλλιέργειας. Τα TIL συλλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (48). Εν συντομία, ο πρωτοπαθής ιστός όγκου διαχωρίστηκε σε θραύσματα 2-3 mm, τα οποία τοποθετήθηκαν σε 24-πλάκα φρεατίου και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 1{{1{{02}}% ανθρώπινος ορός ΑΒ, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, HEPES, γενταμικίνη και 6,000 IU/mL IL-2. Τα εξαγγειωμένα TIL καλλιεργήθηκαν με αντικαταστάσεις μισού μέσου κάθε 2-3 ημέρες. Πρωτογενή ανθρώπινα Τ κύτταρα από περιφερικό αίμα καλλιεργήθηκαν σε μέσο 50:50 που αποτελείται από 50% AIM V συν 50% RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ανθρώπινο ορό ΑΒ, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (100 U/ mL έκαστο· Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7 και 5 ng/mL IL{-15. Οι κυτταρικές γραμμές όγκου που προέρχονται από τον ασθενή δημιουργήθηκαν και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (17). Εν συντομία, ο πρωτογενής ιστός όγκου κόπηκε σε θραύσματα μικρότερα από 2 mm και διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Τα καρκινικά κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε F-Media που περιείχε 5 μΜ αναστολέα Rho κινάσης και τοποθετήθηκαν σε πλάκα πάνω από ένα στρώμα ακτινοβολημένων ινοβλαστών 3T3 (30 Gy). Μετά την αρχική καλλιέργεια, τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε ένα μίγμα 3:1 ακτινοβολημένου 3Τ3-ρυθμισμένου μέσου και F-Media που περιείχε 5 μΜ αναστολέα Rho κινάσης. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T{46}CD40L και B-LCLs διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με l-γλουταμίνη και HEPES ( 10 mM, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM μη απαραίτητα αμινοξέα (Gibco, Thermo Fisher Scientific) και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (100 U/ mL το καθένα· Gibco). Διατηρήσαμε 293GP (ATCC) σε συμπλήρωμα μέσου DMEM με 10% FBS και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (100 U/mL το καθένα· Gibco, Thermo Fisher Scientific). Τα κύτταρα IHW03304, GM3107, KAS011, D8 και D66 ήταν δώρα από τον Alessandro Sette (Ινστιτούτο Ανοσολογίας La Jolla). Αναλύσεις ELISPOT. Τα TIL ή τα PBMC επιστρώθηκαν σε 100,000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες ELISPOT επικαλυμμένες με antiIFN– Abs (1-D1K, Mabtech). Τα κύτταρα επαναδιεγέρθηκαν με δεξαμενές πεπτιδίων HPV-16 E6 και E7 PepMix (JPT), δεξαμενές πεπτιδίων που αντιπροσωπεύουν επιλεγμένες ογκογόνες μεταλλάξεις ή υποδεικνύονται μεμονωμένα πεπτίδια στα 5 ug/mL για τις ομάδες ή 10 ug/mL για τα πεπτίδια για 22 ώρες πριν από την ανάπτυξη Πλάκες ELISPOT σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Mabtech). Για θετικό έλεγχο, χρησιμοποιήθηκαν 5 ug/mL φυτοαιμοσυγκολλητίνης-L. Ex vivo κουλτούρα επέκτασης. Τα PBMC επιστρώθηκαν με μια δεξαμενή πεπτιδίων που αντιπροσωπεύει επιλεγμένες ογκογόνες μεταλλάξεις στα 5 μg/mL. Φρέσκο μέσο που περιείχε 10 IU/mL IL-2 προστέθηκε τις ημέρες 4, 7 και 10. Την ημέρα 14, τα PBMCs επαναδιεγέρθηκαν για χρήση είτε σε ELISPOT είτε σε προσδιορισμούς έκκρισης κυτοκίνης. Αλληλουχία TCR. Τα TIL ή τα PBMC επαναδιεγέρθηκαν με 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) ή πεπτίδιο KRASG12V και τα κύτταρα που εκκρίνουν IFN επισημάνθηκαν με φθορισμό χρησιμοποιώντας το κιτ Human IFN-Secrection Assay σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Miltenyi) . Τα μεμονωμένα κύτταρα IFN- + ταξινομήθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού χρησιμοποιώντας ένα FACSAria (BD Biosciences) και το RNA-Seq πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Illumina Miseq για τον εντοπισμό ζευγαρωμένου TCR και αλυσίδων. Για την ταυτοποίηση του Ε{94}}ειδικού CD4+ κλώνου TCR, τα κύτταρα που εκκρίνουν IFN ταξινομήθηκαν όπως παραπάνω και οι αλληλουχίες TCR και TCR ενισχύθηκαν με ένθετη, πολυπλεγμένη PCR, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (49). Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν για προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger (ETON Biosciences). Για ανάλυση συχνότητας TCR, τα PBMC πριν και μετά από 14-ημέρα ex vivo επέκταση με υποδεικνυόμενα πεπτίδια στάλθηκαν στην Adaptive Biotechnologies. Ανάλυση έκφρασης HPV. Το RNA απομονώθηκε από Hu-56 πρωτογενή κύτταρα όγκου και κυτταρική γραμμή όγκου και υποβλήθηκε για μαζική RNA-Seq. Οι αναγνώσεις αλληλουχίας ζευγαρωμένου άκρου χαρτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας BWA (v0.7.12) (50) στο πλήρες γονιδίωμα του HPV (GenBank accession no. NC_001526.2) και στο αντίστοιχο μεταγραφικό του. Το αρχείο χάρτη στοίχισης ακολουθίας που προέκυψε μετατράπηκε σε ταξινομημένο δυαδικό χάρτη στοίχισης και ευρετηριάστηκε, ακολουθούμενο από καταμέτρηση αντιστοιχισμένων αναγνώσεων χρησιμοποιώντας το SAMtools (v1.2) (50). Ολόκληρη-εξωμική αλληλουχία. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας ολόκληρου εξώματος και η αλληλουχία RNA-Seq πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο La Jolla για την Ανοσολογική Αλληλουχία Πυρήνα χρησιμοποιώντας κιτ Agilent σύλληψης ολόκληρου εξώματος και κιτ Illumina, αντίστοιχα. Τα βιολογικά δείγματα FFPE διανεμήθηκαν από το Κέντρο Καρκίνου του Moores στο Tempus για αλληλούχιση επόμενης γενιάς μαζί με ταιριαστό DNA αναφοράς χρησιμοποιώντας δείγματα περιφερικού αίματος. Οι αναγνώσεις αλληλουχίας από την αλληλουχία εξώματος του όγκου και τα φυσιολογικά δείγματα ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς GRCh38 χρησιμοποιώντας SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Οι παραλλαγές Exome αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας SpeedSeq Somatic και οι παραλλαγές σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας SNPeff (v4.3i) (52). Τα δεδομένα αλληλουχίας RNA-Seq και ολόκληρων εξομών για αυτό το χειρόγραφο έχουν μεταφορτωθεί στο NCBI BioProject, με αριθμό πρόσβασης PRJNA924789. Ρετροϊική μεταγωγή Τ κυττάρων. Αλληλουχίες νουκλεοτιδίων TCR συντέθηκαν και κλωνοποιήθηκαν στη ραχοκοκαλιά του ρετροϊού MSGV1 χρησιμοποιώντας BioXP 3200 (Codex). Η αλληλουχία ήταν βελτιστοποιημένη με κωδικόνιο για έκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα. Οι σταθερές περιοχές του ανθρώπινου TCR ανταλλάχθηκαν με σταθερές περιοχές TCR ποντικού με υποκαταστάσεις για την ενίσχυση της έκφρασης της επιφάνειας και την προώθηση του προτιμησιακού ζευγαρώματος (53, 54). Τα ανθρώπινα PBMCs απομονώθηκαν από φλεγμονώδεις επιστρώσεις. Τα CD{131}} ή CD8+ Τ κύτταρα αφαιρέθηκαν με μαγνητική επιλογή και το αρνητικό κλάσμα που περιείχε όλα τα εναπομείναντα λεμφοκύτταρα καλλιεργήθηκε σε μέσο Τ κυττάρων με 50 ng/mL αντι-CD3 Ab (OKT3) για 2 ημέρες.
Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό
Τα υπερκείμενα ρετροϊικά TCR δημιουργήθηκαν με συνεπιμόλυνση κυττάρων 293GP με τον φορέα MSGV1 που περιέχει τη σχετική αλληλουχία TCR και το πλασμίδιο RD113. Δύο ημέρες μετά τη διαμόλυνση, τα υπερκείμενα ρετροϊού συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν είτε φρέσκα είτε κατεψυγμένα στους -80 βαθμούς. Οι μεταγωγές πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες επικαλυμμένες με RetroNectin (Takara), όπως περιγράφηκε προηγουμένως (5). Η έκφραση σταθερής περιοχής TCR ποντικού αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα μεταγωγής. Τα Τ-λεμφοκύτταρα που κατασκευάστηκαν με TCR χρησιμοποιήθηκαν όχι νωρίτερα από την ημέρα 7 μετά την αρχική διέγερση. Λειτουργικές δοκιμασίες Τ κυττάρων. Συγκαλλιεργήσαμε 5 × 104 TILs, μετατραπέντα Τ κύτταρα ή κύτταρα J76 Jurkat με 1 × 105 B-LCL που παλμώθηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας με ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις πεπτιδίου ή 5 × 103 καρκινικά κύτταρα που σπάρθηκαν την προηγούμενη ημέρα στο {{16} }πλάκες με κάτω ή με επίπεδο πυθμένα, αντίστοιχα. Όπου ενδείκνυται, αντι-CD28 αγωνιστής (κλώνος CD28.2, BioLegend) ή αντι-PD-L1 αποκλεισμού (κλώνος 29E.2A3, BioLegend) προστέθηκαν σε συνκαλλιέργειες Τ-λεμφοκυττάρων και κυττάρων όγκου στα 5 και 10 ug/mL, αντίστοιχα. Για προσδιορισμούς κυτοκίνης και δεικτών ενεργοποίησης, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας 1 × κοκτέιλ ενεργοποίησης κυττάρων (BioLegend) που περιέχει PMA και ιονομυκίνη. Για μελέτες αποκλεισμού HLA, 20 ug/mL από τα ακόλουθα Abs προστέθηκαν σε B-LCL με παλμό πεπτιδίου τουλάχιστον 2 ώρες πριν από την προσθήκη των Τ κυττάρων: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend) ή έλεγχος ισοτύπου IgG2a ποντικιού (MOPC-173, BioLegend). Όπου υποδεικνύεται, τα κύτταρα όγκου καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες με 10 ng/mL ανασυνδυασμένης ΙΡΝ- πριν από την προσθήκη Τ κυττάρων. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από 18-24 ώρες, η IFN- μετρήθηκε με ELISA (Thermo Fisher Scientific) και τα κυτταρικά σφαιρίδια χρωματίστηκαν για κυτταρομετρία ροής. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κυτταροτοξικότητας με συγκαλλιέργεια Τ κυττάρων με καρκινικά κύτταρα σε ενδεικνυόμενες αναλογίες τελεστή προς στόχο. Εν συντομία, 5 χ 103 καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα πριν από την προσθήκη Τ κυττάρων στις υποδεικνυόμενες αναλογίες. Η λύση των κυττάρων-στόχων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον αναλυτή κυττάρου σε πραγματικό χρόνο xCELLigence (ACEA Biosciences), ο οποίος αξιολογούσε την ηλεκτρική σύνθετη αντίσταση λόγω της προσκόλλησης των κυττάρων κάθε 30 λεπτά μέχρι το τέλος του πειράματος. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού xCELLigence RTCA και τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως κανονικοποιημένος δείκτης κυττάρων σε 1 τη στιγμή που προστέθηκαν Τ κύτταρα. Δοκιμασία παρουσίασης MHC-II. Συνθετικά κατασκευάσματα DNA που κωδικοποιούν τα ακόλουθα δημιουργήθηκαν και κλωνοποιήθηκαν σε MSGV1 χρησιμοποιώντας ένα BioXP 3200 (Codex): τα Ν-τερματικά 25 αμινοξέα του ανθρώπινου γονιδίου HLA-B, ακολουθούμενα από τα πρώτα 50 αμινοξέα του HPV-16 E6 ή 25 αμινοξέα του KRASG12V συντηγμένα με τα καρβοξυτελικά 55 αμινοξέα του ανθρώπινου HLA-B, ενός στοιχείου αυτοδιάσπασης Τ2Α και της κωδικεύουσας αλληλουχίας του EGFP. Τα ιικά υπερκείμενα δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και τα αυτόλογα B-LCL μετατράπηκαν σε πλάκες επικαλυμμένες με RetroNectin μετά από ολονύκτια διέγερση σε ένα στρώμα ακτινοβολημένων (0,5 Gy) 3Τ3 κυττάρων που εκφράζουν ανθρώπινο CD40L (3T3-CD40L). Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής εκτιμήθηκε με ποσοτικοποίηση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης EGFP. Τα μετατραπέντα B-LCL διεγέρθηκαν με 3Τ3-CD40L παρουσία 200 IU/mL ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-4 (PeproTech) για 2 διαδοχικούς γύρους 2-3 ημερών πριν από τη συγκαλλιέργεια με αυτόλογα TIL. Δημιουργία DCs για προσδιορισμούς παρουσίασης αντιγόνου. Τα DC δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο πλαστικής προσκόλλησης. Τα κατεψυγμένα PBMC αποψύχθηκαν και επιστρώθηκαν σε μέσο DC (RPMI-1640 συμπληρωμένο με 1-γλουταμίνη, 5% απενεργοποιημένο με θερμότητα ανθρώπινο ορό ΑΒ και 100 U/mL κάθε πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη) για 2 ώρες στους 37 βαθμούς. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με πλύσιμο με ζεστό PBS και τα προσκολλημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DC συμπληρωμένο με 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) και 500 U/mL IL-4 (PeproTech) για 6 ημέρες . Προσθέσαμε 1 ug/mL πεπτιδίου KRASG12V ή 20 ug/mL πρωτεΐνης KRASG12V ή WT KRAS (Abcam) απευθείας σε ανώριμα DCs όλη τη νύχτα. Την επόμενη μέρα, τα DC συλλέχθηκαν και συγκαλλιεργήθηκαν με Τ-λεμφοκύτταρα κατασκευασμένα με TCR σε αναλογία 1:1 κατά τη διάρκεια της νύχτας προτού αξιολογηθεί η ανοδική ρύθμιση του CD137 με κυτταρομετρία ροής. Ρετροϊική μεταγωγή κυττάρων όγκου. Η κωδικεύουσα αλληλουχία του ανθρώπινου CIITA συντέθηκε (Integrated DNA Technologies) και κλωνοποιήθηκε σε MSGV1 από την Gibson Assembly. Οι κωδικεύουσες αλληλουχίες του HLADRB5*01:01 και οι αλυσίδες που διαχωρίζονται από μια αλληλουχία Ρ2Α συντέθηκαν (Integrated DNA Technologies) και κλωνοποιήθηκαν σε έναν τροποποιημένο φακοϊικό φορέα pHAGE ανάντη μιας ακολουθίας Τ2Α ακολουθούμενη από μια περικομμένη ακολουθία αναφοράς CD34 από Gibson Assembly. Τα υπερκείμενα ρετροϊικά δημιουργήθηκαν με MSGV1, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα υπερκείμενα των φακοϊών δημιουργήθηκαν με συνεπιμόλυνση κυττάρων 293Τ με πλασμίδια pHAGE, tat, rev, gag/pol και vsv-g. Τα υπερκείμενα του ιού συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα και συμπυκνώθηκαν με φυγοκέντρηση σε σωλήνες Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Τα καρκινικά κύτταρα επιστρώθηκαν και, 1 ημέρα αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με υπερκείμενο ρετροϊού ή φακοϊού συμπληρωμένο με 10 μg/mL πολυβρενίου. Τέσσερις ώρες αργότερα, το υπερκείμενο που περιείχε ιό αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με ένα μέσο καλλιέργειας. Τα καρκινικά κύτταρα MHC-II+ και CD34+ ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν διαλογέα κυττάρων FACS Fusion (BD Biosciences). Κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα επισημάνθηκαν με συζευγμένα με φθοριόχρωμα μονοκλωνικά Abs στα ακόλουθα αντιγόνα: αντι-ανθρώπινο CD3-PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) και TCR -APC αντι–ποντικιού (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Τα νεκρά κύτταρα χρωματίστηκαν είτε με DAPI είτε με LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–Το τετραμερές PE συναρμολογήθηκε και επισημάνθηκε από το NIH Tetramer Core Facility. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 1 ug/mL τετραμερούς για 1 ώρα σε πάγο. Διεξήχθη χρώση Ab για επιφανειακά αντιγόνα για 15 λεπτά σε πάγο. Για την ενδοκυτταρική χρώση κυτοκινών (ICS), τα Τ κύτταρα συγκαλλιεργήθηκαν με APC με παλμικό πεπτίδιο για 4-6 ώρες παρουσία Brefeldin A. Τα κύτταρα διαπερατοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για ενδοκυτταρικές κυτοκίνες με το κιτ Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) μετά από χρώση επιφάνειας , σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα ακόλουθα συζευγμένα με φθορόχρωμα Abs χρησιμοποιήθηκαν για χρώση με κυτοκίνη: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF-–BV785 (Mab11 , BioLegend) και Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCelesta (BD Biosciences) και αναλύθηκαν με το λογισμικό FlowJo v10.7. Στατιστική. Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές αναλύσεις με Prism 8 (GraphPad Software). Για συγκρίσεις ICS, χρησιμοποιήθηκε ένα μη ζευγαρωμένο 2-τεστ ουράς t. Για τη σύγκριση της καταστολής της σηματοδότησης Τ-κυττάρων που προκαλείται από τον αποκλεισμό HLA Ab–Ab, χρησιμοποιήθηκε ένας τρόπος ANOVA 2-. P < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό. Έγκριση μελέτης. Τα ταυτοποιημένα ανθρώπινα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν κατόπιν ενημέρωσης μέσω του πρωτοκόλλου UCSD IRB 101391CX, "Tumor Environment Phenotyping and Cell Isolation". Τα άτομα στη μελέτη παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση.
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Hanahan D, Weinberg RA. Χαρακτηριστικά του καρκίνου: η επόμενη γενιά. Κύτταρο. 2011; 144(5):646–674.
2. Shamseddine AA, et al. Ανοσία όγκου και ανοσοθεραπεία για καρκίνους που σχετίζονται με τον HPV. Cancer Discov. 2021, 11(8):1896–1912.
3. Simanshu DK, et al. Κορυφαία ανασκόπηση των πρωτεϊνών RAS και των ρυθμιστών τους σε ανθρώπινες ασθένειες. Κύτταρο. 2017; 170 (1): 17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Ένα απροσδόκητα μεγάλο πολυκλωνικό ρεπερτόριο Τ-λεμφοκυττάρων ειδικών για τον HPV είναι έτοιμο για δράση σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.
5. Stevanović S, et al. Τοπίο ανοσογόνων καρκινικών αντιγόνων σε επιτυχημένη ανοσοθεραπεία επιθηλιακού καρκίνου που προκαλείται από ιούς. Επιστήμη. 2017;356(6334):200–205.
6. Bhatt KH, et al. Το προφίλ των ειδικών αποκρίσεων των Τ-κυττάρων του HPV{1}} αποκαλύπτει ευρεία αντιδραστικότητα αντιγόνου σε ασθενείς με στοματοφαρυγγικό καρκίνο. J Εχρ Med. 2020;217(10):e20200389.
7. Veatch JR, et al. Ειδικά για BRAF V600E CD{4}} Τ κύτταρα που διεισδύουν στον όγκο συσχετίζονται με την πλήρη κλινική ανταπόκριση στο μελάνωμα. J Clin Invest. 2018; 128 (4): 1563–1568.
8. Veatch JR, et al. Τα ενδογενή CD4+ Τ κύτταρα αναγνωρίζουν νεοαντιγόνα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων επαναλαμβανόμενων ογκογόνων μεταλλάξεων οδηγών KRAS και ERBB2 (Her2). Cancer Immunol Res. 2019; 2(13):910–922.
