Η θρομβομοντουλίνη ρυθμίζεται προς τα πάνω στους νεφρούς των γυναικών με προεκλαμψία

edmund.chen@wecistanche.com

Η ενδοθηλιακή γλυκοπρωτεΐνη θρομβομοντουλίνη ρυθμίζει την πήξη, την αγγειακή φλεγμονή και την απόπτωση. Στονεφρό, η θρομβομοντουλίνη προστατεύει το φράγμα της σπειραματικής διήθησης προκαλώντας αλληλεπιδράσεις μεταξύ του σπειραματικού ενδοθηλίου και των ποδοκυττάρων. Αρκετές σπειραματικές παθολογίες χαρακτηρίζονται από απώλεια σπειραματικής θρομβομοντουλίνης. Σε γυναίκες με προεκλαμψία, τα επίπεδα της διαλυτής θρομβομοντουλίνης στον ορό είναι αυξημένα, αντανακλώντας πιθανώς απώλεια από το σπειραματικό ενδοθήλιο. Ξεκινήσαμε να διερευνήσουμε εάν η έκφραση θρομβομοντουλίνης μειώνεται στους νεφρούς των γυναικών με προεκλαμψία και των αρουραίων που εκτέθηκαν σε έναν αναστολέα αγγειογένεσης. Η έκφραση θρομβομοντουλίνης εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και qPCR στονεφρώνιστοί αυτοψίας συλλέχθηκαν από 11 προεκλαμπτικές γυναίκες, 22 έγκυες γυναίκες ελέγχου και 11 υπερτασικές μη έγκυες γυναίκες. Περαιτέρω,νεφράαπό αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις sunitinib ή sunitinib σε συνδυασμό με ανταγωνιστές υποδοχέα ενδοθηλίνης μελετήθηκαν. Τα επίπεδα σπειραματικής πρωτεΐνης θρομβομοντουλίνης αυξήθηκαν στονεφράγυναικών με προεκλαμψία. Παράλληλα, σε αρουραίους που εκτέθηκαν σε sunitinib, η σπειραματική θρομβομοντουλίνη ρυθμίστηκε προς τα πάνω με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και η ανοδική ρύθμιση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης προηγήθηκε της έναρξης των ιστοπαθολογικών αλλαγών. Ο εκλεκτικός αποκλεισμός ETAR, αλλά όχι ο διπλός αποκλεισμός ETA/BR, ομαλοποίησε την επαγόμενη από το sunitinib αύξηση στην έκφραση της θρομβομοντουλίνης και τη λευκωματουρία. Προτείνουμε ότι η έκφραση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης αυξάνεται σε πρώιμο στάδιονεφρική βλάβηπου προκαλείται από αντιαγγειογενετικές συνθήκες. Η ανοδική ρύθμιση αυτής της νεφροπροστατευτικής πρωτεΐνης στα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί να χρησιμεύσει ως μηχανισμός για την προστασία του φραγμού σπειραματικής διήθησης στην προεκλαμψία.

Λέξεις-κλειδιά;νεφρική ανεπάρκεια; νεφρό; νεφρική βλάβη? Νεφρική δυσλειτουργία; νεφρικοί ιστοί? νεφρών

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

Η προεκλαμψία επηρεάζει το 3-5 τοις εκατό των εγκύων γυναικών και αποτελεί σημαντική αιτία μητρικής και νεογνικής νοσηρότητας και θνησιμότητας1. Η προεκλαμψία χαρακτηρίζεται από δυσλειτουργία του πλακούντα και παραγωγή πλακούντα αρκετών αντιαγγειογενετικών και προφλεγμονωδών παραγόντων (π.χ. διαλυτή Flt-1, διαλυτή ενδογλίνη και TNF-alpha), οι οποίοι συμβάλλουν στη συστηματική ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, σε αύξηση της αγγειακής αντίστασης , και επιπλοκές σε πολλαπλά όργανα2. ονεφρόπροσβάλλεται συχνά σε γυναίκες με προεκλαμψία, με συμπτώματα που κυμαίνονται από ήπια πρωτεϊνουρία έως πρωτεϊνουρία νεφρωσικού εύρους καινεφρική ανεπάρκειασε μεταγενέστερα στάδια της νόσου3. Οι παθολογικές αλλαγές στονεφράΟι γυναίκες με προεκλαμψία χαρακτηρίζονται από ενδοθηλίνες, εξάλειψη της διαδικασίας του ποδοκυττάρου και απώλεια ποδοκυττάρων4,5. Τι οδηγεί αυτές τις παθολογικές αλλαγές δεν είναι πλήρως κατανοητό.Νεφρική δυσλειτουργίαστην προεκλαμψία πιθανότατα προκαλείται από διαταραχή των οδών σηματοδότησης που εμπλέκονται στη διατήρηση του φραγμού σπειραματικής διήθησης6. Για παράδειγμα, τα αυξημένα επίπεδα του διαλυτού αντιαγγειογόνου παράγοντα Flt-1 οδηγούν σε εξασθενημένη σηματοδότηση του VEGF στο σπείραμα, με αποτέλεσμα τη διαταραχή του φραγμού σπειραματικής διήθησης, πρωτεϊνουρία και σπειραματική ενδοθηλίωση7,8. Σύμφωνα με αυτά, φάρμακα που αναστέλλουν την αγγειογενετική σηματοδότηση όπως το sunitinib σχετίζονται με ανεπιθύμητες ενέργειες που μιμούνται την προεκλαμψίανεφρόφαινότυπος 9. Ένας άλλος σημαντικός μεσολαβητής υπέρτασης καινεφρική βλάβηστην προεκλαμψία και την αναστολή του VEGF είναι το σύστημα ενδοθηλίνης10. Η ενδοθηλίνη είναι ένας ισχυρός αγγειοσυσταλτικός παράγοντας που παράγεται από ενδοθηλιακά κύτταρα που σηματοδοτούν μέσω του τύπου ενδοθηλίνης

