Μέρος Ⅰ: Οργανοειδή νεφρού που δημιουργούνται από ερυθροειδή προγονικά κύτταρα ασθενών με αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσο των νεφρών

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice, & et al.

Εισαγωγή

Αυτοσωμικό επικρατές πολυκυστικόΝεφρική Νόσος(ADPKD) είναι η πιο συχνή γενετική αιτία χρόνιας νεφρικής νόσου (ΧΝΝ) παγκοσμίως και είναι μια από τις πιο διαδεδομένες κληρονομικές μονογονικές διαταραχές, που επηρεάζει έναν πληθυσμό που υπολογίζεται σε 1:400-1000 [1]. ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστικήΝεφρική Νόσος) προκαλείται από μεταλλάξεις στα γονίδια PKD1 (τύπου 1 πολυκυστική νεφρική νόσο) και PKD2 (τύπου 2 πολυκυστική νεφρική νόσο), που κωδικοποιούν την πολυκυστίνη-1(PC1) και την πολυκυστίνη-2 (PC2), αντίστοιχα, με αποτέλεσμα αλλοιώσεις των βλεφαρίδων και σχηματισμό κύστεων. Και οι δύο πρωτεΐνες ρυθμίζουν πολυάριθμες μοριακές οδούς καθώς και τη μορφογένεση και τη λειτουργία των ιστών. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί στους οποίους βασίζεται η κυστεογένεση παραμένουν ασαφείς. Είναι καλά αποδεκτό ότι μια μετάλλαξη βλαστικής σειράς ακολουθούμενη από μια σωματική μετάλλαξη (δεύτερο χτύπημα) στο φυσιολογικό αλληλόμορφο είναι απαραίτητη για την κυστογένεση [2,3]. Επιπλέον, με βάση τα αποτελέσματα από ορθολογικά μοντέλα ποντικών, έχει αποδειχθεί ότι απαιτείται πρόσθετη νεφρική προσβολή (τρίτο χτύπημα) για ταχεία και σοβαρή ανάπτυξη κύστης σε ώριμους νεφρούς [4,5]. Φαίνεται ότι στους ανθρώπους, τα περισσότερα δεύτερα χτυπήματα συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της νεφρικής ανάπτυξης, οδηγώντας σε σχηματισμό κυστικών και ανάπτυξη ακόμη και στη μήτρα. Επομένως, η σοβαρότητα και ο ρυθμός εξέλιξης της νεφρικής νόσου που προκύπτει από μεταλλάξεις PKD1 (τύπου 1 πολυκυστική νεφρική νόσο) και PKD2 (πολυκυστική νεφρική νόσος τύπου 2) μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες, όπως ο χρόνος αδρανοποίησης των γονιδίων, η ανάπτυξη των νεφρών στάδιο, περιβαλλοντική επίδραση, παρουσία συνοδών νεφρικών βλαβών και ποικιλία γενετικών μεταλλάξεων.

Αν και έχουν υπάρξει αναρίθμητα δεδομένα σχετικά με τους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς της ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστικήΝεφρική Νόσος) που συλλέγονται από μελέτες που χρησιμοποιούν ορθολογικά και μη μοντέλα ποντικών, είναι διαθέσιμες μόνο λίγες μελέτες που εστιάζουν σε ανθρώπινα κυτταρικά μοντέλα κυστεογένεσης [6]. Το 2007, οι Takahashi et al.[Z επαναπρογραμμάτισαν επιτυχώς τα σωματικά κύτταρα σε πολυδύναμα βλαστοκύτταρα με εμβρυϊκές ιδιότητες, ονομάζοντάς τα "επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα" (iPSCs). Έκτοτε, πολλές πηγές σωματικών κυττάρων έχουν επαναπρογραμματιστεί σε iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) είτε από ζωικούς είτε από ανθρώπινους ιστούς (hiPSCs)[Z], με τους ενήλικους ινοβλάστες να αντιπροσωπεύουν την κύρια πηγή των τελευταίων. Το 2013, οι Freedman et al.[8] επαγόμενα hiPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) από τους ινοβλάστες του ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστικήΝεφρική Νόσος) ασθενείς και βρήκαν μειωμένη ακτινωτή έκφραση πολυκυστίνης-2, υποστηρίζοντας τη χρήση τέτοιων κυττάρων για τη διερεύνηση της παθοφυσιολογίας της πολυκυστικής νόσου (PKD). Πιο πρόσφατα, οι Chen et al ανέφεραν το 2016 ότι είχαν λάβει κύτταρα hiPS από προγονικά κύτταρα ερυθροειδών [9].