9. Cafri G, et al. Τ κύτταρα μνήμης που στοχεύουν ογκογενείς μεταλλάξεις που ανιχνεύονται στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του επιθηλίου. Nat Commun. 2019; 10 (1): 449.
10. Tran Ε, et αϊ. Θεραπεία μεταφοράς Τ-κυττάρων που στοχεύει το μεταλλαγμένο KRAS στον καρκίνο. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.
11. Draper LM, et al. Στόχευση των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων HPV-16+ από Τ-κύτταρα που έχουν δημιουργηθεί με γονίδιο TCR που στρέφονται κατά του Ε6. Clin Cancer Res. 2015; 21(19):4431–4439.
12. Jin BY, et al. Τα κατασκευασμένα Τ κύτταρα που στοχεύουν το Ε7 μεσολαβούν στην υποχώρηση των καρκίνων του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων σε ένα μοντέλο ποντικού. JCI Insight. 2018; 3(8): e99488.
13. Bear AS, et al. Ο βιοχημικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός των μεταλλαγμένων επιτόπων KRAS επικυρώνει αυτή την ογκοπρωτεΐνη για ανοσολογική στόχευση. Nat Commun. 2021; 12(1):4365.
14. Oh DY, et al. Τα ενδοκαρκινικά CD4+ Τ κύτταρα μεσολαβούν στην αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης στον άνθρωπο. Κύτταρο. 2020;181(7):1612–1625.
15. Cachot Α, et al. Τα ειδικά για τον όγκο κυτταρολυτικά CD4 Τ κύτταρα μεσολαβούν στην προστατευτική ανοσία έναντι του ανθρώπινου καρκίνου. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.
16. Doran SL, et al. Γονιδιακή θεραπεία υποδοχέα Τ-κυττάρων για επιθηλιακούς καρκίνους που σχετίζονται με τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων: μια μελέτη πρώτης στον άνθρωπο, φάσης Ι/ΙΙ. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.
17. Liu X, et αϊ. Επαναπρογραμματισμός υπό όρους και μακροχρόνια επέκταση φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων από ανθρώπινα βιοδείγματα. Nat Protoc. 2017, 12 (2): 439–451.
18. Veatch JR, et al. Τα νεοαντιγόνα-ειδικά CD4+ Τ κύτταρα στο ανθρώπινο μελάνωμα έχουν διαφορετικές καταστάσεις διαφοροποίησης και συσχετίζονται με τη λειτουργία των CD8+ Τ κυττάρων, των μακροφάγων και των Β κυττάρων. Καρκινικό Κύτταρο. 2022; 40 (4): 393-409.
19. Lowery FJ, et al. Μοριακές υπογραφές αντικαρκινικών νεοαντιγόνων αντιδρώντων Τ κυττάρων από μεταστατικούς ανθρώπινους καρκίνους. Επιστήμη. 2022;375(6583):877–884.
20. Kreiter S, et al. Αυξήθηκε η αποτελεσματικότητα παρουσίασης αντιγόνου με τη σύζευξη αντιγόνων με σήματα διακίνησης MHC κατηγορίας Ι. J Immunol. 2008; 180 (1): 309–318.
21. Zaretsky JM, et al. Μεταλλάξεις που σχετίζονται με επίκτητη αντίσταση στον αποκλεισμό της PD-1 στο μελάνωμα. N Engl J Med. 2016; 375(9):819–829.
22. Gros A, et al. Αναγνώριση ανθρώπινων νεοαντιγόνων καρκίνου του γαστρεντερικού από κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα PD-1+. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.
23. Scholtalbers J, et al. TCLP: ένας διαδικτυακός κατάλογος καρκινικών κυτταρικών γραμμών που ενσωματώνει τύπο HLA, προβλεπόμενους νεο-επιτόπους, ιούς και γονιδιακή έκφραση. Genome Med. 2015; 7 (1): 118.
24. Juneja V, Choi J, inventors; BioNTech US Inc., εκδοχέας. Κατασκευές υποδοχέα Τ κυττάρων και χρήσεις αυτών. Ευρεσιτεχνία ΗΠΑ Αρ. US202103040215A1. 4 Νοεμβρίου 2021.
