Η θρομβομοντουλίνη βελτιώνει τη χρόνια νεφρική νόσο που προκαλείται από τον μετασχηματιζόμενο αυξητικό παράγοντα-b1 μέσω της οδού σήματος του συζευγμένου υποδοχέα G-protein 15/Akt

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma 1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo Shuangeji 5 , Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 και Esteban C. Gabazza2,9

1 Τμήμα Διαβήτη, Μεταβολισμού και Ενδοκρινολογίας, Μεταπτυχιακή Σχολή Ιατρικής του Πανεπιστημίου Mie, Tsu-city, Mie, Ιαπωνία; 2 Τμήμα Ανοσολογίας, Μεταπτυχιακή Σχολή Ιατρικής του Πανεπιστημίου Mie, Tsu-city, Mie, Ιαπωνία; 3 Τμήμα Πνευμονικής και Ιατρικής Κριτικής Φροντίδας, Μεταπτυχιακή Σχολή Ιατρικής του Πανεπιστημίου Mie, Tsu-city, Mie, Ιαπωνία; 4 Τμήμα Γαστρεντερολογίας και Ηπατολογίας, Πανεπιστήμιο Mie Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Ιαπωνία; 5 Τμήμα Νευρωνικής Αναγέννησης και Κυτταρικής Επικοινωνίας, Μεταπτυχιακή Σχολή Ιατρικής του Πανεπιστημίου Mie, Tsu-city, Mie, Ιαπωνία; 6 Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Ιαπωνία. και 7 Νεφρολογικό Τμήμα, Νοσοκομείο Taizhou, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Wenzhou, Lihai, επαρχία Zhejiang, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Πνευματικά δικαιώματα ª 2020, International Society of Nephrology. Δημοσιεύτηκε από την Elsevier Inc. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης με την άδεια CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Αλληλογραφία: Esteban C. Gabazza, Τμήμα Ανοσολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Ιαπωνία. E-mail: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; ή Yutaka Yano, Διαβήτης, Μεταβολισμός και Ενδοκρινολογία, Μεταπτυχιακή Σχολή Ιατρικής του Πανεπιστημίου Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Ιαπωνία. E-mail: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT και TY συνέβαλαν εξίσου σε αυτήν την εργασία. 9 Το YY και το ECG είναι συν-ανώτεροι συγγραφείς. Λήψη 1 Σεπτεμβρίου 2019. αναθεωρήθηκε στις 24 Απριλίου 2020· δεκτό στις 7 Μαΐου 2020

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: απόπτωση; χρόνια νεφρική νόσος; Υποδοχέας συζευγμένος με πρωτεΐνη G. ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη. μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-b1

Η ίνωση των νεφρών είναι η κοινή συνέπεια των χρόνιων νεφρικών παθήσεων που εξελίσσεται αναπόφευκτα σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου με ανεπάρκεια οργάνων που αντιμετωπίζεται μόνο με θεραπεία υποκατάστασης. Δεδομένου ότι ο μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-b1 είναι ο κύριος παίκτης στην παθογένεση της ινώδους του νεφρού, θέσαμε την υπόθεση ότι η ανασυνδυασμένη θρομβομοντουλίνη μπορεί να βελτιώσει την προοδευόμενη από τον αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού β1 προοδευτική προοδευτική ίνωση και ανεπάρκεια των νεφρών. Για να διερευνήσουμε την υπόθεσή μας, δημιουργήσαμε ένα νέο διαγονιδιακό ποντίκι ανθρώπινο μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-b1 ειδικό για το σπειράμα για να αξιολογήσουμε το θεραπευτικό αποτέλεσμα της ανασυνδυασμένης θρομβομοντουλίνης. Αυτό το διαγονιδιακό ποντίκι ανέπτυξε προοδευτική σπειραματική σκλήρυνση και σωληναριακή διάμεση ίνωση με νεφρική ανεπάρκεια. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη θρομβομοντουλίνη για τέσσερις εβδομάδες ανέστειλε σημαντικά την ίνωση των νεφρών και βελτίωσε τη λειτουργία των οργάνων σε σύγκριση με τα διαγονιδιακά ποντίκια που δεν είχαν λάβει θεραπεία. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη θρομβομοντουλίνη ανέστειλε σημαντικά την απόπτωση και τη μεσεγχυματική διαφοροποίηση των ποδοκυττάρων αλληλεπιδρώντας με τον συζευγμένο με πρωτεΐνη G υποδοχέα 15 για να ενεργοποιήσει το μονοπάτι σηματοδότησης Akt και να ρυθμίσει προς τα πάνω την έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένης της survivin. Έτσι, η μελέτη μας υποδηλώνει έντονα την πιθανή θεραπευτική αποτελεσματικότητα της ανασυνδυασμένης θρομβομοντουλίνης για τη θεραπεία τηςχρόνια νεφρική νόσοςκαι επακόλουθη ανεπάρκεια οργάνων.

κιστανάκιμπορώθεραπεία νεφρικής νόσουβελτίωση της νεφρικής λειτουργίας

Μεταφραστική δήλωση

Ίνωση και δυσλειτουργία τουνεφράαποτελούν σήμερα μεγάλα προβλήματα υγείας παγκοσμίως. Επί του παρόντος δεν υπάρχει εγκεκριμένο αντιϊνωτικό φάρμακο για τη θεραπεία της νεφρικής ίνωσης. Ο μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-b1 είναι ο κύριος και κοινός οδηγός της νεφρικής ινογένεσης στη χρόνια νεφρική νόσο που προκαλείται από πολλές διαταραχές. Βρήκαμε εδώ ότι η ανασυνδυασμένη θρομβομοντουλίνη, ένα φάρμακο εγκεκριμένο στην Ιαπωνία για τη θεραπεία της διάχυτης ενδαγγειακής πήξης, καταστέλλει την εξέλιξη της σπειραματικής σκλήρυνσης, της σωληναριακής διάμεσης ίνωσης και της νεφρικής ανεπάρκειας που προκαλείται από την υπερέκφραση του ανθρώπινου μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-b1, υποδηλώνοντας την πιθανή θεραπευτική του αξία για τη θεραπεία τουχρόνιες νεφρικές παθήσεις.

Χρόνια νεφρική νόσοείναι ένα σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας που σχετίζεται με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα που επηρεάζει περίπου το 13 τοις εκατό του ενήλικου πληθυσμού στις ανεπτυγμένες χώρες.1 Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ανέφερε ότιχρόνια νεφρική νόσος(ΧΝΝ) ήταν η αιτία του 1,5 τοις εκατό των θανάτων παγκοσμίως το 2012.1 Επιπλέον, πρόσφατα επιδημιολογικά δεδομένα υποδεικνύουν παγκόσμια σταθερή αύξηση του αριθμού των ασθενών με ΧΝΝ.2,3 Στις περισσότερες περιπτώσεις, η παθολογική διαδικασία εξελίσσεται προοδευτικά, οδηγώντας τελικά σε νεφρική ανεπάρκεια σταδίου, η οποία αντιμετωπίζεται αποκλειστικά με δια βίου αιμοκάθαρση ή μεταμόσχευση νεφρού.4,5 Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) και η αρτηριακή υπέρταση είναι οι πιο συχνές αιτίες ΧΝΝ ακολουθούμενες από ισχαιμία, σπειραματοσκλήρωση αγνώστου αιτιολογίας, ουρολογικές αποφράξεις και χρόνιες λοιμώξεις. Ανεξάρτητα από την υποκείμενη διαταραχή, η τελική και κοινή παθολογική συνέπεια της ΧΝΝ είναι η ίνωση των νεφρών.7 Η νεφρική ίνωση είναι η ανώμαλη επούλωση και αναδιαμόρφωση των παρεγχυματικών δομών των νεφρών που υπόκεινται σε παρατεταμένη ή επαναλαμβανόμενη βλάβη που χαρακτηρίζεται από την παρουσία σωληναριακής διάμεσης ίνωσης. σπειραματοσκλήρωση και σωληναριακή ατροφία.8 Ο κύριος μοχλός της νεφρικής ινωδογένεσης είναι το γεγονός μετασχηματισμού της ανάπτυξης ή (TGF)-b1.8,9 TGFb1 μπορεί να προάγει την ίνωση διεγείροντας την έκκριση πρωτεϊνών εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και χημειοτακτικών παραγόντων ή πολλαπλασιαστικών παραγόντων ινοβλαστών, αναστέλλοντας τις μεταλλοπρωτεϊνάσες και προάγοντας την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση.10 Εκτός από τη θεραπεία της νόσου , ένα εγκεκριμένο φάρμακο που στοχεύει ειδικά τη νεφρική ίνωση δεν είναι προς το παρόν διαθέσιμο.6

Η θρομβομοντουλίνη (TM) είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη με πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του συστήματος πήξης, της ανοσολογικής απόκρισης, των φλεγμονωδών αντιδράσεων και της κυτταρικής επιβίωσης.11 Η μοριακή δομή της ΤΜ περιέχει μια περιοχή που μοιάζει με λεκτίνη, 6 τομείς που μοιάζουν με επιδερμικούς αυξητικούς παράγοντες , μια περιοχή πλούσια σε σερίνη/θρεονίνη, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και μια κυτταροπλασματική ουρά.12 Η θρομβίνη, ένας προπηκτικός παράγοντας που δημιουργείται κατά την ενεργοποίηση του συστήματος πήξης, γίνεται αντιπηκτικός και αντιινωδολυτικός παράγοντας μετά τη δέσμευση στο ΤΜ.13 Το σύμπλεγμα ΤΜ-θρομβίνης αυξάνει τη δημιουργία της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C (APC), ενός αντιπηκτικού με αντιφλεγμονώδη και κυτταροπροστατευτική δράση, ενεργοποιώντας την πρωτεΐνη C. Επιπλέον, το ΤΜ από μόνο του μπορεί να μειώσει άμεσα τη φλεγμονώδη απόκριση αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της πρωτεΐνης της ομάδας υψηλής κινητικότητας Β-1 (HMGB1), καταστέλλοντας τα ανοσογόνα δενδριτικά κύτταρα, τα ηωσινόφιλα, τα μαστοκύτταρα και το σύστημα του συμπληρώματος.13–18

Υπάρχουν δημοσιευμένα αποτελέσματα που δείχνουν προληπτικές επιδράσεις της ΤΜ στη διαβητική νεφρική νεφρική βλάβη και ισχαιμία-επαναιμάτωση νεφρικής βλάβης.19-21 Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει αξιολογήσει την επίδραση της ανασυνδυασμένης ΤΜ στην προοδευτική ίνωση των νεφρών που προκαλείται από το TGFb1, έναν κοινό παράγοντα νεφρικής ίνωσης στην διάφορες ασθένειες που προκαλούν ΧΝΝ. Θέσαμε την υπόθεση ότι το TM μπορεί να βελτιώσει την νεφρική ίνωση και τη νεφρική ανεπάρκεια που προκαλείται από TGFb1-. Για να διερευνήσουμε αυτήν την υπόθεση, αξιολογήσαμε τη θεραπευτική επίδραση της ανασυνδυασμένης ΤΜ σε ένα πρόσφατα αναπτυγμένο διαγονιδιακό TGFb1 (TG) ποντίκι ειδικό για σπειράματα που αναπτύσσεται προοδευτικάνεφρική ίνωση και νεφρική ανεπάρκεια.