Ένας υποδοχέας (ETAR) στα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα, με αποτέλεσμα αγγειοσυστολή11. Αντίθετα, η σηματοδότηση ενδοθηλίνης μέσω του υποδοχέα ενδοθηλίνης τύπου Β (ETBR) έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου και προστακυκλίνης που προάγουν την αγγειοδιαστολή11,12. Ο αποκλεισμός του ETR, και ειδικότερα ο εκλεκτικός ανταγωνισμός του ETAR, μειώνει αποτελεσματικά την αρτηριακή πίεση και την πρωτεϊνουρία σε μοντέλα τρωκτικών με προεκλαμψία και αναστολή του VEGF13. Ομοίως, πρόσφατα δείξαμε ότι ο επιλεκτικός αποκλεισμός ETAR σώζει τουςνεφρώνφαινότυπος αρουραίων που εκτέθηκαν σε αναστολή VEGF14. Η θρομβομοντουλίνη είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που εκφράζεται κυρίως από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και είναι ένα συστατικό της ενδοθηλιακής επιφάνειας glycocalyx15. Η θρομβομοντουλίνη διατηρεί την αγγειακή ομοιόσταση ρυθμίζοντας την πήξη, τη φλεγμονή και την απόπτωση15,16. Σε γυναίκες με προεκλαμψία, έχουν αναφερθεί αυξημένα επίπεδα διαλυτής θρομβομοντουλίνης στον ορό17, τα οποία πιθανότατα αντανακλούν την αυξημένη διάσπαση της εκτομοτομής της θρομβομοντουλίνης από το ενδοθήλιο18. Η θρομβομοντουλίνη παίζει κεντρικό ρόλο στη διατήρηση του φραγμού σπειραματικού πτωχεύματος σε διαβητικά ποντίκια: η διαταραγμένη σηματοδότηση της θρομβομονδουλίνης οδηγεί σε αυξημένη απόπτωση των σπειραματικών ενδοθηλιακών κυττάρων και των ποδοκυττάρων και αυξημένη ενεργοποίηση του σπειραματικού συμπληρώματος, με αποτέλεσμα επιδεινωμένη πρωτεϊνουρία και σπειραματική Έτσι, η θρομβομοντουλίνη έχει σημαντικές κυτταροπροστατευτικές επιδράσεις στο φράγμα σπειραματικής διόγκωσης και η διαταραχή της σηματοδότησης της θρομβομοντουλίνης μπορεί να εμπλέκεται σεΝεφρική Νόσοςστην προεκλαμψία. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε εάν η έκφραση της θρομβομοντουλίνης είναι μειωμένη στονεφράγυναικών με προεκλαμψία και σε μοντέλο αναστολής του VEGF σε αρουραίους. Επιπλέον, διερευνήσαμε το ρόλο του συστήματος ενδοθηλίνης στην έκφραση νεφρικής θρομβομοντουλίνης σε αυτό το μοντέλο αρουραίου χρησιμοποιώντας έναν εκλεκτικό ανταγωνιστή ETAR και έναν διπλό ανταγωνιστή ETA/BR.

Μέθοδοι

Υλικό ασθενούς. Η κοόρτη νεφρικής αυτοψίας που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη έχει περιγραφεί προηγουμένως (βλέπε:21). Εν ολίγοις, διενεργήθηκε πανελλαδική έρευνα στο Ολλανδικό Παθολογικό Μητρώο (PALGA) για τη συλλογήνεφρικούς ιστούςαπό ασθενείς που ήταν έγκυες και είχαν επιβεβαιωμένα περιστατικά προεκλαμψίας. Επιπλέον, συμπεριλήφθηκαν δύο ομάδες ελέγχου: (1) έγκυες γυναίκες χωρίς υπερτασική διαταραχή πριν ή κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και (2) νεαρές μη έγκυες γυναίκες με ιατρικό ιστορικό χρόνιας υπέρτασης. Τα δεδομένα παθολογίας συνδέθηκαν με τα αρχεία της Εθνικής Επιτροπής Μητρικής Θνησιμότητας της Ολλανδικής Εταιρείας Μαιευτικής. Η προεκλαμψία ορίστηκε με βάση τα διαγνωστικά κριτήρια της International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy (ISSHP)22. Ενσωματωμένο σε παραφίνηνεφρόδείγματα από 11 γυναίκες με προεκλαμψία, 22 εγκύους μάρτυρες με φυσιολογική πίεση και 11 μη έγκυες υπερτασικές μάρτυρες ήταν διαθέσιμα για αυτή τη μελέτη. Όλα τα δείγματα αυτοψίας κωδικοποιήθηκαν και στη συνέχεια χειρίστηκαν και αναλύθηκαν ανώνυμα σύμφωνα με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας της Ολλανδίας (Code for Proper Secondary Use of Human Tissue, Dutch Federation of Medical Scientific Societies). Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Ιατρικού Κέντρου του Leiden University (αριθμός άδειας P12.107).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ

Αρουραίοι. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Οδηγίας 2010/63/ΕΕ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του νόμου περί πειραμάτων στα ζώα της Ολλανδίας, μετά από έγκριση από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Ιατρικού Κέντρου Eras mus (αριθμός άδειας 118-16-01). Αρσενικοί αρουραίοι Wistar Kyoto (WKY, 280–300 g) ελήφθησαν σε ηλικία 10 εβδομάδων. Τα ζώα στεγάστηκαν σε πειραματικό δωμάτιο με θερμοκρασία 21-22 βαθμούς και κύκλο φωτός/σκότους 12- ωρών. Τα ζώα είχαν πρόσβαση σε τυπική εργαστηριακή τροφή για αρουραίους και νερό κατά βούληση. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά πειράματα, με λεπτομερείς μεθόδους και τον φαινότυπο αυτών των ζώων που δημοσιεύθηκαν προηγουμένως14,23. Εν συντομία, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές δόσεις sunitinib με ή χωρίς ανταγωνιστές ETR για 8 ημέρες. Η αρτηριακή πίεση της αορτής μετρήθηκε με ραδιοτηλεμετρία. Πριν και μετά τη χορήγηση της θεραπείας(ών), οι αρουραίοι στεγάστηκαν σε μεταβολικούς κλωβούς για 48 ώρες. Η πρώτη ημέρα χρησιμοποιήθηκε για εγκλιματισμό και η δεύτερη για τη συλλογή 24-ωρών δειγμάτων ούρων. Στην πρώτη μελέτη, οι αρουραίοι τυχαιοποιήθηκαν να λάβουν χαμηλή, ενδιάμεση ή υψηλή δόση sunitinib (7, 14 ή 26,7 mg/kg/ημέρα po sunitinib-L-malate (Sutent, Pfizer), αντίστοιχα) ή φορέα για 8 ημέρες . Στο τέλος του πειράματος, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία με 60 mg/kg πεντοβαρβιτάλης ενδοπεριτοναϊκά και αφαίμαξη μέσω παρακέντησης της κοιλιακής φλέβας23. Στη δεύτερη μελέτη, στους αρουραίους χορηγήθηκε φορέας ή η ενδιάμεση δόση sunitinib (14 mg/kg/ημέρα po) μόνη της ή σε συνδυασμό με macitentan (διπλός ανταγωνιστής ETA/BR, 100 mg/kg/ημέρα po) ή σιταξεντάνη (εκλεκτική ETAR). ανταγωνιστής, 30 ή 100 mg/kg/ημέρα po). Στο τέλος του πειράματος, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία μέσω υπερβολικής δόσης αναισθησίας Forane (ισοφλουρανίου) και αφαίμαξης μέσω παρακέντησης της κοιλιακής φλέβας14. Και στις δύο μελέτες, μετά την ευθανασία, ηνεφράαποκόπηκαν ταχέως για μεταγενέστερες αναλύσεις.

Ιστολογία νεφρού.Οι τομές νεφρών αξιολογήθηκαν τυφλά από παθολόγο για την παρουσία ή την απουσία διόγκωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων, διόγκωσης επιθηλιακών κυττάρων, ισχαιμίας και ενδοεπιθηλιακής πρωτεΐνης. Για την ηλεκτρονική μικροσκοπία εξετάστηκαν δύο σπειράματα, μελετήθηκε η παρουσία σπειραματικών ενδοθηλινών και η μορφολογία των ποδοκυττάρων. Ιστοπαθολογικά ευρήματα σε ανθρώπους και ζώα που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις sunitinib έχουν δημοσιευτεί στο παρελθόν21,23.

Ανοσοϊστοχημεία.Τα τμήματα νεφρών αποπαραφινώθηκαν. Η ανάκτηση αντιγόνου που προκαλείται από τη θερμότητα διεξήχθη χρησιμοποιώντας ρυθμιστικά διαλύματα κιτρικού (αντισώματος κατά ανθρώπινης θρομβομοντουλίνης) ή Tris/EDTA (αντισώματα θρομβομοντουλίνης και αντι-ETAR κατά αρουραίου). Η υπεροξειδάση αποκλείστηκε σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου για 20 λεπτά.Νεφρότα δείγματα επωάστηκαν με μια μονοκλωνική αντι-ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη ποντικού (1:200, Leica Biosystems, Danvers), μια μονόκλωνη θρομβομονδουλίνη κουνελιού κατά ποντικού/ποντικού (1:2000, Abcam) ή ένα πολυκλωνικό αντι-ETAR κουνελιού (1:700, αντίσωμα Invitrogen, Carlsbad) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η δέσμευση του πρωτογενούς αντισώματος οπτικοποιήθηκε με σημασμένο με υπεροξειδάση πολυμερές αντι-ποντικού ή επισημασμένο κατά κουνελιού (Dako, Δανία) και διαμινοβενζιδίνη ως χρωμογόνο.

