Η επαγωγή περιφερειακής εκπαιδευμένης ανοσίας στο πάγκρεας διεγείρει την αντικαρκινική δραστηριότητα για τον έλεγχο της εξέλιξης του καρκίνου του παγκρέατος Μέρος 1

Παρά την αξιοσημείωτη επιτυχία της ανοσοθεραπείας σε πολλούς τύπους καρκίνου, το αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου δεν έχει ακόμη ωφεληθεί. Τα έμφυτα ανοσοκύτταρα είναι κρίσιμα για την αντικαρκινική ανοσοεπιτήρηση και πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι αυτοί οι πληθυσμοί διαθέτουν μια μορφή μνήμης, που ονομάζεται εκπαιδευμένη έμφυτη ανοσία, η οποία συμβαίνει μέσω μεταγραφικού, επιγενετικού και μεταβολικού επαναπρογραμματισμού.

Εδώ αποδεικνύουμε ότι τα σωματίδια -γλυκάνη που προέρχονται από ζυμομύκητες, ένας επαγωγέας της εκπαιδευμένης ανοσίας, διακινούνται στο πάγκρεας, γεγονός που προκαλεί μια εξαρτώμενη από το CCR2-εισροή μονοκυττάρων/μακροφάγων στο πάγκρεας που εμφανίζουν χαρακτηριστικά εκπαιδευμένης ανοσίας. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να ενεργοποιηθούν κατά την έκθεση σε καρκινικά κύτταρα και παράγοντες που προέρχονται από όγκο και παρουσιάζουν ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα έναντι των κυττάρων όγκου του παγκρέατος. Σε ορθοτοπικά μοντέλα αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού πόρου, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με γλυκάνη εμφανίζουν σημαντικά μειωμένο φορτίο όγκου και παρατεταμένη επιβίωση, η οποία ενισχύεται περαιτέρω όταν συνδυάζεται με ανοσοθεραπεία. Αυτά τα ευρήματα χαρακτηρίζουν τους δυναμικούς μηχανισμούς και τον εντοπισμό της περιφερειακής εκπαιδευμένης ανοσίας και προσδιορίζουν μια εφαρμογή εκπαιδευμένης ανοσίας στον καρκίνο.

Η ανοσία έχει πολλές λειτουργίες, όπως τον καθαρισμό παλαιών και κατεστραμμένων κυττάρων: Το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί επίσης να καθαρίσει παλιά και κατεστραμμένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων, για να προστατεύσει το σώμα από ασθένειες. Μπορεί επίσης να διατηρήσει την ισορροπία του σώματος: το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί επίσης να εξισορροπήσει το εσωτερικό περιβάλλον του σώματος, να διατηρήσει την ισορροπία μεταξύ των ανοσοκυττάρων και να αποφύγει την εμφάνιση ασθενειών όπως η υπερβολική αντίδραση ή η ανοσολογική ανεπάρκεια, επομένως η ανοσία είναι πολύ σημαντική για το ανθρώπινο σώμα.

Ταυτόχρονα, διαπιστώσαμε ότι το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να βελτιώσει την ανοσία. Το Cistanche είναι πλούσιο σε μια ποικιλία βιολογικά ενεργών συστατικών, όπως πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή, στερόλες κ.λπ. βακτήρια. Βελτιώστε την αντίσταση και την ανοσία του οργανισμού. Επιπλέον, το Cistanche έχει επίσης αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και ηρεμιστικά αποτελέσματα, τα οποία μπορούν να βοηθήσουν στην ανακούφιση της σωματικής κόπωσης και στην εξάλειψη του στρες για την ενίσχυση του ανοσοποιητικού.

Κάντε κλικ για να μάθετε συμπλήρωμα cistanche deserticola

Η διάγνωση του αδενοκαρκινώματος του παγκρεατικού πόρου (PDAC) είναι καταστροφική, με μόνο το 10 τοις εκατό των ασθενών να επιβιώνουν τα τελευταία 5 χρόνια1. Αν και το ποσοστό επιβίωσης από το 2014 έχει αυξηθεί από 6 σε 10 τοις εκατό, ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει ανθεκτικός στην πλειονότητα των διαθέσιμων επί του παρόντος θεραπειών.

Επιπλέον, καθώς τα δημογραφικά στοιχεία των Ηνωμένων Πολιτειών μεταβάλλονται, προβλέπεται ότι ο καρκίνος του παγκρέατος θα γίνει η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας που σχετίζεται με τον καρκίνο έως το 2030 και επομένως αποτελεί μια σημαντική μελλοντική πρόκληση για τους κλινικούς γιατρούς2. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ιδιαίτερα θανατηφόρος επειδή σε πρώιμα στάδια σπάνια εμφανίζονται κλινικά συμπτώματα, με αποτέλεσμα το 75-80 τοις εκατό των ασθενών να διαγνωστεί με προχωρημένη, μη εξαιρέσιμη νόσο3,4. Ακόμη και σε ασθενείς που είναι κατάλληλοι για εκτομή, το ποσοστό επιβίωσης 5-του έτους είναι μόνο 20–25 τοις εκατό 4. Επιπλέον, ο καρκίνος του παγκρέατος έχει δείξει μικρή ανταπόκριση στις ανοσοθεραπείες που έχουν δείξει αξιοσημείωτα αποτελέσματα σε άλλους συμπαγείς όγκους5–9. Οι κλινικές δοκιμές Φάσης Ι και ΙΙ που χρησιμοποιούν αναστολείς CTLA-4 και PD-1 τόσο μόνοι όσο και σε συνδυασμό έχουν κριθεί αναποτελεσματικές για τη θεραπεία του PDAC, κάτι που πιθανώς εξηγείται από τη μη ανοσογονική φύση του PDAC10- 12.

Μια σημαντική πρόκληση για την επιτυχή εφαρμογή της ανοσοθεραπείας στο PDAC είναι η υπέρβαση του ανοσοκατασταλτικού μικροπεριβάλλοντος όγκου του παγκρέατος (TME). Το PDAC χαρακτηρίζεται από ένα πυκνό προ-ογκογόνο δεσμοπλαστικό στρώμα, μια πληθώρα ανοσοκατασταλτικών κυτταρικών υποομάδων εντός αυτού του στρώματος όπως μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (TAMs), ρυθμιστικά Τ-κύτταρα (T-regs) και κατασταλτικά κύτταρα που προέρχονται από μυελοειδή (MDSCs). , έλλειψη ενεργοποιημένων αντικαρκινικών ανοσοκυττάρων και υπεραγγείωση που προσδίδει σε ένα υποξικό μικροπεριβάλλον13–16. Μαζί αυτές οι συνθήκες καθιστούν εξαιρετικά δύσκολη την αποτελεσματική χορήγηση ανοσοθεραπειών στο πάγκρεας και για αυτά τα θεραπευτικά φάρμακα την επιτυχή ενεργοποίηση αντικαρκινικών ανοσολογικών αποκρίσεων, εάν φτάσουν εκεί. Επομένως, χρειάζονται απεγνωσμένα νέες θεραπείες που όχι μόνο μπορούν να στοχεύσουν ειδικά το πάγκρεας, αλλά μπορούν επίσης να διεισδύσουν στο πυκνό δεσμοπλαστικό στρώμα και να είναι ικανές να προκαλέσουν ισχυρές αντικαρκινικές ανοσοαποκρίσεις παρά την ανοσοκατασταλτική ΤΜΕ.

Η εκπαιδευμένη έμφυτη ανοσία είναι ένα εξελικτικά αρχαίο πρόγραμμα ανοσολογικής μνήμης που πρόσφατα μπήκε σε εις βάθος επιστημονική έρευνα. Τα εκπαιδευμένα έμφυτα ανοσοκύτταρα έχουν αποδειχθεί ότι υφίστανται μεταγραφικό, επιγενετικό και μεταβολικό επαναπρογραμματισμό κατά την έκθεση σε συγκεκριμένα αρχικά ερεθίσματα, και όταν αυτά τα έμφυτα ανοσοκύτταρα εκτίθενται ξανά σε ένα δευτερεύον ετερόλογο ερέθισμα, «εκπαιδεύονται» να ανταποκρίνονται περισσότερο σε αυτό το ερέθισμα που εκδηλώνεται με ενισχυμένη φλεγμονώδη απόκριση17–19. Πολλά βιολογικά φάρμακα μπορούν να προκαλέσουν εκπαιδευμένη ανοσία, συμπεριλαμβανομένου του εμβολίου Bacillus Calmette-Guérin (BCG) και της φυσικής ένωσης -γλυκάνης. Αν και οι περισσότερες μελέτες σχετικά με την εκπαιδευμένη ανοσία επικεντρώνονται σε παθογόνα όπως τα βακτήρια και οι ιοί ως δευτερεύον ερέθισμα, νέες μελέτες υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα όγκου μπορεί επίσης να επανενεργοποιήσουν εκπαιδευμένα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Όλες οι έρευνες μέχρι σήμερα έχουν χρησιμοποιήσει υποδόρια μοντέλα καρκίνου, επομένως δεν είναι γνωστό εάν η παρουσία εκπαιδευμένων έμφυτων ανοσοκυττάρων μπορεί να προκαλέσει αντικαρκινικά αποτελέσματα σε όγκους εντός συμπαγών οργάνων, όπως ο καρκίνος του παγκρέατος20,21.

Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε απροσδόκητα ότι ενδοπεριτοναϊκά (IP) ενέθηκαν διακινήσεις σωματιδίων -γλυκάνης που προέρχονται από ζυμομύκητα σε μεγάλη αναλογία στο πάγκρεας. Η απευθείας διακίνηση -γλυκάνης στο πάγκρεας υπογραμμίζει μια προηγουμένως αχαρακτηρισμένη οδό για την επαγωγή περιφερειακής εκπαιδευμένης ανοσίας. Επιπρόσθετα, δοκιμάσαμε την υπόθεση ότι αυτή η διακίνηση μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την πρόκληση αντικαρκινικής ανοσίας κατά του καρκίνου του παγκρέατος. Δεδομένης της αποτυχίας της πλειονότητας των θεραπευτικών και ανοσοθεραπειών μόνα τους και σε συνδυασμό για τη θεραπεία του PDAC και της δυσκολίας στόχευσης αυτών των θεραπευτικών σκευασμάτων στο πάγκρεας, τα ευρήματά μας συλλογικά παρέχουν μια πιθανή σημαντική ανακάλυψη όχι μόνο στην άμεση στόχευση του παγκρέατος αλλά και στη στρατολόγηση κατά του όγκου. έμφυτα ανοσοκύτταρα στο ανοσολογικά ψυχρό PDAC TME.

Αποτελέσματα

Τα σωματίδια που προέρχονται από ζυμομύκητες -γλυκάνη διοχετεύονται κατά προτίμηση στο πάγκρεας.

Έχει τεκμηριωθεί καλά ότι η χορήγηση -γλυκανών από βακτήρια και μύκητες αυξάνει τον αριθμό και τη συχνότητα των αιματοποιητικών και πολυδύναμων προγόνων που στρέφονται προς τη μυελοειδή γενεαλογία, η οποία τελικά λειτουργεί ως σημαντικό βήμα στην επαγωγή της κεντρικής και περιφερειακής εκπαιδευμένης ανοσίας22. . Ωστόσο, δεν έχει ακόμη αποδειχθεί πού ακριβώς διακινεί η γλυκάνη μετά τη χορήγηση για να έχει αυτά τα αποτελέσματα.

