Συγκέντρωση μεταγραφών και ανακάλυψη γονιδίου του σαρκώδους στελέχους Cistanche Deserticola-Ⅰ

Φόντο

Το Cistanche deserticola είναι ένα εντελώς μη φωτοσυνθετικό παρασιτικό φυτό με μεγάλη φαρμακευτική αξία και διανέμεται κυρίως στην έρημο της βορειοδυτικής Κίνας. Το αποξηραμένο σαρκώδες στέλεχος του είναι ένα κρίσιμο τονωτικόπαραδοσιακή κινεζική ιατρικήμε ρόλο κυρίως βελτίωσης της ανδρικής σεξουαλικής λειτουργίας και ενίσχυσης της ανοσίας, αλλά λίγες μηχανιστικές μελέτες έχουν διεξαχθεί εν μέρει λόγω της έλλειψης γονιδιωματικών και μεταγραφικών πόρων.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΚΙΝΕΖΙΚΗ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Αποτελέσματα

Σε αυτήν τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε αλληλουχία βαθιάς μεταγραφής στο σαρκώδες στέλεχος του C. deserticola και δημιουργήθηκαν περίπου 80 εκατομμύρια αναγνώσεις χρησιμοποιώντας αλληλουχία άκρου ζεύγους Illumina στην πλατφόρμα HiSeq2000. Χρησιμοποιώντας τον συναρμολογητή τριάδας, λάβαμε 95.787 αλληλουχίες μεταγραφής με μήκη μεταγραφής που κυμαίνονται από 200 bp έως 15.698 bp, με μέσο μήκος 950 βάσεων και μήκος N50 1.519 βάσεων. 63.957 μεταγραφές ταυτοποιήθηκαν ως ενεργά εκφρασμένες με FPKM Μεγαλύτερο ή ίσο με 0,5, όπου 30.098 μεταγραφές σχολιάστηκαν με περιγραφές γονιδίων ή όρους γονιδιακής οντολογίας με αναλύσεις ομοιότητας αλληλουχίας έναντι πολλών δημόσιων βάσεων δεδομένων (Uniprot, NR και Nt στο NCGBI, και KEG) . Επιπλέον, εντοπίσαμε βασικά ενζυμικά γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της λιγνίνης και των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών (PhGs) που είναι γνωστό ότι είναι τα κύρια δραστικά συστατικά. Τέσσερα γονίδια αμμωνίας-λυάσης φαινυλαλανίνης (PAL), το πρώτο ένζυμο κλειδί στη βιοσύνθεση λιγνίνης και PhG ταυτοποιήθηκαν με βάση τη σύγκριση αλληλουχιών και τη φυλογενετική ανάλυση. Δύο μονοπάτια βιοσύνθεσης των PhGs προτάθηκαν επίσης για πρώτη φορά.

συμπεράσματα

Συνολικά, ολοκληρώσαμε μια συνολική ανάλυση του μεταγραφώματος σαρκώδους στελέχους C. deserticola χρησιμοποιώντας τεχνολογία RNA-seq. Μια συλλογή ενζυμικών γονιδίων που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση της λιγνίνης και των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών ταυτοποιήθηκε από τα συγκεντρωμένα και σχολιασμένα μεταγραφήματα και προβλέφθηκε επίσης η οικογένεια γονιδίων του PAL. Τα δεδομένα αλληλουχίας από αυτή τη μελέτη θα παρέχουν μια πολύτιμη πηγή για τη διεξαγωγή μελλοντικής έρευνας βιοσύνθεσης φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών και λειτουργικών γονιδιωματικών μελετών σε αυτό το σημαντικό φαρμακευτικό φυτό.

