ΑφηρημένηΑν και η γήρανση είναι ο μεγαλύτερος παράγοντας κινδύνου για χρόνιες (καρκίνος, διαβητικούς, καρδιαγγειακές και νευροεκφυλιστικές) ασθένειες, λίγες παρεμβάσεις είναι γνωστές εκτός από τον θερμιδικό περιορισμό και έναν μικρό αριθμό φαρμάκων (με σημαντικές παρενέργειες) που αντιμετωπίζουν άμεσα τη γήρανση. Επομένως, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για νέες επιλογές που μπορούν γενικά να καθυστερήσουν τις διαδικασίες γήρανσης και να αποτρέψουν ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία. Η κυτταρική γήρανση είναι η βάση των διαδικασιών γήρανσης. Η χρονολογική διάρκεια ζωής (CLS) του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae είναι το καθιερωμένο πρότυπο σύστημα για τη διερεύνηση των παρεμβάσεων της ανθρώπινης μεταμιτωτικής κυτταρικής γήρανσης. Το CLS ορίζεται ως ο αριθμός των ημερών που τα κύτταρα παραμένουν βιώσιμα σε μια στατική φάση. Αναπτύξαμε μια νέα, φθηνή και γρήγορη ποσοτική μέθοδο για τη μέτρηση του CLS σε κυτταροκαλλιέργειες που επωάστηκαν μαζί με διάφορους χημικούς παράγοντες και μάρτυρες σε 96-πλάκες φρεατίων. Το πρωτόκολλό μας PICLS με (1) τη χρήση ιωδιούχου προπιδίου για ανάγνωση κυτταρικής επιβίωσης με βάση το φθορισμό σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας και (2) μέτρηση συνολικού αριθμού κυττάρων μέσω απορρόφησης OD600nm από την ίδια πλάκα παρέχει πραγματική ικανότητα υψηλής απόδοσης. Ανάλογα με την επιμελητεία, μεγάλοι αριθμοί πλακών μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία παράλληλα, έτσι ώστε ο έλεγχος χιλιάδων ενώσεων να είναι εφικτός σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η μέθοδος επικυρώθηκε με τη μέτρηση της επίδρασης της ραπαμυκίνης και του θερμιδικού περιορισμού στο CLS ζύμης. Χρησιμοποιήσαμε αυτήν την προσέγγιση για τον έλεγχο χημικών παραγόντων. Ανακαλύψαμε την αντιγηραντική/νευροπροστατευτική δυνατότητα της 2,5-άνυδρο-D-μαννιτόλης (2,5-AM) και προτείνουμε τη χρήση της μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με άλλες αντιγηραντικές παρεμβάσεις.

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και έχει την ικανότητα να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου και να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες, και έχει επίσης μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ για να δείτε τα αντιγηραντικά προϊόντα

【Για περισσότερες πληροφορίες: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Λέξεις-κλειδιάSaccharomyces cerevisiae · Χρονολογική διάρκεια ζωής · Χημικός έλεγχος · Αντιγηραντική ένωση · 2,5-ανυδρο-D-μαννιτόλη

Εισαγωγή

The growing fraction of the elderly (>65 ετών) μεταξύ του συνολικού πληθυσμού (από ~ 10 τοις εκατό παγκοσμίως (πάνω από 20 τοις εκατό στις χώρες του πρώτου κόσμου) το 2020 σε 16 τοις εκατό το 2050), καθώς και το αυξανόμενο προσδόκιμο ζωής τους (κατά ~ 10 χρόνια από το 1960 στις χώρες του πρώτου κόσμου ), αντιμετωπίζει τον κόσμο με όλο και πιο δύσκολα προβλήματα [1, 2]. Εκτός από τη γενική μείωση της δραστηριότητας της ζωής, η γήρανση παραμένει ο μεγαλύτερος παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη χρόνιων ασθενειών που, στη συνέχεια, θέτουν σε κίνδυνο την ανεξάρτητη ανθρώπινη ζωή και τελικά οδηγούν στο θάνατο [3-7]. Οι τρέχουσες ιατρικές προσεγγίσεις για την πρόληψη παθολογιών που σχετίζονται με την ηλικία αποτελούν συστάσεις για έναν υγιεινό τρόπο ζωής, συμπεριλαμβανομένης της άσκησης και της διατροφής. Ωστόσο, αυτές οι παρεμβάσεις από μόνες τους δεν επαρκούν για την πρόληψη της εμφάνισης ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία.