Σε αυτές τις μελέτες, χρησιμοποιήθηκαν ολόκληρα σωματίδια -γλυκάνης (WGP) που προέρχονται από Saccharomyces cerevisiae, τα οποία είναι κοίλα κύτταρα ζυμομύκητα 2-4 micron κατασκευασμένα από υψηλής συγκέντρωσης (1,3) -γλυκάνες. Ο λεπτομερής χαρακτηρισμός της WGP -γλυκάνης περιγράφεται σε μία από τις άλλες μελέτες μας. Σε αντίθεση με άλλες μορφές -γλυκάνης που χρησιμοποιούνται στην εκπαιδευμένη ανοσία, αυτή η σύνθεση είναι μοναδική στο ότι είναι σωματιδιακή και απαιτεί ενεργή φαγοκυττάρωση για να ασκήσει τα αποτελέσματά της. Για την αξιολόγηση της διακίνησης αυτής της σωματιδιακής γλυκάνης, το WGP επισημάνθηκε με (5-(4,6- Διχλωροτριαζινυλ) Αμινοφθοροσκεΐνη) (DTAF) και ενέθηκε IP σε ποντίκια άγριου τύπου (WT) C57BL/6. Τρεις ημέρες μετά τη χορήγηση IP (3-ημέρα WGP), οι πνεύμονες, ο σπλήνας, οι βουβωνικοί και μεσεντερικοί λεμφαδένες, τα κύτταρα της περιτοναϊκής κοιλότητας και το πάγκρεας συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με παγωμένο PBS για να ξεπλυθεί το DTAFWGP από το περιτόναιο που μπορεί να έχουν προσκολληθεί στην επιφάνεια του οργάνου και η παρουσία DTAF-WGP σε κάθε όργανο εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Ενώ υπήρξε κάποια διακίνηση του DTAF-WGP στον σπλήνα, τους μεσεντέριους λεμφαδένες και το υπόλοιπο DTAF-WGP στην περιτοναϊκή κοιλότητα, το πάγκρεας έδειξε μια εντυπωσιακή και απροσδόκητη παρουσία του DTAF-WGP (Εικ. 1α).

Για περαιτέρω αξιολόγηση αυτής της διακίνησης και για να διασφαλιστεί ότι η ετικέτα DTAF δεν εμπλέκεται στον μηχανισμό διακίνησης, το WGP ραδιοεπισημάνθηκε με 89Zr και εγχύθηκε IP (Εικ. 1b) ή επωάστηκε με περιτοναϊκούς μακροφάγους στους οποίους στη συνέχεια εγχύθηκε IP (Εικ. 1c). Τα ποντίκια απεικονίστηκαν αρχικά χρησιμοποιώντας σάρωση PET/CT 48 ώρες μετά την ένεση και χρησιμοποιούνται πράσινοι κύκλοι για να υποδείξουν την παρατηρούμενη προτιμησιακή συσσώρευση του 89Zr-WGP στο πάγκρεας. Στη συνέχεια έγινε νεκροσκόπηση και μετρήθηκε η ραδιενεργή υπογραφή κάθε οργάνου. Με βάση τα δεδομένα της κυτταρομετρίας ροής, το 89Zr-WGP διακινήθηκε σε μεγάλες ποσότητες στο πάγκρεας και βρέθηκε σε χαμηλότερα επίπεδα στον σπλήνα, το ήπαρ και το εντερικό σύστημα. Τα περιτοναϊκά μακροφάγα που καλλιεργήθηκαν με 89Zr-WGP και στη συνέχεια εγχύθηκαν IP είχαν παρόμοια αν και ελαφρώς πιο διαφοροποιημένη διακίνηση από το καθαρό 89Zr-WGP, και επίσης συσσωρεύτηκαν πιο έντονα στο πάγκρεας (Εικ. 1δ). Η διακίνηση περιτοναϊκών μακροφάγων φορτωμένων με WGP στο πάγκρεας υποδεικνύει ότι τόσο τα γυμνά WGP όσο και τα μακροφάγα που έχουν φαγοκυτταρώσει το WGP εμφανίζουν τροπισμό στο πάγκρεας.

Για να εκτιμηθεί ο ρόλος που έπαιξε ο γνωστός υποδοχέας του WGP στη διακίνηση του WGP, τα ποντίκια που δεν είχαν τον υποδοχέα λεκτίνης τύπου C, Dectin-1, (Dectin{-1−/− ποντίκια) ενέθηκαν με IP με DTAF-WGP. Σε σύγκριση με τα ποντίκια WT, τα ποντίκια Dectin-1−/− εμφάνισαν πενταπλάσια μείωση στην ποσότητα του WGP που διακινήθηκε στο πάγκρεας, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Εικ. 1δ). Το 89ZrWGP έχει επίσης εγχύσει IP σε ποντίκια WT και Dectin-1−/− ποντίκια. Σε σύγκριση με τα ζώα WT, υπήρξε σημαντικά μικρότερη διακίνηση 89Zr-WGP στο πάγκρεας των ποντικών Δεκτίνη-1−/− (Εικ. 1ε). Για να διασφαλιστεί ότι αυτή η διαδικασία ήταν ειδική για τη γλυκάνη, ένα φθορίζον σωματίδιο λατέξ 3 μm με βάση το πολυστυρένιο, ίδιου μεγέθους με ένα σωματίδιο WGP, εγχύθηκε IP και δεν βρέθηκε να συσσωρεύεται στο πάγκρεας (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν έναν προηγουμένως αχαρακτηρισμένο τροπισμό που εξαρτάται από τη δεκτίνη-1 στον οποίο η -γλυκάνη διακινείται στο πάγκρεας.

Εικ. 1 Τα σωματίδια -γλυκάνης διακινούνται στο πάγκρεας με τρόπο που εξαρτάται από τη δεκτίνη-1-. ένα DTAF-WGP εγχύθηκε IP και 3 ημέρες αργότερα διαφορετικοί ιστοί (n=3) συλλέχθηκαν και αξιολογήθηκαν για την παρουσία του DTAF-WGP με κυτταρομετρία ροής. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικά διαγράμματα κουκκίδων και συνοπτικά δεδομένα. *p=0.032, **p=0.0057, ****p < 0,0001. b Το WGP επισημάνθηκε με 89Zr-WGP ή οι περιτοναϊκοί μακροφάγοι επωάστηκαν με 89Zr-WGP και πλύθηκαν, ακολουθούμενος από ένεση IP. Η απεικόνιση PET/CT εμφανίζει τη διακίνηση του 89Zr-WGP μετά από 48 ώρες. Τα όργανα αξιολογήθηκαν μεμονωμένα για ραδιενέργεια μετά από νεκροσκόπηση χρησιμοποιώντας μετρητή γάμμα. Στο c, η σημασία αναφέρεται σε σύγκριση με το πάγκρεας (n=3). ****p < 0,0001. d Δεκτίνη-1−/− ποντίκια ή ποντίκια WT ενέθηκαν με DTAF-WGP και η συσσώρευση του DTAF-WGP στο πάγκρεας αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής (WT PBS n=3, WT WGP n {{ 27}}, KO συν PBS n=3, KO συν WGP n=4). e Dectin-1−/− ποντίκια ή ποντίκια WT (n=4) ενέθηκαν με 89Zr-WGP και 48 ώρες αργότερα χρησιμοποιήθηκε ένα PET/CT για την αξιολόγηση της ποσότητας στο πάγκρεας. Το σήμα ποσοτικοποιήθηκε αναφέροντας το ποσοστό της ενέσιμης δόσης (%) στο πάγκρεας. *p=0.046. Μια μονόδρομη ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις του Tukey χρησιμοποιήθηκε στο a–d, και ένα μη ζευγαρωμένο, δύο ουρών μαθητικό t-test χρησιμοποιήθηκε στο π.χ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύτηκαν ως μέσος όρος ± SEM. ns μη σημαντικό. Κάθε δείγμα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικά ανεξάρτητο ζώο που ελήφθη σε ένα μόνο ανεξάρτητο πείραμα το οποίο επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές για επαλήθευση των αποτελεσμάτων.

-Η γλυκάνη που διακινείται στο πάγκρεας διεγείρει μια εισροή έμφυτων ανοσοκυττάρων που δείχνουν έναν φαινότυπο εκπαιδευμένης ανοσίας.

Μετά την ανακάλυψη ότι η -γλυκάνη εμφανίζει τροπισμό προς το πάγκρεας, παρατηρήθηκε επίσης ότι το ανοσοποιητικό τοπίο του παγκρέατος άλλαξε σημαντικά μετά τη θεραπεία με WGP. Η άφιξη του WGP στο πάγκρεας συνοδεύτηκε από μια ευδιάκριτη εισροή CD11b συν μυελοειδών κυττάρων στο πάγκρεας την ημέρα 3, μερικά από τα οποία είχαν φαγοκυτταρώσει το WGP (Εικ. 2α).

Αυτό το εύρημα μας οδήγησε να εξετάσουμε πώς επηρεάζονται οι γενικοί ανοσοποιητικοί πληθυσμοί του παγκρέατος μετά τη θεραπεία με IP WGP. Όπως έχει παρατηρηθεί προηγουμένως ότι οι ανοσολογικές αλλαγές που σχετίζονται με την εκπαιδευμένη ανοσία στο ΒΜ είναι πιο έντονες 1-εβδομάδα μετά την έκθεση στη -γλυκάνη22, το ανοσοποιητικό προφίλ του παγκρέατος εξετάστηκε σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με μικροσωματίδιο πολυστυρενίου 3 μm ή WGP 7 ημέρες μετά τη χορήγηση. Πρώτον, παρατηρήθηκε ότι υπήρξε περίπου επταπλάσια αύξηση στον συνολικό απόλυτο αριθμό των CD45 συν ανοσοκυττάρων στο πάγκρεας μετά τη θεραπεία με WGP (Εικ. 2b). Ο έλεγχος μικροσωματιδίων πολυστυρενίου 3 μm δεν είχε τέτοια αποτελέσματα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1β), υποδεικνύοντας ότι αυτή η εισροή ανοσοκυττάρων είναι ειδική για το WGP. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση στο ποσοστό των CD45 συν ανοσοκυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 1c).

Για να ταξινομήσουμε περαιτέρω ποιοι κυτταρικοί τύποι ήταν υπεύθυνοι για αυτήν την επέκταση του πληθυσμού του ανοσοποιητικού CD45 συν, ο απόλυτος αριθμός (Εικ. 2β) και το σχετικό ποσοστό (Συμπληρωματικό Σχήμα 1c) των μυελοειδών κυττάρων (CD11b συν), των Τ-κυττάρων (CD3 συν) , Β-κύτταρα (CD19 συν) και ΝΚ κύτταρα (NK1.1 συν) αξιολογήθηκαν. Οι αθροιστικές αλλαγές στο πάγκρεας αντιπροσωπεύονται από γραφήματα πίτας που δείχνουν ότι η επέκταση του μυελοειδούς διαμερίσματος είναι υπεύθυνη για τη σχετική μείωση του ποσοστού άλλων πληθυσμών κυττάρων και τη συνολική αύξηση του πληθυσμού CD45 συν μετά από θεραπεία με WGP (Εικ. 2γ) . Στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν αυτή η εισροή CD11b συν ανοσοκυττάρων ήταν παροδική, επομένως το ποσοστό των συνολικών κυττάρων CD45 plus και κυττάρων CD11b συν στο πάγκρεας μετά από ένεση IP μετρήθηκε στις 7,10, 18 και 30 ημέρες.