Ανάλυση χρώσης.Η χρώση θρομβομοντουλίνης και ETAR βαθμολογήθηκε από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές τυφλούς σε σχέση με την κλινική διάγνωση και θεραπεία (CCLA και MB). Είκοσι πέντε τυχαία επιλεγμένα σπειράματα ανά δείγμα βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ημιποσοτική κλίμακα ως εξής: 0, απουσία; 1,<10% glomerular="" staining;="" 2,="" 10–49%="" glomerular="" staining;="" 3,="" 50–90%="" of="" glomerular="" staining;="" and="" 4,="">90 τοις εκατό της σπειραματικής χρώσης. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των διαφορετικών βαθμολογιών φαίνονται στα συμπληρωματικά σχήματα S1, S2, S3. Η συμφωνία μεταξύ των παρατηρητών ήταν ελάχιστα επαρκής σε όλα τα πειράματα βαθμολόγησης (κ Μεγαλύτερη ή ίση με 0,5). Όταν οι παρατηρητές βαθμολόγησαν διαφορετικά τα σπειράματα, επιτεύχθηκε η συναίνεση.

qPCR.Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR για να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση mRNA της θρομβομοντουλίνης και του ET AR. Το RNA απομονώθηκε με αντιδραστήριο TRIzol (Life Technologies, San Francisco, CA, USA). Η σύνθεση του cDNA πραγματοποιήθηκε με αντίστροφη μεταγραφάση AMV (Roche, Basel, Switzerland) και η ποσοτική PCR SYBR Green πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, CA, USA). Οι αλληλουχίες εκκινητών περιγράφονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Η έκφραση μετρήθηκε με τη μέθοδο του συγκριτικού κύκλου κατωφλίου και κανονικοποιήθηκε στην έκφραση της φωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης της υποξανθίνης. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση καμπύλης τήξης για να επαληθευτεί η ειδικότητα της εφαρμογής.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΡΥΣΗ

Στατιστική ανάλυση.Η παραλλαγή μεταξύ των παρατηρητών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη στατιστική κάπα. Τα κανονικά κατανεμημένα συνεχή δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη λιγότερο σημαντική διαφορά post-hoc τεστ για τις προγραμματισμένες συγκρίσεις ομάδων ανά ζεύγη. Για την ανάλυση των διαφορών στις βαθμολογίες έκφρασης σπειραματικής θρομβομοντουλίνης μεταξύ των ομάδων στη κοόρτη αυτοψίας, χρησιμοποιήθηκε η τακτική λογιστική παλινδρόμηση για ομαδοποιημένα δεδομένα με γενικευμένες εξισώσεις εκτίμησης (GEE). Για την ανάλυση πιθανών συσχετίσεων μεταξύ της έκφρασης της θρομβομοντουλίνης και των ιστοπαθολογικών ή κλινικών ευρημάτων, χρησιμοποιήθηκε η συσχέτιση Pearson. Τα σχήματα των καμπυλών απόκρισης θρομβομοντουλίνης και ET AR στο εύρος δόσης του sunitinib εξετάστηκαν μέσω γραμμών παλινδρόμησης. Π<0.05 was="" considered="" statistically="" signifcant.="" unless="" stated="" otherwise,="" summary="" data="" in="" the="" figures="" are="" reported="" as="" the="">

Αποτελέσματα Η σπειραματική θρομβομοντουλίνη είναι αυξημένη στους νεφρούς των γυναικών με προεκλαμψία. Η χρώση με θρομβομοντουλίνη αναλύθηκε σε δείγματα νεφρών από 11 γυναίκες με προεκλαμψία,22 έγκυες μάρτυρες με φυσιολογική πίεση και 11 μη έγκυες υπερτασικές μάρτυρες. Οι υπερτασικοί μάρτυρες ήταν μεγαλύτεροι σε ηλικία από τις γυναίκες των άλλων 2 ομάδων μελέτης. Σε σύγκριση με τις έγκυες γυναίκες ελέγχου, οι προεκλαμπτικές γυναίκες είχαν μεγαλύτερη διάρκεια κύησης και υψηλότερη αρτηριακή πίεση (Συμπληρωματικός Πίνακας S2). Ανεξάρτητα από την παρουσία θρομβομοντουλίνης στο σπείραμα, η θρομβομοντουλίνη ήταν παρούσα στα περισωληνάρια τριχοειδή αγγεία σε όλα τα δείγματα που μελετήθηκαν (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Στα σπειράματα, η έκφραση θρομβομοντουλίνης φαινόταν να προέρχεται από τον αγγειακό πόλο (Εικ. 1Α). Κατά μέσο όρο, η έκφραση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης ήταν υψηλότερη στους προεκλαμπτικούς ασθενείς σε σύγκριση με τις έγκυες και υπερτασικές μάρτυρες (Εικ. 1). σε σύγκριση με την προεκλαμψία, οι μάρτυρες είχαν χαμηλότερες βαθμολογίες έκφρασης σπειραματικής θρομβομοντουλίνης (έγκυες μάρτυρες, OR: 3.{12}}; 95 τοις εκατό -CI: (1,1, 7,8), p<0.05; and="" hypertensive="" controls,="" or:="" 6.1;="" 95%-ci:="" (1.6,="" 23.3),=""><0.01). in="" pre-eclampsia="" cases,="" glomerular="" thrombomodulin="" protein="" levels="" were="" inversely="" associated="" with="" the="" presence="" of="" glomerular="" endothelins="" (r:="" −0.71;=""><0.05). furthermore,="" in="" hypertensive="" controls,="" thrombomodulin="" levels="" were="" inversely="" associated="" with="" the="" glomerular="" tuf="" size="" (r:−0.79,=""><>