Η γήρανση χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια της φυσιολογικής ακεραιότητας, της αποτελεσματικότητας στις κυτταρικές λειτουργίες και της μεταβολικής σηματοδότησης [8]. Οι αυξανόμενες προσπάθειες κατευθύνονται για την κατανόηση των διαδικασιών κυτταρικής γήρανσης που επηρεάζουν το εξαιρετικά διασυνδεδεμένο και λειτουργικά περιττό δίκτυο αλληλεπιδράσεων γονιδίων και πρωτεϊνών [8, 9]. Παρά την πολυπλοκότητα της γήρανσης, πρόσφατη έρευνα σε διαφορετικά συστήματα μοντέλων, συμπεριλαμβανομένων των θηλαστικών, έχει δείξει ότι η καθυστερημένη γήρανση και η αυξημένη διάρκεια της υγείας είναι εφικτά με παρεμβάσεις κατά της γήρανσης όπως η εφαρμογή χορήγησης φαρμάκου ραπαμυκίνης και ο περιορισμός θερμίδων (γλυκόζης) [10-15]. Ως εκ τούτου, η επέκταση του ρεπερτορίου των αντιγηραντικών ενώσεων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γεροπροστατευτικά θεραπευτικά και μειώνοντας τις ανεπιθύμητες παρενέργειές τους είναι μία από τις πολλά υποσχόμενες στρατηγικές που μπορεί να καθυστερήσει τη γήρανση και να παρατείνει το διάστημα της υγείας.

Πρόσφατη έρευνα έχει δείξει ότι οι μοριακοί μηχανισμοί που παρατηρούνται στην ανθρώπινη γήρανση διατηρούνται σε διαφορετικούς οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της μονοκυτταρικής μαγιάς [8, 10, 16, 17]. Η εκκολαπτόμενη μαγιά Saccharomyces cerevisiae είναι ένας από τους πιο μελετημένους οργανισμούς-μοντέλους για την αποκάλυψη των βιολογικών διεργασιών που εμπλέκονται στην κυτταρική γήρανση. Τα πλεονεκτήματα της μελέτης της γήρανσης στη ζύμη περιλαμβάνουν ένα σύντομο χρόνο παραγωγής, μια ανθεκτική διάρκεια ζωής και την καταλληλότητά του σε δοκιμές υψηλής απόδοσης. Ως εκ τούτου, αυτός ο οργανισμός έγινε ένα ισχυρό εργαλείο για τον εντοπισμό των αντιγηραντικών παρεμβάσεων. Η μαγιά χρησιμοποιείται συνήθως για τη μελέτη της γήρανσης με δύο διαφορετικούς τρόπους: την αντιγραφική διάρκεια ζωής (RLS) και τη χρονολογική διάρκεια ζωής (CLS) [18]. Το RLS μετρά τον αριθμό των φορών που διαιρείται ένα μεμονωμένο κύτταρο, ένα μοντέλο γήρανσης για μιτωτικά κύτταρα όπως τα βλαστοκύτταρα. Το CLS μετρά τη διάρκεια του χρόνου που ένα μη διαιρούμενο κύτταρο παραμένει βιώσιμο στη στατική φάση, ένα μοντέλο γήρανσης για μεταμιτωτικά κύτταρα όπως οι νευρώνες. Η βιωσιμότητα των γερασμένων κυττάρων ζυμομύκητα κάτω από συνθήκες σταθερής φάσης στερούμενων θρεπτικών συστατικών μειώνεται και τελικά πεθαίνουν.

Το CLS παραδοσιακά μετράται με την εκτίμηση των μετρήσεων μονάδων σχηματισμού αποικιών (CFUs) στην πλάκα άγαρ [18]. Κύτταρα ζυμομύκητα σε φιάλη με συνολικό μέσο (Μεγαλύτερο ή ίσο με 20 ml) εκτίθενται σε μία μόνο χημική ένωση. Σε διαφορετικά χρονικά σημεία (π.χ., μετά από 2, 5 και 8 ημέρες), μικρά δείγματα της καλλιέργειας χρονολογικής γήρανσης από το fask αραιώνονται σειριακά, τοποθετούνται σε πλάκες θρεπτικού άγαρ και επωάζονται για 2-3 ημέρες για σχηματισμό και μέτρηση αποικιών. Το κλάσμα επιβίωσης προσδιορίζεται από το CFU για κάθε χρονολογικό σημείο ηλικίας σε σχέση με την ημέρα 1 (θεωρείται 100 τοις εκατό επιβίωση κυττάρων). Η προσέγγιση CFU είναι ποσοτική αλλά συνδέεται με πολλά μειονεκτήματα. Απαιτεί πολλαπλές σειριακές αραιώσεις, στάδια επιμετάλλωσης και περιόδους επώασης για την εμφάνιση των αποικιών. Η καταμέτρηση των αποικιών πραγματοποιείται είτε με χειροκίνητα είτε με ακριβά όργανα. Επιπλέον, αυτή η μέθοδος είναι ακατάλληλη και πολύ ακριβή για διαλογή υψηλής απόδοσης (HTS) χιλιάδων ενώσεων επειδή απαιτεί σημαντικές ποσότητες των φαρμάκων που δοκιμάστηκαν, καλλιέργειες φιάλης μεγάλου όγκου και πολλές πλάκες άγαρ. Δυστυχώς, η μέθοδος CFU και όλες οι πρόσφατες παραλλαγές για τη μέτρηση του CLS εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την ικανότητα των μεταμιτωτικών κυττάρων να εισέλθουν ξανά στη μιτωτική φάση. Κατ' αρχήν, αυτή η μεθοδολογία δεν μπορεί να διακρίνει τη ζύμη σε μιτωτική ανακοπή από τα νεκρά κύτταρα.