Εισαγωγή

Το C. deserticola είναι ένα παγκόσμιο γένος πολυετών φυτών της ερήμου από την οικογένεια Orobanchaceae και είναι ένα εντελώς μη φωτοσυνθετικό είδος και συνήθως αναπτύσσεται υπόγεια ολοπαρασιτικό φυτό. Παρασιτεί στις ρίζες του ψαμμόφυτου Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), το οποίο κατοικεί κυρίως σε ερήμους και ημιερήμους λόγω της υψηλής ανοχής του στην ξηρασία και την αλατότητα. Το C. deserticola παρουσιάζει ισχυρή αντοχή στις σκληρές περιβαλλοντικές συνθήκες και διανέμεται κυρίως στη βορειοδυτική Κίνα, ιδιαίτερα στην Εσωτερική Μογγολία, το Gansu και το Xinjiang. Θεωρείται άγριο είδος υπό εξαφάνιση τα τελευταία χρόνια λόγω της αυξημένης κατανάλωσης από τον άνθρωπο. Το C. deserticola, το οποίο συχνά αποκαλείται τζίνσενγκ της ερήμου, είναι κοινώς γνωστό ως έρημο-σκουπόκαμπο και το αποξηραμένο σαρκώδες στέλεχος έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως παραδοσιακά σημαντικό τονωτικό στην Κίνα και την Ιαπωνία εδώ και πολλά χρόνια. Καταγράφηκε αρχικά στο Shen Nong Ben Cao Jing (Dictionary of Chinese Materia Medica, 1977) περίπου πριν από 1800 χρόνια και θεωρήθηκε ως μία από τις κύριες πηγές τουΚινεζικό φαρμακευτικό βότανο Cistanche.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Τα εκχυλίσματα του C. deserticola διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα φαρμακευτικών λειτουργιών, ειδικά για χρήση στη βελτίωση της σεξουαλικής λειτουργίας, τονωτικό των νεφρών, την προστασία του ήπατος, τη δραστικότητα του περιβάλλοντος, την ενίσχυση της μνήμης, την ανοσοτροποποιητική, αντιοξειδωτική δράση, την αντιφλεγμονώδη, αντιική δράση κ.λπ. κύρια βιοδραστικά συστατικά του C. deserticola είναι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PheGs, PhGs). Μέχρι σήμερα, περισσότεροι από 20 φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες έχουν απομονωθεί από το χυμώδες στέλεχος του C.deserticola. Ανάμεσά τους,ακτεοσίδη και εχινακοσίδηαποτελούν δύο κύρια συστατικά με σημαντικές φαρμακολογικές δραστηριότητες και τεκμηριώνονται ως τα πρότυπα ποιότητας του C. deserticola στην κινεζική φαρμακοποιία (εκδόσεις 2005 και 2010). Τρία χημικά συστατικά των PhGs είναι το οργανικό οξύ, ο σακχαρίτης και το φαινυλαιθανοειδές, ωστόσο, οι λεπτομέρειες σχετικά με τις βιοσυνθετικές οδούς φαινυλαιθανοειδών παραμένουν ελάχιστα κατανοητές στο C.deserticola.

Παρά την εμπορική και φαρμακευτική σημασία του C.deserticola, τα γονιδιωματικά και μεταγραφικά δεδομένα αυτού του είδους είναι πολύ περιορισμένα. Δεν υπάρχουν διαθέσιμα EST στη βάση δεδομένων NCBI και οι πλήρεις πληροφορίες γονιδιώματος για αυτό το είδος δεν είναι διαθέσιμες εκτός από την αλληλουχία γονιδιώματος του χλωροπλάστη. Τα περιορισμένα μεταγραφικά δεδομένα εμποδίζουν τη μελέτη των βιοσυνθετικών μηχανισμών PhG. Η τεχνολογία RNA-seq μπορεί να δημιουργήσει αλληλουχίες των εκφραζόμενων τμημάτων του στοχευόμενου γονιδιώματος και να αναγνωρίσει γονίδια [18] χρησιμοποιώντας τις πλατφόρμες τεχνολογίας NGS (όπως Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq και Roche 454). Γίνεται ολοένα και πιο δημοφιλές στη συναρμολόγηση μεταγραφής de novo, καθώς είναι μια οικονομικά αποδοτική και ισχυρή προσέγγιση με υψηλή ανάλυση και ευρύ δυναμικό εύρος, ειδικά επειδή έχει το πλεονέκτημα να εξερευνά μεταγραφές χαμηλής αφθονίας. Λόγω των διαφόρων πλεονεκτημάτων, το RNA-seq είναι ειδικά ελκυστικό για οργανισμούς που δεν αποτελούν πρότυπο με περιορισμένους γενετικούς πόρους. Ωστόσο, δεν υπάρχει λεπτομερής έρευνα για το μεταγραφικό C. deserticola από RNA-seq.

Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε την αλληλουχία του στελέχους για το C. deserticola χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina Hiseq2000 και λάβαμε ακατέργαστα δεδομένα 7,9 G. Με τη συναρμολόγηση και τον σχολιασμό, εξορύξαμε τα γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση του PhG και τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για ολόκληρη τη βιοσύνθεση λιγνίνης. Η ανάλυση αλληλουχίας RNA δημιούργησε το πρώτο μεταγραφικό συναινετικό C. deserticola και παρείχε νέες ιδέες για μια ολοκληρωμένη κατανόηση της φαρμακευτικής αξίας του C. deserticola. Επιπλέον, η μέθοδος που περιγράφεται εδώ μπορεί να εφαρμοστεί ευρέως σε μεταγραφικά προφίλ για να διευκολυνθεί η ανακάλυψη γονιδίων που εμπλέκονται σε συγκεκριμένες οδούς βιοσύνθεσης φαρμακευτικών συστατικών σε άλλο φαρμακευτικό φυτό με πολύ περιορισμένους γονιδιωματικούς πόρους.

Υλικά και Μέθοδοι

Συλλογή φυτικού υλικού

Το φρέσκο ​​χυμώδες στέλεχος για το C. deserticola στο στάδιο της ανασκαφής συλλέχθηκε από μια φυτική βάση στην πόλη BayanHot της Alxa League στην Εσωτερική Μογγολία στη βορειοδυτική Κίνα. Η άδεια συλλογής ελήφθη από τον ιδιοκτήτη (HongKui CongRong Group) της βάσης του εργοστασίου. Το δείγμα του κουπονιού κατατέθηκε στο Core Genomic Facility στο Ινστιτούτο Γονιδιωματικής του Πεκίνου, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Μετά τον καθαρισμό, οι χυμώδεις ιστοί βλαστών κόπηκαν σε μικρά κομμάτια και καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία.

Εκχύλιση RNA, κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA και αλληλουχία Illumina

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από το χυμώδες στέλεχος χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZol (Invitrogen Inc., Καλιφόρνια, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα που προέκυψαν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase I για να αφαιρεθεί οποιοδήποτε γονιδιωματικό DNA. Τα εκχυλισμένα RNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν βιοαναλυτή Agilent 21{00 (Agilent Technologies) και ελέγχθηκαν για ακεραιότητα χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση μετουσιωτικής γέλης αγαρόζης με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Σε επόμενες αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν δείγματα RNA με αναλογίες A260/A280 μεταξύ 1,9 και 2,1, αναλογίες RNA 28S:18S υψηλότερες από 1,0 και αριθμούς ακεραιότητας RNA (RINs) -8.5.