κιστανάκι για τα νεφρά

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Τα αυξημένα κυκλοφορούντα θραύσματα ΤΜ συσχετίζονται με νεφρική δυσλειτουργία

Η ΤΜ, μια γλυκοπρωτεΐνη που συνδέεται με τη μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων, διασπάται σε θραύσματα, χάνοντας τις προστατευτικές της λειτουργίες κατά τη διάρκεια της ενδοθηλιακής βλάβης.22 Η διαβητική νεφροπάθεια σχετίζεται με ενδοθηλιακή βλάβη. κυκλοφορούντα επίπεδα ΤΜ (4,4 έναντι 3,3 pg/ml) και ενεργού TGFb1 (0,28 έναντι 0,24 ng/ml) (Συμπληρωματικός Πίνακας S1, Συμπληρωματικό Σχήμα S1A). Η ΤΜ συσχετίζεται σημαντικά με την κρεατινίνη, το ενεργό TGFb1 και τη διαλυτή ποδοκίνη (Συμπληρωματικό Σχήμα S1B). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η απώλεια λειτουργικού δεσμευμένου στη μεμβράνη ΤΜ σχετίζεται με αυξημένη απελευθέρωση του ενεργού TGFb1 και δυσλειτουργία των νεφρών.

Ποντικός TG με ειδική έκφραση σπειράματος πλήρους μήκους ανθρώπινου γονιδίου TGFb1

Αναπτύξαμε ένα ποντίκι TG που υπερεκφράζει το πλήρους μήκους ανθρώπινο γονίδιο TGFb1 στα ποδοκύτταρα. Το ποντίκι δημιουργήθηκε με την τοποθέτηση του ανθρώπινου TGFb1 υπό τον έλεγχο του προαγωγέα ποδοκίνης σε ένα κατασκεύασμα βακτηριακού τεχνητού χρωμοσώματος (BAC) (Συμπληρωματικό Σχήμα S2, Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Λάβαμε 5 ποντικούς ιδρυτές που εξέφραζαν 3 αντίγραφα και 3 ποντίκια ιδρυτές που εξέφραζαν 1 αντίγραφο του ανθρώπινου διαγονιδίου TGFb1. Η έκφραση του διαγονιδίου ήταν ειδική για τα νεφρά και οι απόγονοι των ιδρυτών ήταν βιώσιμοι (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Τα ποντίκια είχαν τελειόμηνη κύηση και τα απορρίμματα ήταν κανονικού μεγέθους. Τα ποντίκια γεννήθηκαν με την αναμενόμενη αναλογία Μεντελιανού.

Για να χαρακτηρίσουμε τα ποντίκια TG, μετρήσαμε αρκετάνεφρικές παραμέτρουςκάθε 4 εβδομάδες για περίοδο 16 εβδομάδων (Συμπληρωματικό Σχήμα S4). Οι συγκεντρώσεις του TGFb1 στο πλάσμα και στα ούρα αυξήθηκαν σημαντικά στα ποντίκια TGFb1- σε σύγκριση με τα ποντίκια άγριου τύπου (WT) από τις πρώτες εβδομάδες μετά τη γέννηση και στη συνέχεια παρέμειναν σταθερά σε υψηλό επίπεδο (Εικόνα 1α). Τα ποντίκια TGFb1-TG εμφάνισαν σημαντική αύξηση στην περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη στον νεφρικό ιστό τη 20η εβδομάδα (190,5 έναντι 96.0 mg/νεφρό). ), μεσαγγειακή επέκταση από την 4η εβδομάδα (1,9 έναντι 1,1 βαθμολογίες) και στην εναπόθεση κολλαγόνου από τη 12η εβδομάδα (0,9 τοις εκατό έναντι 0,1 τοις εκατό ) μετά τη γέννηση σε σύγκριση με τους αντίστοιχους WT (Εικόνα 1a–f ). Η συμβατική οπτική μικροσκοπία έδειξε διεύρυνση της βασικής μεμβράνης της κάψουλας Bowman, πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης, αυξημένη εναπόθεση κολλαγόνου σε μεσαγγειακό και διάμεσο χώρο και σωληναριακή ατροφία (Εικόνα 1bd). Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης έδειξε σπειραματοσκλήρωση, συμπεριλαμβανομένου του μετασχηματισμού μικρολαχνών και της εξάλειψης των ποδοκυττάρων, μειωμένη σπειραματική τριχοειδική ενδοθηλιακή διάτρηση, πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης και αυξημένη εναπόθεση μεσαγγείου θεμέλιας ουσίας (Εικόνα 2a–i). Οι συγκεντρώσεις στα ούρα των πρώιμων δεικτών της νεφροπάθειας πρωτεΐνη που δεσμεύει λιπαρά οξέα (185,1 έναντι 87,0 pg/ml) καινεφρική βλάβητο μόριο 1 (441,9 έναντι 256,9 pg/ml) ενισχύθηκε σημαντικά σε ποντίκια TGFb1-TG από την 4η και 8η εβδομάδα ηλικίας, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα ποντίκια WT που ταιριάζουν με την ηλικία τους (Συμπληρωματικό Σχήμα S5). Η ολική πρωτεϊνουρία και η αναλογία ολικής πρωτεΐνης-κρεατινίνης στα ούρα αυξήθηκαν σημαντικά την 4η, 8η, 12η, 16η και 2{26}}η εβδομάδα σε ποντίκια TGFb1-TG σε σύγκριση με τα αντίστοιχα WT (Εικόνα 3α) . Το επίπεδο του αζώτου της ουρίας στο αίμα ήταν σημαντικά αυξημένο από την 4η εβδομάδα (5,1 έναντι 4,1 mg/dl) και η συγκέντρωση της κρεατινίνης από την 8η εβδομάδα (1,1 έναντι 0,4 mg/dl) σε ποντίκια TGFb1-TG σε σύγκριση με τους αντίστοιχους WT (Εικόνα 3β).

Το rhTM αναστέλλει τη σπειραματοσκλήρωση και τη σωληναρισιακή διάμεση ίνωση

Σε σύγκριση με ποντίκια TGFb{{0}}TG που έλαβαν φυσιολογικό ορό (SAL) και ποντίκια WT που έλαβαν θεραπεία με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο (RH) TM ή SAL, τα ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με ρυθμό εμφάνισαν σημαντικά μειωμένο μεσαγγειακό επέκταση/κυτταρικότητα (1,3 έναντι 3.{{3{37}}}} βαθμολογία) και σημαντικά χαμηλή εναπόθεση κολλαγόνου σωληναρισμάτων και σπειραματοσκλήρωση (121,3 τοις εκατό έναντι 139,7 τοις εκατό ) (Εικόνα 4α–ε). Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, η περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη (11,7 έναντι 19,9 mg/g), οι συγκεντρώσεις κολλαγόνου Ι στον νεφρό ιστό (101,3 έναντι 196,7 ng/mg πρωτεΐνης) και περιοστίνης (21,7 έναντι 40,8 ng/ mg πρωτεΐνης), και η σχετική έκφραση mRNA του κολλαγόνου Ι μειώθηκαν σημαντικά σε νεφρικούς ιστούς από ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με νεφρικούς ιστούς από ποντικούς ελέγχου (Εικόνα 4στ, Συμπληρωματικοί Πίνακες S2 και S3). Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης έδειξε σημαντική μείωση της εξάλειψης των ποδοκυττάρων από τη διαδικασία του ποδιού και πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μόνο με SAL (Συμπληρωματικό Σχήμα S6AB και B). Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις στον νεφρικό ιστό της χημειοελκυστικής πρωτεΐνης μονοκυττάρων προϊβρωτικών κυτοκινών-1 (45,0 έναντι 76,1 pg/mg πρωτεΐνης), ιντερλευκίνης-13 (612,1 έναντι 1002,0 pg/mg πρωτεΐνης) και ενεργού TGFb1 (131,0 έναντι 151,5 pg/mg πρωτεΐνης) μειώθηκαν σημαντικά σε ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με ποντικούς ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα S7). Η συγκέντρωση του HMGB1 στον νεφρικό ιστό μειώθηκε επίσης σημαντικά στους νεφρικούς ιστούς από ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση μενεφρικούς ιστούςαπό ποντίκια ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα S7). Η συγκέντρωση στο πλάσμα του συμπλέγματος θρομβίνης αντιθρομβίνης αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα TGFb1-TG/SAL σε σύγκριση με την ομάδα WT/SAL, αλλά δεν βρέθηκε διαφορά μεταξύ των ομάδων TGFb1-TG/rhTM και WT/rhTM (Συμπληρωματικό Σχήμα S8A). Όπως αναμενόταν, υπήρχε υψηλή συγκέντρωση ΤΜ στο πλάσμα ποντικών TGFb1-TG και WT που έλαβαν θεραπεία με rhTM. Η συγκέντρωση του συμπλέγματος APC/αντιθρυψίνης στο πλάσμα μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα TGFb1-TG/SAL σε σύγκριση με τις ομάδες WT/SAL και TGFb1-TG/rhTM (280,5 έναντι 384,6 pg/ml) , και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο επίπεδο του αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (Συμπληρωματικό Σχήμα S8A). Τα επίπεδα του C5a στο πλάσμα, στα ούρα καινεφρικό ιστό(630.1 έναντι 1075,0 pg/mg πρωτεΐνης) και η διαλυτή στο πλάσμα ποδοκίνη μειώθηκαν σημαντικά σε ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν SAL (Συμπληρωματικό Σχήμα S8B). Το επίπεδο της ποδοκίνης στα ούρα ήταν υψηλότερο στην ομάδα TGFb1-TG/SAL από ό,τι στις ομάδες WT/SAL και TGFb1-TG/rhTM (Συμπληρωματικό Σχήμα S9A–C).