Έκφραση σπειραματικής θρομβομοντουλίνης σε αρουραίους που εκτέθηκαν σε sunitinib.Για να κατανοήσουμε καλύτερα τα ευρήματά μας στην προεκλαμπτικήνεφρά,Η χρώση με σπειραματική θρομβομοντουλίνη μελετήθηκε σε αρουραίους που εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις του αναστολέα του υποδοχέα VEGF sunitinib. Η χορήγηση του sunitinib είχε ως αποτέλεσμα αύξηση της αρτηριακής πίεσης και της πρωτεϊνουρίας με δοσοεξαρτώμενο τρόπο23. Οι αρουραίοι που εκτέθηκαν στη χαμηλή δόση του sunitinib δεν είχαν ιστοπαθολογικές ανωμαλίες. ενδοθηλίνες παρατηρήθηκαν στονεφράτων αρουραίων που εκτέθηκαν στις ενδιάμεσες και υψηλές δόσεις sunitinib· εναποθέσεις ινώδους παρατηρήθηκαν μόνο στα σπειραματικά τριχοειδή αγγεία ζώων που εκτέθηκαν σε υψηλή δόση sunitinib23. Κανένα από τα βαθμολογημένα σπειράματα σε αρουραίους δεν ήταν αρνητικό για θρομβομοντουλίνη. Η σπειραματική πρωτεΐνη θρομβομοντουλίνης αυξήθηκε στους νεφρούς των αρουραίων που εκτέθηκαν στις χαμηλές και ενδιάμεσες δόσεις sunitinib (ρ < 0.05,="" εικ.="" 2α),="" αλλά="" όχι="" σε="" αρουραίους="" που="" εκτέθηκαν="" στην="" υψηλότερη="" δόση="" του="" sunitinib="" (ρ="">< 0).="" sunitinib.="" προς="" υποστήριξη="" αυτών="" των="" ευρημάτων,="" ένα="" μοντέλο="" παλινδρόμησης="" έδειξε="" ότι="" τα="" επίπεδα="" πρωτεΐνης="" σπειραματικής="" θρομβομοντουλίνης="" συσχετίστηκαν="" μη="" γραμμικά="" με="" τη="" δόση="" του="" sunitinib="" ως="" στατιστικά="" σημαντική="" τετραγωνική="" σχέση="" (εικ.="" 2β,="" y="2.829" συν="" 0.="" 056x−0,002x2,=""><0.01). to="" study="" the="" factors="" that="" may="" induce="" upregulation="" of="" glomerular="" thrombomodulin,="" we="" next="" stained="" for="" the=""  etar,="" which="" mediates="">νεφρική βλάβηπου προκαλείται από την αναστολή του VEGF. Σε αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με χαμηλές και ενδιάμεσες δόσεις sunitinib, αλλά όχι σε αρουραίους που έλαβαν υψηλή δόση sunitinib, η σπειραματική χρώση ETAR ήταν αυξημένη σε σύγκριση με τους αρουραίους ελέγχου (p < {{0}}.0="" 1,="" εικ.="" 2c).="" παράλληλα="" με="" τα="" επίπεδα="" θρομβομοντουλίνης,="" τα="" επίπεδα="" του="" σπειραματικού="" etar="" συσχετίστηκαν="" τετραγωνικά="" με="" τη="" δόση="" του="" sunitinib="" (y="0.642" συν="" 0,087x−0,003x2,=""><0.001). without="" taking="" into="" account="" the="" different="" treatment="" groups,="" glomerular="" etar="" protein="" levels="" were="" directly="" correlated="" with="" glomerular="" thrombomodulin="" protein="" levels="" (r:="" 0.460,=""><>

Η θεραπεία με τον αναστολέα ETAR sitaxentan ομαλοποιεί την έκφραση της θρομβομοντουλίνης.Για να μελετηθεί εάν η έκφραση της θρομβομοντουλίνης ρυθμίζεται από τη σηματοδότηση της ενδοθηλίνης, οι αρουραίοι που εκτέθηκαν στην ενδιάμεση δόση του sunitinib υποβλήθηκαν σε θεραπεία με παράγοντες αποκλεισμού ETR. Η θεραπεία με έναν εκλεκτικό ανταγωνιστή ETAR (σιταξεντάνη) ομαλοποίησε την αρτηριακή πίεση και τη λευκωματουρία σε αρουραίους που έλαβαν sunitinib14 (Συμπληρωματικό Σχήμα S4). Αντίθετα, η θεραπεία με έναν διπλό ανταγωνιστή ETA/BR (μασιτεντάνη) είχε ως αποτέλεσμα την ομαλοποίηση της αρτηριακής πίεσης αλλά όχι την ομαλοποίηση της λευκωματουρίας που προκαλείται από το sunitinib14 (Συμπληρωματικό Σχήμα S4).