Τα τελευταία χρόνια, έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στη δημιουργία 3-διαστάσεων οργανοειδών από iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) [Z,10-12]. ΠρωταρχικόςνεφρόΤα σωληνοειδή επιθηλιακά οργανοειδή μπορούν να προέρχονται από ιστό νεφρού, καθώς και από ούρα, και αυτά τα οργανοειδή είναι ένα σημαντικό εργαλείο για εξατομικευμένη μοντελοποίηση ασθενειών, όπως φαίνεται από τους Schutgens et al. [13].Σε μεταγενέστερες μελέτες, οι Freedman et al.[14] μπόρεσαν να δημιουργήσουννεφρόοργανοειδή που προέρχονται από μια εμπορικά διαθέσιμη κυτταρική σειρά hiPS, καθιερώνοντας ένα πρωτόκολλο για τη δημιουργία των τύπων κυττάρων που υπάρχουν στη μετανεφρική μάζα που δημιουργούν όλες τις δομές του νεφρώνα. Στη συνέχεια, γκρεμίζοντας το PKD1 (τύπου 1 πολυκυστικόνεφρόασθένεια) ή γονίδια PKD2 (τύπου 2 πολυκυστική νόσο των νεφρών), αυτοί οι ερευνητές παρατήρησαν σχηματισμό κύστης απόνεφρόσωληνάρια. Λαμβάνοντας υπόψη όλες αυτές τις προηγμένες και καινοτόμες τεχνολογίες, στοχεύσαμε να αποκτήσουμε iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) από τα κυκλοφορούντα ερυθροειδή προγονικά κύτταρα του ADPKD (Αυτοσωματικά κυρίαρχα πολυκυστικάΝεφρική Νόσος)ασθενείς και δοκιμάζουν την ανάπτυξη νεφρικών οργανοειδών in vitro για να ανακεφαλαιώσουν τα βήματα που εμπλέκονται στην οργανογένεση, προσπαθώντας να προκαλέσουν κάποια παθοφυσιολογικά συμβάντα που σχετίζονται με την πρώιμη κυστογένεση.

Κάντε κλικ στο cistanche παρενέργειες και όφελος για τα νεφρά

Μέθοδοι Επιλογή ασθενούς

Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από δύο μη συγγενείς γυναίκες ασθενείς (PT1 και PT2) με κλινική διάγνωση ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσος των νεφρών) (PT1:66 ετών, eGFR 43,8 mL/min ανά 1,73 m2 και PT2:56 ετών, eGFR/0. min ανά 1,73 m2), παρακολούθηση στη Νόσο Πολυκυστικού Νεφρού. Εξωτερική Κλινική του Νεφρολογικού Τμήματος του Ομοσπονδιακού Πανεπιστημίου του Σάο Πάολο (UNIFESP) και ένα άλλο δείγμα συλλέχτηκε από μια υγιή γυναίκα, η οποία χρησίμευσε ως έλεγχος για τη σταθεροποίηση και την ομαλοποίηση της τεχνικής. Η διάγνωση ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσος των νεφρών) βασίστηκε στο θετικό οικογενειακό ιστορικό και στην παρουσία νεφρικών κύστεων, σύμφωνα με τα υπερηχογραφικά διαγνωστικά κριτήρια των Pei et al.[15].(Οι οικογενειακές γενεαλογίες παρουσιάζονται στο Σχήμα S1A). Και οι δύο ασθενείς είχαν κυστικούς νεφρούς και ήπαρ (Εικόνες Μαγνητικού Συντονισμού παρουσιάζονται στο Σχήμα S1B). Η μελέτη εξετάστηκε και εγκρίθηκε από τη Συμβουλευτική Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr.1199.-0079-10/2018). Μετά από μια συνέντευξη για να εξηγήσουν τον σκοπό της μελέτης, τόσο οι ασθενείς όσο και ο υγιής μάρτυρας υπέγραψαν το έντυπο ενημερωμένης συγκατάθεσης.