Οι τρέχουσες τεχνικές εξελίξεις στις μεθόδους που προέρχονται από CFU μετρούν την επιβίωση και την ανάπτυξη των κυττάρων με βάση την ανάπτυξη μαγιάς στάσιμης φάσης που εκτίθεται σε φάρμακο σε καλλιέργεια πλούσια σε θρεπτικά συστατικά είτε σε υγρό μέσο είτε με προσδιορισμό κηλίδων σε πλάκα άγαρ [17, 19-21] . Μετά από 24 ώρες, η έκφυση γηρασμένων κυττάρων σε υγρό μέσο μετράται με την απορρόφηση στα OD600nm, ενώ στον προσδιορισμό κηλίδωσης, η ανάπτυξη παλαιωμένης κηλίδας καλλιέργειας σε μέσο άγαρ αναγνωρίζεται οπτικά μετά από 48 ώρες. Η υλικοτεχνική βελτίωση περιλαμβάνει τη χρήση πλακών 96-πηγαδιών που επιτρέπουν περιορισμένο έλεγχο στελεχών χημικής ή γονιδιωματικής διαγραφής. Για συγκεντρωμένα στελέχη διαγραφής ζυμομυκήτων με ετικέτα, απαιτείται κυτταρομετρία ροής για να ποσοτικοποιηθεί η βιωσιμότητα του μεμονωμένου στελέχους [22].

Το ιωδιούχο προπίδιο (PI) είναι μια φθορίζουσα χρωστική που εισέρχεται μόνο στα νεκρά κύτταρα και, ως εκ τούτου, είναι ένας ισχυρός δείκτης για την άμεση ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας των κυττάρων [23-25]. Προηγουμένως, οι μελέτες χρησιμοποίησαν μια προσέγγιση βασισμένη στο PI για τη μέτρηση του CLS και τον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων με ανάλυση των εικόνων που αποκτήθηκαν από έναν μετρητή φθορίζοντος κυττάρου, έναν transilluminator UV ή μια κυτταρομετρία ροής [26, 27]. Ωστόσο, οι απαιτήσεις πολλαπλών δειγμάτων επεξεργασίας, απεικόνισης και λογισμικού για την ανάλυση δεδομένων είναι δαπανηρές και χρονοβόρες, γεγονός που παρεμπόδισε αυτές τις μεθόδους σε εφαρμογές πραγματικών υψηλής απόδοσης. Η εισαγωγή εναλλακτικών βαφών όπως το πράσινο SYTOX είναι περιορισμένης αξίας σε περιβάλλον υψηλής απόδοσης λόγω του απαγορευτικού κόστους [26].

Ως εκ τούτου, απαιτούνται νέες μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας του γηρασμένου κυττάρου για την αποφυγή των περιορισμών που σχετίζονται με τις υπάρχουσες μεθοδολογίες. Σε αυτή την εργασία, περιγράφουμε το PICLS, μια μέθοδο μέτρησης CLS που βασίζεται σε PI και είναι ανεξάρτητη από την ανάπτυξη. Η νέα μας προσέγγιση βασίζεται στην επώαση κυττάρων ζυμομύκητα με διάφορες δοκιμαστικές ενώσεις ή διαφορετικές συνθήκες του μέσου δοκιμής σε 96-πλάκες φρεατίων. Χρησιμοποιούμε PI για να ποσοτικοποιήσουμε την επιβίωση των κυττάρων. Γρήγορη και αποτελεσματική ανάγνωση (εντός ~ 15 λεπτών) παρέχεται από μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών, μια συσκευή χαμηλού κόστους που είναι άμεσα διαθέσιμη στα περισσότερα εργαστήρια. Αυτή η φθηνή μεθοδολογία είναι κατάλληλη για μεγάλης κλίμακας διαλογή των χημικών παραγόντων για τον εντοπισμό αντιγηραντικών ενώσεων, καθώς πολλές διαφορετικές ενώσεις, μάρτυρες ή αραιώσεις μπορούν εύκολα να τοποθετηθούν σε μία πλάκα και μεγάλοι αριθμοί πλακών μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία παράλληλα. Επιπλέον, επικυρώσαμε τη μέθοδό μας προσδιορίζοντας την επέκταση του CLS της ζύμης χρησιμοποιώντας γνωστές παρεμβάσεις αντιγήρανσης όπως η χορήγηση ραπαμυκίνης και ο περιορισμός των θερμίδων. Μια γρήγορη εξέταση διαθέσιμων χημικών ουσιών στο εργαστήριό μας αποκάλυψε απροσδόκητα 2,5-άνυδρο-D-μαννιτόλη (2,5-AM) που επεκτείνει τη διάρκεια ζωής της μαγιάς. Επιβεβαιώσαμε επίσης την αντιγηραντική δραστηριότητα του 2,{15}}π.μ. με παραδοσιακές μεθόδους ανάπτυξης. Άλλα δοκιμασμένα ανάλογα σακχάρου δεν παρείχαν παρόμοιο αποτέλεσμα.

