Οι επιδράσεις λεύκανσης του δέρματος της εκτοΐνης μέσω της καταστολής της διεγειρόμενης από -MSH μελανογένεσης και της ενεργοποίησης των αντιοξειδωτικών οδών Nrf2 σε κερατινοκύτταρα ακτινοβολημένα με UVA

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1, Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 και Hsin-Ling Yang 8,*

Αφηρημένη:Η παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία Α (UVA) προκαλεί υπερβολικήμελανογένεσηστα κύτταρα του δέρματος που οδηγεί σε μελάγχρωση. Επιδείξαμε τις αποχρωματιστικές και αντι-μελανογονικές επιδράσεις της Ectoine, ενός φυσικού βακτηριακού οσμολύτη, σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ακτινοβολημένα με UVA (HaCaT) και διευκρινίστηκαν οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί. Τα κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με χαμηλές συγκεντρώσεις Εκτοΐνης (0.5–1,5 μΜ) και προσδιορίστηκαν για διάφορες παραμέτρους αποχρωματισμού και αντι-μελανογένεσης. Αυτή η προκαταρκτική θεραπεία μείωσε σημαντικά τη δημιουργία ROS, την παραγωγή της ορμόνης διέγερσης των μελανοκυττάρων (-MSH) και την έκφραση της προοπιομελανοκορτίνης (POMC) σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολήθηκαν με UVA. Επίσης,αντιοξειδωτικόΟι εκφράσεις πρωτεΐνης της οξυγενάσης της αίμης-1 (HO-1), της NAD(P)H αφυδρογονάσης [κινόνη 1] (NQO-1) και της καταλυτικής υπομονάδας της γλουταμινικής κυστεΐνης (-GCLC) ήταν διαμεσολαβείται μέσω της πυρηνικής μετατόπισης του πυρηνικού παράγοντα ερυθροειδούς2-σχετικού παράγοντα 2 (Nrf2) του οποίου η καταστροφή πράγματι εξασθενεί αυτό το αποτέλεσμα, υποδηλώνοντας τη σημασία της οδού theNrf2. Η εκτοΐνη μεσολαβούσε στην ενεργοποίηση του Nrf2 μέσω των οδών p38, πρωτεϊνικής κινάσης Β (επίσης γνωστή ως AKT), κινάσης πρωτεΐνης C (PKC) και κινάσης πρωτεΐνης κινάσης II της καζεΐνης (CKII). Το ρυθμισμένο μέσο που λήφθηκε από τα κύτταρα HaCaT που είχαν υποστεί προεπεξεργασία με Ectoine και ακτινοβολήθηκε με UVA μείωσε τηντυροσινάση, πρωτεΐνη που σχετίζεται με τυροσινάση-1 και -2 (TRP-1/-2), κυκλική πρωτεϊνική κινάση AMP (c-AMP), πρωτεΐνη δέσμευσης στοιχείων c-AMPresponse (CREB ), και εκφράσεις του μεταγραφικού παράγοντα (MITF) που σχετίζονται με τη μικροφθαλμία που οδηγούν σε κύτταρα μελανώματος B16F10 που ανέστειλαν τη σύνθεση μελανίνης. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η αντιμελανογόνος δράση σε κύτταρα B16F10 που διεγείρονται από -MSH ήταν παρατηρήσιμη μόνο σε συγκεντρώσεις 50-400 μM εκτοΐνης, υποδηλώνοντας τον βασικό ρόλο που διαδραματίζει το δέρμα κερατινοκυττάρων που έχει υποστεί επεξεργασία με εκτοΐνη (0,5-1 μΜ).λεύκανσηυπάρχοντα. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η Ectoine θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένας αποτελεσματικός τοπικός φυσικός καλλυντικός παράγοντας με αποχρωματιστική και αντιμελανογονική αποτελεσματικότητα.

Λέξεις-κλειδιά:Εκτοΐνη; κερατινοκύτταρα;μελανογένεση; τυροσινάση; -MSH; Nrf2

Το Cistanche έχει αντιοξειδωτική δράση.

1. Εισαγωγή

Η έκθεση του ανθρώπινου δέρματος στην ακτινοβολία UVA πυροδοτεί τη δημιουργία ROS και επίσης την υπερπαραγωγή μελανίνης στα κύτταρα του δέρματος. Η ανεξέλεγκτη παραγωγή ROS θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε καταστάσεις μελανώματος. Οι περισσότεροι λευκαντικοί παράγοντες του δέρματος στοχεύουν και προσπαθούν να ελαχιστοποιήσουν τομελανογένεσηδιαδικασία μέσω της αναστολής της -MSH καιτυροσινάσηπαραγωγές [1]. Οι περισσότερες κρέμες λεύκανσης του δέρματος αποτελούνται από υδροκινόνη [2] ή υδροκορτιζόνη [3], οι οποίες είναι γνωστό ότι μειώνουν τον σχηματισμό μελανίνης, αλλά συνδέονται επίσης με σοβαρές παρενέργειες. Για παράδειγμα, ακμή, ξεφλούδισμα και φαγούρα στο δέρμα, μπλε και μαύρος αποχρωματισμός του δέρματος, ωχρόνοια, ερεθισμός του δέρματος και τσούξιμο, ακόμη και φλεγμονή. Ωστόσο, το δέρμαλεύκανσηπαράγοντες από φυσικές πηγές, για παράδειγμα, το Kojic acid (ένα μυκητιακό παράγωγο που λαμβάνεται από τα είδη Penicillium και Aspergillus) αναφέρεται επίσης ότι προκαλεί «δερματίτιδα εξ επαφής» σε άτομα που έχουν ευαίσθητο δέρμα. Σε αυτά τα άτομα, περισσότερο από 1 τοις εκατό του kojic acid θα μπορούσε να προκαλέσει σοβαρές υπερευαίσθητες παρενέργειες [4,5]. Επομένως, μόνο λίγα φυσικά προερχόμενα δέρματαλεύκανσηπροϊόντα (ελαοσίνη, εκχύλισμα γλυκόριζας, ασκορβικό οξύ, πρωτεΐνη σόγιας, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη κ.λπ.) χρησιμοποιούνται επί του παρόντος στη βιομηχανία καλλυντικών [6]. Ωστόσο, τα προϊόντα περιποίησης δέρματος που στοχεύουν κυρίως τις ιδιότητες αποχρωματισμού έχουν κατά καιρούς αποτύχει να επικεντρωθούν στην εξουδετέρωση των βλαβερών επιπτώσεων που προκαλούνται από την υπερβολική παραγωγή ROS που προκαλείται από την ακτινοβολία UVAμελανογένεσηστα κύτταρα του δέρματος.