Εικόνα 1|Ο ανθρώπινος αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού b1 (TGFb1) διαγονιδιακός ποντικός (TG) αναπτύσσει προοδευτική ίνωση των νεφρών. (α) Οι συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης TGFb1 στο πλάσμα και στα ούρα μετρήθηκαν με ενζυμική ανοσολογική δοκιμασία και η περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη ιστού με χρωματομετρικό προσδιορισμό. (β-δ) Τα τμήματα του νεφρικού ιστού χρωματίστηκαν με (β) περιοδικό οξύ-Schiff (ράβδοι ¼ 20 mm) και με (c,d) τρίχρωμο Masson (ράβδοι ¼ 10{{ 40}} mm) και στη συνέχεια (e,f) ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης ή το λογισμικό απεικόνισης WinROOF (Mitani Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία). Ο αριθμός ποντικών για αξιολόγηση νεφρικού ιστού: για ποντίκια άγριου τύπου (WT), n ¼ 4 στις 4, 12 και 20 εβδομάδες. για ποντίκια TG, n ¼ 7 στις 4 εβδομάδες, n ¼ 8 στις 16 εβδομάδες και n ¼ 9 σε παιδιά ηλικίας 20 εβδομάδων. Ο αριθμός ποντικών για αξιολόγηση πλάσματος και ούρων: για ποντίκια WT, n ¼ 12 στις 4 εβδομάδες, n ¼ 8 στις 8 εβδομάδες, n ¼ 7 στις 12 εβδομάδες και n ¼ 4 στις 16 και 20 εβδομάδες. για ποντίκια TG, n ¼ 24 στις 4 εβδομάδες, n ¼ 17 στις 8 και 12 εβδομάδες και n ¼ 9 στις 16 και 20 εβδομάδες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσο διατεταρτημόριο εύρος. Στατιστική ανάλυση με Mann-Whitney U test. *P <0,05, **p=""><0,01, ****p=""><0,0001. ns,="" όχι="" σημαντικό.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

Εικόνα 2|Μικροσκοπικά ευρήματα ηλεκτρονίων μετάδοσης στο μοντέλο ινώδους νεφρού που προκαλείται από μετασχηματιστικό αυξητικό παράγοντα b1. Η στερέωση, ο χειρισμός και η αφαίρεση των νεφρών από ποντικούς πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (α, β) Μετασχηματισμός μικρολαχνών και (α, β, δ, ε, ζ) εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού (λευκές αιχμές βελών) των ποδοκυττάρων, (γ–ε) μειωμένη σπειραματική τριχοειδική ενδοθηλιακή οπή (κίτρινες κεφαλές βελών), (στ) πάχυνση του Υπάρχει σπειραματική βασική μεμβράνη (αστερίσκοι) και (h,i) αυξημένη εναπόθεση μεσαγγειακής μήτρας (λευκά βέλη). CL, τριχοειδής αυλός. Για να βελτιστοποιήσετε την προβολή αυτής της εικόνας, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου στη διεύθυνση www.kidney-international.org.

Το rhTM βελτιώνει τη νεφρική λειτουργία

Τα επίπεδα της πρωτεΐνης δέσμευσης L-λιπαρών οξέων (197.0 έναντι 313,4 pg/ml),μόριο νεφρικής βλάβης1 (299,9 έναντι 596,2 pg/ml), το άζωτο ουρίας αίματος (12,9 έναντι 34,8 mg/dl), η κρεατινίνη (0,5 έναντι 1,4 mg/dl) και η αναλογία λευκωματίνης-κρεατινίνης μειώθηκαν σημαντικά σε TGFb1-Ποντίκια TG με νεφρική ίνωση που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με τα αντίστοιχα TG που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Εικόνα 5). Η ολική πρωτεΐνη ούρων και η αναλογία ολικής πρωτεΐνης κρεατινίνης μειώθηκαν επίσης σε ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με τους αντίστοιχους που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Εικόνα 5).

Το rhTM μειώνει την απόπτωση των σπειραματικών κυττάρων

Η χρώση με τη μεσολάβηση της τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης dUTP με το άκρο σήμανσης έδειξε σημαντικά μειωμένο αριθμό αποπτωτικών κυττάρων σε σπειράματα από ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με σπειράματα από TGFb1- ποντίκια TG που έλαβαν θεραπεία με SAL Σχήμα S10A και B). Η διάσπαση της κασπάσης-3 μειώθηκε επίσης σημαντικά σε νεφρικούς ιστούς από ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με νεφρικούς ιστούς από ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν SAL (Συμπληρωματικό Σχήμα S10C). οιστούς των νεφρώναπό ποντίκια TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM, σε σύγκριση με αυτά από TGFb1-TG που έλαβαν θεραπεία με SAL, έδειξαν σημαντική αύξηση στα επίπεδα mRNA του λεμφώματος Β-κυττάρων 2 (Bcl-2), Β -κυτταρικό λέμφωμα-εξαιρετικά μεγάλο (Bcl-XL), ένας βακουλοϊικός αναστολέας της απόπτωσης που περιέχει 5 (BIRC5, επίσης γνωστό ως survivin) και BIRC6 (Apollon) με αυξημένη αναλογία Bcl-2–Bax (Συμπληρωματικό Σχήμα S11 ).

Εικόνα 3|Ο ανθρώπινος αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού b1 (TGFb1) διαγονιδιακός (TG) ποντικός έχει νεφρική δυσλειτουργία. (α) Η ολική πρωτεΐνη και (β) το άζωτο της ουρίας του αίματος (BUN) μετρήθηκαν με χρωματομετρικές μεθόδους και η κρεατινίνη με μια ενζυματική μέθοδο. Ο αριθμός ποντικών για αξιολόγηση πλάσματος και ούρων: για ποντίκια άγριου τύπου (WT), n ¼ 12 στις 4 εβδομάδες, n=7 στις 8 και 12 εβδομάδες και n=4 στις 16 και 2{ {21}} εβδομάδες; για ποντίκια TG, n =24 στις 4 εβδομάδες, n=17 στις 8 και 12 εβδομάδες και n=9 στις 16 και 20 εβδομάδες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσος ± διατεταρτημοριακό εύρος. Στατιστική ανάλυση με Mann-Whitney U test. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>

Το rhTM αναστέλλει την απόπτωση των ποδοκυττάρων

Η προεπεξεργασία των ποδοκυττάρων με rhTM μείωσε σημαντικά την απόπτωση των ποδοκυττάρων που καλλιεργήθηκαν παρουσία TGFb1, όπως αξιολογήθηκε από τον αριθμό των κυττάρων στη φάση subG1 (3,2 τοις εκατό έναντι 5,2 τοις εκατό ), τερματικά με τη μεσολάβηση της δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης dUTP nick end-labeling - θετικά κύτταρα 1.0 έναντι 5.4 κυττάρων/Fifield) και ο βαθμός διάσπασης της κασπάσης-3 (αναλογίες 0.9 έναντι 1.1) (Εικόνα 6a–e). Ο έλεγχος των αντιαποπτωτικών παραγόντων σε καλλιεργημένα ποδοκύτταρα έδειξε ότι η rhTM αυξάνει σημαντικά την έκφραση mRNA του αντιαποπτωτικού παράγοντα Bcl-2 σε σύγκριση με την έκφραση σε κύτταρα που δεν έχουν υποστεί αγωγή (Συμπληρωματικό Σχήμα S12). Η έκφραση mRNA του αντιαποπτωτικού παράγοντα BIRC5 επίσης αυξήθηκε σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με rhTM σε σύγκριση με την έκφραση σε κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή (Συμπληρωματικό Σχήμα S12). Η έκφραση mRNA του προαποπτωτικού παράγοντα Bax μειώθηκε σημαντικά με θεραπεία rhTM σε σύγκριση με καμία θεραπεία (Συμπληρωματικό Σχήμα S12). Η θεραπεία με rhTM ανέστειλε επίσης σημαντικά την έκφραση της αννεξίνης V και της τελικής χρώσης dUTP με τη μεσολάβηση της δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης σε ποδοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου (Συμπληρωματικό Σχήμα S13A–E) και υπό συνθήκες υψηλής γλυκόζης A–Eup1 ) επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την αντιαποπτωτική ιδιότητα του rhTM στα ποδοκύτταρα. Η εξερεύνηση της οδού αντιαποπτωτικής κινάσης πρωτεΐνης Β (Akt)25 έδειξε ότι η rhTM ενίσχυσε τη φωσφορυλίωση της Akt σε ανθρώπινα πρωτογενή ποδοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου ή TGFb1 (Συμπληρωματικό Σχήμα S15A και B). Στη συνέχεια απομονώσαμε ποδοκύτταρα από κάθε ομάδα ποντικών και αξιολογήσαμε τη φωσφορυλίωση Akt με στύπωμα Western. Υπήρξε σημαντικά ενισχυμένη φωσφορυλίωση του Akt σε ποδοκύτταρα που απομονώθηκαν από την ομάδα TGFb{{3{33}}}}TG/rhTM σε σύγκριση με τα ποδοκύτταρα από την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία (αναλογίες 1,1 έναντι 0,7) (Συμπληρωματικό Σχήμα S16A και B).

Διαμεσολάβηση GPR15

Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι η ΤΜ ενεργοποιεί τις ενδοκυτταρικές οδούς αλληλεπιδρώντας με τον υποδοχέα 1 του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFR1) καιΥποδοχέας συζευγμένος με πρωτεΐνη G15 (GPR15).26,27 Τα ποδοκύτταρα εκφράζουν το FGFR128 αλλά αν εκφράζουν το GPR15 είναι ασαφές. Εδώ απομονώσαμε ποδοκύτταρα από κάθε ομάδα ποντικών και δείξαμε ότι τα ποδοκύτταρα εκφράζουν επίσης GPR15 (Συμπληρωματικό Σχήμα S17A–E). Βρήκαμε ότι τα ποδοκύτταρα από υγιή μάρτυρα και έναν ασθενή με σπειραματοσκλήρωση εκφράζουν επίσης GPR15 (Συμπληρωματικό Σχήμα S18). Για να διευκρινίσουμε εάν το FGFR1 ή το GPR15 μεσολαβεί στην ανασταλτική δραστηριότητα rhTM στην απόπτωση των ποδοκυττάρων, αξιολογήσαμε την αντιαποπτωτική δραστηριότητα της rhTM σε υποκύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TGFb1-παρουσία αναστολέα FGFR1 ή μετά τη διαμόλυνση των κυττάρων με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA). έναντι του FGFR1 ή του GPR15. Η προεπεξεργασία των ποδοκυττάρων με αναστολέα FGFR1 (Συμπληρωματικό Σχήμα S19A και Β) ή FGFR1 siRNA (13,2 τοις εκατό έναντι 7,9 τοις εκατό) (Εικόνα 7α και β) δεν μπόρεσε να καταργήσει την ανασταλτική δράση της rhTM στην απόπτωση των ποδοκυττάρων. Ωστόσο, η διαμόλυνση των κυττάρων με GPR15 siRNA κατήργησε πλήρως την ανασταλτική δράση της rhTM (14,6 τοις εκατό έναντι 13,8 τοις εκατό)απόπτωση των ποδοκυττάρων(Εικόνα 7α–γ).