Επέκταση ερυθροειδών προγονικών κυττάρων που απομονώθηκαν από πλήρες αίμα Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνα vacutainer που περιείχε EDTA (ως αντιπηκτικό) σε θερμοκρασία δωματίου. Τα προγονικά κύτταρα του ερυθροειδούς (EP) διαχωρίστηκαν στη συνέχεια μέσω μιας μεθόδου RosetteSep (15216; Stem Cell Technologies), η οποία αφαιρούσε ανεπιθύμητα κύτταρα, όπως ώριμα ερυθρά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια διατηρώντας παράλληλα τον επιθυμητό πληθυσμό EP. Λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης EPs στο πλήρες αίμα, τα κύτταρα επεκτάθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε ειδικό μέσο καλλιέργειας που περιείχε κυτοκίνες και συμπληρώματα (μέσο X-Vivo, Lonza). Τα κύτταρα EP αναγνωρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τον υποδοχέα τρανσφερίνης (CD71) και γλυκοφορίνη Α(Gly A) ως δείκτες επισημασμένοι με GFP (Σχήμα S2).

Επαναπρογραμματισμός ερυθροειδών προγονικών κυττάρων

Τα διευρυμένα κύτταρα EP συλλέχθηκαν και πυρηνώθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ επαναπρογραμματισμού Epi5 Episomal iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) (Thermo Fisher) που περιέχει ένα βελτιστοποιημένο μείγμα πέντε παραγόντων επαναπρογραμματισμού (Οκτώβριος-4, Sox2, Lin28, L-Myc, και Klf4). Η επιμόλυνση (ηλεκτροδιάτρηση) πραγματοποιήθηκε με επισωματικούς φορείς (χωρίς ιούς, μη ενσωματωμένους) από κιτ παράγοντα Lonza Nucleo. Μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε μέσο καλλιέργειας ειδικό για ReproTeSR για επαναπρογραμματισμό (Stem Cell Technologies) υπό τυπικές συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας (37C, 95 τοις εκατό CO, και 5 τοις εκατό Ο,).

Καρυότυπος

Για να επαληθευτεί εάν η διαδικασία επαναπρογραμματισμού διατήρησε τη χρωμοσωμική ακεραιότητα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση καρυότυπου στο Γενετικό Τμήμα του UNIFESP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ul κολχικίνης (0,08 μg/ml) σε 5 ml iPs μέσο κυτταροκαλλιέργειας για την πρόκληση διακοπής του κυτταρικού κύκλου, που ακολουθήθηκε από την προσθήκη ενός διαλύματος υποτονικού KCl 0,075 Μ για την πρόκληση πυρηνικής διόγκωσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με ένα μίγμα μεθανόλης και οξικού οξέος (3:1). Τα χρωμοσώματα μεταφάσης συλλέχθηκαν και η χρώση Wright χρησιμοποιήθηκε για την κυτταρογενετική ανάλυση των ζωνών G (Σχήμα S3).

Χαρακτηρισμός αποικίας iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα).

Τα κύτταρα EP επαναπρογραμματίστηκαν με επισωματικούς φορείς που σχημάτισαν τυπικές αποικίες iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) και παρουσίασαν έναν φυσιολογικό καρυότυπο (Σχήμα S3). Τα χαρακτηριστικά της αποικίας iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) συγκρίθηκαν με εκείνα ενός καθιερωμένου ελέγχου που προέρχεται από το κύτταρο γραμμής H9 (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, διαθέσιμο από το Wicell Research Institute, USA) Σχήμα 1Β). Δεδομένου ότι τα iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) παρουσίασαν τυπική μορφολογία, οι δείκτες πολυδύναμης ταυτοποιήθηκαν με ανοσοφθορισμό. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τη στερέωση, τα δείγματα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές, μπλοκαρίστηκαν σε 5 τοις εκατό PSA και 0,3 τοις εκατό Triton-X-100/DPBS και επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτογενή αντισώματα (Cell Signaling, Ma, EUA), συγκεκριμένα, OCT4(1 :400 αραίωση) ως δοκιμή πολυδυναμίας. Την επόμενη μέρα, παρασκευάστηκε μια νέα αντικειμενοφόρος πλάκα, πλύθηκε σε PBS και επωάστηκε με ένα δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor (αραίωση 1:200, Cell Signaling) και προστέθηκε DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, USA) για πυρηνικά ταυτοποίηση.