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη μιας μεθόδου για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων χρησιμοποιώντας μέτρηση φθορισμού ιωδιούχου προπιδίου στον αναγνώστη μικροπλακών

Το νέο μας πρωτόκολλο ξεκινά με την έκθεση κυττάρων ζυμομύκητα άγριου τύπου ή των μεταλλαγμάτων τους που τοποθετούνται σε μέσα πλούσια σε θρεπτικά συστατικά σε 96-πλάκες φρεατίων μαζί με μια συγκεκριμένη συγκέντρωση χημικών ενώσεων ενδιαφέροντος. Χρησιμοποιούμε το PI ως δείκτη για τον κυτταρικό θάνατο, καθώς αυτή η φθορίζουσα χρωστική εισέρχεται μόνο σε κύτταρα που δεν επιβιώνουν [23-25]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων στην καλλιέργεια στατικής φάσης ποσοτικοποιείται μετά από έναν καθορισμένο αριθμό ημερών με ανάγνωση του φθορισμού PI στον αναγνώστη μικροπλακών που, με τη σειρά του, παρέχει ένα ηλεκτρονικά αναγνώσιμο λογιστικό φύλλο για ανάλυση δεδομένων.

Ως πρώτη επικύρωση, δείχνουμε ότι η εργασία με μικρές ποσότητες σε φρεάτια μικροπλάκας παρέχει αποτελέσματα παρόμοια με τις προσεγγίσεις που βασίζονται σε κυψελίδες και ότι ο αναγνώστης μικροπλακών είναι αρκετά ευαίσθητος ώστε να συλλαμβάνει δεδομένα επιβίωσης κυττάρων. Έτσι, αναλύσαμε τη χρώση PI κυττάρων ζυμομύκητα. Κύτταρα ζυμομύκητα αναπτύχθηκαν στη γυάλινη φιάλη και έβρασαν για 15 λεπτά στους 100 βαθμούς . Ζωντανά και νεκρά κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν σε 1×PBS (ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα) χωρίς και με ΡΙ (5 μg/ml) για 15 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν με μικροσκόπιο και η ένταση φθορισμού μετρήθηκε από τον αναγνώστη μικροπλάκας (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Μετά την επιβεβαίωση ότι το PI είναι ένας κατάλληλος δείκτης για τον κυτταρικό θάνατο, πραγματοποιήθηκε μια επακόλουθη ανάλυση για την ανάπτυξη της μεθόδου. Νεκρά κύτταρα που χρωματίστηκαν με ΡΙ επαναιωρήθηκαν σε PBS μέχρι τα τελικά 48 OD600nm που μετρήθηκαν στην κυψελίδα χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αραιώθηκαν σειριακά σε PBS (OD600nm 48 έως 0,05) και μεταφέρθηκαν σε μια μαύρη πλάκα φρεατίου (costar 3603). Να σημειωθεί ότι οι μαύρες μικροπλάκες είναι τέσσερις φορές πιο ακριβές από τις διαφανείς πλάκες και λιγότερο εύκολα διαθέσιμες, αλλά τις χρησιμοποιήσαμε καθώς είναι πιο κατάλληλες για ανάγνωση φθορισμού λόγω της υγρασίας του αυτοφθορισμού που προέρχεται από τα δείγματα και τις επιφάνειες της μικροπλάκας. Με ένα σύστημα απεικόνισης GelDoc (Εικ. 1Α), οπτικοποιήσαμε τον βαθμό ενσωμάτωσης της χρώσης PI στα νεκρά κύτταρα ζυμομύκητα σε διάφορες αραιώσεις. Χρησιμοποιώντας την ίδια πλάκα, μετρήσαμε την ένταση φθορισμού PI με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών σε διέγερση 535 nm και μήκη κύματος εκπομπής 617 nm. Βρήκαμε μια υψηλή γραμμική συσχέτιση μεταξύ της έντασης φθορισμού PI και της κυτταρικής απορρόφησης στο OD600nm (Εικ. 1Β). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η παραλλαγή της μεθόδου που βασίζεται στον φθορισμό PI είναι αποτελεσματική για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 της κυβέτας (Εικ. 1D). Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τη σχέση μεταξύ της έντασης φθορισμού PI και του κυττάρου OD600nm της πλάκας φρεατίου 96- εντός του βέλτιστου εύρους OD600nm 0,05–12. Παρατηρούμε μια σχεδόν τέλεια γραμμική συσχέτιση (Εικ. 1Ε). Έτσι, το πρωτόκολλό μας αντιπροσωπεύει μια ισχυρή μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων.