Η εκτοΐνη είναι ένας «φυσικός ακραίος λύτης» που παράγεται από διάφορα είδη μικροοργανισμών που υποπίπτουν στο στρες [7,8]. Αυτή η ένωση απομονώθηκε για πρώτη φορά από τα είδη βακτηρίων Ectothiorhodospira που ζουν στην αιγυπτιακή έρημο. Ο καταρράκτης των γονιδίων οπερονίου ect (ectA, ectB, ectC ή ectD) εμπλέκονται στην παραγωγή αυτής της ένωσης. Η εκτοΐνη χαρακτηρίζεται χημικά ως 1,4,5,6-τετραϋδρο-2-μεθυλ-4-πυριμιδινοκαρβοξυλικό οξύ [9]. Ως συνδετικό για την υγρασία, το Ectoine helpsin, την αναδόμηση της κυτταρικής μεμβράνης του δέρματος [10], την προστασία από βλάβες και τη ρύπανση από την υπεριώδη ακτινοβολία [11,12], την ενυδάτωση του δέρματος [13], την καθυστέρηση της πρόωρης γήρανσης του δέρματος [14], κ.λπ. για τα προστατευτικά του δέρματος, το Ectoine έχει αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμο στη θεραπεία της ατοπικής δερματίτιδας [15], της νόσου του Αλτσχάιμερ [16], καθώς και στην αναστολή της αναπαραγωγής του HIV [17], στο ραδιόφωνο και στη χημειοθεραπεία [18] και στην κίρρωση του ήπατος. 19]. Εικάζεται ότι η εκτοΐνη εμφανίζει τις αποχρωματιστικές της ιδιότητες και τις ιδιότητες λεύκανσης του δέρματος χωρίς να προκαλεί ανεπιθύμητες παρενέργειες [20]. Αντίθετα, οι μοριακοί μηχανισμοί που προκαλούνται από την Ectoine δεν είναι γνωστοί. Ως εκ τούτου, ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να οριοθετήσει τους μηχανισμούς αποχρωματισμού και αντιμελανογόνου με τη μεσολάβηση της εκτοΐνης που προκαλούνται σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ακτινοβολημένα με UVA (HaCaT) ως το σύστημα κυτταρικού μοντέλου. Η επίδραση των εκκρίσεων που προκαλούνται από την εκτοΐνη των παραγόντων προστασίας του δέρματος από τα κύτταρα HaCaT στο μέσο καλλιέργειας (ρυθμισμένο μέσο) δοκιμάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας μια τυπική σειρά κυττάρων μελανώματος (B16F10).

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Αντιδραστήρια και Αντισώματα

Η εκτοΐνη (αριθμός προϊόντος: 81619, καθαρότητα μεγαλύτερη από ή ίση με 95 τοις εκατό) αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (Taufkichen, Γερμανία). Εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS), πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη, τροποποιημένο Dulbecco's Eagle'smedium (DMEM) και 1-γλουταμίνη αγοράστηκαν από την Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, USA). l-DOPA, μελανίνη, 3-4,5-διμεθυλ-2-υλ-2,5-διφαινυλ τετραζόλιο βρωμίδιο (MTT) και -MSH προμηθεύτηκαν από τη Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) και 20,70-διχλωροφλουορεσκεΐνη-διοξεική (DCFH2-DA) προμηθεύτηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Όλοι οι φαρμακολογικοί αναστολείς που απαιτούνται για τα JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X) και CKII ελήφθησαν από την Calbiochem (La Jolla, CA, USA) λήφθηκε αναστολέας PI3K/AKT2402(LY) από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Όλα τα αντισώματα για POMC, CREB, -ακτίνη,τυροσινάση, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, πρωτεΐνη που σχετίζεται με ECH τύπου Kelch-1 (Keap-1), andTRP-1, TRP-2 ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Γερμανία). Τα αντισώματα κατά -GCLC και HO{10}} προμηθεύτηκαν από την Gene Tex Inc. (Σαν Αντόνιο, Τέξας, ΗΠΑ). Λάβαμε αντισώματα κατά της κινάσης πρωτεΐνης c-AMP και CKII από την Abcam (Cambridge, MA, ΗΠΑ). Οι ιστόνες, MITF, ρ-ρ38, ρ38, ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ ελήφθησαν από την Cell Signal Technology (Beverly, ΜΑ, ΗΠΑ). Τα αντιδραστήρια ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) ελήφθησαν από την Millipore, (Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια (σε βαθμό HPLC) είτε αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich ή τη Merck & Co., Inc. (Darmstadt, Γερμανία).