Εικόνα 4|Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αναστέλλει τη σπειραματοσκλήρωση και τη σωληναρισιακή διάμεση ίνωση. Τομές νεφρικού ιστού χρωματίστηκαν (α, β) με περιοδικό οξύ-Schiff και (γ, δ) με τρίχρωμο Masson και (ε) στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης ή το λογισμικό απεικόνισης WinROOF. (ε) Η μέση τιμή της ομάδας άγριου τύπου (WT)/αλατούχου ορού (SAL) λήφθηκε ως 100 τοις εκατό . Στατιστική ανάλυση με Mann-Whitney U test. (στ) Η περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη ιστού μετρήθηκε με χρωματομετρική μέθοδο, συγκέντρωση κολλαγόνου Ι-α1 (Col1a1) και περιοστίνης με ενζυμική ανοσοδοκιμασία και έκφραση mRNA με αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης-πολυμεράσης. Στατιστική ανάλυση με ανάλυση διακύμανσης Kruskal Wallis και διορθωμένη δοκιμή Dunn. n=8 σε κάθε ομάδα. Ράβδοι {{10}} (a,c) 50 mm και (d) 20 mm. Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσος ± διατεταρτημοριακό εύρος. *Ρ < 0,05,="" **ρ="">< 0,01,="" ***ρ="">< 0,001,="" ****ρ="">< 0,0001.="" tg,="" διαγονιδιακό;="" tgfb1,="" μετασχηματιστικός="" αυξητικός="" παράγοντας="" b1.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

Το rhTM αναστέλλει την ΕΜΤ των ποδοκυττάρων

Υπήρχε μια σημαντικά αυξημένη περιοχή με θετική χρώση για την ποδοκίνη και την ακτίνη α-λείου μυός (a-SMA) (1,4 τοις εκατό έναντι 11,2 τοις εκατό ) σε ποντίκια TGFb1-TG/SAL σε σύγκριση με TGFb1-TG / ποντίκια rhTM (Εικόνα 8α και β). Στη συνέχεια καλλιεργήσαμε in vitro πρωτογενή ανθρώπινα ποδοκύτταρα, προκατεργασμένα με rhTM πριν προσθέσουμε πρωτεΐνη TGFb1 στο μέσο καλλιέργειας. Η μορφολογία που μοιάζει με ινοβλάστες και η ενισχυμένη έκφραση του a-SMA καταστέλλονται σε ποδοκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με rhTM σε σύγκριση με κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Συμπληρωματικό Σχήμα S20A). Επιπλέον, η rhTM ανέστειλε την έκφραση του mRNA της φιμπρονεκτίνης και της βιμεντίνης, αν και ενίσχυσε την έκφραση mRNA της Ε-καντερίνης στα ποδοκύτταρα σε σύγκριση με την έκφραση σε κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Συμπληρωματικό Σχήμα S20B). Τα μέλη της οικογένειας SMAD 2 (Smad2) και Smad3 διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη μεσολαβούμενη από TGFb1-επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT).29 Η θεραπεία με rhTM κατέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση των Smad2 και Smad3 σε TGFb1-TG ποντίκια σε σύγκριση με ποντίκια TG που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Εικόνα 8γ) και σε ανθρώπινα ποδοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν παρουσία TGFb1 (Συμπληρωματικό Σχήμα S20C).29 ποντίκια TG που έλαβαν θεραπεία με rhTM (TGFb1-TG/rhTM) εμφανίζουν επίσης λιγότερη έκφραση a-SMA (3,7 τοις εκατό έναντι 17,2 τοις εκατό) σε σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη υποβληθέντα σε θεραπεία (Συμπληρωματικό Σχήμα S21A και B).

Εικόνα 5|Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) βελτιώνει τη νεφρική βλάβη και τη νεφρική δυσλειτουργία. Η κρεατινίνη μετρήθηκε με ενζυματική μέθοδο. ολική πρωτεΐνη με χρωματομετρική μέθοδο. και άζωτο ουρίας αίματος (BUN) και λευκωματίνη, μόριο νεφρικής βλάβης 1 (KIM-1), πρωτεΐνη δέσμευσης L-λιπαρών οξέων (L-FABP) και ολικός αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού b1 (TGFb1) με ενζυμική ανοσολογική δοκιμασία. n=8 σε κάθε ομάδα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσο ± διατεταρτημόριο εύρος. Στατιστική ανάλυση με ανάλυση διακύμανσης Kruskal-Wallis και μη διορθωμένη δοκιμή Dunn. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" όχι="" σημαντικό.="" sal,="" αλατούχο="" διάλυμα;="" tg,="" διαγονιδιακό;="" wt,="" άγριου="">

Το GPR15 μεσολαβεί στην ανασταλτική δραστηριότητα του rhTM στο EMT

Η επιμόλυνση των ποδοκυττάρων με το FGFR1 siRNA δεν μπόρεσε να καταργήσει την ανασταλτική δράση του rhTM στις σχετικές εκφράσεις mRNA τόσο του κολλαγόνου Ι-α1 όσο και του α-SMA σε υποκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TGFb1- (Συμπληρωματικό Σχήμα S22). Ωστόσο, η επιμόλυνση κυττάρων με GPR15 siRNA κατήργησε σημαντικά την ανασταλτική δραστηριότητα του rhTM στις σχετικές εκφράσεις mRNA τόσο του κολλαγόνου I-a1 όσο και του a-SMA σε υποκύτταρα που έλαβαν TGFb1- (Συμπληρωματικό Σχήμα S22).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

TGFb1 και τραυματισμός σπειραματικών κυττάρων

Η κοινή συνέπεια των διαταραχών που προκαλούν ΧΝΝ είναι η νεφρική ίνωση.8,30,31 Το TGFb1 είναι ο κοινός οδηγός της ινογένεσης στους νεφρούς που σχετίζεται με ΧΝΝ που προκαλείται από ασθένειες όπως ΣΔ, αρτηριακή υπέρταση και αυτοάνοσες διαταραχές.10 Κύτταρα από το σπειράμα και τους σωληναριστήρες μπορεί να εκκρίνει τις λανθάνουσες μορφές του TGFb1 που, όταν ενεργοποιηθεί υπερβολικά κατά τη διάρκεια τραυματισμού του ιστού, μπορεί να οδηγήσει σε νεφρική ουλή.32 Καθώς ο TGFb1 μπορεί να διεγείρει τη δική του έκκριση, η ινωτική διαδικασία γενικά γίνεται ένας φαύλος κύκλος. 1- μεσολάβησείνωση των νεφρώνείναι τραυματισμός των ποδοκυττάρων και των σπειραματικών ενδοθηλιακών κυττάρων.33–35 Το επίπεδο της διαλυτής ΤΜ στο πλάσμα είναι δείκτης ενδοθηλιακής βλάβης. Σε συμφωνία με τον ρόλο του TGFb1 στη βλάβη των νεφρικών κυττάρων, εδώ βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση του ενεργού TGFb1 με διαλυτό ΤΜ, διαλυτή ποδοκίνη και κρεατινίνη στο πλάσμα από ασθενείς με ΣΔ. Διαφωνία μεταξύ σπειραματικών ενδοθηλιακών κυττάρων και ποδοκυττάρων κατά τη διάρκεια ανεφρική βλάβηοδηγεί σε τοπική έκφραση πρωτεασών που προκαλεί αποικοδόμηση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης.34–36 Αυτό μπορεί να εξηγήσει την ανίχνευση της διαλυτής ποδοκίνης και τη σημαντική συσχέτισή της με τη διαλυτή ΤΜ στους ασθενείς μας με ΣΔ.

Εικόνα 6|Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) καταστέλλει την απόπτωση των ποδοκυττάρων που προκαλείται από τον μετασχηματισμό του αυξητικού παράγοντα b1 (TGFb1). (α) rhTM προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας των ποδοκυττάρων 1 ώρα πριν από την πρόκληση απόπτωσης με 10 ng/ml TGFb1 για 48 ώρες. (β) Το ποσοστό των κυττάρων στη φάση subG1 ανιχνεύθηκε με συναδέλφους κυτταρομετρία. (α, β) n=3 σε κάθε ομάδα. (γ, δ) Ο αριθμός των κυττάρων με κατακερματισμό DNA μετρήθηκε με ανάλυση dUTP nick end-labeling (TUNEL) με τη μεσολάβηση της τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης (n {= 3) σε ομάδες αλατούχου [SAL]/SAL και rhTM/SAL· n=6 στις ομάδες SAL/TGFb1 και rhTM/TGFb1) και (ε) ο βαθμός διάσπασης της κασπάσης-3 μετρήθηκε με στύπωμα Western (n=4 σε κάθε ομάδα). Μπάρες=100 χλστ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσος ± διατεταρτημοριακό εύρος. Στατιστική ανάλυση με Mann-Whitney U test. *P <0,05. dapi,="" 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη;="" hpf,="" πεδίο="" υψηλής="" ισχύος.="" ns,="" όχι="" σημαντικό.="" τα="" ιστογράμματα="" εμφανίζονται="" ως="" τοις="" εκατό="" μέγιστο="" (ποσοστό="" της="" μέγιστης="" τιμής),="" κλιμακώνοντας="" κάθε="" καμπύλη="" σε="" λειτουργία="100" τοις="" εκατό="" .="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

Ειδική για ποδοκύτταρα ανθρώπινη ίνωση νεφρού που σχετίζεται με υπερέκφραση TGFb1

Ένα φάρμακο που μπορεί να εξουδετερώσει την επίδραση του TGFb1 θα ήταν ιδανικό για να εμποδίσει τη νεφρική ίνωση. Εδώ δημιουργήσαμε ένα ποντίκι TG που υπερεκφράζει το ανθρώπινο γονίδιο TGFb1 στο σπείραμα που αναπτύσσει αυθόρμητη και προοδευτική σπειραματική σκλήρυνση και σωληναρισιακή διάμεση ίνωση με νεφρική ανεπάρκεια ήδη 4 εβδομάδες μετά τη γέννηση. Το μοντέλο δείχνει προχωρημένη σπειραματοπάθεια με τραυματισμό των ποδοκυττάρων και των σπειραματικών ενδοθηλιακών κυττάρων. πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης και μεσαγγειακή επέκταση με διάμεση ουλή. αυξημένοι δείκτες τραυματισμού νεφρικού ιστού και νεφρικής δυσλειτουργίας. και αυξημένο TGFb1 στο πλάσμα,νεφρικό ιστόκαι τα ούρα. Η αύξηση στην ούρα απέκκριση πρωτεϊνών, TGFb1 και ενεργοποίηση του συστήματος συμπληρώματος μπορεί να εξηγήσει την ταυτόχρονη ανάπτυξη διάμεσης ουλής στο παρόν μοντέλο μας.37-40 Περαιτέρω πειράματα αποκάλυψαν αυξημένα αποπτωτικά κύτταρα και ενεργοποίηση πρωτεϊνών Smad στον νεφρικό ιστό από μη επεξεργασμένο TGFb {3}}Ποντίκια TG σε σύγκριση με ποντίκια WT. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα δείχνουν αυτό το νέο ποντίκι TGFb1-TG ως κατάλληλο μοντέλο για ανακάλυψη φαρμάκων σείνωση των νεφρών.