Η έκφραση mRNA της θρομβομοντουλίνης αυξήθηκε στους νεφρούς αρουραίων που εκτέθηκαν σε sunitinib σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικ. 3Α, p<0.01). administration="" of="" sitaxentan,="" at="" both="" concentrations,="" on="" top="" of="" sunitinib="" normalized="" thrombomodulin="" mrna="" expression="" to="" control="" levels=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" macitentan="" did="" not="" affect="" thrombomodulin="" mrna="" levels.="" relative="" thrombomodulin="" mrna="" expression="" was="" directly="" associated="" with="" relative="" etar="" mrna="" expression="" in="" the="" control="" group="" (r:="" 0.936,=""><0.01). in="" animals="" exposed="" to="" sunitinib="" only,=""  thrombomodulin="" mrna="" expression="" was="" directly="" associated="" with="" the="" amount="" of="" albuminuria="" (r:="" 0.876,=""><0.01). at="" the="" protein="" level,="" sunitinib="" exposure="" resulted="" in="" higher="" glomerular="" thrombomodulin="" expression="" as="" compared="" to="" controls="" (fig. 3b,=""><0.05). neither="" co-administration="" of="" sunitinib="" with="" sitaxentan="" or="" macitentan="" resulted="" in="" the="" normalization="" of="" the="" sunitinib-induced="" increase="" in="" glomerular="" thrombomodulin="" protein="">

Συζήτηση

Εδώ, δείχνουμε ότι η νεφροπροστατευτική πρωτεΐνη θρομβομοντουλίνη είναι αυξημένη στονεφρόσπειράματα γυναικών με προεκλαμψία. Επιπλέον, δείχνουμε ότι σε αρουραίους που εκτέθηκαν στον αναστολέα αγγειογένεσης sunitinib, η σπειραματική θρομβομοντουλίνη ρυθμίζεται προς τα πάνω με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και η αύξηση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης προηγείται της έναρξης των ιστοπαθολογικών εκδηλώσεων. Τέλος, δείχνουμε ότι ο αποκλεισμός του ETAR ομαλοποιεί την επαγόμενη από το sunitinib ανοδική ρύθμιση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η ανοδική ρύθμιση της σπειραματικής ενδοθηλιακής θρομβομοντουλίνης συμβαίνει σε πρώιμο στάδιο της προεκλαμψίαςνεφρική βλάβηκαι χρησιμεύει ως μηχανισμός για την προστασία του φραγμού σπειραματικής διόγκωσης. Η μελέτη μας είναι η πρώτη που αναφέρει αυξημένη έκφραση σπειραματικής θρομβομοντουλίνης στην προεκλαμψία. Δεδομένου ότι προηγουμένως ανακαλύψαμε ότι στους πλακούντες των γυναικών με προεκλαμψία, η θρομβομοντουλίνη ρυθμίζεται προς τα κάτω24, η

Τα αυξημένα επίπεδα ορού της διαλυτής θρομβομοντουλίνης εκτοτομής σε ασθενείς με προεκλαμψία17 μπορεί να προέρχονται από το σπειραματικό ενδοθήλιο. Επιπλέον, βρήκαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης σπειραματικής θρομβομοντουλίνης και της παρουσίας σπειραματικών ενδοθηλινών, υποδηλώνοντας ότι η ανοδική ρύθμιση της θρομβομοντουλίνης χρησιμεύει ως μηχανισμός σπειραματικής προστασίας. Αυτή η ιδέα υποστηρίζεται από προκλινικά στοιχεία σε διαβητικούς ποντικούς, στα οποία η θρομβομοντουλίνη διατηρεί κριτικά την επιβίωση των σπειραματικών κυττάρων και καταστέλλει την ενεργοποίηση του σπειραματικού συμπληρώματος19,20. Σε αντίθεση με το εύρημα μας ότι μια αντιαγγειογενετική κατάσταση αυξάνει τα επίπεδα σπειραματικής θρομβομοντουλίνης, μια προηγούμενη μελέτη διαπίστωσε ότι η θεραπεία με sFlt-1 μείωσε την έκφραση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης σε αρουραίους με μισοφέγγαρο σπειραματονεφρίτιδα25. Ο Hara et al.25 δεν μελέτησε την επίδραση του sFlt-1 στη σπειραματική θρομβομοντουλίνη σε υγιείς αρουραίους. Ως εκ τούτου, αν και αυξημένα επίπεδα φλεγμονωδών παραγόντων ανευρίσκονται επίσης στην προεκλαμψία, η μείωση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης σε αυτή τη μελέτη μπορεί να εξηγηθεί από την υψηλού βαθμού σπειραματική φλεγμονή που υπάρχει στη σπειραματονεφρίτιδα (προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, ενεργοποίηση συμπληρώματος), η οποία καταστέλλει έντονα την έκφραση της θρομβομοντουλίνης26 .