Οι βιβλιοθήκες RNA-seq δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ προετοιμασίας δειγμάτων RNA Illumina Truseq. Το Poly(A)+ RNA απομονώθηκε από το συνολικό RNA χρησιμοποιώντας σφαιρίδια Dynal ligo(dT)25 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τον καθαρισμό, προστέθηκε ένα ρυθμιστικό θραυσματοποίησης για να σπάσει το mRNA σε μικρά θραύσματα. Ο πρώτος κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας αυτά τα σύντομα θραύσματα ως εκμαγεία, μαζί με την αντίστροφη μεταγραφάση SuperScript III και τον εκκινητή τυχαίου εξαμερούς N6. Στη συνέχεια συντέθηκε cDNA δεύτερης έλικος χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα, dNTPs, RNaseH και DNA πολυμεράση Ι. Το δίκλωνο cDNA που προέκυψε υποβλήθηκε σε τελική επισκευή χρησιμοποιώντας πολυμεράση DNA Τ4, θραύσμα Klenow πολυμεράσης Ι DNA και κινάση πολυνουκλεοτιδίου Τ4 και απολινώθηκε σε προσαρμογείς που χρησιμοποιούν Τ4 DNA λιγάση. Τα συνδεδεμένα με προσαρμογέα θραύσματα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ εκχύλισης QiaQuick PCR και εκλούστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα ΕΒ. Μετά από ανάλυση χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, επιλέχθηκαν κατάλληλα θραύσματα ως εκμαγεία για ενίσχυση PCR. Η αλληλούχιση της προκύπτουσας βιβλιοθήκης cDNA πραγματοποιήθηκε με ένα σύστημα Illumina HiSeq 2000.

Μεταγραφές de novo συγκρότηση και ποσοτικοποίηση γονιδιακής έκφρασης

Οι ακατέργαστες αναγνώσεις που δημιουργήθηκαν από την αλληλουχία καθαρίστηκαν αφαιρώντας τις ακολουθίες προσαρμογέα (ATCTCGTATGCCGTC) χρησιμοποιώντας μια εσωτερική μέθοδο. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια αυστηρή διαδικασία φιλτραρίσματος χαμηλής ποιότητας. Πρώτον, οι βάσεις με βαθμολογία ποιότητας phred χαμηλότερη από 20 θα περικόπτονταν από το 3'άκρο της ακολουθίας, μέχρι να εκτελεστούν σε μία βάση με υψηλότερη ποιότητα (Μεγαλύτερη ή ίση με 20). Εάν το μήκος ανάγνωσης ήταν μικρότερο από 50 bp, θα απορριφόταν. Δεύτερον, οι αναγνώσεις θα φιλτράρονται περαιτέρω με το κριτήριο ότι το 70% των βάσεων σε μία ανάγνωση έχουν βαθμολογίες υψηλής ποιότητας (Μεγαλύτερες ή ίσες με 20). Τρίτον, χρησιμοποιήθηκαν μόνο αναγνώσεις ζευγαρωμένου άκρου για περαιτέρω συναρμολόγηση. Η συναρμολόγηση μεταγραφής de novo πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την έκδοση Trinity_20130216 [30] που αποτελούνταν από τρεις διαδοχικές ενότητες λογισμικού: Inchworm, Chrysalis και Butterfly. Οι παράμετροι συναρμολόγησης ορίστηκαν ως εξής:-seqType fq-JM 300G -min_contig_length 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20.

Για να ποσοτικοποιηθεί η αφθονία των μεταγραφών, οι αναγνώσεις άκρου ζεύγους με την ακολουθία ευθυγραμμίστηκαν εκ νέου με τις συγκεντρωμένες μεταγραφές χρησιμοποιώντας ένα σενάριο στο Trinity. Οι χαρτογραφημένες αναγνώσεις χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτικοποίηση με λογισμικό RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization). Η αφθονία γονιδίων ή ισομορφών αντιπροσωπεύτηκε από το θραύσμα ανά κιλοβάση μεταγραφής ανά εκατομμύριο χαρτογραφημένο θραύσμα (FPKM), αυτά τα μεταγραφήματα με τιμή FPKM ίση ή μεγαλύτερη από 0.05 ορίστηκαν όπως εκφράστηκαν.