25. Sharpe AH, Pauken KE. Οι ποικίλες λειτουργίες της ανασταλτικής οδού PD1. Nat Rev Immunol. 2018; 18 (3): 153–167.
26. Abelin JG, et al. Ο καθορισμός κανόνων επεξεργασίας και δέσμευσης συνδέτη HLA-II με φασματομετρία μάζας ενισχύει την πρόβλεψη του επιτόπου του καρκίνου. Ασυλία, ανοσία. 2019; 51 (4): 766–779.
27. Silvius JR, et al. Το K-ras4B και οι πρενυλιωμένες πρωτεΐνες που δεν έχουν «δεύτερα σήματα» συνδέονται δυναμικά με τις κυτταρικές μεμβράνες. ΜοΙ Biol Cell. 2006;17(1):192–202.
28. Chang CH, Flavell RA. Ο μεταενεργοποιητής κατηγορίας II ρυθμίζει την έκφραση πολλαπλών γονιδίων που εμπλέκονται στην παρουσίαση αντιγόνου. J Εχρ Med. 1995, 181(2):765–767.
29. Rodig SJ, et al. Οι πρωτεΐνες MHC προσδίδουν διαφορική ευαισθησία στον αποκλεισμό CTLA{-4 και PD-1 σε μη θεραπευμένο μεταστατικό μελάνωμα. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.
30. Ahmadzadeh M, et al. Τα ανθρώπινα ρυθμιστικά Τ κύτταρα CD4+ που διεισδύουν στον όγκο εμφανίζουν ένα ξεχωριστό ρεπερτόριο TCR και παρουσιάζουν αντιδραστικότητα όγκου και νεοαντιγόνου. Sci Immunol. 2019; 4(31):eaao4310.
31. Oliveira G, et al. Το τοπίο των βοηθητικών και ρυθμιστικών αντικαρκινικών CD4+ Τ κυττάρων στο μελάνωμα. Φύση. 2022;605(7910):532–538.
32. Rock KL, et al. Παρουσιασου! Με μόρια MHC κατηγορίας I και MHC τάξης II. Trends Immunol. 2016; 37 (11): 724–737.
33. Takechi Y, et al. Μια πρωτεΐνη μελανοσωμικής μεμβράνης είναι ένας στόχος κυτταρικής επιφάνειας για θεραπεία μελανώματος. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.
34. Lepage S, Lapointe R. Οι μελανοσωμικές αλληλουχίες στόχευσης από το gp100 είναι απαραίτητες για την παρουσίαση ενδογενούς επιτόπου περιορισμένης από MHC κατηγορίας II και την κινητοποίηση σε ενδοσωματικά διαμερίσματα. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.
35. Alspach Ε, et αϊ. Τα νεοαντιγόνα MHC-II διαμορφώνουν την ανοσία του όγκου και την απόκριση στην ανοσοθεραπεία. Φύση. 2019;574(7780):696–701.
36. Dengjel J, et al. Η αυτοφαγία προάγει την παρουσίαση πεπτιδίων MHC τάξης II από πρωτεΐνες ενδοκυτταρικής πηγής. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.
37. Matsuzaki J, et al. Απαιτούνται μη κλασσικές οδοί επεξεργασίας αντιγόνου για περιορισμένη από MHC τάξης ΙΙ άμεση αναγνώριση όγκου από NY-ESO-1- ειδικά CD4+ Τ κύτταρα. Cancer Immunol Res. 2009; 2 (4): 341-350.
38. Höhn Η, et al. Τα CD{1}} λεμφοκύτταρα διείσδυσης όγκου στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας αναγνωρίζουν πεπτίδια περιορισμένα σε HLA-DR που παρέχονται από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων-Ε7. J Immunol. 1999, 163(10):5715–5722.
39. Höhn Η, et al. Πεπτίδια ιού ανθρωπίνων θηλωμάτων τύπου 33 Ε7 που παρουσιάζονται από το HLA-DR*0402 σε Τ κύτταρα που διεισδύουν στον όγκο στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.