Εικόνα 7|Ο συζευγμένος υποδοχέας G-protein (GPR15) μεσολαβεί στην αναστολή της απόπτωσης ανασυνδυασμένης ανθρώπινης θρομβομοντουλίνης (rhTM) στα ποδοκύτταρα. Ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα ποδοκυττάρων επιμολύνθηκαν με υποδοχέα ινοβλαστικού αυξητικού παράγοντα 1 (FGFR1) μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA), GPR15 siRNA ή ανακατεμένο siRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια προστέθηκε rhTM στην κυτταροκαλλιέργεια 1 ώρα πριν από την επεξεργασία με αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού b1 (TGFb1). Τα αποπτωτικά κύτταρα (α) αξιολογήθηκαν με συναδέλφους κυτταρομετρία και (β) στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκαν. (γ) Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για στύπωμα Western. n{{1{0}} σε κάθε ομάδα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσος ± διατεταρτημοριακό εύρος. Στατιστική ανάλυση με Mann-Whitney U test. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="" φυσιολογικός="">

Εικόνα 8|Αναστολή επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης από ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM). (α) Η Podocin και η ακτίνη α-λείου μυός (a-SMA) χρωματίστηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (β) Η θετική περιοχή για χρώση a-SMA προσδιορίστηκε ποσοτικά με το λογισμικό επεξεργασίας εικόνας WinROOF. n=3 σε ομάδες άγριου τύπου (WT)/αλατούχου (SAL) και WT/rhTM και n=5 σεμετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-b1-διαγονιδιακό(TGFb{{0}}TG)/SAL και TGFb1-TG/rhTM ομάδες. (γ) Ολικές (t) και φωσφορυλιωμένες (ρ) πρωτεΐνες μέλους της οικογένειας SMAD (Smad) αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western. n=8 σε κάθε ομάδα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσος ± διατεταρτημοριακό εύρος. Στατιστική ανάλυση με ανάλυση διακύμανσης Kruskal-Wallis και διορθωμένη δοκιμή Dunn. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0,08." για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="" διεύθυνση="">

Το rhTM βελτιώνει την ίνωση των νεφρών

Έχουμε δείξει ότι η rhTM βελτιώνει την πνευμονική ίνωση που αναπτύχθηκε σε ποντίκια που υπερεκφράζουν ανθρώπινο TGFb1 στους πνεύμονες καταστέλλοντας την απόπτωση κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων.41 Κλινικές δοκιμές έχουν επίσης δείξει βελτίωση της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης μετά από θεραπεία rhTM. για θεραπεία ίνωσης οργάνων. Υποθέσαμε ότι η rhTM θα ήταν αποτελεσματική στη σχετιζόμενη με TGFb1- ίνωση των νεφρών. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, αντιμετωπίσαμε ποντίκια TGFb1-TG ειδικά για τα νεφρά με rhTM.44 Η χορήγηση rhTM για 4 εβδομάδες μείωσε σημαντικά τον τραυματισμό, τη δυσλειτουργία και την ίνωση των νεφρών. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με rhTM εμφάνισαν χαμηλά επίπεδα ολικής πρωτεΐνης, λευκωματίνης, TGFb1, C5a και μειωμένα νεφρικά επίπεδα προφιβρωτικών κυτοκινών, C5a και HMGB1.45 Η θεραπεία με rhTM ανέστειλε επίσης τόσο την απόπτωση όσο και την EMT των ποδοκυττάρων. Ωστόσο, το rhTM δεν άσκησε καμία επίδραση στο σύμπλεγμα αντιθρομβίνης θρομβίνης, έναν δείκτη ενεργοποίησης της πήξης, αν και αύξησε τη δημιουργία του APC, ενός αντιπηκτικού παράγοντα με αντιφλεγμονώδη και αντιαποπτωτική δράση.23 Αξίζει να σημειωθεί ότι η θρομβίνη, το προπηκτικό ένζυμο, μπορεί παραδόξως προάγουν την αντιπηκτική δράση σε χαμηλού βαθμού προθρομβωτικές καταστάσεις σχηματίζοντας το σύμπλεγμα ΤΜ/θρομβίνης, το οποίο αυξάνει την παραγωγή του αντιπηκτικού APC. Ωστόσο, η θρομβίνη λειτουργεί κυρίως ως προπηκτικό σε υπερβολικές προθρομβωτικές καταστάσεις (π.χ. σήψη).46 Αυτή η διπλή και παράδοξη επίδραση της θρομβίνης μπορεί να εξηγήσει τη φαινομενική ανεπάρκεια της rhTM στην αναστολή της ενεργοποίησης της πήξης στο μοντέλο μας, το οποίο βρίσκεται σε χαμηλή προθρομβωτική κατάσταση. . Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι το rhTM amelio-ρυθμίζει την προοδευτική ίνωση και τη δυσλειτουργία τουνεφράμε την παράταση ή την πρόληψη της EMT των σπειραματικών κυττάρων και με την καταστολή της φλεγμονής, της ενεργοποίησης του συμπληρώματος και της δραστηριότητας του αυξητικού παράγοντα άμεσα ή έμμεσα μέσω ενεργοποίησης της οδού πρωτεΐνης C και μείωσης της έκφρασης HMGB1. Η βελτίωση της διαβητικής νεφροπάθειας σε ποντίκια με αυξημένη κυκλοφορούσα περιοχή παρόμοια με λεκτίνη ΤΜ και επιδείνωση της νόσου σε ποντίκια που δεν έχουν την περιοχή παρόμοια με λεκτίνη υποστηρίζουν την ευεργετική επίδραση της rhTM στη νεφρική ίνωση.20,21

Αναστολή της απόπτωσης των ποδοκυττάρων

Τα ποδοκύτταρα παίζουν κρίσιμους ρόλους στη διατήρηση του φραγμού σπειραματικής διήθησης και στο σχηματισμό του διαφράγματος της σχισμής για την πρόληψη της απώλειας βασικών πρωτεϊνών που κυκλοφορούν.47Νεφρική βλάβηπου προκαλείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου, υψηλή γλυκόζη ή φλεγμονώδεις μεσολαβητές, συμπεριλαμβανομένου του TGFb1, επάγει την απόπτωση των ποδοκυττάρων που οδηγεί σε εξάντληση των ποδοκυττάρων που μπορεί τελικά να προκαλέσει νεφρική δυσλειτουργία. , ο TGFb1 εκπέμπει ενδοκυτταρικά σήματα μέσω της οικογένειας των παραγόντων μεταγραφής Smad ή μέσω σηματοδοτικών μονοπατιών ανεξάρτητων από Smad.48 Η ενεργοποίηση της εξαρτώμενης από το Smad μονοπατιού συμβαίνει όταν ο ενεργοποιημένος υποδοχέας TGFb1 φωσφορυλιώνει τα Smad2 και Smad3, τα οποία με το Smad4 μετατοπίζονται στον πυρήνα Smad2/4. Το σύμπλεγμα Smad3/Smad4 διεγείρει τη μεταγραφή των προαποπτωτικών παραγόντων και μειώνει αυτή των αντιαποπτωτικών παραγόντων που οδηγούν σε κυτταρική απόπτωση.49 Σε συμφωνία με αυτό, βρήκαμε το υψηλό νεφρικό επίπεδο του προαποπτωτικού παράγοντα Bax και ένα χαμηλό επίπεδο των αντιαποπτωτικών παραγόντων Bcl2 και Bcl-XL σε ποντίκια TGFb1- TG. Το TM μπορεί να αναστείλει την απόπτωση διαφορετικών τύπων κυττάρων.21,41,49 Σύμφωνα με αυτό, εδώ βρήκαμε ότι η rhTM αναστέλλει την απόπτωση των ποδοκυττάρων που προκαλείται από υπεροξείδιο του υδρογόνου, υψηλή γλυκόζη ή TGFb1, και αυτό το εύρημα μπορεί να εξηγήσει την ευεργετική επίδραση της rhTM στη ΧΝΝ . Επιπλέον, η rhTM έγειρε την ισορροπία προς την αναστολή της απόπτωσης μειώνοντας την έκφραση του Bax, αυξάνοντας την έκφραση των Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 και BIRC6 και αυξάνοντας την ενεργοποίηση της οδού Akt στοιστούς των νεφρών. Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η rhTM διεγείρει την επιβίωση των ποδοκυττάρων ευνοώντας την ενεργοποίηση της Akt και την έκφραση αντιαποπτωτικού παράγοντα.

κιστάνα για χρόνια νεφρική νόσο

Αναστολή της EMT

Η ΕΜΤ των ποδοκυττάρων συμβάλλει επίσης στη νεφρική ίνωση. Τα ποδοκύτταρα που υποβάλλονται σε EMT απελευθερώνουν πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας που συσσωρεύονται και εναποτίθενται κατά τη διάρκεια της νεφρικής ινογένεσης που σχετίζεται με το TGFb1-. Το φωσφορυλιωμένο Smad3 προάγει την EMT διεγείροντας τη μεταγραφή των πρωτεϊνών μήτρας και μειώνοντας την έκφραση επιθηλιακών δεικτών.51 Σε συμφωνία με αυτό, βρήκαμε αυξημένο EMT ποδοκυττάρων σε TGFb1-TG ποντίκια και ποδοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν παρουσία TGFb1 ή κάτω οξειδωτικές συνθήκες ή συνθήκες υψηλής γλυκόζης. Προηγούμενες αναφορές υποδεικνύουν ότι η rhTM καταστέλλει την EMT.52,53 Εδώ βρήκαμε ότι η rhTM αναστέλλει την EMT των ποδοκυττάρων και των σωληναρισιακών ενδιάμεσων επιθηλιακών κυττάρων σε ποντίκια TGFb1-TG. Η αναστολή της ενεργοποίησης της πρωτεΐνης Smad φαίνεται να είναι ο μηχανισμός της ευεργετικής επίδρασης του rhTM στο EMT επειδή τα ποντίκια TGFb1-TG και τα πρωτογενή ποδοκύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με rhTM απεικόνισαν σημαντικά μειωμένη φωσφορυλίωση των Smad2 και Smad3 σε σύγκριση με καταστάσεις χωρίς θεραπεία. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την ανασταλτική δραστηριότητα του ΤΜ στο ΕΜΤ.