Λειτουργικός σχολιασμός εκφρασμένων μεταγραφών

Δεν υπάρχουν σύνολα σχολιασμών γονιδίων του C. deserticola εκτός από το γονιδίωμα του χλωροπλάστη [1]. Σημειώσαμε τις εκφρασμένες μεταγραφές συγκρίνοντάς τις με τα ενημερωμένα σύνολα δεδομένων Genbank Nt, Genbank Nr και TAIR10_ pep_20101214_χωριστά χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα BLAST (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

Γονιδιακή οντολογία και σχολιασμός διαδρομής KEGG Με ευθυγράμμιση ομοιότητας ακολουθίας με τη βάση δεδομένων Uniprot ( ο σχολιασμός Gene Ontology (GO) όλων των συγκεντρωμένων μεταγραφών λήφθηκε χρησιμοποιώντας ένα αρχείο συσχέτισης που λήφθηκε από (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/ βάσεις δεδομένων/GO/goa/UNIPROT/gene_συσχέτιση goa_uniprot.gz όρων GO πραγματοποιήθηκε με τη χρήση προσαρμοσμένων σεναρίων και σχολιάσαμε τα γονίδια στο τέταρτο επίπεδο. Κατηγορίες CC, BP ​​και MF ξεχωριστά.

Οι πληροφορίες της διαδρομής KEGG εκχωρήθηκαν για όλες τις προβλεπόμενες αλληλουχίες πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Οι αλληλουχίες σε μορφή fasta υποβλήθηκαν στο αίτημα KAAS και λήφθηκαν τα αρχεία που προέκυψαν από όλες τις πληροφορίες οδών που σχετίζονται με το μεταγραφικό στέλεχος του C. deserticola. 13 σύνολα δεδομένων γονιδίων φυτικών οργανισμών στο KEGG χρησιμοποιήθηκαν για σχολιασμό χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BBH (αμφίδρομη καλύτερη επιτυχία).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ανάλυση RT-qPCR

Μετά την πέψη με DNase I, περίπου 5 ug ολικού RNA μετατράπηκαν σε cDNA πρώτης έλικος μέσω της αντίδρασης ανάστροφης μεταγραφής με εκκινητές ολίγο(dT)15 και σύστημα αντίστροφης μεταγραφής GoScript (Promega). Τα προϊόντα cDNA στη συνέχεια αραιώθηκαν 10- φορές με απιονισμένο νερό χωρίς νουκλεάση πριν χρησιμοποιηθούν ως πρότυπο σε PCR πραγματικού χρόνου. Συγκεκριμένα cDNA ενισχύθηκαν με το σύστημα GoTaq 2-Step RT-qPCR (Promega) σε όγκο 20 ul. Η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε στη θερμοκρασία ανόπτησης των 60 μοιρών με το 7500 Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι σχετικές αφθονίες μεταγραφής υπολογίστηκαν με τη μέθοδο του συγκριτικού ορίου κύκλου με το γονίδιο "comp10579_c0" ως εσωτερικό πρότυπο, χρησιμοποιώντας το λογισμικό 7500 Manager.

Τα ζεύγη εκκινητών για RT-PCR σχεδιάστηκαν με βάση το διαδικτυακό λογισμικό (http://primer3.ut.ee/) και παρατίθενται στο σύνολο δεδομένων S1.

Αποτελέσματα

Αλληλουχία RNA και de novo συγκρότηση μεταγραφώματος σαρκώδους μίσχου C. deserticola