Εικ. {{0}}η γλυκάνη διεγείρει μια εισροή εκπαιδευμένων μυελοειδών κυττάρων στο πάγκρεας. ένα ποσοστό CD45 συν CD11b συν DTAF συν κύτταρα στο πάγκρεας 3 ημέρες αφότου τα ποντίκια WT έλαβαν IP DTAF-WGP. β Επτά ημέρες μετά την ένεση PBS ή WGP, απόλυτοι αριθμοί CD45 συν (n=15), CD11b συν (n=18), CD3 συν (n {{1{{30} Εμφανίζονται }}}), CD19 plus (n=10) και NK1.1 plus (n=14). ****p < 0.0001. γ Διαγράμματα πίτας που αντιπροσωπεύουν τις αλλαγές συχνότητας των βασικών πληθυσμών ανοσοκυττάρων μετά τη θεραπεία με WGP. d ποντίκια WT ενέθηκαν με PBS (n=5) ή WGP (n=5) και το ποσοστό των κυττάρων CD45 plus και CD45 συν CD11b plus μετρήθηκε 7, 10, 18 και 30 ημέρες αργότερα ( n=3). **p=0,0034, ****p < 0,0001 (CD45), **p=0,0023 (CD11b). e Απόλυτοι αριθμοί F4/80 συν (n=10), Ly6C συν (n {= 10) και Ly6G συν (n=8) εντός του πληθυσμού CD11b συν. **p=0,003, ****p < 0,0001. f Επτά ημέρες μετά την IP PBS ή WGP το πάγκρεας επαναδιεγέρθηκε με LPS. Μετρήθηκε η παραγωγή TNF σε κύτταρα CD11b plus (n=28), CD11b συν F4/80 plus (n=9) και CD11b συν Ly6C συν (n=8). *p=0.024, ***p=0.0001, ****p < 0,0001. g Επτά ημέρες μετά το PBS ή το WGP, ο πληθυσμός CD45 συν CD11b συν εμπλουτίστηκε (n=4). Τα κύτταρα επαναδιεγέρθηκαν με ή χωρίς LPS για 24 ώρες. Η παραγωγή TNF και IL-6 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ELISA. ****p < 0,0001. h Τα παγκρεατικά CD11b συν κύτταρα από ποντίκια που είχαν εκπαιδευτεί με PBS και WGP ταξινομήθηκαν. Έγινε RT-qPCR για να ποσοτικοποιηθεί το TNF (n=4), το IL-6 (n=4), το iNOS (PBS n=4, το WGP n=3) , και IL-10 (PBS n=4, WGP n=5) επίπεδα έκφρασης mRNA. *p=0.028, **p=0.0018, ****p < 0,0001. Τα I CD11b plus κύτταρα από ποντίκια στα οποία έγινε ένεση PBS ή WGP (24 ώρες) ταξινομήθηκαν (n=4). Οι ιστόνες απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση western blot (πάνω) ή ELISA (κάτω) για H3K4me3, H3K27Ac, ​​H3K27me3 και ολικό H3. ****p < 0,0001. j Επτά ημέρες μετά την IP WGP ή PBS, οι πληθυσμοί του παγκρεατικού CD45 συν CD1b συν ταξινομήθηκαν. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση RNA-Seq (PBS n=3, WGP n=3).

Αντιπροσωπεύεται η κατανομή των τιμών p (–log10(p-value)) και οι αλλαγές αναδίπλωσης (log2 FC) των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. k t-SNE γραφικά του πληθυσμού CD11b συν σε ποντίκια που εκπαιδεύτηκαν με PBS ή WGP 7 ημέρες πριν και αναλύθηκαν με CyTOF (PBS n=3, WGP n=3). Τα μη ζευγαρωμένα, δύο ουρών του μαθητή t-test χρησιμοποιήθηκαν στα b, e, f και h. Μια μονόδρομη ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε στα d, g και i. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SEM. ns μη σημαντικό. Κάθε δείγμα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικά ανεξάρτητο ζώο που λαμβάνεται σε ένα μόνο ανεξάρτητο πείραμα.

Ενώ το ποσοστό των κυττάρων CD11b plus κορυφώθηκε την ημέρα 7, το ποσοστό των κυττάρων CD45 plus φάνηκε να κορυφώνεται την ημέρα 10, γεγονός που μπορεί να υποδεικνύει ότι μετά την εισροή κυττάρων CD11b plus στο πάγκρεας, μπορεί να ακολουθήσει εισροή άλλων τύπων ανοσοκυττάρων. Το ποσοστό των ανοσοκυττάρων στο πάγκρεας μειώθηκε στα βασικά επίπεδα την ημέρα 30, αποδεικνύοντας ότι αυτή η εισροή είναι παροδική (Εικ. 2δ). Μέσα στο μυελοειδές διαμέρισμα, παρατηρήσαμε ότι ο απόλυτος αριθμός (Εικ. 2e) και το ποσοστό (Συμπληρωματικό Σχήμα 1c) των μακροφάγων (F4/80 plus), των μονοκυττάρων (Ly6C συν) και των ουδετερόφιλων (Ly6G συν) ήταν όλα αυξημένα. Η εισροή ανοσοκυττάρων στο πάγκρεας αποδείχθηκε επίσης ότι εξαρτάται από τη δόση του WGP που εγχύθηκε, όπου υψηλότερες δόσεις WGP συσχετίστηκαν με την αυξημένη εισροή συνολικών CD45 συν CD11b συν μυελοειδών κυττάρων και CD45 συν CD11b συν F4/80 συν μακροφάγων. (Συμπληρωματικό Σχ. 1δ).

Καθώς η παγκρεατίτιδα και η καταστροφή των παγκρεατικών νησίδων συνδέονται με τη διήθηση των ανοσοκυττάρων του παγκρέατος, το Η συν Ε του παγκρέατος πραγματοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η ακεραιότητα των ακινών 7 ημέρες μετά τη χορήγηση του WGP (Συμπληρωματικό Σχήμα 1e). Η αμυλάση ορού, ένας διαγνωστικός δείκτης παγκρεατίτιδας, μετρήθηκε επίσης σε ποντίκια που έλαβαν WGP έναντι PBS 7 ημέρες μετά την ένεση (Συμπληρωματικό Σχήμα 1στ). Ούτε οι νησίδες ούτε η αμυλάση του ορού επηρεάστηκαν αρνητικά από τη θεραπεία με WGP και την παρατηρούμενη ανοσολογική εισροή, υποδεικνύοντας ότι η εισροή ανοσοκυττάρων σε αυτόν τον μηχανισμό δεν προκαλεί παγκρεατική καταστροφή.

Για να διερευνήσουμε εάν τα κύτταρα που βρέθηκαν να διεισδύουν στο πάγκρεας του ποντικού μετά τη θεραπεία με WGP εμφάνισαν φαινότυπο εκπαιδευμένης ανοσίας, χρησιμοποιήσαμε ένα τυπικό πρωτόκολλο εκπαίδευσης στο οποίο τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με WGP ή PBS και 7 ημέρες αργότερα το πάγκρεας συλλέχτηκε και στη συνέχεια επαναδιεγέρθηκε με LPS. Η παραγωγή TNF- έχει χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατος δείκτης για την αξιολόγηση της εκπαιδευμένης απόκρισης. Συνολικά CD11b συν μυελοειδή κύτταρα, CD11b συν F4/80 συν μακροφάγα και CD11b συν Ly6C συν μονοκύτταρα αποδείχθηκε ότι παράγουν περισσότερο TNF- λόγω προηγούμενης έκθεσης στο WGP, όπως εκτιμήθηκε από το ποσοστό των κυττάρων TNF- plus και του MFI (Εικ. . 2στ). Για περαιτέρω αξιολόγηση αυτών των ευρημάτων, τα κύτταρα CD11b plus ταξινομήθηκαν από το πάγκρεας αυτών των ποντικών και διεγέρθηκαν εκ νέου ex vivo με LPS και τα επίπεδα TNF- και IL-6 στα υπερκείμενα μετρήθηκαν με ELISA. Σε σύγκριση με κύτταρα CD11b plus από ποντίκια PBS, κύτταρα από ποντίκια που είχαν εκπαιδευτεί με WGP που διεγέρθηκαν εκ νέου με LPS παρήγαγαν σημαντικά περισσότερο TNF- και IL{16}} (Εικ. 2g), γεγονός που σημαίνει ότι τα παγκρεατικά κύτταρα CD11b plus που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με WGP είχαν εκπαιδευτεί.

Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας RT-PCR, όπου παγκρεατικά CD11b συν κύτταρα ταξινομημένα από ποντίκια που είχαν εκπαιδευτεί με PBS ή WGP φάνηκε ότι παράγουν περισσότερο TNF-, IL-6, iNOS και λιγότερη IL-10 λόγω Θεραπεία WGP (Εικ. 2h). Δεδομένου ότι η εκπαιδευμένη ανοσία σχετίζεται με μεταβολικό και επιγενετικό επαναπρογραμματισμό23, μετρήσαμε τα επίπεδα γαλακτικού για να εξετάσουμε εάν εμπλέκεται η γλυκόλυση. Πράγματι, τα WGPtrained CD11b plus κύτταρα εκκρίνουν περισσότερο γαλακτικό σε σύγκριση με μη εκπαιδευμένα κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1g). Μετρήσαμε επίσης τις τροποποιήσεις ιστόνης των κυττάρων CD11b plus που έχουν εκπαιδευτεί με WGP. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ι, τα επίπεδα έκφρασης των H3K4me3 και H3K27Ac ενισχύθηκαν σημαντικά σε κύτταρα CD11b συν εκπαιδευμένα με WGP. Αυτό αποκαλύφθηκε τόσο με ανάλυση στυπώματος western (Εικ. 2i, πάνω) όσο και με ποσοτική ανάλυση ELISA (Εικ. 2i, κάτω). Μαζί αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι όχι μόνο το WGP υποκινεί έναν εκπαιδευμένο φαινότυπο στα κύτταρα που κυκλοφορούν στο πάγκρεας, αλλά υφίστανται επίσης μεταβολικό και επιγενετικό επαναπρογραμματισμό.

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA (RNA-Seq) πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια σε FACS ταξινομημένα CD45 συν CD11b συν κύτταρα 7 ημέρες μετά τη χορήγηση PBS ή WGP για να ληφθεί ένας αμερόληπτος και ολοκληρωμένος χαρακτηρισμός των μυελοειδών πληθυσμών στο πάγκρεας. Ανακαλύφθηκαν συνολικά 1459 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs), με 661 ρυθμισμένα προς τα πάνω και 798 γονίδια προς τα κάτω στη ρύθμιση WGPtrained (Εικ. 2j). Οι αναλύσεις εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA) επιβεβαίωσαν περαιτέρω τις προηγουμένως διερευνημένες ανοδικές ρυθμίσεις σε μονοπάτια που σχετίζονται με την παραγωγή TNF- και IL{10}} (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α). Με την παρατηρούμενη εισροή ανοσοκυττάρων, οι DEG που σχετίζονται με τη χημειοταξία των λευκοκυττάρων, τη μετανάστευση λευκοκυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α), τη χημειοταξία των μονοκυττάρων, τη μετανάστευση μακροφάγων και τη μετανάστευση μυελοειδών λευκοκυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 2b) ήταν όλα σημαντικά στην ομάδα πλούσια σε WG. Επιπλέον, οι οδοί Reactome σηματοδότησης CLEC7A δεκτίνης-1 και οδοί υποδοχέα λεκτίνης τύπου C εμπλουτίστηκαν σημαντικά, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τη συμμετοχή της Δεκτίνης-1 σε αυτή τη διαδικασία (Συμπληρωματικό Σχήμα 2γ).

Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο μυελοειδής πληθυσμός παρατηρήθηκε ότι είναι υπεύθυνος για την επέκταση του πληθυσμού CD45 plus και ότι τα μυελοειδή κύτταρα είναι ποικίλος πληθυσμός, πραγματοποιήθηκε ανάλυση CyTOF σε πάγκρεας από ποντικούς που έλαβαν PBS ή WGP 7 ημέρες πριν. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί εντός του παγκρέατος ταυτοποιήθηκαν και συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Τα διαγράμματα t-SNE έδειξαν ότι μετά τη θεραπεία με WGP υπήρξε μια σχετική μείωση στον πληθυσμό των μακροφάγων που κατοικούν, ο οποίος εκφράζει σε μεγάλο βαθμό δείκτες Μ2 όπως το CD206. Παρατηρήσαμε επίσης την εμφάνιση αρκετών μυελοειδών πληθυσμών στο πάγκρεας που ορίστηκαν ως Ly6C συν μονοκύτταρα που προέρχονται από μακροφάγους, διηθητικά φλεγμονώδη μονοκύτταρα, ενεργοποιημένα μακροφάγα και CD206 συν ενεργοποιημένα μακροφάγα (Εικ. 2k και Συμπληρωματικό Σχήμα 2δ). Οι γραφικές παραστάσεις viSNE που περικλείονται στον πληθυσμό CD11b συν έδειξαν μια ευδιάκριτη επέκταση των μονοκυττάρων και των μακροφάγων, με πρόσθετες αυξήσεις των πληθυσμών δενδριτικών κυττάρων (DCs), ουδετερόφιλων και NK μετά τη θεραπεία με WGP (Συμπληρωματικό Σχήμα 2e).

Επιπλέον, αυτές οι αναλύσεις υπογραμμίζουν ότι μετά την προπόνηση WGP και τη διέγερση LPS, ο TNF παρήχθη κυρίως από μακροφάγα και μονοκύτταρα, το IL{0}} και το iNOS παρήχθησαν κυρίως από τα μακροφάγα, το Granzyme-B παρήχθη από ΝΚ κύτταρα και μακροφάγους και η IFN παρήχθη που παράγεται κυρίως από ουδετερόφιλα (Συμπληρωματικό Σχ. 2στ). Αυτό αποκαλύπτει ότι ενώ πολλοί κυτταρικοί πληθυσμοί αλλάζουν λόγω της θεραπείας με WGP, τα πρωτεύοντα κύτταρα που εκπαιδεύονται από το WGP, όπως εκτιμάται από την αυξημένη έκφραση του TNF, είναι μακροφάγα και μονοκύτταρα και ότι δεν υπάρχει ούτε ένας τύπος κυττάρου υπεύθυνος για τον φαινότυπο της εκπαιδευμένης ανοσίας που παρατηρήθηκε.

Για να εκτιμήσουμε εάν αυτό το φαινόμενο της εισροής και ενεργοποίησης μυελοειδών κυττάρων εξαρτιόταν από άλλους ανοσοποιητικούς πληθυσμούς ή καθοδηγείται εξ ολοκλήρου από τα ίδια τα μυελοειδή κύτταρα, εξαντλήσαμε συγκεκριμένους ανοσοποιητικούς πληθυσμούς και παρατηρήσαμε τον εκπαιδευμένο φαινότυπο. Τα mAbs αντιCD4 και αντι-CD8 χρησιμοποιήθηκαν μόνα τους και σε συνδυασμό για την εξάντληση των Τ-κυττάρων, αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα της εξάντλησης (Συμπληρωματικό Σχήμα 3a) και παρατηρήθηκε ο εκπαιδευμένος φαινότυπος των μυελοειδών κυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 3b, c). Τα κύτταρα ΝΚ εξαντλήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας mAb PK136, η αποτελεσματικότητα εξάντλησης αξιολογήθηκε (Συμπληρωματικό Σχήμα 3d) και παρατηρήθηκε ο εκπαιδευμένος φαινότυπος (Συμπληρωματικό Σχήμα 3e, f). Απουσία Τ-κυττάρων και ΝΚ κυττάρων, τα μυελοειδή κύτταρα εξακολουθούσαν να παρατηρούνται να εκπαιδεύονται από το WGP. Ο εκπαιδευμένος φαινότυπος αξιολογήθηκε επίσης σε ποντικούς NSG που δεν έχουν Β-κύτταρα, Τ-κύτταρα και ΝΚ κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 3g, h). Αυτά τα ποντίκια εξακολουθούσαν να παρουσιάζουν έναν σαφή φαινότυπο εκπαιδευμένης ανοσίας.

Τέλος, εξαντλήσαμε τα ουδετερόφιλα χρησιμοποιώντας Ly6G mAb. Παρά την εξάντληση των κοκκιοκυττάρων, εξακολουθούμε να παρατηρούμε προπόνηση που προκαλείται από WGP στο CD11b συν μυελοειδές διαμέρισμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 3i–k). Συνολικά, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι τα διεισδυτικά μυελοειδή κύτταρα στο πάγκρεας εκπαιδεύονται από -γλυκάνη χωρίς τη βοήθεια ή την επίδραση προσαρμοστικών ανοσοποιητικών πληθυσμών, κυττάρων ΝΚ ή κοκκιοκυττάρων.

Η αλληλουχία RNA μονοκυττάρου αποκαλύπτει συγκεκριμένους πληθυσμούς προφλεγμονωδών μακροφάγων/μονοκυττάρων που κυκλοφορούν στο πάγκρεας κατά τη θεραπεία με γλυκάνη.

Καθώς οι αναλύσεις CyTOF μας έχουν αποκαλύψει την εμφάνιση αρκετών προηγουμένως αχαρακτηρισμένων πληθυσμών στο πάγκρεας μετά από θεραπεία με WGP, για να αποκτήσουμε μια πιο εις βάθος κατανόηση των κυτταρικών πληθυσμών που υπάρχουν στο πάγκρεας, πραγματοποιήθηκε αλληλουχία μονοκυττάρου RNA (scRNA-Seq). σε ταξινομημένα κύτταρα CD45 plus από ποντίκια που έλαβαν PBS και ποντίκια που έλαβαν WGP τρεις ({5}}ημέρα WGP) και επτά ημέρες πριν (7-ημέρα WGP). Δισδιάστατη αναπαράσταση UMAP 11.132 κυττάρων που συγκεντρώθηκαν από τρία δείγματα με συστάδες που προκύπτουν από k-πλησιέστερους γείτονες και αλγόριθμους Louvain χωρισμένους σε 19 διακριτές συστάδες (Εικ. 3a, b). Αξιολογήθηκε η σχετική συχνότητα κάθε συστάδας σε κάθε πειραματική ομάδα.

Εδώ, σημαντικές αυξήσεις στη συχνότητα των ομάδων 3, 4 και 10 παρατηρήθηκαν την 7η ημέρα μετά τη θεραπεία με WGP, μαζί με σχεδόν εξαφάνιση της ομάδας 5 (Εικ. 3γ). Οι σχετικές συχνότητες πολλών άλλων πληθυσμών φάνηκε επίσης να μειώνονται με την πάροδο του χρόνου. Ωστόσο, αυτή η φαινομενική τάση είναι πιθανό να οφείλεται στη σχετική αύξηση της συχνότητας άλλων πληθυσμών. Συνολικά, οι ομάδες 3,4,10 και 5 εμφανίζονται πιο σημαντικά αλλοιωμένες λόγω της θεραπείας με WGP (Εικ. 3δ).

Οι πληθυσμοί που σημειώθηκε προηγουμένως ότι μεταβλήθηκαν σημαντικά με την πάροδο του χρόνου λόγω της θεραπείας με WGP ήταν μέρος του μυελοειδούς διαμερίσματος, όπως προσδιορίστηκε από την έκφραση CSF1R (Εικ. 3d, e). Καθώς αυτά τα δεδομένα μαζί με προηγούμενα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι μυελοειδείς πληθυσμοί οδηγούν τις ανοσολογικές αλλαγές που σχετίζονται με τη θεραπεία με WGP, οι δυναμικές ομάδες CSF1R συν 3,4,10 και 5 διερευνήθηκαν με περισσότερες λεπτομέρειες όπως φαίνεται από γραφήματα βιολιού (Εικ. 3στ) και κουκκίδα διαγράμματα που αντιπροσωπεύουν τα κορυφαία 12 γονίδια-δείκτες με μέση βαθμολογία Ζ για κάθε ομάδα (Εικ. 3g). Το σύμπλεγμα 5, το οποίο υπήρχε σε ποντίκια PBS αλλά ουσιαστικά εξαφανίστηκε μετά τη θεραπεία με WGP, αναγνωρίστηκε ως μόνιμοι μακροφάγοι24,25. Αυτό το σύμπλεγμα εξέφρασε επίσης αξιοσημείωτα MAF και APO που σχετίζονται και τα δύο με την πόλωση των μακροφάγων Μ226-28. Το σύμπλεγμα 19 παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό αμετάβλητο με την πάροδο του χρόνου, επομένως δεν περιγράφηκε με περισσότερες λεπτομέρειες, αλλά εμφάνισε ένα προφίλ έκφρασης παρόμοιο με το σύμπλεγμα 5, και επομένως αντιπροσωπεύει επίσης ένα υποσύνολο μακροφάγων που κατοικούν στον ιστό. Το σύμπλεγμα 10, ο πληθυσμός μακροφάγων Ly6Clo, είχε επίσης παρόμοιο προφίλ έκφρασης με το σύμπλεγμα μακροφάγων μόνιμης κατοικίας 5, και αξιοσημείωτες υπογραφές έκφρασης των ARG1 και FABP. Υποθέτουμε ότι αυτός ο πληθυσμός είναι επαναπολωμένοι μόνιμοι μακροφάγοι δεδομένης της έλλειψης έκφρασης Ly6C, της ομοιότητας με τον πληθυσμό μόνιμων μακροφάγων και της εξαφάνισης του μόνιμου πληθυσμού μετά τη θεραπεία με WGP. Οι ομάδες 3 και 4 μοιράζονται τον γενικό φαινοτυπικό χαρακτηρισμό ως μονοκύτταρα/μακροφάγα που διεισδύουν στο Ly6CHi. Το σύμπλεγμα 4 είχε μια αξιοσημείωτη έκφραση των Chil3 και Plac8, τα οποία μαζί έχουν ταυτοποιηθεί από μια άλλη ομάδα για τον εντοπισμό μακροφάγων διείσδυσης Ly6Chi29.

Τέλος, το σύμπλεγμα 3, το οποίο απουσίαζε σε παρελθόντες ποντικούς και έδειξε τη μεγαλύτερη αύξηση στη σχετική συχνότητα μεταξύ όλων των ομάδων μετά τη θεραπεία με WGP, εξέφρασε σημαντικές υπογραφές των TNFAIP2, IL1B, SOD2 και PRDX5, υποδεικνύοντας έναν έντονα προφλεγμονώδη φαινότυπο. Η ομάδα 3 ταυτοποιήθηκε έτσι ως μονοκύτταρα/μακροφάγα που διεισδύουν φλεγμονώδη Ly6CHi. Είναι ενδιαφέρον ότι εντός του μυελοειδούς υποσυνόλου, οι πληθυσμοί που φαίνεται να αυξάνονται λόγω της θεραπείας με WGP είναι οι μόνοι πληθυσμοί που εκφράζουν το TNFAIP2, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα που εισέρχονται στο πάγκρεας είναι πιθανότατα εκπαιδευμένα μυελοειδή κύτταρα.

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η κατάσταση ενεργοποίησης καθενός από τις τέσσερις δυναμικές μυελοειδείς ομάδες, κατασκευάστηκαν διαγράμματα κουκκίδων για να δείξουν τη σχετική έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με μια προφλεγμονώδη κατάσταση και μια αντιφλεγμονώδη κατάσταση (Εικ. 3h). Οι ομάδες 3 και 4, τα διεισδυτικά μονοκύτταρα/μακροφάγοι, αποδείχθηκαν προφλεγμονώδεις, οι μόνιμοι μακροφάγοι ήταν αντιφλεγμονώδεις και οι μακροφάγοι στη συστάδα 10 έδειξαν έναν ενδιάμεσο φαινότυπο. Σε συμφωνία με προηγούμενα δεδομένα CyTOF και κυτταρομετρίας ροής, αυτά τα δεδομένα scRNA-Seq χαρακτηρίζουν περαιτέρω αυτά τα πρόσφατα ταυτοποιημένα μυελοειδή κύτταρα στο πάγκρεας ως ετερογενή πληθυσμό μετασχηματισμένων και επαναπολωμένων μακροφάγων Ly6CLo και προφλεγμονωδών Ly6CHi που διεισδύουν σε μονοκύτταρα μακροφάγα. εκπαιδευμένης ανοσίας.

Η καθοδηγούμενη από το WGP εισροή και εκπαίδευση μυελοειδών κυττάρων στο πάγκρεας εξαρτάται από το CCR2-και εμφανίζεται ήδη 24 ώρες μετά τη θεραπεία με WGP.

Στη συνέχεια εξετάσαμε ποιοι μηχανισμοί ήταν υπεύθυνοι για αυτήν την εισροή κυττάρων στο πάγκρεας. Τα δεδομένα RNA-Seq χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό χημειοκινών και κυτοκινών των οποίων η έκφραση ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω κατά τη θεραπεία με WGP (Εικ. 4α). Ενώ αρκετές χημειοκίνες και κυτοκίνες ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, η παρατήρησή μας για την εισροή μακροφάγων και μονοκυττάρων στο πάγκρεας κέντρισε ένα συγκεκριμένο ενδιαφέρον για το CCR2 λόγω της συμμετοχής του στη στρατολόγηση μονοκυττάρων και μακροφάγων και στην έξοδο μονοκυττάρων από τον μυελό των οστών30-32. Τα δεδομένα CyTOF έδειξαν επίσης σημαντική αύξηση στα θετικά κύτταρα CCR μετά από θεραπεία με WGP (Εικ. 4β) και το scRNA-Seq έδειξε μια ευδιάκριτη έκφραση του CCR2 στις ομάδες 3 και 4, που ήταν οι δύο πληθυσμοί που έδειξαν τις πιο ευδιάκριτες φαινότυποι εκπαιδευμένης ανοσίας (Εικ. 4γ). Επιπρόσθετα, 24 ώρες μετά τη θεραπεία με WGP, τα ολικά παγκρεατικά λύματα έδειξαν 30-πλάσια αύξηση στο CCL2, το οποίο είναι ο συνδέτης για το CCR2 και εμπλέκεται στη μεσολάβηση της χημειοταξίας των μονοκυττάρων (Εικ. 4δ).

Τα δεδομένα RNA-Seq είχαν δείξει μια σαφή υπογραφή της στρατολόγησης και διακίνησης ανοσοκυττάρων, και αυτά τα δεδομένα έδειξαν επίσης ότι το WGP ρύθμισε προς τα πάνω τον πολλαπλασιασμό των λευκοκυττάρων και των μονοπύρηνων κυττάρων (Εικ. 4e). Για να διερευνηθεί εάν τα CCR2 συν μυελοειδή κύτταρα πολλαπλασιάζονταν μόλις έφτασαν στο πάγκρεας, το ποσοστό των κυττάρων CCR2 plus που εκφράζουν το Ki67 αξιολογήθηκε σε ποντίκια που έλαβαν PBS και WGP. Μετά τη θεραπεία με WGP υπήρξε μια αύξηση στα συνολικά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (Εικ. 4στ) και ένα μεγάλο ποσοστό αυτών των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων ήταν CD11b συν CCR2 συν (Εικ. 4g). Στη συνέχεια ερευνήσαμε τη συμβολή των κυττάρων CCR2 plus στον εκπαιδευμένο φαινότυπο. 7 ημέρες μετά την in vivo θεραπεία με PBS ή WGP, οι πληθυσμοί CCR2 plus και CCR2– μετρήθηκαν για εκπαιδευμένη απόκριση (Εικ. 4h). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η πλειονότητα των κυττάρων που εκπαιδεύτηκαν μετά από θεραπεία με WGP ήταν CCR2 συν.

Για να εξεταστεί περαιτέρω ο ρόλος του CCR2 σε εκπαιδευμένα με γλυκάνη μονοκύτταρα/μακροφάγα, τα ποντίκια CCR2−/− εκπαιδεύτηκαν με WGP-γλυκάνη. Τα ποντίκια CCR2−/− δεν υπέστησαν εισροή CD45 συν (Εικ. 4i) ή CD45 συν CD11b συν μυελοειδών κυττάρων (Εικ. 4j) στο πάγκρεας και δεν παρουσίασαν εκπαιδευμένη απόκριση όπως αποκαλύπτεται από την παραγωγή TNF- (Εικ. 4k). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το CCR2 παίζει κρίσιμο ρόλο στη μετανάστευση των εγγενών ανοσοκυττάρων στο πάγκρεας και στην επαγωγή περιφερειακής εκπαιδευμένης ανοσίας στο πάγκρεας.

Όπως σημειώθηκε προηγουμένως, το CCR2 είναι σημαντικό για την πρώιμη στρατολόγηση μονοκυττάρων, αλλά λιγότερο σημαντικό για την καθυστερημένη πρόσληψη33. Μέχρι στιγμής, είχαμε επίσης παρατηρήσει ότι στις 7 ημέρες μετά την προπόνηση WGP, το CCR2 ήταν κρίσιμο για τη στρατολόγηση εκπαιδευμένων μυελοειδών κυττάρων στο πάγκρεας. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν αυτή η εισροή συνέβη νωρίς κατά την προπόνηση του WGP και εάν τα CCR2 συν μυελοειδή κύτταρα στρατολογήθηκαν στο πάγκρεας. Για το σκοπό αυτό, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS ή WGP και οι παγκρεατικοί ιστοί αναλύθηκαν 24 και 48 ώρες αργότερα. Παραδόξως, ήδη από 24 ώρες μετά την προπόνηση WGP, αυξάνεται το CD45 plus (Συμπληρωματικό Σχ. 4a), CD11b plus (Συμπληρωματικό Σχ. 4β), F4/80 plus (Συμπληρωματικό Σχ. 4γ), Ly6C συν (Συμπληρωματικό Σχ. 4δ) και CD11b συν CCR2 plus (Συμπληρωματικό Σχήμα 4e) κύτταρα παρατηρήθηκαν.

Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι αυτά τα μυελοειδή κύτταρα εκπαιδεύτηκαν ήδη από 24 ώρες μετά τη θεραπεία με WGP (Συμπληρωματικό Σχήμα 4στ). Αυτή η παρατήρηση υπογραμμίζει μια απόκλιση μεταξύ αυτών των αποτελεσμάτων και των προηγουμένως παρατηρηθέντων φαινοτύπων εκπαιδευμένης ανοσίας που συνήθως δεν ξεκινούν πριν από τουλάχιστον 3 ημέρες μετά την προπόνηση.

Εικ. 4 Το CCR2 απαιτείται για τη διακίνηση ανοσοκυττάρων στο πάγκρεας. ένας Χάρτης θερμότητας χημειοκινών και κυτοκινών που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε κύτταρα CD11b συν 7-ημέρας που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με WGP βάσει δεδομένων RNA-Seq. b viSNE γραφική παράσταση του CD11b συν παγκρεατικού πληθυσμού σε PBS και 7-ημέρας εκπαιδευμένα με WGP ποντίκια, υπογραμμίζοντας την έκφραση του CCR2. Εικόνες που έγιναν με δεδομένα CyTOF. c δεδομένα scRNA-Seq που δείχνουν ένα UMAP των μυελοειδών συστάδων που εκφράζουν CCR2. d Έκφραση CCL2 σε ολικά παγκρεατικά λύματα 24 ώρες μετά τη θεραπεία με WGP a που μετρήθηκε με RT-PCR (n=6). ****p=0.0001. Το GSEA δημιούργησε γραφήματα εμπλουτισμού γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό λευκοκυττάρων σε CD11b συν παγκρεατικά κύτταρα από 7-ημέρα που εκπαιδεύτηκαν σε WGP σε σύγκριση με ποντίκια PBS. Το PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος και συγκρίθηκε με το WGP. f Συνοπτικά δεδομένα του ποσοστού των CD45 συν παγκρεατικών κυττάρων που είναι Ki67 plus σε ποντίκια PBS και 7-ημέρας εκπαιδευμένα με WGP (n=4). ***p=0.0007. g Τα κύτταρα περιορίστηκαν αρχικά στον πληθυσμό CD45 συν Ki67 plus. Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν το ποσοστό των CD45 συν Ki67 συν πολλαπλασιαζόμενα παγκρεατικά κύτταρα που είναι CD11b συν CCR2 συν σε PBS και 7-ημέρας εκπαιδευμένα σε ποντίκια WGP (n=4). *p=0.0261. h Τα παγκρεατικά κύτταρα από PBS και 7-ημέρας εκπαιδευμένα με WGP ποντίκια (n=5) διεγέρθηκαν εκ νέου με LPS και το ποσοστό των θετικών και αρνητικών κυττάρων CCR2 που παράγουν TNF μετρήθηκε σε κάθε κατάσταση. Τα κύτταρα περιορίστηκαν αρχικά στο υποσύνολο CD45 συν CD11b συν. Εμφανίστηκαν αντιπροσωπευτικά διαγράμματα κουκκίδων και συνοπτικά δεδομένα. *p=0.022, **p=0.0073, ***p=0.0007. Τα ποντίκια i–k WT και CCR2−/− υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS ή WGP και αξιολογήθηκε το ποσοστό των κυττάρων I CD45 plus στο πάγκρεας (****p <0,0001) και j το ποσοστό των κυττάρων CD45 plus που ήταν CD11b plus . **σ=0.0013. k Το ποσοστό του CD45 συν CD11b συν κύτταρα που παράγουν TNF. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικά διαγράμματα ροής και συνοπτικά δεδομένα. Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει δεδομένα από ένα ποντίκι. ***p=0.0002. (i–k: WT PBS n=9, WT WGP n=9, CCR2−/− PBS n=8, CCR2−/− WGP n=8).

Ένα μη ζευγαρωμένο, δύο ουρών μαθητικό t-test χρησιμοποιήθηκε στα d, f και g, ενώ ένα μονόδρομο ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε στο h–k. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύτηκαν ως μέσος όρος ± SEM. ns μη σημαντικό. Στο f–k, κάθε δείγμα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικά ανεξάρτητο ζώο που ελήφθη σε ένα μόνο ανεξάρτητο πείραμα το οποίο επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές για επαλήθευση των αποτελεσμάτων.

Τα εκπαιδευμένα με WGP παγκρεατικά διηθητικά μυελοειδή κύτταρα παρουσιάζουν εκπαιδευμένες αποκρίσεις σε παράγοντες που εκκρίνονται από καρκίνους του παγκρέατος και ενισχυμένη φαγοκυττάρωση και κυτταροτοξικότητα με τη μεσολάβηση ROS στα καρκινικά κύτταρα.

Καθώς δείξαμε ότι η χρήση του WGP ως αρχικού ερεθίσματος έχει ως αποτέλεσμα εγγενή ανοσοκύτταρα που είναι εκπαιδευμένα να ανταποκρίνονται πιο σθεναρά στη δευτερογενή έκθεση στο LPS και ότι αυτά τα κύτταρα συσσωρεύονται στο πάγκρεας μετά τη θεραπεία, θέλαμε να μάθουμε εάν δευτερεύοντα ερεθίσματα σχετίζονται με όγκους του παγκρέατος μπορεί επίσης να προκαλέσει αυτή την εκπαιδευμένη απάντηση. Για το σκοπό αυτό, ερευνήσαμε αρχικά εάν τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος είναι ικανά να προκαλέσουν την επαγόμενη από το WGP εκπαιδευμένη απόκριση. Για να διερευνηθεί αυτό το ερώτημα, τα περιτοναϊκά μακροφάγα καλλιεργήθηκαν με PBS ή WGP in vitro και 7 ημέρες αργότερα διεγέρθηκαν εκ νέου με LPS, το υπερκείμενο από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν από ένα παρθένο πάγκρεας ποντικού και το υπερκείμενο από καλλιεργημένα κύτταρα KPC, τα οποία είναι μια κυτταρική σειρά ενός όγκος του παγκρέατος σε φόντο C57BL/6 που προέρχεται από το LSL-KrasG12D/ plus. LSL-Trp53R172H/ plus ; Pdx1-Ποντίκια Cre (KPC) ή καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος Pan02 για 24 ώρες. Η παραγωγή TNF στο υπερκείμενο μετρήθηκε με ELISA.

Σε σύγκριση με το υπερκείμενο από καλλιεργημένα φυσιολογικά παγκρεατικά κύτταρα που δεν ενεργοποίησαν προηγουμένως εκπαιδευμένους μακροφάγους, το υπερκείμενο από καλλιεργημένα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα KPC και Pan02 διέγειρε περισσότερους μακροφάγους εκπαιδευμένους σε παραγωγή TNF- -σε -γλυκάνη (Συμπληρωματικό Σχήμα 5α). Επιπλέον, για να ελεγχθεί η πιθανότητα ότι η ίδια η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση των κυττάρων, τα περιτοναϊκά μακροφάγα καλλιεργήθηκαν με σφαιρίδια μικροσωματιδίων πολυστυρενίου 3 μm και στη συνέχεια διεγέρθηκαν εκ νέου με PBS ή LPS (Συμπληρωματικό Σχ. 5β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενισχυμένη παραγωγή TNF ήταν ειδική για την προπόνηση WGP.

Αυτό στη συνέχεια δοκιμάστηκε σε ένα περιβάλλον ex vivo στο οποίο τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS ή WGP και 7 ημέρες αργότερα συλλέχθηκαν τα πάγκρεας, εμπλουτίστηκαν τα παγκρεατικά μυελοειδή κύτταρα και στη συνέχεια επαναδιεγέρθηκαν με τα υπερκείμενα από καλλιεργημένα KPC (Συμπληρωματικό Σχήμα 5c) ή Pan02 κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχ. 5δ). Έδειξε ότι το WGP in vivo εκπαιδευμένο CD11b συν μυελοειδή κύτταρα στο πάγκρεας παρήγαγαν σημαντικά περισσότερο TNF- σε απόκριση σε μέσα που ρυθμίζονται από όγκους. Τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν ένα πλήθος παραγόντων που μπορεί να λειτουργήσουν ειδικά ως το δεύτερο ερέθισμα στην εκπαιδευμένη ανοσία. Είναι γνωστό ότι τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος εκφράζουν υψηλά επίπεδα μοριακών μοτίβων που σχετίζονται με βλάβη (DAMPs) και προφλεγμονώδεις παράγοντες, όπως ο ανασταλτικός παράγοντας μετανάστευσης μακροφάγων (MIF). Η MIF είναι μια κυτοκίνη που είναι γνωστό ότι εκκρίνεται σε υψηλές συγκεντρώσεις από όγκους του παγκρέατος που μπορεί να δράσει απευθείας στα μυελοειδή κύτταρα34,35.

Πράγματι, η MIF ήταν παρούσα στο υπερκείμενο των κυττάρων KPC και Pan02 όπως αξιολογήθηκε με ELISA (Συμπληρωματικό Σχήμα 5e). Υποθέσαμε λοιπόν ότι το MIF μπορεί να είναι ένας πιθανός παράγοντας που εκκρίνεται από όγκο που μπορεί να λειτουργήσει ως δεύτερο σήμα στη ρύθμιση της επαγόμενης από το WGP εκπαιδευμένης ανοσίας. Για να διερευνηθεί αυτό, τα παγκρεατικά μυελοειδή κύτταρα από in vivo ποντίκια που είχαν εκπαιδευτεί με WGP διεγέρθηκαν εκ νέου με παρόμοια συγκέντρωση ανασυνδυασμένου MIF (rMIF) όπως υπάρχει σε ρυθμισμένα με όγκο μέσα. Όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 5στ, τα παγκρεατικά μυελοειδή κύτταρα που είχαν προηγουμένως εκπαιδευτεί με WGP έδειξαν ενισχυμένη παραγωγή TNF- κατά την επαναδιέγερση rMIF. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν την ιδέα ότι τα κύτταρα όγκου του παγκρέατος, μέσω διαλυτών παραγόντων που απελευθερώνουν, μπορούν να χρησιμεύσουν ως το δεύτερο σήμα για την ενεργοποίηση μυελοειδών κυττάρων στο πάγκρεας που έχουν εκπαιδευτεί από το WGP.

Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν αυτά τα έμφυτα ανοσοκύτταρα που έχουν εκπαιδευτεί με WGP έχουν ενισχυμένες εγγενείς ιδιότητες κατά του όγκου. Τα δεδομένα της αλληλουχίας RNA έδειξαν ότι οι μηχανισμοί που σχετίζονται με τη φαγοκυττάρωση ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στη ρύθμιση WGP (Εικ. 5a), που υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να είναι ένας μηχανισμός αντικαρκινικής λειτουργικότητας. Τα κορυφαία 20 εμπλουτισμένα μονοπάτια KEGG και οι βιολογικές διεργασίες Γονιδιακής Οντολογίας (GO) κατά την προπόνηση WGP παρατίθενται στους Συμπληρωματικούς Πίνακες 1 και 2. Τα CD45 plus ανοσοκύτταρα και τα CD11b συν μυελοειδή κύτταρα από το εκπαιδευμένο με WGP πάγκρεας ποντικών συλλέχθηκαν και προσδιορίστηκαν για πιθανή φαγοκυττάρωση. Η θεραπεία με WGP οδήγησε σε σημαντική αύξηση στο φαγοκυτταρικό δυναμικό των συνολικών κυττάρων CD45 συν ανοσοκυττάρων (Εικ. 5b) και στα CD11b συν μυελοειδή κύτταρα (Εικ. 5γ).

Επιπλέον, in vivo εκπαιδευμένα μυελοειδή κύτταρα έδειξαν αύξηση στη φαγοκυττάρωση των καρκινικών κυττάρων KPC (Εικ. 5δ). Στη συνέχεια αξιολογήσαμε εάν τα μυελοειδή κύτταρα που εκπαιδεύτηκαν από το WGP έδειξαν αυξημένη κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα KPC. Τα δεδομένα RNA-Seq έδειξαν ότι οι DEG που σχετίζονται με βιοσυνθετικές διεργασίες αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και τη θετική ρύθμιση των μεταβολικών διεργασιών ROS εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε μυελοειδή κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με WGP (Εικ. 5e).

Ως αποτέλεσμα, υποθέσαμε ότι η ανοδική ρύθμιση της παραγωγής ROS από το WGP θα είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη κυτταροτοξικότητα των παγκρεατικών μυελοειδών κυττάρων στα καρκινικά κύτταρα KPC. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα CD11b συν από το πάγκρεας απομονώθηκαν από ποντίκια εκπαιδευμένα με γλυκάνη ή μη εκπαιδευμένα ποντίκια και επιστρώθηκαν με κύτταρα KPC που εκφράζουν τη λουσιφεράση (KPCLuc συν) για 24 ώρες. Μυελοειδή κύτταρα που εκπαιδεύτηκαν με WGP έδειξαν τριπλάσια αυξημένη κυτταροτοξικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα KPC και η αναστολή της παραγωγής ROS χρησιμοποιώντας τον αναστολέα ROS Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) ακύρωσε πλήρως την αύξηση της κυτταροτοξικότητας που προκλήθηκε από το WGP (Εικ. 5στ). Η επαγόμενη από το ROS υπεροξείδωση των λιπιδίων παίζει κρίσιμο ρόλο στην απόπτωση, την αυτοφαγία και τη φερρόπτωση36. Χρησιμοποιήσαμε έτσι δύο επιπλέον αναστολείς ROS, τον Trolox και τη δεφεροξαμίνη (DFO), για να εξετάσουμε την επίδρασή τους στην κυτταροτοξικότητα.Η προσθήκη Trolox και DFO ανέστειλε σημαντικά το WGPtrained CD11b συν την προκαλούμενη από κύτταρα κυτταροτοξικότητα (Εικ. 5g), υποδηλώνονταςότι η επαγόμενη από ROS λιπιδική υπεροξειδάση εμπλέκεται, τουλάχιστον εν μέρει, σε αυτή την κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από ROS.

Εικ. 5 Παγκρεατικά διηθητικά μυελοειδή κύτταρα που έχουν εκπαιδευτεί με WGP παρουσιάζουν ενισχυμένη φαγοκυττάρωση και κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από ROS. Διαγράμματα εμπλουτισμού (GSEA) και θερμικός χάρτης γονιδίων που σχετίζονται με τη θετική ρύθμιση της φαγοκυττάρωσης σε κύτταρα CD11b συν από 7-ημέρα που εκπαιδεύτηκαν με WGP σε σύγκριση με ποντίκια PBS. β Το ποσοστό των CD45 συν παγκρεατικών κυττάρων που φαγοκυττάρουν ένα σωματίδιο pHrodo Green Staph Aureus σε ποντίκια PBS (n=10) και 7-day WGP (n=9) μαζί με το MFI του pHrodo Πράσινο σωματίδιο Staph Aureus. Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει δεδομένα από ένα ποντίκι. *p {{10}},043, ****p < 0,0001. γ Το ποσοστό των CD11b συν μυελοειδών παγκρεατικών κυττάρων που φαγοκυτταροποίησαν ένα σωματίδιο pHrodo Green Staph Aureus σε ποντίκια PBS (n=13) και 7-ημέρας WGP (n=13). Τα κύτταρα αρχικά περιορίστηκαν στον πληθυσμό CD45 plus. Εμφανίζεται το MFI του σωματιδίου pHrodo Green Staph Aureus. **p=0.0021, ***p=0.0002. δ Το ποσοστό των CD11b συν μυελοειδών παγκρεατικών κυττάρων που φαγοκυτταροποίησαν το KPCGFP συν κύτταρα όγκου σε ποντίκια PBS (n {= 5) και 7-ημέρας WGP (n=5). *p=0.0103. Τα κύτταρα αρχικά περιορίστηκαν στον πληθυσμό CD45 plus. Εμφανίζεται επίσης το συνοπτικό MFI του σήματος GFP plus. *p=0.0379. e Διαγράμματα εμπλουτισμού (GSEA) και θερμικός χάρτης γονιδίων που σχετίζονται με τις βιοσυνθετικές διαδικασίες αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και τη θετική ρύθμιση μεταβολικών διεργασιών ενεργών ειδών οξυγόνου σε κύτταρα CD11b συν από 7-ημέρα που εκπαιδεύτηκαν σε WGP σε σύγκριση με ποντίκια PBS. f Συνοψισμένα αποτελέσματα από μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας όπου κύτταρα CD11b plus από PBS και 7-ημέρας εκπαιδευμένα με WGP ποντίκια ταξινομήθηκαν και επωάστηκαν σε αναλογία 1:20 KPCLuc συν: CD11b συν κύτταρα για 24 ώρες. Το NAC χρησιμοποιήθηκε για τον αποκλεισμό της έκφρασης ROS και η κυτταροτοξικότητα του όγκου εκτιμήθηκε με φωταύγεια (PBS n=3, WGP n=4). g Συνοπτικά δεδομένα από προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας όπου τα κύτταρα CD11b plus από ποντίκια 7-ημέρας εκπαιδευμένα με WGP ταξινομήθηκαν και επωάστηκαν σε αναλογία 1:20 KPCLuc συν: CD11b συν κύτταρα για 24 ώρες. Προστέθηκαν Trolox ή DFO ή αντίστοιχοι μάρτυρες φορέα και προσδιορίστηκε η κυτταροτοξικότητα του όγκου με μέτρηση της φωταύγειας (n=3). *p=0.0255, **p=0.0019. Ένα μη ζευγαρωμένο, δύο ουρών του μαθητή t-test χρησιμοποιήθηκε στο b–d, και g και μια μονόδρομη ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε για το f. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύτηκαν ως μέσος όρος ± SEM. ns μη σημαντικό. Σε b–g, κάθε δείγμα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικά ανεξάρτητο ζώο που ελήφθη σε ένα μόνο ανεξάρτητο πείραμα το οποίο επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές για επαλήθευση των αποτελεσμάτων.

Τελικά, αυτά τα δεδομένα προσδιορίζουν ότι τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος είναι ικανά να επανενεργοποιούν διεισδυτικά μυελοειδή κύτταρα στο πάγκρεας εκπαιδευμένα με WGP και ότι αυτά τα κύτταρα παρουσιάζουν ενισχυμένη φαγοκυττάρωση και κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από ROS.

Η εκπαιδευμένη ανοσία που προκαλείται από το WGP μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και παρατείνει την επιβίωση σε ορθοτοπικά μοντέλα καρκίνου του παγκρέατος.

Στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν οι εκπαιδευμένες έμφυτες ανοσοαποκρίσεις στο πάγκρεας με τη μεσολάβηση γλυκάνης θα οδηγούσαν στη δημιουργία ενός αντικαρκινικού μικροπεριβάλλοντος που μπορεί να επαρκεί για να ξεπεραστεί η χαρακτηριστικά ανοσοκατασταλτική TME του PDAC. Αντίστοιχα, στα ποντίκια δόθηκε 1 δόση είτε PBS είτε WGP την ημέρα -7, και την ημέρα 0, 1 × 105 κύτταρα KPC ή KPCLuc plus εμφυτεύτηκαν ορθοτοπικά στην ουρά του παγκρέατος (Εικ. 6α). Την ημέρα 21 τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και μετρήθηκε το βάρος του όγκου (Εικ. 6b). Στη ρύθμιση της ένεσης των κυττάρων KPCLuc plus, τα ποντίκια ενέθηκαν με υπόστρωμα λουσιφεράσης και οι όγκοι απεικονίστηκαν (Εικ. 6c).

Και οι δύο μελέτες έδειξαν μια αξιοσημείωτη μείωση του φορτίου του όγκου ως αποτέλεσμα της θεραπείας με WGP και η επιβίωση ήταν επίσης σημαντικά παρατεταμένη σε ποντίκια που εκπαιδεύτηκαν με WGP (Εικ. 6δ). Ο ανοσοφαινοτυπικός προσδιορισμός των όγκων έδειξε μια επίμονη αύξηση σε κύτταρα CD45 συν ανοσοκύτταρα, CD11b συν μυελοειδή κύτταρα και F4/80 συν μακροφάγα στο περιβάλλον που εκπαιδεύτηκε με WGP (Εικ. 6e). Τα CD11b συν μυελοειδή κύτταρα (Εικ. 6f) και CD11b συν F4/80 συν μακροφάγα (Εικ. 6g) εντός του όγκου έδειξαν επίσης σημαντική αύξηση στην παραγωγή TNF- λόγω WGP. Τόσο ένας αυξημένος αριθμός CD11b συν μυελοειδών κυττάρων (Εικ. 6h, αριστερά) όσο και μια αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων CD11b συν που παράγουν TNF- (Εικ. 6h, δεξιά) συσχετίστηκαν σημαντικά με μειωμένο φορτίο όγκου. Ούτε τα CD4 συν ούτε τα CD8 συν Τ-κύτταρα έδειξαν αυξημένη IFN-, υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι η μείωση του φορτίου του όγκου οδηγήθηκε από τα εκπαιδευμένα με WGP μυελοειδή κύτταρα (Εικ. 6i). Παρόμοια αντικαρκινικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε ποντικούς που εμφυτεύτηκαν ορθοτοπικά με όγκους Pan02 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6α).

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι τα έμφυτα ανοσοκύτταρα είναι υπεύθυνα για τις παρατηρούμενες αντικαρκινικές ανοσοαποκρίσεις, ορθοτοπικοί όγκοι KPC εμφυτεύθηκαν σε ποντίκια NSG. Παρόμοια με τα ποντίκια WT, τα ποντίκια NSG εμφάνισαν επίσης σημαντική μείωση στο μέγεθος του όγκου λόγω της εκπαίδευσης WGP, επιβεβαιώνοντας ότι τα αντικαρκινικά αποτελέσματα του WGP οδηγούνταν από εγγενή ανοσοκύτταρα και λειτουργούσαν ανεξάρτητα από προσαρμοστικές αποκρίσεις (Συμπληρωματικό Σχήμα 6β). Καλαφάτη κ.ά. είχε δείξει ότι η έμφυτη ανοσοποιητική εκπαίδευση της κοκκιοποίησης προάγει την αντικαρκινική ανοσία21.

Αν και δεν είχαμε δει σημαντική συμβολή των κοκκιοκυττάρων στον φαινότυπο της εκπαιδευμένης ανοσίας μας, εξετάσαμε εάν τα κοκκιοκύτταρα εμπλέκονται στην εξαρτώμενη από το WGP μείωση των παγκρεατικών όγκων εξαντλώντας τα ουδετερόφιλα και παρατηρώντας την ανάπτυξη όγκου σε ποντίκια που έλαβαν PBS και WGP. Αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα εξάντλησης των ουδετερόφιλων στο πάγκρεας (Συμπληρωματικό Σχήμα 6c) μαζί με το φορτίο του παγκρεατικού όγκου (Συμπληρωματικό Σχήμα 6δ). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν σημαντική μείωση στο μέγεθος του όγκου στην ομάδα WGP απουσία ουδετερόφιλων.

Εικ. 6 Η επαγωγή εκπαιδευμένης ανοσίας στο πάγκρεας έχει αντικαρκινικά αποτελέσματα. ένα Πειραματικό σχήμα. b Οι ποντικοί C57BL/6 έλαβαν μία μόνο IP ένεση WGP ή PBS και ποντίκια 7 ημερών εμφυτεύτηκαν ορθοτοπικά με KPC καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες όγκων και ποσοτική ανάλυση του βάρους του όγκου. Το βάρος του όγκου μετρήθηκε την ημέρα 21 (PBS n=10, WGP n=12). ***p=0.0004. c Ποντίκια C57BL/6 (n=4) έλαβαν μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή ένεση WGP ή PBS και 7 ημέρες αργότερα εμφυτεύτηκαν ορθοτοπικά με KPC συν Luc παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Την ημέρα 21 μετά την εμφύτευση του όγκου, τα ποντίκια έλαβαν υπόστρωμα βιοφωταύγειας λουσιφερίνης IP και τοποθετήθηκαν σε συσκευή απεικόνισης φωτονίων για τη μέτρηση του μεγέθους του όγκου in vivo. *p=0.0403. δ Επιβίωση ποντικών στο πειραματικό σχήμα που φαίνεται στο α, χρησιμοποιώντας κύτταρα KPC (n=5). **σ=0.0018. e Φαινότυπος των όγκων που δείχνει το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων που είναι CD45 plus, το ποσοστό του πληθυσμού CD45 plus που είναι CD11b plus και το ποσοστό των κυττάρων CD11b plus που είναι F4/80 plus (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0165 (CD45), ***p=0.0001 (CD11b), **p=0.0034 (F4/80). f Παραγωγή TNF σε κύτταρα CD11b συν από PBS και 7-ημέρα εκπαιδευμένα με WGP που διεγέρθηκαν εκ νέου με LPS. Εμφανίζονται το ποσοστό των κυττάρων TNF plus και το MFI του TNF (PBS n=10, WGP n=9). **p=0.007, ***p=0.0002. g Συνοπτικά δεδομένα της παραγωγής TNF σε κύτταρα CD11b συν F4/80 plus από PBS και 7-ημέρα εκπαιδευμένα σε WGP που διεγέρθηκαν εκ νέου με LPS. Εμφανίζονται το ποσοστό των κυττάρων TNF plus και το MFI του TNF (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0155, ***p=0.0001. h Το βάρος του όγκου συσχετίστηκε με το ποσοστό CD45 συν ανοσοκυττάρων που ήταν CD11b συν (αριστερά) και το ποσοστό CD45 συν CD11b συν TNF συν κύτταρα (δεξιά). (PBS n=10, WGP n=9). i Συνοψισμένα δεδομένα του ποσοστού των CD4 plus και CD8 plus Τ-κυττάρων που εκφράζουν IFN (PBS n {= 10, WGP n=9) Τα δεδομένα αντιπροσωπεύτηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Οι συντελεστές συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της ισχύος των γραμμικών συσχετισμών και χρησιμοποιήθηκαν μη ζευγαρωτά, δύο ουρών του Student's t-tests. ns μη σημαντικό. Κάθε δείγμα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικά ανεξάρτητο ζώο που ελήφθη σε ένα μόνο ανεξάρτητο πείραμα το οποίο επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές για επαλήθευση των αποτελεσμάτων.

Τα εκπαιδευμένα CCR2 συν μυελοειδή κύτταρα είναι πρωτεύοντα τελεστικά κύτταρα στον αντικαρκινικό μηχανισμό.

Δεδομένης της πλήρους αναστολής της διακίνησης έμφυτων ανοσοκυττάρων στο πάγκρεας και της εκπαίδευσης των παγκρεατικών μυελοειδών κυττάρων μετά από θεραπεία με WGP σε ποντίκια CCR2−/−, σκεφτήκαμε ότι τα ποντίκια CCR2−/− δεν θα έδειχναν επίσης τις ευεργετικές αντικαρκινικές ανοσολογικές επιδράσεις της προπόνησης WGP . Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, τα ποντίκια CCR2−/− που έλαβαν WGP δεν εμφάνισαν μειωμένο φορτίο όγκου (Εικ. 7α) σε σύγκριση με ποντίκια WT.

Αυτό έδειξε ότι το CCR2 είναι απαραίτητο για την καθοδηγούμενη από το WGP εισροή εκπαιδευμένων έμφυτων ανοσοκυττάρων στο πάγκρεας και ότι αυτά είναι επακόλουθα για τα αντικαρκινικά αποτελέσματα. Αν και η σηματοδότηση CCL2-CCR2 είχε αναγνωριστεί ότι είναι κρίσιμη για τη στρατολόγηση εκπαιδευμένων μακροφάγων που προέρχονται από μονοκύτταρα στο πάγκρεας, θέλαμε επίσης να μάθουμε εάν η παρουσία εκπαιδευμένων HSC στο μυελό των οστών και η δημιουργία κεντρικά εκπαιδευμένης ανοσίας μόνο ήταν αρκετό για να επιβραδύνει την ανάπτυξη των ορθοτοπικών όγκων του παγκρέατος.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η άμεση αντικαρκινική λειτουργικότητα των διεισδυτικών CCR2 συν μυελοειδών κυττάρων, οι πληθυσμοί CCR2 plus και CCR{3}} από ποντίκια που είχαν εκπαιδευτεί με WGP ταξινομήθηκαν, αναμίχθηκαν με κύτταρα όγκου KPC και εμφυτεύτηκαν ορθοτοπικά σε ποντικούς. Οι όγκοι που αναμείχθηκαν με κύτταρα CCR2 plus ήταν μικρότεροι από εκείνους που αναμείχθηκαν με κύτταρα CCR2−, υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι τα ίδια τα εκπαιδευμένα CCR2 συν μυελοειδή κύτταρα είναι πρωτεύον κύτταρο τελεστής στον αντικαρκινικό μηχανισμό (Εικ. 7β). Η ανάλυση CyTOF αυτών των όγκων αποκάλυψε ότι οι αναμεμιγμένοι όγκοι CCR2 συν είχαν σημαντικά λιγότερα CD11b συν μυελοειδή κύτταρα και σημαντικά αυξημένα CD8 συν Τ-κύτταρα που υπάρχουν εντός του όγκου (Εικ. 7c, d). Η αναλογία CD8 συν Τ-κυττάρων: CD11b συν μυελοειδή κύτταρα αυξήθηκε επίσης σημαντικά στην κατάσταση CCR2 συν πρόσμιξη (Εικ. 7e).

Εικ. 7 Οι μηχανισμοί αντικαρκινικού τελεστή της θεραπείας με WGP και κλινικά σχετικά μοντέλα. ποντίκια WT και CCR2-/- υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS ή WGP και 7 ημέρες αργότερα εμφυτεύτηκαν με ορθοτοπικά κύτταρα όγκου παγκρέατος KPC. Το βάρος του όγκου την ημέρα 21 αναφέρεται. (WT PBS n=5, WT WGP n=6, CCR2 PBS n=6, CCR2−/− WGP n=6). **p=0.0027 (WT PBS vs WT WGP), *p=0.0118 (WT WGP vs CCR2−/− PBS), **p=0.0034 (WT WGP vs CCR2−/− WGP). b Τα ταξινομημένα CCR2 plus και CCR2− παγκρεατικά CD11b κύτταρα από ποντίκια που είχαν εκπαιδευτεί με WGP αναμίχθηκαν με κύτταρα KPC και εμφυτεύτηκαν ορθοτοπικά. Το μέγεθος του όγκου αξιολογήθηκε 21 ημέρες αργότερα (CCR2 συν n=5, CCR2− n=5). *p=0.0247. c διαγράμματα t-SNE που δημιουργούνται με ανάλυση CyTOF των όγκων ανάμειξης από β. Οι ομάδες που εμφανίζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων υποδεικνύονται από τους κύκλους. Εμφανίζονται συνολικά δεδομένα (αριστερά) και αντιπροσωπευτικά διαγράμματα t-SNE για κάθε ομάδα. d Συνοπτικό ποσοστό των κυττάρων CD8 plus και CD11b plus σε ανάμικτους όγκους (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.01, **p=0.007. e Η αναλογία CD8 συν :CD11b συν κύτταρα σε ανάμικτους όγκους (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.0474. f Έκφραση του PD-L1 σε καρκινικά κύτταρα KPC, κύτταρα CD11b plus και F4/80 plus σε όγκο KPC 21 ημέρες μετά την εμφύτευση (KPC n=5, CD11b συν n=6, F4/80 συν n=6). g Πειραματικό σχήμα θεραπείας WGP και anti-PD-L1. Τα ποντίκια (n=5) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS ή WGP και 7 ημέρες αργότερα εμφυτεύτηκαν με ορθοτοπικούς όγκους του παγκρέατος KPC. Τις ημέρες 3, 7 και 11 μετά την εμφύτευση, τα ποντίκια έλαβαν αντι-PD-L1 mAb ή μάρτυρα ισότυπου mAb IgG2b κατά αρουραίου. Η επιβίωση παρακολουθήθηκε. **p=0.0018 (WGP vs PBS ή PD-L1), **p=0.0021 (WGP vs WGP συν PD-L1). h Πειραματικό σχήμα του WGP που χρησιμοποιείται στο θεραπευτικό περιβάλλον. Τα ποντίκια εμφυτεύτηκαν με ορθοτοπικούς όγκους του παγκρέατος KPC και τους χορηγήθηκε WGP μόλις τα ποντίκια είχαν αναρρώσει από το χειρουργείο την ημέρα 4 και 1 εβδομάδα αργότερα την ημέρα 11. *p=0.0163. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύτηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Μια μονόδρομη ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε για το a και ένα μη ζευγαρωμένο, διπλής ουράς μαθητή t-test χρησιμοποιήθηκε για τα b, d και e. Το log-rank test χρησιμοποιήθηκε για τα g και h. ns μη σημαντικό. Κάθε δείγμα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικά ανεξάρτητο ζώο που ελήφθη σε ένα μόνο ανεξάρτητο πείραμα το οποίο επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές για επαλήθευση των αποτελεσμάτων.

Το WGP συνεργάζεται με τη θεραπεία με mAb αντι-PD-L1 για να παρατείνει την επιβίωση σε μοντέλα PDAC.

Παρόλο που παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του φορτίου του όγκου λόγω της εκπαίδευσης στο WGP, όλα τα ποντίκια ανέπτυξαν θανατηφόρους όγκους. Οι μελέτες μας εντόπισαν ότι η θεραπεία με WGP επηρέασε δραστικά τον φαινότυπο των μυελοειδών πληθυσμών στο πάγκρεας.

Αν και είχαμε εντοπίσει ότι το κύριο τελεστικό κύτταρο που είναι υπεύθυνο για τις αντικαρκινικές επιδράσεις του WGP είναι το CCR2 συν διηθητικά μονοκύτταρα/μακροφάγα, σκεφτήκαμε ότι αυτές οι ανοσολογικές αλλαγές μπορεί επίσης να επηρεάσουν τη συνολική ΤΜΕ με τρόπο που θα μπορούσε να καταστήσει τα προσαρμοστικά ανοσοκύτταρα πιο ανταποκρινόμενα σε θεραπεία αποκλεισμού σημείων ελέγχου. Συγκεκριμένα, επειδή είχαμε παρατηρήσει μια αύξηση στην αναλογία των CD8 συν Τ-κυττάρων που υπάρχουν σε CCR2 συν μεικτούς όγκους (Εικ. 7c) και είχαμε επίσης παρατηρήσει σημαντική έκφραση PD-L1 σε μυελοειδή κύτταρα που υπάρχουν σε όγκους KPC (Εικ. 7στ), υποθέσαμε ότι η θεραπεία με WGP μπορεί να ενισχύσει τα αποτελέσματα της θεραπείας με mAb με αντι-PD-L1.

Για να εκτιμηθεί εάν η θεραπεία με mAb αντι-PD-L1 συνεργάζεται με την επαγόμενη από WGP εκπαιδευμένη ανοσία στο πάγκρεας, σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με PBS ή WGP που εμφυτεύτηκαν με ορθοτοπικούς όγκους KCP έλαβαν στη συνέχεια mAb ελέγχου αντι-PD-L1 ή ισότυπο IgG2b αρουραίου. Όπως έχει αποδειχθεί σε αρκετές κλινικές δοκιμές, η θεραπεία με antiPD-L1 από μόνη της απέτυχε να παρατείνει την επιβίωση ακόμη και πέρα ​​από αυτή των ποντικών που έλαβαν αγωγή με mAb ισότυπου ελέγχου IgG2b (Εικ. 7g). Τα ποντίκια που είχαν εκπαιδευτεί με WGP επιβίωσαν σημαντικά περισσότερο από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με IgG2b και αντι-PD-L1. Ωστόσο, ένας συνδυασμός WGP και anti-PD-L1 μαζί παρέτεινε την επιβίωση πιο αποτελεσματικά. Αυτό δείχνει ότι υπάρχει κλινικό όφελος από τον συνδυασμό του WGP με τη θεραπεία αποκλεισμού ανοσοσημείων ελέγχου antiPD-L1.

Μέχρι στιγμής, η χρήση του WGP έχει περιγραφεί σε ένα περιβάλλον στο οποίο το WGP χορηγείται πριν από την εμφύτευση κυττάρων όγκου. Λαμβάνοντας υπόψη τη μείωση του μεγέθους του όγκου αυτού του μοντέλου, δοκιμάσαμε επίσης ένα πιο κλινικά σχετικό μοντέλο στο οποίο εμφυτεύτηκαν ποντίκια με ορθοτοπικούς όγκους KPC και χρησιμοποιήθηκε το WGP για την υποκίνηση εκπαιδευμένης ανοσίας στη συνέχεια, Εικ. 7η). Στο θεραπευτικό πλαίσιο, η καθοδηγούμενη από το WGP εισροή εκπαιδευμένων μυελοειδών κυττάρων στο πάγκρεας αποδείχθηκε επίσης ότι παρατείνει την επιβίωση. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η έναρξη της εκπαιδευμένης ανοσίας στο πάγκρεας χρησιμοποιώντας το WGP έχει σχετικές κλινικές εφαρμογές στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος που απαιτούν περαιτέρω μεταφραστική έρευνα και διερεύνηση.

For more information:1950477648nn@gmail.com