Μεσολάβηση υποδοχέα στην προστατευτική δραστηριότητα rhTM

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το GPR15 ή το FGFR1 μεσολαβεί στην κυτταροπροστατευτική δράση του ΤΜ.26,27,54 Δοκιμάσαμε εάν αυτοί οι υποδοχείς μεσολαβούν στην προστατευτική δράση του rhTM έναντι της απόπτωσης και του EMT. Ενώ η καθοδική ρύθμιση της πρωτεΐνης GPR15 από το siRNA κατήργησε πλήρως την κατασταλτική δραστηριότητα της rhTM στην απόπτωση των ποδοκυττάρων με τη μεσολάβηση του TGFb1-, ούτε το FGFR1 siRNA ούτε ο αναστολέας του την κατάργησαν, υποδηλώνοντας ότι το GPR15 μεσολαβεί στην προστατευτική δραστηριότητα rhTM. Υπήρξε ενισχυμένη φωσφορυλίωση του Akt σε καλλιεργημένα ποδοκύτταρα και ποδοκύτταρα που απομονώθηκαν από ποντίκια TGFb1-TG μετά από θεραπεία με rhTM, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή της ενδοκυτταρικής οδού Akt. Μια εργασία που δείχνει ότι η rhTM ενεργοποιεί την οδό Akt στα ενδοθηλιακά κύτταρα υποστηρίζει αυτό το εύρημα.55 Η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Akt μπορεί να ενισχύσει περαιτέρω το φαινόμενο rhTM αυξάνοντας την επιφανειακή έκφραση GPR15.56 Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η rhTM προστατεύει τα ποδοκύτταρα από την απόπτωση στο TGFb μας. {13}}Ποντίκια TG ενεργοποιώντας τον άξονα GPR15/Akt που οδηγεί σε ενισχυμένη έκφραση αντι-αποπτωτικών παραγόντων και μειωμένη έκφραση προαποπτωτικών παραγόντων.57 Από την άλλη πλευρά, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι οι αναφυλατοξίνες C3a και C5a μέσω των GPR τους μπορεί να συμβάλλουν στην Η ΧΝΝ με τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων και ότι η APC μπορεί να αναστείλει την απόπτωση των ποδοκυττάρων και την ίνωση των νεφρών μέσω του υποδοχέα της ενδοθηλιακής πρωτεΐνης C και του υποδοχέα που ενεργοποιείται από πρωτεάση 1.23,58-61 Εδώ, βρήκαμε ότι η rhTM αναστέλλει το σύστημα συμπληρώματος και αυξάνει τη δημιουργία APC. Επομένως, εκτός από την ενεργοποίηση της οδού GPR15/Akt, η αναστολή των παραγόντων του συμπληρώματος και η αυξημένη ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C και των υποδοχέων της μπορεί επίσης να εξηγήσει τις ευεργετικές επιδράσεις της rhTM στο TGFb1-που σχετίζεταιμοντέλο ινώδους νεφρού.

Επιπλέον, η μείωση της ρύθμισης του GPR15 αλλά όχι εκείνη του FGFR1 εμπόδισε την ανασταλτική επίδραση του rhTM στο EMT, υποδηλώνοντας ότι το GPR15 μεσολαβεί επίσης σε αυτήν την προστατευτική δραστηριότητα rhTM. Η αναστολή των πρωτεϊνών Smad εμπλέκεται στην καταστολή του EMT επειδή η θεραπεία με rhTM ανέστειλε τη φωσφορυλίωση τόσο του Smad2 όσο και του Smad3 σε ποντίκια TGFb1-TG και σε καλλιεργημένα ποδοκύτταρα. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της αναστολής της πρωτεΐνης Smad μέσω GPR15 είναι ασαφής. Ορισμένα στοιχεία δείχνουν ότι η οδός Akt μπορεί να αλληλεπιδρά και να ρυθμίζει την οδό σηματοδότησης Smad,62–64 και ότι η Akt μπορεί να αποτρέψει τη φωσφορυλίωση του Smad3 αλληλεπιδρώντας απευθείας με το μη φωσφορυλιωμένο Smad3 για να το απομονώσει έξω από τον πυρήνα, οδηγώντας σε αναστολή της μεταγραφής και της EMT.62– 64 Με βάση αυτές τις αναφορές, είναι κατανοητό ότι το Akt ενεργοποιήθηκε μετά τη δέσμευση rhTM σε απομονωτές GPR15 μη φωσφορυλιωμένου Smad3 οδηγώντας σε αναστολή της EMT των ποδοκυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτή η μεσολαβούμενη από το Akt ευεργετική δράση παρατηρείται μόνο σε μη κακοήθη κύτταρα.65–67 Σε κακοήθη κύτταρα, η αλληλεπίδραση του TGFb1 με τους υποδοχείς του μπορεί να ενεργοποιήσει άμεσα την οδό φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης/Akt/Σαλιγκάρι και να προκαλέσει EMT.65–67 Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης μας υποστηρίζουν τον ρόλο του GPR15 ως υποδοχέα που μεσολαβεί στις ευεργετικές επιδράσεις του rhTM στα ποδοκύτταρα.

συμπέρασμα

Συνοπτικά, εδώ αναφέρουμε για πρώτη φορά ένα νέο διαγονιδιακό ποντίκι TG που υπερεκφράζει το πλήρους μήκους του ανθρώπινου γονιδίου TGFb1 ειδικά σε σπειράματα που αναπτύσσουν αυθόρμητη και προοδευτική σπειραματική σκλήρυνση, σωληνοειδή διάμεση ίνωση καιΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑκαι βελτίωση της εγκατεστημένης ινώδους νεφρού/νεφρικής ανεπάρκειας μέσω αλληλεπίδρασης rhTM με το GPR15 που αναστέλλει την απόπτωση και τη μεσεγχυματική μετάβαση των ποδοκυττάρων.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Δημιουργία του ποντικιού TGFb1 BAC TG

TGFb1-Ποντίκι BAC-TG που εκφράζει το πλήρους μήκους ανθρώπινο γονίδιο TGFb1 υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ποδοκίνης ποντικού, δημιουργήθηκε με προπυρηνική ένεση σε 392 έμβρυα ποντικού C57BL/6J (CLEA Japan, Inc., Τόκιο, Ιαπωνία). Αξιολογήσαμε τους ιδρυτές TG και τη μετάδοση της βλαστικής γραμμής του κατασκευάσματος BAC TG με στύπωμα Southern (Συμπληρωματικά Υλικά και Μέθοδοι).

πειραματόζωα

Τα ποντίκια TGFb1-TG εκτράφηκαν για περισσότερες από 10 γενιές κάτω από το υπόβαθρο C57BL/6 πριν χρησιμοποιηθούν στα πειράματα. Τα νεογνά WT χρησιμοποιήθηκαν ως ζώα ελέγχου. Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο περιβάλλον απαλλαγμένο από παθογόνα και υποβλήθηκαν σε κύκλο φωτός-σκότους 12-ώρας σε θερμοκρασία και υγρασία περιβάλλοντος που κυμαίνεται μεταξύ 22 βαθμών και 26 βαθμών και 40 τοις εκατό και 70 τοις εκατό , και με ad libitum πρόσβαση σε τροφή και νερό στο σπίτι των ζώων του Πανεπιστημίου Mie (Συμπληρωματικά Υλικά και Μέθοδοι).

Ηθική δήλωση

Η Επιτροπή Ασφάλειας του Πειράματος Ανασυνδυασμένου DNA (αρ. έγκρισης I-629· ημερομηνία: 19 Σεπτεμβρίου 2013) και η Επιτροπή για τη διερεύνηση των ζώων του Πανεπιστημίου Mie (αρ. έγκρισης 27-4· ημερομηνία: 19 Αυγούστου 2015) ενέκρινε τα πρωτόκολλα της μελέτης. Όλες οι επεμβάσεις σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις θεσμικές οδηγίες του Πανεπιστημίου Mie και ακολουθώντας τις διεθνώς εγκεκριμένες αρχές εργαστηριακής φροντίδας ζώων που δημοσιεύθηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (https://olaw.nih.gov/).

Για την κλινική έρευνα, δόθηκε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς και τα υγιή άτομα και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας για την Κλινική Έρευνα του Πανεπιστημίου Mie (αρ. έγκρισης 1043 και 2194).

Πειραματικό σχέδιο

Για τον χαρακτηρισμό τουνεφρόμοντέλο ίνωσης, κατανείμαμε τα αρσενικά TGFb{{{0}}TG ποντίκια (n=24) και τα αρσενικά ποντίκια WT (n=12) ηλικίας 4 εβδομάδων και βάρους 20 έως 23 g σε 3 ομάδες με 8 ποντίκια TGF b1-TG και 4 ποντίκια WT σε κάθε ομάδα. Ποντίκια από κάθε ομάδα WT και TGFb1-TG υποβλήθηκαν σε ευθανασία τις εβδομάδες 0, 8 ή 16 για τη συλλογή δειγμάτων ούρων, αίματος και νεφρών για την αξιολόγηση των αλλαγών στην ίνωση και τις παραμέτρους της νεφρικής λειτουργίας με την πάροδο του χρόνου.

Για να αξιολογηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του rhTM (το rhTM παρασχέθηκε ευγενικά από την Asahi Kasei Pharma Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) σε νεφρική ίνωση, ποντίκια TGFb1-TG (n= 8) ή συγγενείς WT (n {{2 }}) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με rhTM (3 mg/kg) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση, 3 φορές την εβδομάδα κατά τη διάρκεια των 4 εβδομάδων πριν από τη θανάτωση των ποντικών. Τα ποντίκια TGFb1-TG (n =8) ή τα νεογνά WT (n= 8) ​​που έλαβαν ίση ποσότητα φυσιολογικού SAL με ενδοπεριτοναϊκή ένεση χρησιμοποιήθηκαν ως ποντίκια αρνητικού ελέγχου.

Το πρωτόκολλο της παρούσας μελέτης ακολούθησε τις κατευθυντήριες γραμμές Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) για έρευνα σε ζώα. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν και οι ερευνητές που μέτρησαν παραμέτρους τυφλώθηκαν σε ομάδες θεραπείας.

Βιοχημική ανάλυση

Οι συγκεντρώσεις της ολικής πρωτεΐνης (κιτ ανάλυσης πρωτεΐνης BCA, Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), χημειοελκυστική πρωτεΐνη μονοκυττάρων-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), σύμπλεγμα θρομβίνης αντιθρομβίνης (Cedarlane Laboratories, Hornby, Οντάριο, Καναδάς) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Συμπληρωματικά Υλικά και Μέθοδοι).

Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα πρωτογενή κύτταρα ανθρώπινου ποδοκυττάρου αγοράστηκαν από την CELPR OGEN (Torrance, CA). Πρωτεύοντα κύτταρα ανθρώπινων ποδοκυττάρων καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς. Το μέσο συμπληρώθηκε με 10 τοις εκατό απενεργοποιημένο με θερμότητα εμβρυϊκό βόειο ορό (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 IU/ml πενικιλίνη, 100 mg/ml στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη (Συμπληρωματικά Υλικά και Μέθοδοι).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως διάμεσο ± διατεταρτημόριο εύρος. Η στατιστική διαφορά μεταξύ των μεταβλητών υπολογίστηκε με ανάλυση διακύμανσης Kruskal-Wallis με ανάλυση post hoc χρησιμοποιώντας το τεστ Dunn. Το τεστ Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθούν οι διαφορές μεταξύ 2 ομάδων. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας την έκδοση 8 του GraphPad Prism.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκε ως P <>

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ

Το ECG, το CND-G και το YY έχουν δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για το ποντίκι TGFb1-TG μενεφρική ίνωσηπου χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη. Οι CND-G και YY έλαβαν επιχορήγηση από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστήμης και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας για την παρούσα μελέτη. Τα ECG, TY, CND-G και MT έλαβαν επιχορήγηση από τη Shionogi Pharmaceuticals. Όλοι οι άλλοι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε εν μέρει από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστήμης και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (Kakenhi αρ. 17K09824 για YY· Kakenhi αρ. 17K08442 για CND-G) και εν μέρει από επιχορήγηση από τη Shionogi & Co, Ltd., Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, στην ανάλυση δεδομένων, στην απόφαση για δημοσίευση ή στην προετοιμασία του χειρογράφου.

Μέρος αυτής της εργασίας δημοσιεύτηκε σε αφηρημένη μορφή.

ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΕΣ ΣΥΓΓΡΑΦΕΩΝ

Το AT ετοίμασε το μοντέλο της νόσου και έγραψε το πρώτο προσχέδιο του χειρογράφου. Τα TY, KN, TT, RI και CND-G προετοίμασαν τα μοντέλα ασθένειας και μέτρησαν τις παραμέτρους. Οι AM και SW πραγματοποίησαν τη μικροσκοπική μελέτη μετάδοσης. Οι MT, YO και AU μέτρησαν παραμέτρους και πραγματοποίησαν τα πειράματα in vitro. Οι YT, LQ, TK και VFD παρείχαν πνευματικές συνεισφορές. Το YY και το ΗΚΓ διόρθωσαν το προσχέδιο του χειρογράφου και σχεδίασαν τη μελέτη.

κιστάνος ​​για συμπτώματα νεφρικής ανεπάρκειας

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Συμπληρωματικό Αρχείο (PDF) Συμπληρωματικό Υλικό και Μέθοδοι.

Πίνακας S1. Χαρακτηριστικά των θεμάτων.

Πίνακας S2. Εκκινητές για RT-PCR ιστών ποντικού.

Πίνακας S3. Εκκινητές για RT-PCR ανθρώπινων ποδοκυττάρων.

Εικόνα S1. Τα διαλυτά θραύσματα θρομβομοντουλίνης συσχετίζονται με τον TGFb1 και την κρεατινίνη σε ασθενείς με ΣΔ.

Εικόνα S2. Κατασκεύασμα ανθρώπινου TGFb1-βακτηριακού τεχνητού χρωμοσώματος (BAC). Εικόνα S3. Ιδρυτικά ποντίκια που εκφράζουν το πλήρους μήκους του ανθρώπινου γονιδίου TGFb1.

Εικόνα S4. Χαρακτηρισμός του ειδικού για το σπειράμα μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα b1 διαγονιδιακού ποντικού.

Εικόνα S5. Το ανθρώπινο διαγονιδιακό ποντίκι TGFb1 έχει αυξημένους δείκτες νεφρικής βλάβης.

Εικόνα S6. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) μειώνει την εξάλειψη των ποδοκυττάρων και την πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης.

Εικόνα S7. Τα διαγονιδιακά ποντίκια TGFb1 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) έχουν χαμηλή συγκέντρωση προφιβρωτικών παραγόντων και HMGB1 στον νεφρικό ιστό. Εικόνα S8. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αυξάνει την παραγωγή ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C, αναστέλλει το σύστημα συμπληρώματος, μειώνει την κυκλοφορούσα διαλυτή ποδοκίνη, αν και δεν ασκεί καμία επίδραση στο σύστημα πήξης σε διαγονιδιακά ποντίκια TGFb1.

Εικόνα S9. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) μειώνει τη συγκέντρωση της ποδοκίνης στα ούρα.

Εικόνα S10. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) μειώνει την απόπτωση των σπειραματικών κυττάρων.

Εικόνα S11. Η θεραπεία της ινώδους νεφρού που σχετίζεται με υπερέκφραση του TGFb1- με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αναστέλλει την απόπτωση στον νεφρικό ιστό.

Εικόνα S12. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αυξάνει την έκφραση των αντιαποπτωτικών παραγόντων στα ποδοκύτταρα.

Εικόνα S13. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) καταστέλλει την απόπτωση των ποδοκυττάρων που προκαλείται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου.

Εικόνα S14. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) καταστέλλει την απόπτωση των ποδοκυττάρων που προκαλείται από υψηλά επίπεδα γλυκόζης.

Εικόνα S15. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αυξάνει την ενεργοποίηση των οδών Akt στα ποδοκύτταρα.

Εικόνα S16. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αυξάνει τη φωσφορυλίωση Akt σε ποδοκύτταρα από ποντίκια TGFb1-TG.

Εικόνα S17. Ποδοκύτταρα από κάθε ομάδα θεραπείας ποντικών εκφράζουν GPR15 mRNA.

Εικόνα S18. Χρώση του GPR15 σε ποδοκύτταρα από ένα υγιές άτομο και έναν ασθενή με εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρωση.

Εικόνα S19. Ο υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών-1 δεν εμπλέκεται στην ανασταλτική δραστηριότητα της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης θρομβομοντουλίνης (rhTM) στα ποδοκύτταρα.

Εικόνα S20. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αναστέλλει την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση των ποδοκυττάρων.

Εικόνα S21. Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη (rhTM) αναστέλλει την έκφραση της ακτίνης α-λείου μυός στα νεφρικά σωληνάρια.

Εικόνα S22. Ο συζευγμένος υποδοχέας G-protein (GPR15) μεσολαβεί στην ανασταλτική δράση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης θρομβομοντουλίνης (rhTM) στην επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση των ποδοκυττάρων.

Συμπληρωματικές Αναφορές.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Χρόνια νεφρική νόσος. Νυστέρι. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli Μ, et al. Αξιολόγηση της παγκόσμιας κατάστασης της υγείας των νεφρών. ΤΖΑΜΑ. 2017; 317: 1864–1881.

3. Levin Α, Tonelli Μ, Bonventre J, et αϊ. Παγκόσμια υγεία των νεφρών 2017 και μετά: ένας οδικός χάρτης για το κλείσιμο των κενών στη φροντίδα, την έρευνα και την πολιτική. Νυστέρι. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Επιπολασμός, ανίχνευση, αξιολόγηση και διαχείριση χρόνιας νεφρικής νόσου. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz ΜΚ, et αϊ. Θεραπεία χρόνιας νεφρικής νόσου. Kidney Int. 2012; 81:351-362.

6. Breyer MD, Susztak K. Η επόμενη γενιά θεραπευτικών για τη χρόνια νεφρική νόσο. Nat Rev Drug Discov. 2016; 15:568–588.

7. Liu Y. Νεφρική ίνωση: νέες γνώσεις για την παθογένεση και τη θεραπεία. Kidney Int. 2006; 69:213-217.

8. Liu Y. Κυτταρικοί και μοριακοί μηχανισμοί νεφρικής ίνωσης. Nat Rev Nephrol. 2011; 7:684-696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. Ο περιορισμός της ενδοθηλιακής σηματοδότησης TGF-βήτα είναι επαρκής για τη μείωση της ενδοθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης και της ίνωσης στη ΧΝΝ. J Am Soc Nephrol. 2015; 26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et αϊ. Σηματοδότηση TGF-beta1/p53 στη νεφρική ινογένεση. Σήμα κυψέλης. 2018; 43:1–10.

11. Conway EM. Η θρομβομοντουλίνη και ο ρόλος της στη φλεγμονή. Semin Immunopathol. 2012; 34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Θρομβομοντουλίνη και αγγειακό ενδοθήλιο: γνώσεις για λειτουργικές, ρυθμιστικές και θεραπευτικές πτυχές. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Thrombomodulin συνδέει την πήξη με τη φλεγμονή και την ανοσία. Στόχοι φαρμάκων Curr. 2012; 13:421-431.

14. Roeen Ζ, Toda Μ, D'Alessandro-Gabazza CN, et αϊ. Η θρομβομοντουλίνη αναστέλλει την ενεργοποίηση των ηωσινόφιλων και των μαστοκυττάρων. Cell Immunol. 2015; 293:34–40.

15. Takagi Τ, Taguchi Ο, Toda Μ, et αϊ. Η αναστολή του αλλεργικού βρογχικού άσθματος από τη θρομβομοντουλίνη προκαλείται από δενδριτικά κύτταρα. Am J Respir Crit Care Med. 2011; 183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Dual modulating functions of thrombomodulin in the alternative complement pathway. Biosci Trends. 2016; 10:231–234.

17. Toda Μ, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi Τ, et al. Η θρομβομοντουλίνη ρυθμίζει τα δενδριτικά κύτταρα τόσο μέσω των ανταγωνισμών της πρωτεΐνης Β1 της ομάδας υψηλής κινητικότητας όσο και μέσω ενός ανεξάρτητου μηχανισμού. Allergol Int. 2014; 63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Η περιοχή που μοιάζει με λεκτίνη της θρομβομοντουλίνης παρεμβαίνει στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος και προστατεύει από την αρθρίτιδα. J Thromb Haemost. 2006; 4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. Η διαλυτή θρομβομοντουλίνη προστατεύει τους ισχαιμικούς νεφρούς. J Am Soc Nephrol. 2009; 20:524-534.

20. Wang Η, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Η περιοχή που μοιάζει με λεκτίνη της θρομβομοντουλίνης βελτιώνει τη διαβητική σπειραματοπάθεια μέσω της αναστολής του συμπληρώματος. Thromb Haemost. 2012; 108:1141-1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, et αϊ. Η περιοχή 1 της θρομβομοντουλίνης βελτιώνει τη διαβητική νεφροπάθεια σε ποντίκια μέσω φλεγμονής που προκαλείται από αντι-NF-kappaB/NLRP3, ενίσχυσης της αντιοξειδωτικής δραστηριότητας NRF2 και αναστολής της απόπτωσης. Διαβητολογία. 2014; 57:424-434.