Το στέλεχος του C. deserticola έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως παραδοσιακά σημαντικό τονωτικό στην Κίνα και την Ιαπωνία εδώ και πολλά χρόνια. Για να αποκτήσουμε μια συνολική επισκόπηση της γονιδιακής έκφρασης στο σαρκώδες στέλεχος C. deserticola, συλλέξαμε δείγματα στελέχους C. deserticola της ίδιας φυτικής βάσης το 2013 και το 2014, αντίστοιχα. Τα συνολικά RNA εκχυλίστηκαν και τα πολυΑ+ RNA καθαρίστηκαν για την κατασκευή βιβλιοθηκών αλληλουχίας RNA ζευγαρωμένου άκρου. 79,433,734 και 86,019,176 αναγνώσεις άκρου ζεύγους που αντιστοιχούν σε σχεδόν 8 δισεκατομμύρια και 8,6 δισεκατομμύρια βάσεις της ακολουθίας ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την αλληλουχία Illumina HiSeq 2000

πλατφόρμα σε δείγματα 2013-έτους και 2014-έτους (Πίνακας 1). Μετά την αφαίρεση των ακολουθιών προσαρμογέων και το φιλτράρισμα αναγνώσεων χαμηλής ποιότητας (δείτε λεπτομέρειες στις Μέθοδοι), χρησιμοποιήθηκαν 64.831.040 αναγνώσεις άκρου ζεύγους υψηλής ποιότητας στο δείγμα έτους 2013- για τη de novo συναρμολόγηση μεταγραφομένων. Χρησιμοποιώντας τον συναρμολογητή αλληλουχίας Trinity [30], δημιουργήθηκαν 51.719 γονίδια και 95.787 αλληλουχίες μεταγραφής με μήκη μεταγραφής που κυμαίνονται από 200 bp έως 15.698 bp. Το μέσο μήκος των συναρμολογημένων μεταγραφών είναι 950 βάσεις και το μήκος N50 είναι 1.519 βάσεις. Ο αριθμός των μεταγραφών σε διαφορετικά μήκη αποκάλυψε ότι το 57,32% των συναρμολογημένων μεταγραφών ήταν περίπου 500 bp ή μεγαλύτερες (Σχήμα 1Α). Οι αναγνώσεις τέλους ζεύγους υψηλής ποιότητας στο 2014-δείγμα έτους αντιστοιχίστηκαν στο συγκεντρωμένο μεταγραφικό. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο αριθμός μεταγραφής για κάθε συναρμολογημένο γονίδιο διέφερε και το 69% των γονιδίων με μία εκφρασμένη ισομορφή ενώ το 31% των γονιδίων εξέφραζε δύο ή περισσότερα μεταγραφήματα (Σχήμα 1Β).

Ποσοτικοποίηση έκφρασης και λειτουργικός σχολιασμός συγκεντρωμένων μεταγραφών

Η αφθονία γονιδίου ή μεταγραφήματος ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο RSEM, στο οποίο οι αναγνώσεις αλληλουχίας ευθυγραμμίστηκαν εκ νέου με τα συναρμολογημένα γονίδια ή τις αλληλουχίες μεταγραφής χρησιμοποιώντας Bowtie, και αυτές οι χαρτογραφημένες αναγνώσεις χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτικοποίηση. Η τιμή FPKM για κάθε γονίδιο ή μεταγραφή υπολογίστηκε και τελικά, εντοπίσαμε 63.957 και 52.857 ενεργά εκφρασμένα μεταγραφήματα (τιμή FPKM μεγαλύτερη από ή ίση με 0.5) σε δείγματα σαρκώδους μίσχου C. deserticola σε 2{{17} }13 και 2014, αντίστοιχα. 44.776 μεταγραφές (70,01% στο 2013-δείγμα έτους, 84,71% στο δείγμα 2014-έτος) εκφράστηκαν συνήθως στα δύο αντίγραφα και η συσχέτιση (συντελεστής συσχέτισης Pearson: 0,91979) των δεδομένων έκφρασής τους ήταν φαίνεται στο S1 Σχ. Τα ακατέργαστα δεδομένα αλληλουχίας είχαν μεταφορτωθεί στη βάση δεδομένων NCBI SRA (αριθμοί πρόσβασης: SRX857402 και SRX858938). Χρησιμοποιήσαμε εκφρασμένα γονίδια που ταυτοποιήθηκαν στο δείγμα 2013-έτους για περαιτέρω ανάλυση. Οι πληροφορίες λειτουργικού σχολιασμού για όλες τις εκφρασμένες μεταγραφές ελήφθησαν χρησιμοποιώντας δύο μεθόδους. Πρώτον, όλα τα εκφρασμένα μεταγραφήματα ευθυγραμμίστηκαν με γνωστές βάσεις δεδομένων νουκλεοτιδίων (GenBank nt) και πεπτιδικών αλληλουχιών (GenBank nr και πεπτίδιο Arabidopsis) χωριστά με τον αλγόριθμο BLAST. Από 63.957 εκφρασμένες μεταγραφές,