2.2. Κυτταρικής καλλιέργειας

Λάβαμε απαθανατισμένα κύτταρα ανθρώπινου δέρματος κερατινοκυττάρου HaCaT και μελανώματος ποντικού B16F10 τόσο από τις υπηρεσίες Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Γερμανία) όσο και από την American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό ενεργοποιημένο με θερμότητα FBS, 1 τοις εκατό στρεπτομυκίνη/πενικιλλίνη και 2 mM L-γλουταμίνη σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα συμπληρωμένο με 5 τοις εκατό CO2 στους 37 ◦C.

2.3. Θεραπείες κυττάρων και ακτινοβολία UVA

Πριν από την ακτινοβολία UVA, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με Ectoine (0.5–1,5 μΜ για 24 ώρες) ή φορέα (PBS). Μετά την επώαση, τα κύτταρα που πλύθηκαν με PBS εκτέθηκαν σε ακτινοβολίες UVA 3 J/cm2 (για 27 λεπτά, λmax, 365 nm, χωρίς ανιχνεύσιμες εκπομπές κάτω από 320 nm) χρησιμοποιώντας το UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec, Cambridge, ΗΒ) [21].

2.4. Ενδοκυττάριος προσδιορισμός ROS

Τα κύτταρα HaCaT σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1,5 × 105 σε θάλαμο 8-φρεατίου Lab Teck που περιείχε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και αναπτύχθηκαν σε συρροή 80 τοις εκατό. Αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν αρχικά σε επεξεργασία με 1,5 μΜ Ectoine και ακολούθησε έκθεση σε ακτινοβολία UVA 3 J/cm2 για το προκαθορισμένο χρονικό διάστημα. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και η μέθοδος DCFH2-DA χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS χρησιμοποιώντας το λογισμικό λύσης λογισμικού Olympus για κάθε κατάσταση [21].

2.5. Ποσοτικοποίηση μελανίνης

Σε μια πλάκα 6-πηγαδιού, κύτταρα μελανώματος B16F10 ποντικού σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2,5 × 105 κύτταρα/φρεάτιο. Υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 100, 200 και 400 μΜ Ectoine για 2 ώρες απουσία ή παρουσία -MSH (1 μΜ). Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της μελανίνης ακολούθησε μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Μετρήσαμε την περιεκτικότητα σε μελανίνη με τον αναγνώστη μικροπλάκας ELISA με μήκος κύματος απορρόφησης 470 nm.

Το κιστάνι αναστέλλει τη μελανίνη.

2.7. Western Blot

Τα κύτταρα HaCaT (1 × 106 κύτταρα/10 cm τρυβλίο) ή B16F10 (1 × 106 κύτταρα/πιάτο 10 cm) υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ποικίλες συγκεντρώσεις εκτοΐνης (0,5, 1 και 1,5 μΜ) ή -MSH (1 μΜ) ακολουθούμενη από ακτινοβολία απουσία ή παρουσία UVA για το προκαθορισμένο χρονικό διάστημα. Τα πλυμένα με PBS κύτταρα συλλέχθηκαν, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη (πυρηνική και κυτοσολική) απομονώθηκε μετά την επεξεργασία. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν στη μέθοδο Western blot που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως για τον προσδιορισμό των εκφράσεων διαφόρων πυρηνικών και κυτοσολικών πρωτεϊνών [21].

2.8. Εκχύλιση RNA και RT-PCR

Προκατεργασμένα με εκτοΐνη (1,5 μΜ, 24 ώρες) κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν στο αντιδραστήριο ΤΡΙζόλης (Invitrogen, Carlsbad) για την απομόνωση του συνολικού RNA από αυτά τα κύτταρα. 1 μg ολικού RNA και τα αντιδραστήρια που παρέχονται από το κιτ Taq πλατίνας SuperScript-III One-Step RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad) χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα PCR με το όργανο Bio-Rad iCycler PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, Ηνωμένες Πολιτείες). Οι εμπρόσθιοι και ανάστροφοι εκκινητές για το Nrf2 που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. Οι εμπρόσθιοι και οι ανάστροφοι εκκινητές για το GAPDH που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Στο τέλος του πειράματος, το προϊόν PCR αναλύθηκε χρησιμοποιώντας γέλη αγαρόζης 1 τοις εκατό. Στη συνέχεια, έγινε ορατό με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Ως εσωτερικό έλεγχο, χρησιμοποιήσαμε το GAPDH [22].

2.9. Δοκιμασία ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα HaCaT καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1 χ 104 κύτταρα/φρεάτιο σε συμπλήρωμα DMEM με 10 τοις εκατό FBS σε θάλαμο 8-φρεατίου Lab Tek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Προεπεξεργάσαμε τα κύτταρα με 1,5 μΜ Εκτοΐνης για τον υποδεικνυόμενο χρόνο ακολουθούμενη από ακτινοβολία απουσία ή παρουσία UVA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού, η οποία χρησιμοποιεί μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [21].