22. Ohlin AK, Larsson Κ, Hansson Μ. Διαλυτή δραστικότητα θρομβομοντουλίνης και διαλυτό αντιγόνο θρομβομοντουλίνης στο πλάσμα. J Thromb Haemost. 2005; 3: 976-982.

23. Gil-Bernabe Ρ, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda Μ, et al. Η εξωγενής ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C αναστέλλει την εξέλιξη της διαβητικής νεφροπάθειας. J Thromb Haemost. 2012; 10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et αϊ. Βελτίωση του διαβήτη με πρωτεΐνη S. Διαβήτης. 2016; 65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Απόπτωση και οξεία νεφρική βλάβη. Kidney Int. 2011; 80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen ΡΚ, et αϊ. Ο FGFR1 μεσολαβεί στην αγγειογένεση που προκαλείται από την περιοχή ανασυνδυασμένης θρομβομοντουλίνης. Cardiovasc Res. 2015; 105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. Η πέμπτη περιοχή που μοιάζει με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα της θρομβομοντουλίνης ανακουφίζει τη σήψη που προκαλείται από LPS μέσω της αλληλεπίδρασης με το GPR15. Thromb Haemost. 2017; 117:570-579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, et al. Ταυτοποίηση σε όλο το γονιδίωμα γονιδίων που είναι απαραίτητα για τους κυτταροσκελετούς των ποδοκυττάρων με βάση την αλληλουχία RNA μονοκυττάρου. Kidney Int. 2017; 92:1119-1129.

29. Vigolo Ε, Marko L, Hinze C, et αϊ. Η κανονική σηματοδότηση BMP σε σωληναριακά κύτταρα μεσολαβεί στην αποκατάσταση μετά από οξεία νεφρική βλάβη. Kidney Int. 2019; 95:108–122.

30. Nangaku M. Χρόνια υποξία και σωληνοειδής διάμεσος τραυματισμός: μια τελική κοινή οδός προς νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Η χρόνια νεφρική νόσος και οι επιπλοκές της. Prim Care. 2008; 35:329–344, vii.

32. Mozes ΜΜ, Bottinger ΕΡ, Jacot ΤΑ, et αϊ. Νεφρική έκφραση πρωτεϊνών ινώδους μήτρας και ισομορφών μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα βήτα (TGF-beta) σε διαγονιδιακά ποντίκια TGF-βήτα. J Am Soc Nephrol. 1999; 10:271-280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. Η κινητήρια πρωτεΐνη Myo1c ρυθμίζει τον μετασχηματιστικό αυξητικό παράγοντα-βήτα σηματοδότηση και την ίνωση στα ποδοκύτταρα. Kidney Int. 2019; 96:139–158.

34. Ebefors Κ, Wiener RJ, Yu L, et αϊ. Ο υποδοχέας ενδοθηλίνης-Α μεσολαβεί στην αποικοδόμηση της σπειραματικής ενδοθηλιακής επιφανειακής στιβάδας μέσω παθολογικής διασταύρωσης μεταξύ ενεργοποιημένων ποδοκυττάρων και σπειραματικών ενδοθηλιακών κυττάρων. Kidney Int. 2019; 96:957–970.

35. Fu J, Lee Κ, Chuang ΡΥ, et αϊ. Βλάβη σπειραματικών ενδοθηλιακών κυττάρων και διασταυρούμενη ομιλία στη διαβητική νεφρική νόσο. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287– F297.

36. Masum ΜΑ, Ichii Ο, Elewa ΥΗΑ, et αϊ. Η τροποποιημένη ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης αποκαλύπτει παθολογική διασταύρωση μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων και ποδοκυττάρων σε ένα μοντέλο ποντικού μεμβρανοπολλαπλασιαστικής σπειραματονεφρίτιδας. Sci Rep. 2018; 8:10276.

37. Abbate Μ, Zoja C, Rottoli D, et al. Τα εγγύς σωληναριακά κύτταρα προάγουν την ινογένεση με τη μεσολάβηση του TGF-βήτα1-επαγωγής περισωληναριακών μυοϊνοβλαστών. Kidney Int. 2002; 61: 2066-2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Τραυματισμός νεφρικού σωληνίσκου: κινητήρια δύναμη προς τη χρόνια νεφρική νόσο. Kidney Int. 2018; 93:568–579.

39. Loefffler I, Wolf G. Μετασχηματισμός αυξητικού παράγοντα-βήτα και η εξέλιξη της νεφρικής νόσου. Μεταμόσχευση Nephrol Dial. 2014; 29 (suppl 1): i37–i45.

40. Murakami Κ, Takemura Τ, Hino S, et αϊ. Αυξητικός παράγοντας-βήτα μετασχηματισμού ούρων σε ασθενείς με σπειραματικά νοσήματα. Pediatr Nephrol. 1997, 11:334-336.

41. Fujiwara Κ, Kobayashi Τ, Fujimoto Η, et αϊ. Αναστολή κυτταρικής απόπτωσης και βελτίωση της πνευμονικής ίνωσης από θρομβομοντουλίνη. Am J Pathol. 2017; 187:2312–2322.

42. Kataoka Κ, Taniguchi Η, Kondoh Υ, et αϊ. Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θρομβομοντουλίνη σε οξεία έξαρση της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης. Στήθος. 2015; 148:436-443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Θρομβομοντουλίνη για οξείες παροξύνσεις ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης: μελέτη απόδειξης της ιδέας. Pulm Pharmacol Ther. 2014; 29:233-240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Βέλτιστη επιλογή ασθενών για αντιπηκτική θεραπεία στη σήψη: μια πρόταση βασισμένη σε στοιχεία από την Ιαπωνία. J Thromb Haemost. 2018; 16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, et al. Ο ρόλος της ομάδας υψηλής κινητικότητας κουτιού 1 (HMGB1) στην παθογένεση των νεφρικών παθήσεων. Acta Pharm Sin B. 2016; 6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi Τ, et al. Δοσοεξαρτώμενες διαφορικές επιδράσεις της θρομβίνης στο αλλεργικό βρογχικό άσθμα. J Thromb Haemost. 2013, 11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner Ν, Skorecki KL, et αϊ. Νέες γνώσεις για τη βιολογία των ποδοκυττάρων στην υγεία και τη νόσο των σπειραμάτων. J Am Soc Nephrol. 2017, 28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang ΥΕ. Μονοπάτια που εξαρτώνται από το Smad και τα ανεξάρτητα από το Smad στη σηματοδότηση της οικογένειας TGF-beta. Φύση. 2003; 425:577-584.

49. Schuster Ν, Krieglstein Κ. Mechanisms of TGF-beta-mediated apoptosis. Cell Tissue Res. 2002; 307:1-14.

50. Greka A, Mundel P. Κυτταρική βιολογία και παθολογία των ποδοκυττάρων. Annu Rev Physiol. 2012; 74:299-323.

51. Isaka Y. Targeting TGF-beta signaling in νεφρική ίνωση. Int J Mol Sci. 2018; 19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, et al. Η θρομβομοντουλίνη επηρεάζει την επιβίωση ασθενών με μη μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της μετάβασης από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό (EMT). PLoS One. 2016; 11: e0160550.

53. Zheng Ν, Huo Ζ, Zhang Β, et αϊ. Η θρομβομοντουλίνη μειώνει το ογκογονικό και μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης της Ε-καντερίνης και της προς τα κάτω ρύθμισης της έκφρασης της Ν-καντερίνης. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. Ο συζευγμένος με πρωτεΐνη G υποδοχέας 15 μεσολαβεί στην αγγειογένεση και στην κυτταροπροστατευτική λειτουργία της θρομβομοντουλίνης. Sci Rep. 2017; 7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. Η ανασυνδυασμένη θρομβομοντουλίνη ασκεί αντι-αυτοφαγική δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα και παρέχει δράση κατά της αθηροσκλήρωσης σε ποντίκια με έλλειψη απολιποπρωτεΐνης Ε. Sci Rep. 2017; 7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Υ, Coblitz Β, et αϊ. Η επιφανειακή έκφραση πρωτεΐνης με τη μεσολάβηση σηματοδότησης PI3K/Akt ανιχνεύεται από αλληλεπιδρώντα μοτίβα 14-3-3. FEB J. 2009; 276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Διπλός ρόλος για τον TGF-beta1 στην απόπτωση. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16:15-34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C, ενεργοποιημένος από πρωτεάση υποδοχέας 1 και νευροπροστασία. Αίμα. 2018; 132:159–169.

59. Isermann Β, Vinnikov ΙΑ, Madhusudhan Τ, et αϊ. Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C προστατεύει από τη διαβητική νεφροπάθεια αναστέλλοντας την απόπτωση του ενδοθηλίου και των ποδοκυττάρων. Nat Med. 2007, 13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Ο ρόλος των αναφυλατοξινών στην υγεία και τις ασθένειες. ΜοΙ Immunol. 2009; 46:2753-2766.

61. Morigi Μ, Perico L, Corna D, et al. Ο αποκλεισμός του υποδοχέα C3a προστατεύει τα ποδοκύτταρα από τραυματισμό στη διαβητική νεφροπάθεια. JCI Insight. 2020; 5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson ΕΑ, et αϊ. Το Akt αλληλεπιδρά απευθείας με το Smad3 για να ρυθμίσει την ευαισθησία στην απόπτωση που προκαλείται από τον TGF-beta. Nat Cell Biol. 2004; 6:366-372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn ΚΥ. Συνεργασία οδού σηματοδότησης στην επαγόμενη από TGF-βήτα επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση. Curr Opin Cell Biol. 2014; 31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. Το PKB/Akt διαμορφώνει τη σηματοδότηση TGF-beta μέσω μιας άμεσης αλληλεπίδρασης με το Smad3. Nat Cell Biol. 2004, 6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. Ο TGF-βήτα προάγει τη σηματοδότηση PI3K-AKT και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη μέσω της διαμεσολαβούμενης από TRAF6-ουβικιυλίωσης του p85alpha. Sci Signal. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Ζ, Weber JC, Han Ζ, et αϊ. Επιδράσεις διχοτομίας της σηματοδότησης Akt στον καρκίνο του μαστού. Μολ Καρκίνος. 2012; 11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. Η σηματοδότηση FAM83A προκαλεί επιθηλιακή μεσεγχυματική μετάβαση μέσω της οδού PI3K/AKT/Snail στο NSCLC. Aging (Albany NY). 2019; 11:6069–6088.