Εικ. 1. Δημιουργία και χαρακτηρισμός iPSC(επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα). Τα iPSC επαναπρογραμματίστηκαν από διευρυμένα προγονικά ερυθροειδή κύτταρα (EP) από έναν υγιή μάρτυρα (HC) και δύο διαφορετικούς ασθενείς με ADPKD (PT1 και PT2).

Α. Σχηματική σταδιακή δημιουργία νεφρικών οργανοειδών Β. Ομοιότητα iPSC (α. τυπική εικόνα του iPSC από τα εμπορικά εμβρυϊκά κύτταρα H9. β. iPSC από προγονικά ερυθροειδή κύτταρα από τον υγιή έλεγχο)

Γ. Μορφολογία των αποικιών iPSC Δ. Χαρακτηρισμός της πολυδυναμίας iPSC που παρατηρείται κάτω από ένα ανεστραμμένο ψηφιακό μικροσκόπιο φθορισμού EVOS fl.

Η επισήμανση αντισώματος OCT4 χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης πολυδύναμης για τον χαρακτηρισμό της πολυδυναμικής φύσης των αποικιών HC, PT1 και PT2.

Οι κυτταρικοί πυρήνες επισημάνθηκαν με DAPI (ράβδος κλίμακας για το Σχήμα 1Β: 200 μm, γραμμή κλίμακας για το Σχήμα 1C: 1000 μm, γραμμή κλίμακας HC / PT2 για το Σχήμα 1D: 1000 μm, γραμμή κλίμακας PT1 για το Σχήμα 1D: 200 μm).

Η ικανότητα των iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) να διαφοροποιούνται και στα τρία βλαστικά στρώματα

Τα iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) αναπτύχθηκαν σε 6-πλάκες με φρεάτιο επικαλυμμένο με Matrigel (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) σε μέσο καλλιέργειας mTeSR1 (Stem Cell Technologies, BC, Καναδάς). Για να αποτραπεί η διαφοροποίηση των iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα), οι αποικίες διαβιβάστηκαν χειροκίνητα με μηχανικό τεμαχισμό με άκρο πιπέτας κάτω από μικροσκόπιο ή διαχωρίστηκαν με ενζυματική πέψη χρησιμοποιώντας Gentle Cell (Life Technologies) (S4 Fig). Χρησιμοποιώντας αυτές τις μεθόδους, τα iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) διατηρήθηκαν για 22 σειριακά περάσματα για να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα ενσωμάτωσαν σωστά τους παράγοντες επαναπρογραμματισμού. Τα iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) διεγέρθηκαν στη συνέχεια για να διαφοροποιηθούν στα τρία βλαστικά στρώματα χρησιμοποιώντας ένα κιτ διαφοροποίησης STEMdiff Trilineage (Stem Cell Technologies). Μετά από πέντε ημέρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση των ειδικών για τη γενεαλογική ηλικία δεικτών του μεσόδερμου και του ενδόδερμου και μετά από επτά ημέρες αναλύθηκαν για εξώδερμα, σύμφωνα με το πρωτόκολλο STEMdiff Trilineage Differentiation (Σχήμα S5).

Μοριακός χαρακτηρισμός και των τριών βλαστικών γραμμών με qRT-PCR

Ολικό RNA από καλλιέργειες των τριών στρωμάτων βλαστών εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ GE RNA Spin Mini (GE Healthcare, USA) και στη συνέχεια μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ αντίστροφης μεταγραφής υψηλής χωρητικότητας (Applied Biosystems, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (gRT-PCR) χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Green PCR (Applied Biosystems, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα επίπεδα έκφρασης mRNA υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2^Ct. Η συνθάση υδροξυμεθυλδιλανίου (HMBS) και η 3-φωσφορική αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί μάρτυρες και η έκφραση του OCT4 χρησιμοποιήθηκε ως ποσοτικός έλεγχος. Η έκφραση του SOX17 χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση της διαφοροποίησης σε ενδόδερμα, το CXCR4 χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση της διαφοροποίησης στο μεσόδερμα και το PAX6 χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση της διαφοροποίησης σε εξώδερμα (Σχήμα S6). Όλες οι αλληλουχίες εκκινητών καθορίζονται στον Πίνακα S1 και η καμπύλη απόδοσης αξιολογήθηκε για κάθε ζεύγος εκκινητών.