2.10. Στατιστική ανάλυση

Χρησιμοποιήσαμε τη μέση ± τυπική απόκλιση (μέση τιμή ± SD) για όλα τα αποτελέσματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από τη δοκιμή Dunnett για συγκρίσεις ανά ζεύγη και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SD τριών ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε σε * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" σε="" σύγκριση="" με="" μη="" επεξεργασμένα="" κύτταρα="" ελέγχου="" και="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" σε="" σύγκριση="" με="" τα="" εκτεθειμένα="" σε="" uva="" κύτταρα="" hacat="" ή="" τα="" κύτταρα="" b16f10="" που="" έχουν="" υποστεί="" αγωγή="" με="">

3. Αποτελέσματα

3.1. Η εκτοΐνη αναστέλλει τη δημιουργία ROS που προκαλείται από την UVA σε κύτταρα HaCaT

Πρώτον, δοκιμάσαμε για τις κυτταροτοξικές επιδράσεις της Ectoine (Εικόνα 1Α) σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολήθηκαν με UVA. Τα δεδομένα MTT μας έδειξαν ότι σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, η εκτοΐνη προκατεργάστηκε (0,5–1,5 μM) και 3 J/cm2 εκτεθειμένα σε UVA κύτταρα HaCaT δεν μπόρεσαν να δείξουν σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικόνα 1Β). Περαιτέρω, η προεπεξεργασία με εκτοΐνη εξασθένησε τον επαγόμενο από την UVA (3 J/cm2) κυτταρικό θάνατο με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 1Β). Εκτός από τα δεδομένα φθορισμού μας, τα οποία έδειξαν ότι, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, η ακτινοβολία 3 J/cm2 UVA και οι επεξεργασίες μόνο με Ectoine (1,5 μΜ) ρύθμισαν σημαντικά τα επίπεδα ROS κατά 5- και 2-πλάσια, αντίστοιχα. Ωστόσο, στην περίπτωση της Ectoinepretreatment τα επίπεδα ROS μειώθηκαν σημαντικά και μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η Ectoine έχειαντιοξειδωτικόεπίδραση κατά της ακτινοβολίας UVA. Αυτό προκαλεί επίσης βασικά επίπεδα ROS στα κύτταρα HaCaT (Εικόνα 1C, D).

3.2. Εκφράσεις κατασταλμένες με εκτοΐνη POMC και -MSH σε ακτινοβολημένα με UVA κύτταρα HaCaT

Τα κερατινοκύτταρα που εκτέθηκαν σε UVA διεγέρθηκαν για το POMC με τη μεσολάβηση ROS-p53 και επίσης μια ορμόνη μικρού πεπτιδίου -MSH που προέρχεται από το POMC [23]. Επομένως, προσδιορίσαμε τα μοτίβα μη έκφρασης αλλαγών του -MSH, POMC και άλλων σχετικών πρωτεϊνών σε κύτταρα HaCaT που είχαν υποστεί προεπεξεργασία με Ectoine και στη συνέχεια τα εκθέσαμε σε UVA (3 J/cm2). Τα δεδομένα στυπώματος Western έδειξαν ότι η επαγόμενη από την UVA ανοδική ρύθμιση των εκφράσεων -MSH και POMC μειώθηκε με προεπεξεργασία με εκτοΐνη. λαμβάνοντας υπόψη ότι, η αγωγή με εκτοΐνη χωρίς ακτινοβολία UVA έχει αναστείλει πλήρως τις εκφράσεις -MSH και POMC των μη ακτινοβολημένων κυττάρων HaCaT (Εικόνα 2Α). Αργότερα, δοκιμάσαμε την επίδραση του «ρυθμισμένου μέσου» (πλάκα 10 mL/100 mm), που λήφθηκε από τα κύτταρα HaCaT που είχαν υποστεί προεπεξεργασία με Ectoine και ακτινοβολημένα με UVA, στομελανογένεσητων κυττάρων μελανώματος B16F10. Το Σχήμα 2Β δείχνει αυτό το ρυθμισμένο μέσο που ρυθμίστηκε προς τα κάτωτυροσινάση, TRP-1, TRP-2, πρωτεϊνική κινάση c-AMP, p-CREB, CREB και MITF σε κύτταρα B16F10.

3.3. Έκφραση μελανίνης και τυροσινάσης με μειωμένη εκτοΐνη σε κύτταρα B16F10 που διεγείρονται από MSH

Τα κύτταρα μελανώματος B16F10 υποβλήθηκαν αρχικά σε υψηλότερες συγκεντρώσεις Εκτοΐνης και η επίδραση της κυτταροτοξικότητας προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι η εκτοΐνη δεν είχε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων B16F10 σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (100–400 μΜ για 72 ώρες). Ωστόσο, η βιωσιμότητα των κυττάρων δεν επηρεάστηκε στις 24 και 48 ώρες της θεραπείας με Ectoine (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επομένως, αυτές οι συγκεντρώσεις χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της επίδρασης της Εκτοΐνης σε διεγερμένο από -MSHμελανογένεσησε κύτταρα B16F10. Τα δεδομένα ποσοτικοποίησης της μελανίνης έδειξαν ότι, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, η θεραπεία μόνο με -MSH (1 μΜ) ρύθμισε σημαντικά τα επίπεδα μελανίνης κατά περισσότερο από 25 τοις εκατό. Ωστόσο, σε σύγκριση με τη θεραπεία μόνο με -MSH, τα κύτταρα που εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις εκτοΐνης (100–400 μM στις 72 ώρες) εξαρτώμενα από τη δόση και μείωσαν σημαντικά το ποσοστό της περιεκτικότητας σε μελανίνη με μέγιστη μείωση μόνο 85 τοις εκατό (ή -15 τοις εκατό από ό,τι χωρίς θεραπεία έλεγχος) παρατηρήθηκε στα 400 μM προεπεξεργασίας με εκτοΐνη (Εικόνα 3Β). Επιπλέον, τα δεδομένα στυπώματος Western μας έδειξαν επίσης ότι η -MSH διεγέρθηκετυροσινάσηΟι εκφράσεις (24 ώρες) και p-CREB (2 ώρες) ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα κάτω με αυξανόμενες συγκεντρώσεις προθεραπειών εκτοΐνης σε αυτά τα κύτταρα μελανώματος (Εικόνα 3C).