Προκειμένου να διευκρινιστεί εάν στην προεκλαμψία, η σπειραματική θρομβομοντουλίνη ρυθμίζεται προς τα πάνω ως αποτέλεσμα της συστηματικής αναστολής του υποδοχέα VEGF, μελετήσαμε την έκφραση θρομβομοντουλίνης σε αρουραίους που εκτέθηκαν σε sunitinib. Το Sunitinib αύξησε δοσοεξαρτώμενα τη σπειραματική θρομβομοντουλίνη σε χαμηλές και ενδιάμεσες δόσεις, αλλά όχι στην υψηλότερη δόση. Καθώς δεν παρατηρήθηκαν ιστολογικές αλλαγές στους νεφρούς αρουραίων που εκτέθηκαν σε χαμηλή δόση sunitinib23, η αύξηση στην έκφραση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης προηγήθηκε της έναρξης της σπειραματικής ιστοπαθολογικής βλάβης που προκλήθηκε από το sunitinib. Σε αρουραίους που εκτέθηκαν σε μια ενδιάμεση δόση sunitinib, παρατηρήθηκε το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης σπειραματικής θρομβομοντουλίνης και αυτό συνδέθηκε άμεσα με την ποσότητα λευκωματουρίας. Ο νεφρικός ιστοπαθολογικός φαινότυπος των περιπτώσεων ανθρώπινης προεκλαμψίας ήταν συγκρίσιμος με τη νεφρική βλάβη των αρουραίων που έλαβαν θεραπεία με ενδιάμεση δόση sunitinib: ενδοθηλίνες παρατηρήθηκαν σε 6 από τις 11 προεκλαμψίες

περιπτώσεις και μικροθρόμβοι παρατηρήθηκαν σε 1 από τις 11 περιπτώσεις προεκλαμψίας21, ενώ στο μοντέλο αρουραίων, οι αρουραίοι που έλαβαν ενδιάμεση δόση είχαν ενδοθηλίνες και οι επίμυες που έλαβαν υψηλότερη δόση είχαν ενδοθηλίνες σε συνδυασμό με εναποθέσεις ινώδους23. Προτείνουμε ότι η έκφραση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης αυξάνεται σε πρώιμο στάδιο προεκλαμψίας και αγγειογενετικής αναστολής, ως προστατευτικός μηχανισμός για την αντιστάθμιση του αντιαγγειογενετικού στρες στον φραγμό σπειραματικής διόγκωσης. Αντίθετα, στους αρουραίους που έλαβαν υψηλότερη δόση, η έκφραση της θρομβομοντουλίνης μειώθηκε σε επίπεδα ελέγχου. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι οι διαστάσεις της στιβάδας του ενδοθηλιακού γλυκοκάλυκα μειώνονται σε γυναίκες με σοβαρή πρώιμη προεκλαμψία27. Ως εκ τούτου, προτείνουμε επίσης ότι στους επίμυες που έλαβαν θεραπεία με sunitinib υψηλής δόσης, επηρεάζεται ο ενδοθηλιακός γλυκοκάλυκας, ο οποίος προκαλεί αλληλεπίδραση μεταξύ θρομβομοντουλίνης και ενζύμων, συμβάλλοντας έτσι στην πρωτεολυτική διάσπαση και την απώλεια της σπειραματικής πρωτεΐνης θρομβομοντουλίνης. Στις περιπτώσεις προεκλαμψίας μας, τα αυξημένα επίπεδα σπειραματικής θρομβομοντουλίνης συσχετίστηκαν με λιγότερες σπειραματικές ενδοθηλίνες, μια βλάβη που προκαλείται άμεσα από διαταραγμένη σπειραματική σηματοδότηση VEGF. Μελέτες in vitro έχουν ταυτοποιήσει τον VEGF ως έναν ισχυρό επαγωγικό παράγοντα έκφρασης θρομβομοντουλίνης σε ενδοθηλιακά κύτταρα28. Ως εκ τούτου, η ανοδική ρύθμιση της νεφρικής θρομβομοντουλίνης υπό αντιαγγειογενετικές συνθήκες όπως η προεκλαμψία και η αγγειογενετική αναστολή μπορεί να φαίνεται αντιφατική. Είναι ενδιαφέρον ότι μια μελέτη έδειξε ότι ο VEGF είναι αυξημένος στα σπειράματα των γυναικών με προεκλαμψία29, αντανακλώντας πιθανότατα έναν σπειραματικό αντισταθμιστικό μηχανισμό σε μια προσπάθεια να αντισταθμιστεί η μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα του VEGF. Έτσι, η ανοδική ρύθμιση της θρομβομοντουλίνης μπορεί να προκληθεί από μια αντισταθμιστική αύξηση του σπειραματικού VEGF υπό συστηματικές αντιαγγειογενετικές συνθήκες. Επιπλέον, η σηματοδότηση ενδοθηλίνης μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης. Τα επίπεδα ενδοθηλίνης στο πλάσμα είναι αυξημένα σε γυναίκες με προεκλαμψία30 και σχετίζονται με συστηματικά επίπεδα sFlt-131,32. Στο μοντέλο αρουραίου μας, και οι δύο θεραπείες με σιταξεντάνη (ανταγωνιστής ETAR) και μασιτεντάνη (διπλός ανταγωνιστής ETA/BR) είχαν ως αποτέλεσμα την ομαλοποίηση της υπέρτασης που προκαλείται από το sunitinib στους αρουραίους μας14. Ωστόσο, μόνο η θεραπεία με σιταξεντάνη (ανταγωνιστής ETAR) ομαλοποίησε την επαγόμενη από το sunitinib ανοδική ρύθμιση της νεφρικής θρομβομοντουλίνης και μείωσε τη λευκωματουρία. Αυτό υποδηλώνει ότι η ρύθμιση της έκφρασης της νεφρικής θρομβομοντουλίνης είναι ανεξάρτητη από την προκαλούμενη από υπέρταση ενδοθηλιακή βλάβη, η οποία υποστηρίχθηκε επίσης από την έλλειψη αυξημένης έκφρασης θρομβομοντουλίνης στους υπερτασικούς ασθενείς ελέγχου. Μένει να διερευνηθεί εάν το ETAR επάγει την έκφραση θρομβομοντουλίνης μέσω συστηματικών επιδράσεων ή μέσω σηματοδότησης σε σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα ειδικά. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση θρομβομοντουλίνης κανονικοποιήθηκε μόνο σε επίπεδο mRNA μετά τον αποκλεισμό ETAR σε αρουραίους που έλαβαν sunitinib, αλλά όχι σε επίπεδο πρωτεΐνης. Αυτή η ασυμφωνία μπορεί να εξηγηθεί από τα μετα-μεταφραστικά αποτελέσματα, τον χρόνο ημιζωής της πρωτεΐνης και παράγοντες που επηρεάζουν τη διάσπαση της θρομβομοντουλίνης από το ενδοθήλιο.