29.220 (45,7%) σχολιάστηκαν και έδειξαν ομολογία με αλληλουχίες σε οποιαδήποτε από τις τρεις θεματικές βάσεις δεδομένων με αποκοπή τιμής E 1e-20. Εν τω μεταξύ, οι υποψήφιες περιοχές κωδικοποίησης για όλες τις εκφρασμένες αλληλουχίες μεταγραφής προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό TransDecoder και τα μεγαλύτερα ORF για κάθε μεταγραφή χρησιμοποιήθηκαν για την αναζήτηση τομέα Pfam. Ως αποτέλεσμα, 21.358 (33,4%) μεταγραφές σχολιάστηκαν με βάση τη βάση δεδομένων Pfam. Συνολικά, 30.098 (47,1%) μεταγραφές αντιστοιχίστηκαν σημαντικά με γνωστά γονίδια στις δημόσιες βάσεις δεδομένων συνδυάζοντας τις δύο παραπάνω μεθόδους. Η πλήρης λίστα εκφρασμένων μεταγραφών με σχολιασμό συνάρτησης εμφανίστηκε σε συμπληρωματικά δεδομένα (S2 Dataset).

Ερευνήσαμε τις κορυφαίες 20 πιο εκφρασμένες μεταγραφές (Πίνακας 2) που αντιστοιχούν στο 18,99% όλων των αναγνώσεων αλληλουχίας και βρήκαμε ότι τα περισσότερα από αυτά είναι γονίδια που ανταποκρίνονται σε αβιοτικά

ερέθισμα στρες. Η δευδρίνη (DHNs), μια κατηγορία υδρόφιλων και θερμοσταθερών πρωτεϊνών στρες με υψηλό αριθμό φορτισμένων αμινοξέων που ανήκουν στην οικογένεια άφθονης όψιμης εμβρυογένεσης της ομάδας II (LEA), είναι το πιο εκφρασμένο γονίδιο. Τρεις διαφορετικές μεταγραφές Dehyrin (comp28713_c0_seq1/2/4) ανιχνεύθηκαν ως εξαιρετικά εκφρασμένες σε σαρκώδεις μίσχους που μπορεί να εμπλέκονται στην προστασία των κυττάρων από τη βλάβη που προκαλείται από το στρες ξηρασίας. Άλλα γονίδια που σχετίζονται με το στρες, όπως η πρωτεΐνη θερμικού σοκ, η πρωτεΐνη που σχετίζεται με το παθογόνο και η μεταλλοθειονεΐνη, βρέθηκαν επίσης εκφρασμένα σε μεγάλο βαθμό, γεγονός που μπορεί να σχετίζεται με το σοβαρό περιβάλλον επιβίωσής της. Επιπλέον, ορισμένα ιδιοσυστατικά γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του 26S ριβοσωμικού γονιδίου RNA (comp22329_c2_seq1), της πρωτεΐνης κατασταλμένης με αυξίνη/ σχετιζόμενης με τον λήθαργο (comp20999_c0_seq1), Ο παράγοντας ριβοζυλίωσης ADP (σύμ20499_ γ0_ακολουθία 1) είχε επίσης μεγάλη μεταγραφή.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%