Ανοσοφθορισμός για τις διάφορες βλαστικές στοιβάδες

Τα iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) προκλήθηκαν να διαφοροποιηθούν σε καλυπτρίδες σε πλάκες έξι φρεατίων. Μετά τη διαφοροποίηση, οι καλυπτρίδες αφαιρέθηκαν από τα αρχικά φρεάτια και μεταφέρθηκαν σε μια νέα πλάκα, όπου τα κύτταρα στερεώθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, όπως περιγράφεται παραπάνω. Χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή αντισώματα κατά OCT4 (1:400; Cell Signaling), CXCR4 (1;100; Cell Signaling), PAX6 (1:100; Thermo Fisher) και SOX17 (1:100; R&D Systems). Ο φθορισμός αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor (1:200, Cell Signaling).

Οργανοειδής διαφοροποίηση νεφρού από iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα)

Τα ρεναλοργανοειδή δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Cruz et al. [6] με κάποιες προσαρμογές. Εν συντομία, 50,000 iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) από τον HC και δύο ασθενείς με ADPKD (Αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νόσος των νεφρών) χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή εναιωρημάτων μεμονωμένων κυττάρων με διάλυμα αποκόλλησης Accutase (Stem Cell Technologies). Τα μεμονωμένα κύτταρα συμπληρώθηκαν με 10 μΜ αναστολέα Rho-κινάσης (Y27632, Stem Cell Technologies ή Stemgent). Μετά από 16 ώρες, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με 1 mL mTeSR1 συν 2,5 τοις εκατό Matrigel συν 10 μuM Y27632. Μετά από 20 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με 1 mL ofmTeSRI μόνο· 14 ώρες αργότερα, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε και τα κύτταρα προκλήθηκαν με 6 μΜ CHIR99021 (AT104; Βλαστοκύτταρο ή Stemgent GSK-3b αναστολέας/αγωνιστής μονοπατιού Wnt) συν Advanced RPMI (Thermo Fisher) συν Glutamax (Life Technologies) συν 10 ug/ml αντιβιοτικό (Αμπικιλλίνη;b:b:b;b; ). Τελικά, 36 ώρες αργότερα, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με μέσο DRB που περιέχει Advanced RPMI (Thermo Fischer) συν Glutamax (Thermo Fischer) συν συμπλήρωμα B27 (17504-044· Life Technologies) συν αντιβιοτικό. Το μέσο DRB άλλαζε κάθε τρεις ημέρες για 28 ημέρες. Αυτή η περίοδος (28 ημέρες) ήταν αρκετή για να είναι ορατά τα οργανοειδή με μικροσκοπία.

Μοριακός χαρακτηρισμός οργανοειδών με RT-PCR

Η ημιποσοτική γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με RT-PCR κατά τη διάρκεια της εμβρυογονικής διαδικασίας με το συνολικό RNA να καθαρίζεται από τις κυτταρικές δομές που σχηματίζονται τις ημέρες 0 (iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα)) και στους 14,21, 28, και 35 ημέρες μετά την επαγωγή διαφοροποίησης. Η έκφραση του WT1 (αναπτυσσόμενος νεφρός), του AQP1 (εγγύς σωλήνας) και του ECAD (δείκτης επιθηλίου κύστης) αξιολογήθηκε. Το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η έκφραση του OCT4 χρησιμοποιήθηκε ως ποσοτικό πρότυπο.