Επίδραση τύπων μικροπλακών στον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων χρησιμοποιώντας μέτρηση φθορισμού ιωδιούχου προπιδίου στον αναγνώστη μικροπλακών

Επίδραση της ραπαμυκίνης στη χρονολογική διάρκεια ζωής της μαγιάς

Η ραπαμυκίνη είναι μια από τις γνωστές παρεμβάσεις κατά της γήρανσης που έχει αποδειχθεί ότι παρατείνει τη διάρκεια ζωής πολλών μοντέλων οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των ζυμομυκήτων, των νηματωδών, των φρουτόμυγων και των ποντικών [10, 14, 15, 28-30]. Αναστέλλει το σύμπλεγμα ανίχνευσης θρεπτικών συστατικών TORC1 (στόχος του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1). Το TORC1 είναι ένα διατηρημένο σύμπλεγμα πρωτεΐνης πολλαπλών υπομονάδων σε ευκαρυωτικά κύτταρα που συνδυάζει θρεπτικά συστατικά στο περιβάλλον με την κυτταρική ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό [19, 29, 31-34].

Εξετάσαμε την επίδραση της ραπαμυκίνης στη χρονολογική διάρκεια ζωής (CLS) του στελέχους ζυμομύκητα για να επικυρώσουμε το πρωτόκολλό μας που αναπτύχθηκε πρόσφατα. Εδώ και παρακάτω, χρησιμοποιήσαμε το πρωτοτροφικό στέλεχος ζυμομύκητα (CEN.PK113- 7D) στα πειράματά μας για να αποφύγουμε τις ισχυρές επιδράσεις της αυξοτροφίας αμινοξέων στην επιβίωση των κυττάρων σε καλλιέργεια στατικής φάσης [35, 36]. Τα κύτταρα γεράστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης στο συνθετικό καθορισμένο (SD) μέσο. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία (24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες). Βρήκαμε ότι η κυτταρική ανάπτυξη έφτασε σε κορεσμό περίπου 24 ώρες μετά την επώαση με 5 ηΜ ή λιγότερο ραπαμυκίνη (Εικ. 4Α). Ωστόσο, η χορήγηση 10 ηΜ ραπαμυκίνης επιβράδυνε την κυτταρική ανάπτυξη και ο κορεσμός επιτεύχθηκε μόνο μετά από 48 ώρες (Εικ. 4Α). Προηγουμένως, μια παρόμοια τάση είχε παρατηρηθεί για κύτταρα που αναπτύσσονταν με ραπαμυκίνη σε ένα πείραμα CLS [37].

Ως επόμενο βήμα, μετρήθηκε το CLS των κυττάρων που αναπτύχθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης. Προσδιορίσαμε την κυτταρική επιβίωση χρησιμοποιώντας φθορισμό PI σε διαφορετικά χρονολογικά χρονικά ηλικιακά σημεία. Το χρονικό σημείο ανάπτυξης 72 ώρες θεωρήθηκε ως η ημέρα 1. Μπορούμε να συμπεράνουμε από το γράφημα επιβίωσης ότι διαφορετικές συγκεντρώσεις προσθήκης ραπαμυκίνης επεκτείνουν το CLS της ζύμης (Εικ. 4Β). Η επιβίωση των γηρασμένων κυττάρων που συμπληρώθηκαν με ραπαμυκίνη (5 nM και 10 nM) την ημέρα 4 ήταν~75 τοις εκατό. Ωστόσο, χωρίς ραπαμυκίνη ήταν~50 τοις εκατό. Την 7η ημέρα, η επιβίωση των ηλικιωμένων κυττάρων που είχαν συμπληρωθεί με ραπαμυκίνη ήταν 70 τοις εκατό. Ωστόσο, χωρίς ραπαμυκίνη μειώθηκε σε λιγότερο από 20 τοις εκατό. Η επέκταση CLS των γηρασμένων κυττάρων μπορεί επίσης να παρατηρηθεί σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (0,62-2,5 nM) ραπαμυκίνης (Εικ. 4Β).

Έχουμε επικυρώσει το πρωτόκολλό μας συγκρίνοντάς το απευθείας με δύο παραδοσιακές προσεγγίσεις ανάπτυξης που μετρούν το CLS της μαγιάς. Πρώτον, πραγματοποιήσαμε τη δοκιμασία ανάπτυξης στο υγρό μέσο για να μετρήσουμε την επίδραση της ραπαμυκίνης στη διάρκεια ζωής. Η επιβίωση των κυττάρων χρονολογικής γήρανσης παρακολουθήθηκε σε διαφορετικά ηλικιακά σημεία με μεταφορά καλλιέργειας 3-µl σε 200 μL μέσου YPD σε φρέσκο ​​τρυβλίο 96-πηγαδιού. Η ανάπτυξη αντιστοιχεί στον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων στο εμβόλιο (Εικ. 4C). Η ανάπτυξη των γηρασμένων κυττάρων που καταγράφηκε μέσω της απορρόφησης OD600nm προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών. Το κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε από την απορρόφηση OD600 nm εκκολπώματος για κάθε ηλικιακό σημείο σε σχέση με την ημέρα 1 (θεωρείται 100 τοις εκατό επιβίωση κυττάρων). Το γράφημα επιβίωσης φαίνεται στο Σχ. 4Δ.