Η θρομβομοντουλίνη έχει σημαντικές αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, που περιλαμβάνουν την αναστολή της διήθησης λευκοκυττάρων με απομόνωση προφλεγμονωδών μορίων όπως το αντιγόνο Lewis y και το HMGB-133,34, μειώνοντας τη δραστηριότητα του NF-κΒ35 και αναστέλλοντας την ενεργοποίηση του συμπληρώματος20. Προηγουμένως, αναφέραμε ότι στις περιπτώσεις προεκλαμψίας μας, η ενεργοποίηση του σπειραματικού συμπληρώματος ήταν αυξημένη σε σύγκριση με εγκύους και υπερτασικούς ελέγχους36. Αυτό υποδηλώνει ότι η ανοδική ρύθμιση της σπειραματικής ενδοθηλιακής θρομβομοντουλίνης στην προεκλαμψία λειτουργεί ως αντιφλεγμονώδης και αντισυμπληρωματικός μηχανισμός. Εκτός από τις γνωστές αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις της, μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι η θρομβομοντουλίνη έχει προφλεγμονώδεις ιδιότητες. Η θρομβομοντουλίνη δεσμεύει τις ιντεγκρίνες λευκοκυττάρων LFA-1 και Mac1, προάγοντας έτσι την προσκόλληση λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο in vitro37. Η αύξηση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης μπορεί επομένως επίσης να συμβάλει άμεσα στη φλεγμονή και τη βλάβη του σπειραματικού συστήματος. Πρέπει να αναγνωρίσουμε τους περιορισμούς της μελέτης μας. Πρώτον, οι γυναίκες με προεκλαμψία στις οποίες διερευνήσαμε την έκφραση της σπειραματικής θρομβομοντουλίνης πέθαναν όλες λόγω των συνεπειών της προεκλαμψίας. Αυτό καθιστά αυτές τις γυναίκες μια συγκεκριμένη υποομάδα ασθενών με προεκλαμψία και επομένως τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορεί να μην είναι εφαρμόσιμα σε όλες τις γυναίκες που αναπτύσσουν προεκλαμψία. Δεύτερον, αρσενικοί αρουραίοι που έλαβαν θεραπεία με sunitinib χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλο για τη μελέτη της ρύθμισης της θρομβομοντουλίνης υπό αντιαγγειογενετικές συνθήκες. Επιπλέον, το sunitinib οδηγεί σε αναστολή διαφορετικών υποδοχέων κινασών τυροσίνης και δεν είναι ειδικός αναστολέας του VEGF. Σαφώς, αυτό το μοντέλο δεν μιμείται πλήρως την προεκλαμψία, ωστόσο, η θεραπεία με sunitinib οδηγεί σε υπέρταση και πρωτεϊνουρία23. Επομένως, μπορέσαμε να χρησιμοποιήσουμε αυτό το μοντέλο για να μελετήσουμε τη ρύθμιση της θρομβομοντουλίνης υπό αντιαγγειογενετικές συνθήκες. Παρά τους περιορισμούς της μελέτης μας, προβάλλει ενδιαφέρουσες ιδέες για τους μηχανισμούς νεφρικής βλάβης στην προεκλαμψία. Συμπερασματικά, η έκφραση της νεφρικής θρομβομοντουλίνης είναι αυξημένη στην προεκλαμψία και σε ένα μοντέλο αγγειογενετικής αναστολής που προκαλείται από το sunitinib. Υποθέτουμε ότι η αύξηση των επιπέδων σπειραματικής θρομβομοντουλίνης αντανακλά έναν νενοπροστατευτικό μηχανισμό ως απόκριση στο αντιαγγειογενετικό στρες στο φράγμα σπειραματικής διήθησης. Επιπλέον, η θεραπεία με έναν ανταγωνιστή ETAR ομαλοποίησε την έκφραση του mRNA της νεφρικής θρομβομοντουλίνης ταυτόχρονα με τη μείωση της πρωτεϊνουρίας σε αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με sunitinib. Χρειάζεται περισσότερη έρευνα σχετικά με το ρόλο της θρομβομοντουλίνης στο φράγμα σπειραματικής διόγκωσης.