Αποτελέσματα

Λήψη iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) από ερυθροειδείς προγόνους (EPs)

Συνοψίζεται το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται για τη λήψη οργανοειδών νεφρών από ερυθροειδείς προγόνους. Η επέκταση των EPs οδήγησε σε κύτταρα 1x10 μοιρών μετά από περίπου 20 ημέρες (S2A Fig) και περίπου δύο μήνες αργότερα, τα EPs αναγνωρίστηκαν από την έκφρασή τους των δεικτών CD71 και Gly A. Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου διαχωρισμού αποκάλυψε έκφραση· 88 τοις εκατό των κυττάρων ήταν θετικοί σε CD71, και 57,4 τοις εκατό ήταν θετικοί για Gly A (S2BFig).

Αφού επαληθεύτηκε ότι τα κύτταρα ήταν EP, επιμολύνθηκαν με παράγοντες επαναπρογραμματισμού (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc και klf4) και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο μέσο για επαναπρογραμματισμό (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) για περίπου πέντε ημέρες. Τα iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) ανέπτυξαν τυπικά κυτταρικά χαρακτηριστικά σχηματίζοντας αποικίες με μορφολογία διαφορετική από εκείνη των μη επαναπρογραμματισμένων κυττάρων που υπάρχουν στην ίδια κυτταρική καλλιέργεια. Τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν έως ότου παρατηρήσαμε τυπικές αποικίες που μοιάζουν με iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) που ήταν παρόμοιες με τις αποικίες της εμπορικής κυτταρικής σειράς H9 (Eig 1B). σφιχτή συσκευασία κυψελών, καλά καθορισμένο ομοιογενές σχήμα και κανονικές άκρες. Η ταυτοποίηση διευκολύνθηκε από τον χαμηλό βαθμό υπερανάπτυξης αποικιών από διαφοροποιημένα κύτταρα σε ένα μέσο επαναπρογραμματισμού χωρίς τροφοδότη (Eig 1C). Δεν βρέθηκαν ανιχνεύσιμες διαφορές μεταξύ των αποικιών iPSC από τους ασθενείς με HC και ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσος των νεφρών) (PTl και PT2) όσον αφορά τη μορφολογία της αποικίας και τους δείκτες πολυδυναμίας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1D.

Τα iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω από την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται στα τρία βλαστικά στρώματα. Τυπικές εικόνες της προόδου της ανάπτυξης του βλαστικού στρώματος σε κύτταρα από το HC φαίνονται στο S5 Σχήμα. Η ανάπτυξη των τριών βλαστικών στιβάδων επαληθεύτηκε με τυπική μορφολογία (Eig 2A) και με επισήμανση ανοσοφθορισμού για δείκτες διαφοροποίησης, συγκεκριμένα, FOXA2 για ενδοδερμική , ακτίνη λείου μυός (SMA) για το μεσόδερμα και SOX2 για το εξώδερμα (Eig2B-2D). Οι αρνητικοί μάρτυρες για τα αντισώματα φαίνονται στο S7 Σχήμα. Το Σχήμα 2Ε δείχνει τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ειδικών δεικτών του ενδοδερμίου (SOX17), του μεσοδέρματος (CXCR4) και του εξωδερμίου (PAX6), όπως ανιχνεύονται με RT-PCR.

Εικ. 2. Χαρακτηρισμός των τριών βλαστικών στοιβάδων. Ασθενείς υγιούς ελέγχου (HC) και ADPKD1 (PT1 και PT2).

Α. Τυπική μορφολογία των τριών βλαστικών στιβάδων. Τα βλαστικά στρώματα χαρακτηρίστηκαν από χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Β. Ενδόδερμα (FOXA2),

C. Mesoderm (SMA) και D. Ectoderm (SOX2). Οι κυτταρικοί πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI. Οι τελευταίες στήλες εμφανίζουν συγχωνευμένες εικόνες.

Ε. Η γονιδιακή έκφραση του OCT4 υποδηλώνει την πολυδυναμία των iPSC, το SOX17 ήταν δείκτης για το ενδόδερμα, το CXCR4 ήταν δείκτης για το μεσόδερμα και το PAX6 ήταν δείκτης για το εξώδερμα (n=2).

Η έκφραση OCT4 από iPSC χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός ποσοτικός έλεγχος. Η έκφραση OCT4 ήταν μη ανιχνεύσιμη στα κύτταρα των τριών βλαστικών στοιβάδων (κλίμακα: 200 μm).