Ομοίως, πραγματοποιήσαμε την έκφυση με ανίχνευση κηλίδων στο μέσο άγαρ. Εντοπίσαμε 3-μl καλλιέργεια γήρανσης στην πλάκα άγαρ YPD και την επωάσαμε για 48 ώρες. Η ανάπτυξη γηρασμένων κυττάρων στην πλάκα YPD άγαρ οπτικοποιήθηκε με το σύστημα απεικόνισης GelDoc (Εικ. 4Ε). Όπως ήταν αναμενόμενο, μπορούμε να παρατηρήσουμε τάσεις παράτασης της διάρκειας ζωής από τη ραπαμυκίνη τόσο σε αναλύσεις YPD υγρού όσο και σε δοκιμές ανάπτυξης άγαρ που είναι παράλληλες με αυτές που προσδιορίζονται με το νέο μας πρωτόκολλο.

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το πρωτόκολλό μας HTS αναπαράγει ότι η ραπαμυκίνη παρατείνει τη διάρκεια ζωής των κυττάρων. Επιπλέον, αξιολογούμε τον παράγοντα Ζ για να αξιολογήσουμε την ποιότητα αυτής της μεθόδου [38]. Γενικά, οι συντελεστές Ζ στην περιοχή 0.5–1.0 είναι ενδεικτικοί εξαιρετικών αναλύσεων HTS. Ο παράγοντας Ζ προσδιορίστηκε για διαφορετικές συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης με φθορισμό PI γηρασμένων κυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Η χρηματοδότησή μας, ένας παράγοντας Z {{10}}.70 για 5 nM ραπαμυκίνη και 0,74 για 10 nM ραπαμυκίνη τοποθετεί αυτήν τη μέθοδο HTS στην κατηγορία υψηλής ποιότητας. Έτσι, το πρωτόκολλό μας είναι αρκετά ισχυρό για να εντοπίσει πιθανές αντιγηραντικές ενώσεις.

Για να διερευνήσουμε εάν η μέθοδος είναι αποτελεσματική σε διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο ζυμομύκητα, δοκιμάσαμε την επίδραση της ραπαμυκίνης στο CLS του στελέχους BY4743. Το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae BY4743 είναι αυξοτροφικό για την ιστιδίνη, τη λευκίνη και την ουρακίλη. Το στέλεχος BY4743 αναπτύχθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης στο μέσο SD συμπληρωμένο με αυξοτροφικά συστατικά. Η επιβίωση των γηρασμένων κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φθορισμό PI (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Βρήκαμε ότι η ραπαμυκίνη αύξησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων BY4743 ποσοτικά με παρόμοιους τρόπους με αυτόν του CEN.PK113-7D. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι η μέθοδός μας είναι αποτελεσματική σε διαφορετικά στελέχη ζύμης.

Επίδραση της γλυκόζης στη χρονολογική διάρκεια ζωής της μαγιάς

Επικυρώσαμε επίσης τη μέθοδό μας εξετάζοντας την επίδραση του περιορισμού των θερμίδων στη χρονολογική διάρκεια ζωής της μαγιάς. Ο περιορισμός των θερμίδων είναι μία από τις καθιερωμένες παρεμβάσεις για την καθυστέρηση της γήρανσης και την παράταση της διάρκειας ζωής σε ολόκληρο τον οργανισμό-μοντέλο, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων ζύμης και θηλαστικών [11, 13, 16]. Για να προσδιορίσουμε την επίδραση του περιορισμού των θερμίδων στο CLS της μαγιάς, μειώνουμε την περιεκτικότητα σε γλυκόζη στο μέσο καλλιέργειας. Αναπτύξαμε το κύτταρο σε τρεις διαφορετικές συνθήκες μέσου SD που περιείχαν 0,25 τοις εκατό , 0,5 τοις εκατό και 2 τοις εκατό γλυκόζη. Μετρήσαμε την κυτταρική ανάπτυξη σε διαφορετικά χρονικά σημεία (24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες). Όλες οι καλλιέργειες έφτασαν σε κορεσμό ανάπτυξης μετά από 24 ώρες (Εικ. 5Α). Η κυτταρική ανάπτυξη ήταν χαμηλότερη σε 0,25 τοις εκατό και 0,5 τοις εκατό σε σύγκριση με 2 τοις εκατό γλυκόζη (Εικ. 5Α). Μετρήσαμε την επιβίωση της χρονολογικής γήρανσης για κύτταρα που αναπτύχθηκαν κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φθορισμού PI (Εικ. 5Β). Από το γράφημα επιβίωσης συμπεραίνουμε ότι ο περιορισμός της γλυκόζης επεκτείνει το CLS της ζύμης. Επιβεβαιώσαμε επίσης ταυτόχρονα την επέκταση του CLS με δοκιμές ανάπτυξης (Εικ. 5C, D και E), επικυρώνοντας περαιτέρω τη νέα μας μέθοδο για τον προσδιορισμό του CLS της ζύμης. Η επίδραση του περιορισμού της γλυκόζης στην επέκταση CLS του στελέχους BY4743 φάνηκε επίσης με τη μέθοδο PICLS (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Έτσι, η προσέγγισή μας για τη μέτρηση του CLS της μαγιάς αντιπροσωπεύει μια νέα, γρήγορη και χαμηλού κόστους μέθοδο για τον έλεγχο των χημικών παραγόντων και τις συνθήκες καλλιέργειας για τον εντοπισμό των αντιγηραντικών παρεμβάσεων.

Ο έλεγχος των χημικών παραγόντων με τη χρήση της πρόσφατα αναπτυγμένης μεθόδου ταυτοποίησε την 2,5-άνυδρη-D-μαννιτόλη ως μια νέα αντιγηραντική ένωση

Μετά την ανάπτυξη και την επικύρωση του νέου πρωτοκόλλου, χρησιμοποιήσαμε αυτή τη μέθοδο για να εξετάσουμε εκατοντάδες χημικούς παράγοντες για την αναγνώριση αντιγηραντικών ενώσεων (Συμπληρωματικό Σχήμα S4 και Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Ως ένα από τα εκπληκτικά αποτελέσματα, βρήκαμε ενδείξεις για την ένωση 2,5-άνυδρο-D-μαννιτόλη (2,5-AM) για την επέκταση του CLS της μαγιάς. Στο Σχ. 6, παρουσιάζουμε το αποτέλεσμα λεπτομερών πειραμάτων παρακολούθησης για αυτήν την ένωση. Δοκιμάσαμε την αντιγηραντική δραστηριότητα του 2,5-AM σε διαφορετικές συγκεντρώσεις στην 96-πλάκα πηγαδιού. Αρχικά, προσδιορίσαμε την επίδραση του 2,5-ΠΜ στην ανάπτυξη των κυττάρων. Κύτταρα ζυμομύκητα επωάστηκαν με ποικίλες συγκεντρώσεις 2,5-AM στο μέσο SD. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία (24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες). Βρήκαμε ότι η κυτταρική ανάπτυξη έφτασε στο ίδιο επίπεδο κορεσμού μετά από 24 ώρες για όλες τις δοκιμασμένες συγκεντρώσεις 2,5-AM (Εικ. 6Α). Στη συνέχεια, μετρήσαμε την επιβίωση χρονολογικά γηρασμένων κυττάρων συμπληρωμένων με διαφορετικές συγκεντρώσεις 2,5-AM χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φθορισμού PI. Όπως προηγουμένως, η καλλιέργεια ανάπτυξης 72 ωρών θεωρήθηκε η ημέρα 1 για την ανάλυση CLS. Το γράφημα επιβίωσης σχεδιάζεται για διαφορετικά χρονολογικά χρονικά σημεία ηλικίας (Εικ. 6Β). Διαπιστώνουμε ότι το 2,5-AM επεκτείνει το CLS με τρόπο που εξαρτάται από τη συγκέντρωση. Η επιβίωση των γηρασμένων κυττάρων που συμπληρώθηκαν με 2,{34}}AM (8 mM) την ημέρα 4 ήταν ~ 80 τοις εκατό. ωστόσο, χωρίς 2,5- AM ήταν ~ 50 τοις εκατό . Την 7η ημέρα, η επιβίωση των ηλικιωμένων κυττάρων 2,5-ΠΜ με συμπλήρωμα ήταν ~ 75 τοις εκατό. ωστόσο, χωρίς 2,5-ΠΜ μειώθηκε σε λιγότερο από 20 τοις εκατό . Η αντιγηραντική δραστηριότητα του 2,5-AM επαληθεύτηκε επίσης με προσδιορισμούς ανάπτυξης (Εικ. 6C, D, και E).

2,5-Το AM είναι ένα μόριο σακχάρου που μπορεί να εισέλθει στο μονοπάτι της γλυκόλυσης. Υδρολύεται μόνο στα ανοδικά γλυκολυτικά στάδια που προκαλούν συσσώρευση μη μεταβολισμένων 2,5-AM-1,6-διφωσφορικών (2,5-AMBP) στα κύτταρα [39-41 ]. Για να ελέγξουμε εάν 2,5-AM σε συγκεντρώσεις παρόμοιες με το πείραμα CLS έχει υποστεί επεξεργασία από ένζυμα γλυκόλυσης, εξετάσαμε την αυξανόμενη ευαισθησία του στελέχους διαγραφής γονιδίου SNF1. Το SNF1 είναι ένας αισθητήρας κυτταρικής ενέργειας και εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεϊνική κινάση ενεργοποιημένη από AMP (AMPK) σε ευκαρυώτες [42, 43]. Τα κύτταρα ζυμομύκητα που στερούνται δραστηριότητας AMPK σχετίζονται με έναν υπερευαίσθητο φαινότυπο ανάπτυξης παρουσία μη μεταβολισμένων γλυκολυτικών ενδιάμεσων [44]. Μετρήσαμε την ανάπτυξη του στελέχους διαγραφής snf1Δ με διαφορετικές συγκεντρώσεις 2,5-AM. Βρήκαμε ότι το 2,5-AM αναστέλλει την ανάπτυξη του στελέχους διαγραφής snf1Δ σε σύγκριση με το στέλεχος άγριου τύπου (Συμπληρωματικό Σχήμα S5). Αυτός ο παρατηρούμενος φαινότυπος ανάπτυξης υποδεικνύει ότι το 2,5-ΑΜ υφίσταται γλυκόλυση και υδρολύεται σε μη μεταβολιζόμενα γλυκολυτικά ενδιάμεσα.

2,5-ΑΜ είναι ένα ανάλογο του τμήματος σακχάρου φρουκτόζη [39]. Για να διευκρινίσουμε εάν άλλα σάκχαρα επηρεάζουν επίσης το CLS, εξετάσαμε την επίδραση της φρουκτόζης, της μαννιτόλης και της μαλτόζης στη γήρανση της ζύμης. Συμπεριλάβαμε επίσης σορβιτόλη η οποία είναι ένα μη μεταβολισμένο σάκχαρο που αναφέρθηκε ότι αυξάνει το CLS των κυττάρων ζυμομύκητα αυξάνοντας την ωσμωτικότητα του μέσου καλλιέργειας [20, 45]. Πρώτον, δοκιμάσαμε την επίδραση της φρουκτόζης, της μαννιτόλης, της μαλτόζης και της σορβιτόλης στην ανάπτυξη των κυττάρων. Τα κύτταρα ζυμομύκητα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις φρουκτόζης, μαννιτόλης, μαλτόζης και σορβιτόλης παρόμοιες με 2,5-AM στο μέσο SD. Όπως τα επωασμένα κύτταρα 2,5-AM, φρουκτόζης, μαννιτόλης, μαλτόζης και σορβιτόλης έφτασαν σε κορεσμό ανάπτυξης μετά από 24 ώρες (Εικ. 7Α). Στη συνέχεια, μετρήσαμε την επιβίωση χρονολογικά γηρασμένων κυττάρων την ημέρα 1, την ημέρα 7, την ημέρα 14 και την ημέρα 21. Σε αντίθεση με την 2,5-ΠΜ, η λήψη συμπληρωμάτων φρουκτόζης, μαννιτόλης, μαλτόζης και σορβιτόλης δεν επέκτεινε τη διάρκεια ζωής του μαγιά (Εικ. 7Β, Γ, Δ, Ε και Συμπληρωματικό Σχ. S6). Αξιοσημείωτα, το 2,5-ΠΜ παρατείνει τη διάρκεια ζωής ακόμη και στο τελευταίο στάδιο της χρονολογικής γήρανσης. Ηλικιωμένα κύτταρα με συμπλήρωμα 2,5-AM (8 mM) επιβιώνουν (~65 τοις εκατό ) την ημέρα 21. Ωστόσο, η επιβίωση των γηρασμένων κυττάρων χωρίς συμπλήρωμα 2,5-ΑΜ ήταν μικρότερη από 10 τοις εκατό .

Προς μεγάλη μας έκπληξη, διαπιστώσαμε ότι η σορβιτόλη σε χαμηλές συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν δεν είναι σε θέση να αυξήσει το CLS (Εικ. 7B, C, D, E και Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Υποθέσαμε ότι ενδέχεται να απαιτούνται υψηλότερες συγκεντρώσεις σορβιτόλης για την αύξηση του CLS. Δοκιμάσαμε μια σειρά υψηλότερων συγκεντρώσεων, συμπεριλαμβανομένης της 1 Μ σορβιτόλης, η συγκέντρωση που αναφέρθηκε προηγουμένως ότι επηρεάζει το CLS (18 τοις εκατό ισοδύναμο με 1 Μ) [20, 45]. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές, βρίσκουμε επίσης ότι πολύ υψηλές συγκεντρώσεις σορβιτόλης (μεταξύ 0,5 και 1 M) αυξάνουν το CLS της ζύμης (Συμπληρωματικό Σχήμα S7), προφανώς αυξάνοντας την οσμωτικότητα του μέσου. Είναι ενδιαφέρον ότι το CLS αυξάνεται κατά 2,5-AM σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση (2 mM) υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός της αντιγηραντικής του δράσης είναι διαφορετικός από τον οσμωτικό. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αντιγηραντική δράση του 2,5-AM είναι ειδική για αυτήν την ένωση σακχάρου και δεν παρατηρείται για πολλές άλλες, παρόμοιας δομής χημικές ουσίες.

【Για περισσότερες πληροφορίες: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】