3.4. Η εκτοΐνη ρύθμισε την έκφραση των πρωτεϊνών HO-1, NQO-1 και -GCLC σε κύτταρα HaCaT

Για να προσδιοριστεί η επίδραση του χρόνου στην πυρηνική μετατόπιση του Nrf2 που προκαλείται από την εκτοΐνη και την επακόλουθη κατάντη έκφραση των πρωτεϊνών HO-1, NQO-1 και -GCLC, τα κύτταρα HaCaT εκτέθηκαν σε 1,5 μΜ Εκτοΐνη και οι κυτταρικές πρωτεΐνες συλλέχθηκαν 0.5, 1, 2, 4, 8 ή 12 ώρες μετά την εξωϊνοθεραπεία. Τα δεδομένα στυπώματος Western έδειξαν ότι εκτός από την πρωτεΐνη -GCLC, 1,5 μΜ Εκτοΐνη προκάλεσε τη μέγιστη έκφραση των πρωτεϊνών ΗΟ{-1, Nrf2 και NQO-1 στο χρονικό σημείο των 4 ωρών. -Το GCLC εμφανίστηκε σε χρονικό σημείο 8 ωρών (Εικόνα 5Α). Τα δεδομένα που λαμβάνονται από την καμπύλη χρόνου μας οδηγούν να ελέγξουμε την επίδραση της συγκέντρωσης της εκτοΐνης στην έκφραση τουαντιοξειδωτικόπρωτεϊνών σε χρονικό σημείο 4 ωρών. Το Σχήμα 5Β δείχνει ότι και οι τρεις αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες εμφάνισαν μέγιστη έκφραση σε 1,5 μΜ συγκέντρωσης Εκτοΐνης. Αργότερα, τα αποτελέσματα της προκατεργασίας με εκτοΐνη δοκιμάστηκαν στην έκφραση του λόγου Nrf2 και Keap-1 στα ακτινοβολημένα με UVA κύτταρα HaCaT. Η ανάλυση δεδομένων Western έδειξε ότι η προ-αγωγή με 1,5 μΜ Ectoine εμφάνισε αύξηση στην αναλογία Nrf2/Keap-1 σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολήθηκαν με UVA (Εικόνα 5C). Είδαμε επίσης συνεπή δεδομένα με την αυξημένη έκφραση του NQO Πρωτεΐνες -1, HO-1 και -GCLC σε κύτταρα HaCaT που υπέστησαν προεπεξεργασία με εκτοΐνη που ακτινοβολήθηκαν με 3 J/cm2 UVA (Εικόνα 5D). Αυτά τα δεδομένα συμπεραίνουν ότι η προεπεξεργασία με εκτοΐνη παίζει προστατευτικό ρόλο σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολούνται με UVA.

3.5. Διάφορες οδοί σηματοδότησης ενεπλάκησαν στην ενεργοποίηση του Nrf2 σε κύτταρα HaCaT που έλαβαν θεραπεία με εκτοΐνη

Προσδιορίσαμε τα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην πυρηνική μετατόπιση του Nrf2 που προκαλείται από την εκτοΐνη. Τα κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φαρμακολογικούς αναστολείς των μονοπατιών σηματοδότησης PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS και CKII, ακολουθούμενα από 1,5 μM Ectoine. Δεδομένα Western blot του πυρηνικού Nrf2 έδειξαν ότι οι οδοί της ρ38 MAPK, PI3K/AKT, PKC και CKII εμπλέκονται σε αυτόν τον μηχανισμό (Εικόνα 6Α). Από τις πληροφορίες που ελήφθησαν, προσδιορίσαμε επίσης την επίδραση της προκατεργασίας με Ectoine στον ρόλο που παίζουν αυτά τα μονοπάτια στην έκφραση των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών. Το Σχήμα 6Β δείχνει ότι η φαρμακολογική αναστολή των μονοπατιών MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII και PKC μείωσε την έκφραση των NQO-1, HO-1 και -GCLCαντιοξειδωτικόπρωτεϊνών στα κύτταρα HaCaT. Επιπλέον, ο χρόνος που χρειάστηκε για τη φωσφορυλίωση του AKT, p38 και την έκφραση των PKC και CKII ενώ εκτέθηκαν στην εκτοΐνη δείχνει ότι, εκτός από το p-AKT, η φωσφορυλίωση του p38 και οι εκφράσεις του PKC και CKII έλαβαν χώρα αργότερα μόνο χρονικά σημεία (μετά από 30 λεπτά) (Εικόνα 6C). Στην περίπτωση της ΑΚΤ, η φωσφορυλίωση παρατηρήθηκε από το χρονικό σημείο των 15 λεπτών που έχει φτάσει στο μέγιστο στα 30 λεπτά (Εικόνα 6C). Στην περίπτωση του AKT, η φωσφορυλίωση παρατηρήθηκε από το χρονικό σημείο των 15 λεπτών που έχει φτάσει στο μέγιστο στα 30 λεπτά (Εικόνα 6C). Αυτά τα σωρευτικά αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μονοπάτια σηματοδότησης p38, AKT, PKC και CKII ενεργοποίησαν την πυρηνική μετατόπιση με τη μεσολάβηση της εκτοΐνης από αντιοξειδωτικά. Nrf2 που οδηγεί στην έκφραση αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών.

3.6. Η αντιμελανογόνος δράση με τη μεσολάβηση της εκτοΐνης κατεστάλη λόγω της πτώσης του Nrf2

Ο ρόλος του Nrf2 στο αντι- μεσολαβούμενο από την εκτοΐνημελανογένεσηπροσδιορίστηκε με σίγαση του Nrf2 σε κύτταρα HaCaT. Τα δεδομένα από το στύπωμα Western έδειξαν ότι τα κύτταρα εξουδετέρωσης Nrf2 που εκτέθηκαν σε 1,5 μΜ Εκτοΐνη έδειξαν ελάχιστη έκφραση NQO-1, HO-1 και -GCLCαντιοξειδωτικόπρωτεΐνες (Εικόνα 7Α). Αργότερα, δοκιμάσαμε την επίδραση του knockdown Nrf2 στην έκφραση των επιπέδων -MSH σε ακτινοβολημένα με UVA (3 J/cm2) κύτταρα HaCaT. Τα αποτελέσματα στυπώματος Western έδειξαν ότι για τον έλεγχο των επιμολυσμένων με siRNA κυττάρων, η ακτινοβολία UVA ήταν σημαντική στην ανοδική ρύθμιση της έκφρασης των επιπέδων -MSH σε κύτταρα που δεν εκτέθηκαν σε εκτοΐνη (Εικόνα 7Β). Ωστόσο, 1,5 μM Ectoine έχει καταστείλει αυτό το αποτέλεσμα. Για την άλλη περίπτωση, κύτταρα που επιμολύνθηκαν με siNrf2 εμφάνισαν μείωση στην έκφραση των επιπέδων -MSH τόσο σε κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή όσο και σε κύτταρα (Εικόνα 7Β). Παρόμοια με τα δεδομένα -MSH, τα δεδομένα φθορισμού μας έδειξαν επίσης ότι η ακτινοβολία UVA ρύθμισε σημαντικά προς τα πάνω την παραγωγή ROS σε κύτταρα μάρτυρα siRNA που δεν είχαν υποστεί επεξεργασία (Εικόνα 7C, D). Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα κατεστάλη σημαντικά όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 1,5 μΜ Εκτοΐνης. Από την άλλη πλευρά, τα επιμολυσμένα με Nrf2 και τα ακτινοβολημένα με UVA κύτταρα HaCaT εμφάνισαν περίπου 8-πλάσια αύξηση των επιπέδων ROS σε σύγκριση με τα επιμολυσμένα κύτταρα Nrf2 που δεν ακτινοβολήθηκαν με UVA αλλά εκτέθηκαν σε θεραπεία με εκτοΐνη (Εικόνα 7C, D). Όλα αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν τον προστατευτικό ρόλο που διαδραματίζει ο Nrf2 στην ελαχιστοποίηση της παραγωγής μελανίνης σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολούνται με UVA. . Όλα αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν τον προστατευτικό ρόλο που διαδραματίζει η εκτοΐνη που διαδραματίζει το Nrf2 στην ελαχιστοποίηση της παραγωγής μελανίνης σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολούνται με UVA.

όφελος cistanche: λεύκανση του δέρματος

4. Συζήτηση

Διάφορο δέρμα -λεύκανσηχρησιμοποιούνται στη βιομηχανία καλλυντικών. Πολλοί από αυτούς τους παράγοντες είναι χημικής προέλευσης και υποφέρουν από τους περιορισμούς πρόκλησης διαφόρων παρενεργειών, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων [24-26]. Επομένως, ο εντοπισμός ασφαλών και φυσικών παραγόντων λεύκανσης του δέρματος αντιπροσωπεύει την ανάγκη της ώρας. Η εκτοΐνη (Εικόνα 1Α) είναι γνωστό ότι χρησιμοποιείται ως ενεργό συστατικό σε κρέμες προσώπου και σε άλλους καλλυντικούς παράγοντες. Αυτό δρα ως παράγοντας ενυδάτωσης του δέρματος και θεωρείται επίσης ότι καθυστερεί την πρόωρη γήρανση του δέρματος [27]. Σχεδόν όλοι οι γνωστοί παράγοντες λεύκανσης του δέρματος στοχεύουν στη μείωση της ρύθμισης τουτυροσινάσηενζυμική δραστηριότητα σε κύτταρα ακτινοβολημένα με υπεριώδη ακτινοβολία που μειώνει τηνμελανογένεσηστα κύτταρα του δέρματος.Yao et al. απέδειξε τολεύκανσηιδιότητες της βιοσυντιθέμενης εκτοΐνης και πρότεινε ότι είναι υποτιθέμενος λευκαντικός παράγοντας. Στη μελέτη τους, εξέτασαν την υψηλή συγκέντρωση (500 μΜ) της εκτοΐνης για τη λευκαντική της δράση σε κυτταρικές σειρές μελανώματος ποντικού (B16F0) και ανθρώπινου μελανώματος (A2058) και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η εκτοΐνη είναι ασφαλής και δυνητικός παράγοντας για την καλλυντική και κλινική εφαρμογή [20]. Ωστόσο, σε αυτήν τη μελέτη, δοκιμάσαμε περαιτέρω τις ευεργετικές επιδράσεις των χαμηλών συγκεντρώσεων εκτοΐνης (0,5–1,5 μΜ) σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολήθηκαν με UVA και αποκρυπτογραφήθηκαν οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί. Στη μελέτη μας, αποδείχθηκε ότι η εκτοΐνη, μέσω της οδού Nrf2/ARE, όχι μόνο έχει προκαλέσει την έκφραση της έκφρασης αντιοξειδωτικών γονιδίων αλλά και μείωσε τα επίπεδα -MSH σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολούνται με UVA μέσω της καταστολής του POMC. Μια μείωση στα επίπεδα -MSH συσχετίστηκε με τη μείωση της δραστηριότητας του ενζύμου της τυροσινάσης που οδηγεί σε μείωση της παραγωγής μελανίνης. Από τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη αναφορά που αποδείχθηκε από τον μηχανισμό που προκαλείται από την Ectoine σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολούνται με UVA. Αυτή η μελέτη σκιαγράφησε τους μοριακούς μηχανισμούς που παρουσιάζονται από την Ectoine σε κύτταρα HaCaT ως το σύστημα κυτταρικού μοντέλου.

Αρχικά προσδιορίσαμε τις υποθανατηφόρες συγκεντρώσεις της εκτοΐνης καθώς και την επίδραση της ακτινοβολίας UVA στη βιωσιμότητα των κυττάρων HaCaT. Τα δεδομένα MTT μας έδειξαν ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις εκτοΐνης (0,5–1,5 μΜ) δεν είχαν σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων HaCaT (Εικόνα 1Β). Η προ-αγωγή με εκτοΐνη αύξησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων HaCaT ακτινοβολημένων με UVA 3 J/cm2 (Εικόνα 1Β). Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, συνεχίσαμε τα περαιτέρω πειράματά μας χρησιμοποιώντας 1,5 μΜ προκατεργασίας Ectoine και ακτινοβολία UVA σε δόσεις 3 J/cm2.

Η παραγωγή ROS που προκαλείται από την ακτινοβολία UVA στα κερατινοκύτταρα του δέρματος είναι ένα ευρέως γνωστό γεγονός [28]. Επομένως, δοκιμάσαμε επίσης για τυχόν ευεργετικά αποτελέσματα από την προεπεξεργασία με εκτοΐνη στην παραγωγή ROS που προκαλείται από την ακτινοβολία UVA σε κύτταρα HaCaT. Τα δεδομένα μας για την ένταση του φθορισμού DCF έδειξαν ότι η προεπεξεργασία με 1,5 μΜ εκτοΐνης μείωσε σημαντικά τα ινκερατινοκύτταρα παραγωγής ROS που προκλήθηκαν από την ακτινοβολία UVA. Παρατηρήθηκε επίσης ότι 1,5 μΜ Εκτοΐνης θα μπορούσε να προκαλέσει αύξηση του βασικού επιπέδου των επιπέδων theROS στα κύτταρα HaCaT που φάνηκε να είναι στατιστικά σημαντικά (Εικόνα 1Δ, Ε).

Οι Rousseau et al. ανέφερε ότι το POMC εκκρίνεται από ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα και μελανοκύτταρα και έχει διεγείρειμελανογένεση[29]. Έχοντας αυτό υπόψη, δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση της ακτινοβολίας UVA και των προεπεξεργασιών με εκτοΐνη στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη μελανογένεση στα κύτταρα HaCaT. Τα δεδομένα Western blot έδειξαν ότι η δοσοεξαρτώμενη μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών -MSH και POMC σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολήθηκαν με UVA προκλήθηκε από την προεπεξεργασία με Ectoine. Αντιστρόφως, η προ-αγωγή με Ectoine έχει διαφορική επίδραση στο πρότυπο έκφρασης τουμελανογένεση-σχετικές πρωτεΐνες. Συγκεκριμένα, σχεδόν όλες οι δοκιμασμένες πρωτεΐνες (Τυροσινάση, TRP-1, TRP-2, c-AMP πρωτεϊνοκινάση, CREB και MITF) εμφάνισαν μειωμένες εκφράσεις με αυξανόμενες συγκεντρώσεις προ-αγωγής με Ectoine σε κύτταρα HaCaT ακτινοβολημένα με UVA (Εικόνα 2Α, Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν το γεγονός ότι το Ectoine διαθέτει αντι-μελανογόνες ιδιότητες σε κύτταρα HaCaT που έχουν ακτινοβοληθεί με UVA.

Η αντιμελανογόνος αποτελεσματικότητα της Ectoine δοκιμάστηκε περαιτέρω σε κύτταρα B16F10, μια ευρέως γνωστή κυτταρική σειρά μελανώματος που χρησιμοποιείται σεμελανογένεσημελέτες [30]. Μία από τις αξιοσημείωτες παρατηρήσεις στη μελέτη μας ήταν ότι, σε αντίθεση με τα κύτταρα HaCaT, υψηλές συγκεντρώσεις Εκτοΐνης (100-400 μΜ) ήταν απαραίτητες για την καταστολή της σύνθεσης μελανίνης σε κύτταρα B16F10 που διεγείρονται από -MSH (Εικόνα 3Β). Τα δεδομένα στυπώματος Western μας έδειξαν ότι η εκτοΐνη εξαρτώμενη από τη δόση ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση τουτυροσινάσηκαι ρ-CREBπρωτεΐνες σε διεγερμένα από -MSH κύτταρα B16F10, που οδηγούν στο προαναφερθέν αποτέλεσμα (Εικόνα 3C). Επομένως, δοκιμάστηκε επίσης εάν αυτές οι υψηλές συγκεντρώσεις εκτοΐνης θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων B16F10. Τα αποτελέσματά μας MTT έδειξαν ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκτοΐνης (100–400 μΜ) δεν είχαν καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων B16F10 (Εικόνα 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κερατινοκύτταρα διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην αντι- μεσολαβούμενη από την εκτοΐνημελανογένεσηκαι αποχρωματιστικές επιδράσεις.

Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2 στον μεταβολισμό των κυττάρων του δέρματος ήταν καλά τεκμηριωμένος [31]. Επομένως, δοκιμάσαμε περαιτέρω τους μηχανισμούς που παίζονται από το μονοπάτι Nrf2/Keap-1 στις επιδράσεις που προκαλούνται από την εκτοΐνη στα κερατινοκύτταρα. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι η εκτοΐνη εξαρτώμενη από τη δόση και σημαντικά αύξησε την αναλογία Nrf2/Keap-1 με μέγιστο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε συγκέντρωση εκτοΐνης 1,5 μΜ. Παρατηρήθηκε επίσης ότι 1,5 μΜ Ectoine ευνόησε την πυρηνική μετατόπιση της πρωτεΐνης Nrf2 με τη μέγιστη έκφραση του Nrf2 από το κλάσμα της πυρηνικής πρωτεΐνης που παρατηρήθηκε στο χρονικό σημείο των 2 ωρών (Εικόνα 4Β). (Εικόνα 4Δ).

Σε ανθρώπινα μελανοκύτταρα και κερατινοκύτταρα, οι Marrot et al. και άλλοι έχουν εξηγήσει τη σημασία της αμυντικής οδού Nrf2 στις αποκρίσεις φωτο-οξειδωτικού στρες [32]. Μελετήσαμε επίσης την επίδραση της έκφρασης αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών με εκτοϊνη μεσολάβηση σε κύτταρα HaCaT. Τα δεδομένα της καμπύλης χρόνου μας έδειξαν ότι η εκτοϊνοποιημένη έκφραση και των τριών αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών (HO-1, NQO-1, -GCLC) και Nrf2 φάνηκε να εκφράζεται με διφασικό τρόπο με την αύξηση του χρόνου ({{ 8}}.5–12 h) με παρατηρήσιμο αποτέλεσμα σημειώθηκε σε χρονικό σημείο 4 ωρών (Εικόνα 5Α). Από αυτό, μια καμπύλη συγκέντρωσης που μετρά την επίδραση της συγκέντρωσης Ectoine στοαντιοξειδωτικόΗ έκφραση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε επίσης σε χρονικό σημείο 4 ωρών. Το Σχήμα 5Β δείχνει ότι σε σύγκριση με τα κύτταρα που δεν έχουν υποστεί αγωγή, η θεραπεία με εκτοΐνη έχει αυξήσει εξαρτώμενα από τη δόση την έκφραση των πρωτεϊνών HO-1, NQO-1, -GCLC. Μετρήσαμε επίσης τον τρόπο με τον οποίο η συγκέντρωση εκτοΐνης επέδειξε προστατευτικά αποτελέσματα σε κύτταρα HaCaT που εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVA. Τα δεδομένα Western blot έδειξαν ότι η εκτοΐνη εξαρτώμενη από τη δόση αύξησε την έκφραση των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών με μια δραματική ρύθμιση στην αναλογία Nrf2/Keap-1 επίσης (Εικόνα 5C, D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εκτοϊνική θεραπεία (1,5 μΜ, 4 ώρες) έχει τη δυνητική επίδραση να επάγει την έκφραση αντιοξειδωτικής πρωτεΐνης στα HaCaTcells που θα μπορούσε να εξουδετερώσει τις επιβλαβείς επιδράσεις που προκαλούνται από την έκθεση σε UVA.

αντιοξειδωτικό cistanche

5. Συμπεράσματα

Από τα παραπάνω δεδομένα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις εκτοΐνης (0.5–1,5 μΜ) θα μπορούσαν να ρυθμίσουν την παραγωγή -MSH και μελανίνης μέσω της καταστολής του POMC καιτυροσινάσημονοπάτι στα κύτταρα HaCaT που έχουν ακτινοβοληθεί με UVA, υποδεικνύοντας την αντι-μελανογένεσηαποτελεσματικότητα. Επιπλέον, η εκτοΐνη συμμετείχε επίσης στην καταστολή της ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS στα κύτταρα HaCaT. Σε αντίθεση με τα κύτταρα HaCaT, οι υψηλές συγκεντρώσεις εκτοΐνης (50-400 μΜ) ήταν σε θέση να δείξουν παρόμοιο αποτέλεσμα στα μελανωματοκύτταρα B16F10 που υποδηλώνουν το γεγονός ότι τα κερατινοκύτταρα θα μπορούσαν να διαδραματίσουν βασικό ρόλο στη μεσολαβούμενη από την εκτοΐνη αντι-μελανογένεσηκαι δέρμα-λεύκανσηεπιπτώσεις στα κύτταρα του δέρματος. Το πιο σημαντικό, η εκτοΐνη μεσολάβησε ευεργετικά αποτελέσματα μέσω της ενεργοποίησης της οδού Nrf2, η οποία επάγει την έκφρασηαντιοξειδωτικόπρωτεϊνών HO-1, NQO-1 και -GCLC. Το AKT αποδείχθηκε ότι είναι η πρώτη οδός σηματοδότησης που ξεκινά την ενεργοποίηση του Nrf2 ακολουθούμενη από τις άλλες οδούς (p38, PKC και CKII). Τέλος, η σίγαση του Nrf2 έδωσε άμεσα στοιχεία ότι το Nrf2 παίζει βασικό ρόλο στη ρύθμιση των ενδοκυτταρικών ROS καθώς και στην παραγωγή -MSH. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ο κύριος μηχανισμός λεύκανσης της Ectoine θα πρέπει να αιτιολογείται από την αναστολή της οδού ROS-p53/POMC{10}}MSH σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολούνται με UVA. Επομένως, η εκτοΐνη ή τα παράγωγά της θα μπορούσαν να είναι ενεργό συστατικό στις ενυδατικές κρέμες και τις λοσιόν που χρησιμοποιούνται ως δυναμικό και φυσικό δέρμαλεύκανσηπράκτορες στη βιομηχανία καλλυντικών.

αντιοξειδωτικό συμπλήρωμα cistanche