Δημιουργία νεφρικών οργανοειδών από iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα)

Τρισδιάστατες νεφρικές δομές δημιουργήθηκαν από iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) που προέρχονται από ασθενείς με HC και ADPKD (Αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νεφρική νόσος) ακολουθώντας βήματα που ανακεφαλαιώνουν την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Το Σχήμα 3 δείχνει τα βήματα που είναι απαραίτητα για τη λήψη των αντίστοιχων εμβρυϊκών δομών. Οι αποικίες iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) (Eig 3A) διαχωρίστηκαν με την Accutase (Εικ. 3B) για να ληφθούν μεμονωμένα iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) (Εικόνα 3C). Λαμβάνοντας υπόψη την κανονική εμβρυογονική διαδικασία, οι αποικίες αναμένεται να διαφοροποιηθούν σε βλάστηλα και στη συνέχεια σε γαστρούλα, αλλά η αυθόρμητη διαφοροποίηση των iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) στην καλλιέργεια εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση, καθώς τα κύτταρα υφίστανται αυθόρμητα απόπτωση [16]. Για να παρακαμφθεί αυτό το ανεπιθύμητο αποτέλεσμα, ένας αναστολέας ROCK σηματοδότησης (10μM αναστολέας Rho-κινάσης Y27632) προστέθηκε 16 ώρες μετά το στάδιο ενός κυττάρου. Η αναστολή της οδού ROCK εμποδίζει τα κύτταρα να ενεργοποιήσουν τις οδούς θανάτου, επιτρέποντάς τους να επιβιώσουν και να προσαρμοστούν για να προχωρήσουν στη διαδικασία διαφοροποίησης. Τα iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) στη συνέχεια αναπτύχθηκαν μέχρι να φτάσουν στο στάδιο της επιβλάστης, το οποίο χαρακτηρίζεται από την παρουσία σφαιροειδών κοιλοτήτων (Εικ. 3D). Στη συνέχεια, προστέθηκε ένας ισχυρός αναστολέας GSK-3b/αγωνιστής μονοπατιού Wnt (CHIR99021), ο οποίος ακολουθήθηκε από την προσθήκη μέσου DRB για να προκληθεί μετάβαση επιθηλίου-μεσεγχυματικού (Εικόνα 3Ε και 3Ε) και τελικά μετάβαση μεσεγχύματος-επιθηλίου ( Σχ. 3G); αυτά τα βήματα επέτρεψαν την επιθηλιοποίηση και τον διαδοχικό σχηματισμό προ-σωληναριακών συσσωματωμάτων και νεφρικών κυστιδίων (Eig 3H), τα οποία τελικά επέτρεψαν τον σχηματισμό νεφρικών σωληνοειδών οργανοειδών (Εικ. 3D). Όλα αυτά τα in vitro στάδια εμβρυογένεσης ήταν παρόμοια για κύτταρα που προέρχονται τόσο από ασθενείς με HC όσο και από ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσος των νεφρών).

Η παρουσία σωληνοειδών δομών επαληθεύτηκε με την έκφραση ειδικών δεικτών με ανοσοφθορισμό: NHE3 και AQP1 για εγγύς σωληνάρια (Eig4A) και NPHS2 για σπειράματα (Eig 4B). Αντίθετα, η επισήμανση AQP2 δεν ανιχνεύθηκε (Eig 4B), επιβεβαιώνοντας ότι αυτό Η μεθοδολογία επέτρεψε μόνο την ανάπτυξη της μετανεφρικής μάζας αλλά όχι του ουρητηρικού οφθαλμού. Ο δείκτης ECAD δεν ανιχνεύθηκε απουσία φορσκολίνης (Εικ. 4Β).