40. Lu YC, et αϊ. Θεραπεία ασθενών με μεταστατικό καρκίνο με χρήση ενός μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας κατηγορίας ΙΙ-περιορισμένου υποδοχέα Τ-κυττάρων που στοχεύει το αντιγόνο βλαστικής σειράς του καρκίνου MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017; 35 (29): 3322–3329.
41. Tran Ε, et αϊ. Ανοσοθεραπεία καρκίνου βασισμένη σε ειδικά για μετάλλαξη CD4+ Τ κύτταρα σε ασθενή με επιθηλιακό καρκίνο. Επιστήμη. 2014;344(6184):641–645.
42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Ενημερωμένη βάση δεδομένων καθαρής συχνότητας αλληλόμορφων (AFND) 2020: ταξινόμηση δεδομένων χρυσού προτύπου, δεδομένα γονότυπου ανοιχτής πρόσβασης και νέα εργαλεία ερωτημάτων. Nucleic Acids Res. 2020;48(d1): D783–D788.
43. Schoenberger SP, et al. Η βοήθεια των Τ-κυττάρων για τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα διαμεσολαβείται από τις αλληλεπιδράσεις του CD40-CD40L. Φύση. 1998;393(6684):480-483.
44. Ahrends Τ, et al. Τα CD{1}} Τ κύτταρα βοηθούν στη δημιουργία ενός προγράμματος κυτταροτοξικών τελεστών Τ-λεμφοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης της ρύθμισης του συνανασταλτικού υποδοχέα και της αυξημένης διεισδυτικότητας των ιστών. Ασυλία, ανοσία. 2017;47(5):848–861.
45. Ferris ST, et al. Τα cDC1 prime και έχουν άδεια από CD4+ Τ κύτταρα για να επάγουν αντικαρκινική ανοσία. Φύση. 2020;584(7822):624–629.
46. Bos R, Sherman LA. Απαιτείται βοήθεια CD{1}} Τ-κυττάρων στο περιβάλλον του όγκου για τη στρατολόγηση και την κυτταρολυτική λειτουργία των CD8+ Τ λεμφοκυττάρων. Cancer Res. 2010; 70 (21): 8368–8377.
47. Haabeth OAW, et al. Η απόρριψη με τη μεσολάβηση CD{1}} κυττάρων όγκου θετικών MHC τάξης II εξαρτάται από την έκκριση αντιγόνου και την έμμεση παρουσίαση στα APCs του ξενιστή. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.
48. Dudley ME, et al. Δημιουργία καλλιεργειών λεμφοκυττάρων που διεισδύουν στον όγκο για χρήση στη θεραπεία μεταβίβασης υιοθέτησης για ασθενείς με μελάνωμα. J Immunother. 2003, 26(4):332–342.
49. Dash P, et al. Ανάλυση ενός κυττάρου του ρεπερτορίου υποδοχέων Τ-κυττάρων. Μέθοδοι ΜοΙ ΒίοΙ. 2015; 1343:181–197.
50. Li Η, et αϊ. Η στοίχιση ακολουθίας/μορφή χάρτη και τα εργαλεία SAM. Βιοπληροφορική. 2009;25(16):2078–2079.
51. Chiang C, et al. SpeedSeq: εξαιρετικά γρήγορη ανάλυση και ερμηνεία προσωπικού γονιδιώματος. Μέθοδοι Nat. 2015; 12 (10): 966–968.
52. Cingolani Ρ, et al. Ένα πρόγραμμα για τον σχολιασμό και την πρόβλεψη των επιπτώσεων των πολυμορφισμών ενός νουκλεοτιδίου, SnpEff: SNPs στο γονιδίωμα του στελέχους Drosophila melanogaster w1118; iso-2; iso-3. Fly (Όστιν). 2012; 6 (2): 80–92.
53. Haga-Friedman Α, et al. Η ενσωμάτωση διαμεμβρανικών υδρόφοβων μεταλλάξεων στο TCR ενισχύει την επιφανειακή του έκφραση και τη λειτουργική απληστία των Τ κυττάρων. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.
54. Cohen CJ, et al. Ενισχυμένη αντικαρκινική δραστηριότητα των Τ κυττάρων που έχουν κατασκευαστεί για να εκφράζουν υποδοχείς Τ-κυττάρων με δεύτερο δισουλφιδικό δεσμό. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.