Για να επαληθευτεί η παρουσία συγκεκριμένων δεικτών που εκφράζονται σε όλη τη διαδικασία ανάπτυξης του προγονικού νεφρού, όλα τα δείγματα (HC, PT1 και PT2) συλλέχθηκαν σε πέντε σημεία της όλης διαδικασίας διαφοροποίησης: ημέρα 0(iPSCs (επαγόμενο πολυδύναμο στέλεχος κύτταρα)), ημέρες 14, 21, 28, και στη συνέχεια την ημέρα 35 (7 ημέρες μετά την επαγωγή κύστης). Η χρονική πορεία της γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε διαφοροποίηση κατά τη διαδικασία εμβρυογένεσης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α-5Γ. Ο δείκτης πολυδυναμίας OCT4 εκφράστηκε από τα iPSC (ημέρα Ο), αλλά τα επίπεδά του μειώθηκαν σε 14 ημέρες, φτάνοντας σε πολύ χαμηλά επίπεδα μετά τη διαφοροποίηση. Αντίθετα, η έκφραση των ειδικών δεικτών του μετανεφρικού μεσεγχύματος (WT1) και του εγγύς σωληναρίου (AQP1) αυξήθηκε προοδευτικά όταν ξεκίνησε η διαδικασία διαφοροποίησης την ημέρα 14, φτάνοντας σε ένα επίπεδο την ημέρα 21. Το Σχήμα 5Δ δείχνει την έκφραση του ECAD, μια κυστογένεση δείκτη, την ημέρα 35, δηλαδή 7 ημέρες μετά την επαγωγή της κύστης από τη φορσκολίνη. Απουσία φορσκολίνης, η έκφραση της ECAD ήταν πολύ χαμηλή, ακόμη και σε ασθενείς με ADPKD (Αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νόσος των νεφρών). Ωστόσο, όταν προστέθηκε φορσκολίνη (ημέρα 28), και οι δύο ασθενείς εμφάνισαν αυξημένη έκφραση ECAD. αλλά το ίδιο μοτίβο δεν παρατηρήθηκε στο οργανοειδές HC το οποίο παρέμεινε με χαμηλά επίπεδα έκφρασης ECAD ακόμη και παρουσία φορσκολίνης.

Η παρουσία κύστεων που σχηματίστηκαν από τα οργανοειδή που διεγείρονται με φορσκολίνη ήταν εμφανής για ασθενείς με ADPKD (Αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσος των νεφρών), όπως φαίνεται στο Eig6. Το επάνω πλαίσιο εμφανίζει εικόνες των οργανοειδών την ημέρα 28, πριν από την προσθήκη της φορσκολίνης (Eig6Aa). Το Eig6Ab (πανοραμική προβολή-4X) και το 6Ac(20X προβολή) δείχνουν τα οργανοειδή την ημέρα 35 παρουσία φορσκολίνη που δείχνει την παρουσία δομών που μοιάζουν με κύστη σε δείγματα και από τους δύο ασθενείς (PT1 και PT2) αλλά όχι στο δείγμα HC. Η παρουσία κύστεων επαληθεύτηκε επίσης με χρώση ανοσοφθορισμού (Εικ. 6Β). Η επισήμανση ECAD δεν ανιχνεύθηκε στο οργανοειδές HC, αλλά παρατηρήθηκε ξεκάθαρα στα οργανοειδή και από τους δύο ασθενείς. Είναι ενδιαφέρον ότι μπορεί επίσης να παρατηρηθεί η παρουσία αυλού κύστης.

Εικ. 3. Δημιουργία σωληνοειδών οργανοειδών.

Εικόνες αντίθεσης φάσης της δημιουργίας επιθηλιακών σωληναριακών οργανοειδών νεφρού σε 28 ημέρες από iPSC που δημιουργήθηκαν από τις ομάδες HC, PT1 και PT2. Τις πρώτες 36 ώρες, τα iPSC διατηρήθηκαν σε τρισδιάστατη καλλιέργεια.

Στη συνέχεια, διαχωρίστηκαν, μετασχηματίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Υ-27632, το οποίο επέτρεψε την κυτταρική αναδιοργάνωση και επιβίωση, παράγοντας σφαιροειδή επιβλάστες (d).

Στη συνέχεια, προστέθηκαν CHIR99201 και DRB, ενεργοποιώντας το μονοπάτι Wnt/-κατενίνης και επιτρέποντας τη διαφοροποίηση σε σωληνοειδή οργανοειδή (Ι).

Η μορφολογία μεταξύ των σφαιροειδών που προέρχονται από ασθενείς με ADPKD και από έναν δότη HC είναι παρόμοια. (Γραμμή κλίμακας για a και f: 1000μm, γραμμή κλίμακας για b, cd, e, g, h και i: 200μm).

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗⅡ