Πώς οι πρωτεΐνες επιδιόρθωσης της κυτταρικής μεμβράνης ρυθμίζουν τη μεταγωγή σήματος του μεταγραφικού παράγοντα για τον έλεγχο της νεφρικής ίνωσης

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Χαϊτσάνγκ Λι

Νεφρόη ίνωση σχετίζεται με την εξέλιξη της οξείαςνεφρότραυματισμό σε χρόνια νεφρική νόσο. Η MG53, μια πρωτεΐνη επιδιόρθωσης της κυτταρικής μεμβράνης, έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει από τραυματισμό των επιθηλιακών κυττάρων των νεφρών και οξεία νεφρική βλάβη. Εδώ, αξιολογήσαμε τον ρόλο του MG53 στη διαμόρφωση τουνεφρόίνωση σε γηρασμένα ποντίκια και σε ποντίκια με μονόπλευρη απόφραξη ουρητήρα (UUO) ένα γνωστό μοντέλο προοδευτικής ίνωσης νεφρού. Τα ποντίκια με κατάλυση MG53 ανέπτυξαν περισσότερη διάμεση ίνωση με την ηλικία από ό,τι τα ποντίκια MG53-άθικτα της ίδιας ηλικίας. Ομοίως, ελλείψει MG53,νεφρόΗ ίνωση ήταν υπερβολική σε σύγκριση με ποντίκια με άθικτη MG53 στον αποφρακωμένο νεφρό σε σύγκριση με τον ετερόπλευρο μη εμπόδιο νεφρό ή τους νεφρούς ποντικών που χειρουργήθηκαν ψευδώς. Ο ουρητήρας απόφραξενεφράαπό ποντίκια με ανεπάρκεια MG53 εμφάνισαν επίσης σημαντικά περισσότερη φλεγμονή από τους νεφρούς με απόφραξη του ουρητήρα από άθικτα ποντίκια MG53. Πειράματα in vitro έδειξαν ότι το MG53 μπορούσε να εισέλθει στους πυρήνες των εγγύς σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και να αλληλεπιδράσει άμεσα με το συστατικό p65 του μεταγραφικού παράγοντα NF-kB, παρέχοντας μια πιθανή εξήγηση της ενισχυμένης φλεγμονής απουσία του MG53. Για να ελεγχθεί αυτό, δόθηκε ενισχυμένη έκφραση MG53 μέσω κατασκευασμένων κυττάρων ή άμεσης παροχής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε ποντίκια που υπόκεινται σε UUO. Αυτό μείωσε την ενεργοποίηση του NF-kB και τη φλεγμονή και εξασθενούσε την ίνωση των νεφρών. Έτσι, το MG53 μπορεί να έχει θεραπευτικό ρόλο στη θεραπεία της χρόνιας φλεγμονής των νεφρών και ως εκ τούτου να παρέχει προστασία έναντιίνωσηπου οδηγεί στον φαινότυπο της χρόνιας νεφρικής νόσου.

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Μεταφραστική δήλωση Η χρόνια φλεγμονή οδηγεί σε ινωτική αναδιαμόρφωση που μπορεί επίσης να αποτελεί τη βάση της μετάβασης από την οξεία νεφρική βλάβη στη χρόνια νεφρική νόσο. Η ενεργοποίηση του πρωτεϊνικού-φλεγμονώδους μεταγραφικού παράγοντα πυρηνικού παράγοντα-kB (NF-kB) εμπλέκεται στην παθογένεση της φλεγμονής των νεφρών. Εδώ, παρέχουμε στοιχεία ότι η MG53, μια προηγουμένως αναγνωρισμένη πρωτεΐνη επιδιόρθωσης της κυτταρικής μεμβράνης, αλληλεπιδρά άμεσα με τον NF-kB και μειώνει τη μεταγραφική του δραστηριότητα. Ταυτόχρονα, η εξωγενώς χορηγούμενη MG53 μπορεί να μειώσει την ινωτική αναδιαμόρφωση του φλεγμονώδους νεφρού. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν μια προστατευτική αλληλεπίδραση μεταξύ του MG53 και του NF-kB για την άμβλυνση της ανάπτυξης της νεφρικής ίνωσης που προκαλείται από φλεγμονή. Η φαρμακολογική χορήγηση του MG53 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία της προοδευτικής ίνωσης των νεφρών.

Η νεφρική δυσλειτουργία, η οποία μπορεί να ταξινομηθεί ως οξεία νεφρική βλάβη (AKI) ή χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ), έχει εξελιχθεί σε επιδημία σε ηλικιωμένους πληθυσμούς. Το 2017, ο επιπολασμός της ΧΝΝ έφτασε το 14,5 τοις εκατό των ατόμων ηλικίας 65 ετών και άνω, με αποτέλεσμα οι δαπάνες του Medicare να ξεπερνούν τα 84 δισεκατομμύρια δολάρια για θεραπεία.^1,2Η ΑΚΙ και η ΧΝΝ είναι πιο συχνές σε άτομα μεγαλύτερης ηλικίας, κυρίως λόγω της αυξημένης ευαισθησίας σε τραυματισμό και της μειωμένης ικανότητας επιδιόρθωσης του γηράσκοντος νεφρού. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η ΧΝΝ είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για ΑΚΙ και, αντιστρόφως, τα επεισόδια ΑΚΙ μπορούν να επιταχύνουν την εξέλιξη της ΧΝΝ προς την νεφρική νόσο τελικού σταδίου. Επί του παρόντος, η θεραπεία της ΑΚΙ είναι κυρίως υποστηρικτική και η θεραπεία της εγκατεστημένης ΧΝΝ επικεντρώνεται στην επιβράδυνση της εξέλιξης μέσω της αναστολής του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης και τώρα πιθανώς μέσω της αναστολής συμμεταφορέα νατρίου-γλυκόζης-2.^3,4

Ανάλογα με τη σοβαρότητα του τραυματισμού, τα εγγύς σωληναριακά κύτταρα, ο κύριος στόχος της οξείας βλάβης, μπορεί να υποστούν αλλαγές στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, 5,6 μεταβολισμό, 7 έκκριση πρωτεϊνικών-φλεγμονωδών και προφιβρωτικών κυτοκινών ή μερική επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση,8 η οποία θα καθορίσει εάν η αναδιαμόρφωση/επισκευή θα είναι επιτυχής ή δυσπροσαρμοστική και θα οδηγήσει σε νεφρική ίνωση, χαρακτηριστικό της ΧΝΝ.9,10 Αυτή η αναδιαμόρφωση συμβαίνει γενικά σε φόντο φλεγμονής των νεφρών,

μειωμένη αγγειακή παροχή και παραγωγή πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) και περιλαμβάνει απώλεια επιθηλιακών κυττάρων και συσσώρευση κολλαγόνων, ακτίνης α-λείου μυός και φιμπρονεκτίνης. έχει επίσης υψηλή συσχέτιση με την επιδείνωση της νεφρικής λειτουργίας.

Η χρόνια φλεγμονή οδηγεί σε ινωτική αναδιαμόρφωση που μπορεί επίσης να αποτελεί τη βάση της μετάβασης από το AKI σε ΧΝΝ.11–13 Σωρευτική έρευνα προτείνει τη συμμετοχή του μεταγραφικού παράγοντα πυρηνικού παράγοντα-kB (NF-kB) στην παθογένεση της φλεγμονής των νεφρών που προκαλείται από μόλυνση, τραυματισμό, ή μεταμόσχευση.11,12,14 Η ενεργοποίηση της κανονικής οδού NF-kB ξεκινά με την ενεργοποίηση του αναστολέα της κινάσης NF-kB (IkB), η οποία οδηγεί σε φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση του IkBa και στην πυρηνική μετατόπιση των ετεροδιμερών NF-kB.15 Η ενεργοποίηση της σηματοδότησης NF-kB σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρού και τα διεισδυτικά ανοσοκύτταρα μπορεί να προκληθεί από παθοφυσιολογικούς παράγοντες όπως η έκθεση σε λιποπολυσακχαρίτες (LPSs) ή ο τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης.¹⁷Εκτός από τα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, τα έμφυτα ανοσοκύτταρα όπως τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα συμβάλλουν επίσης σε τραυματισμό των νεφρών, φλεγμονή και ινωτική αναδιαμόρφωση.^13,18–20

Το cistanche είναι αποτελεσματικό στη θεραπεία της νεφρικής δυσλειτουργίας

Τα αυξανόμενα στοιχεία υποδηλώνουν ότι οι εκκριτικοί παράγοντες που προέρχονται από τους μυς (δηλαδή, οι μυοκίνες) ρυθμίζουν τη συστημική φυσιολογία μέσω της διασταύρωσης των ιστών για να επηρεάσουν την εξέλιξη των νεφρικών παθήσεων.²¹Η MG53 (ονομάζεται επίσης TRIM72) είναι μια πρωτεΐνη τριμερούς μοτίβου (TRIM) εμπλουτισμένη με μυς με κρίσιμη λειτουργία στην επισκευή της κυτταρικής μεμβράνης.²⁴Η επιδιόρθωση της μεμβράνης με τη μεσολάβηση MG53-εμπλέκεται στον μετριασμό της οξείας βλάβης των σκελετικών μυών,²⁵νεφρά,²⁶καρδιά,²⁷ πνεύμονες, 28 εγκέφαλοι,^29,30και δέρμα.³¹Οι προηγούμενες μελέτες μας εντόπισαν χαμηλό επίπεδο έκφρασης MG53 στους νεφρούς, το οποίο είναι βασικό συστατικό στην προστασία του AKI, και τα ποντίκια με έλλειψη MG53 (mg53 / ) ήταν πιο ευαίσθητα σε AKI που προκαλείται από το στρες.²⁶Επίσης πρόσφατα αποδείξαμε ότι η παρατεταμένη αύξηση του MG53 στην κυκλοφορία ενισχύει την επιδιόρθωση και την αναγέννηση των τραυματισμών των ιστών.32 Οι σχετικοί ρόλοι του ειδικού για τους νεφρούς και του εξωγενούς κυκλοφορούντος MG53 στη ρύθμιση της ίνωσης των νεφρών κατά τη διάρκεια της προοδευτικής ΧΝΝ είναι ακόμη άγνωστοι.

Πρόσφατα, έχει εξελιχθεί ένας αναδυόμενος ρόλος του MG53 στη ρύθμιση της προστασίας των ιστών μέσω της αναστολής της φλεγμονής, ειδικά μέσω της διαμόρφωσης της σηματοδότησης NF-kB. Για παράδειγμα, το MG53 εξασθενεί τη νευροτοξικότητα και τη νευρο-φλεγμονή που προκαλείται από LPS αναστέλλοντας το μονοπάτι TLR4/NF-kB,33 και το καρδιακό MG53 ρυθμίζει την έκφραση του KChIP2 για τον έλεγχο της ηλεκτροφυσιολογικής αναδιαμόρφωσης κατά τη διάρκεια της καρδιακής υπερτροφίας.34 Επιπλέον, δείξαμε μια διπλή λειτουργία του MG5 πρόληψη μιας δυσπροσαρμοστικής υπερφλεγμονώδους απόκρισης κατά τη διάρκεια μιας λοίμωξης από υποθανατηφόρο ιό της γρίπης Α, που χαρακτηρίζεται από υπερβολική παραγωγή ιντερφερόνης-b, μέσω καταστολής της ενεργοποίησης IRF3/NF-kB και αναστολής της ανώμαλης ενδοκυτταρικής σηματοδότησης Ca2þ σε μακροφάγους. λοίμωξη από τον ιό, το MG53 αποδείχθηκε ότι αποτρέπει τη θνησιμότητα και τη βλάβη των πνευμόνων, όχι επηρεάζοντας άμεσα τους τίτλους του ιού, αλλά μετριάζοντας την καταιγίδα κυτοκινών (ιντερφερόνη-b, ιντερλευκίνη-6 και ιντερλευκίνη-1β) μέσω αρνητικής ρύθμισης του φλεγμονώδους NLRP3 και πρόληψη της πυρόπτωσης του πνεύμονα.36 Επιπλέον, η χρόνια θεραπεία υψηλής δόσης του εξωγενούς MG53 συνδέθηκε με την καταστολή του NF-kB – μεσολαβούμενη φλεγμονή στην ηλικιωμένη καρδιά.37 Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι το MG53 μπορεί να ρυθμίσει την ανώμαλη σηματοδότηση NF-kB κατά τη διάρκεια της φλεγμονής, αλλά το εάν αυτό συμβαίνει στο πλαίσιο της φλεγμονής των νεφρών δεν έχει μελετηθεί.

Υποθέσαμε ότι το MG53 ρυθμίζει τη φλεγμονή των νεφρών ρυθμίζοντας τη μεταγραφική δραστηριότητα του NF-kB και με αυτόν τον τρόπο μπορεί να μετριάσει την ίνωση των νεφρών που εμφανίζεται ως συνέπεια χρόνιας φλεγμονής. Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε για την αντιμετώπιση αυτής της υπόθεσης.

Το cistanche είναι αποτελεσματικό στη θεραπεία νεφρικών παθήσεων

ΜΕΘΟΔΟΙ

Μελέτες σε ζώα

Όλα τα πειράματα με ζώα συμμορφώθηκαν με τον Οδηγό Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη Φροντίδα και Χρήση Ζώων Εργαστηρίου και ακολουθούσαν πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης του Πανεπιστημίου του Οχάιο. Άγριος τύπος αντιστοίχισης ηλικίας (WT) ή mg53^-/-Τα μη λιπάσματα του στελέχους 129S1/SvImJ χρησιμοποιήθηκαν22 για τον καθορισμό του ρόλου του MG53 στη ρύθμιση της νεφρικής ίνωσης που προκαλείται από την ηλικία και τη μονόπλευρη απόφραξη του ουρητήρα (UUO). Τα ποντίκια C57B6/J (9–10 εβδομάδες) αγοράστηκαν από τα εργαστήρια Jackson.

Για μελέτες νεφρικής βλάβης, τα ποντίκια (9-12 εβδομάδες) υποβλήθηκαν σε UUO για να προκληθεί ίνωση των νεφρών. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν μέσω ισοφλουρανίου (1,5 τοις εκατό -2,0 τοις εκατό ) για να εξασφαλιστεί ένα βαθύ επίπεδο αναισθησίας. Η διαδικασία UUO πραγματοποιήθηκε με απολίνωση του αριστερού ουρητήρα με 5-0 χειρουργικό μετάξι δύο φορές σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα.38 ποντίκια Sham είχαν μόνο μια τομή στο κοιλιακό δέρμα. Για να αξιολογηθεί η επίδραση του rhMG53 στην αποφρακτική νεφρική βλάβη, 1 ομάδα ποντικών UUO έλαβε rhMG53 (2 mg/kg) μέσω ένεσης στην ουραία φλέβα ξεκινώντας αμέσως μετά την επέμβαση UUO (ημέρα 0) και στη συνέχεια καθημερινά για 7 ημέρες, με 2 πρόσθετες δόσεις τις ημέρες 9 και 11. Μια ομάδα ελέγχου ποντικών UUO έλαβε ενέσεις φυσιολογικού ορού σύμφωνα με το ίδιο πρόγραμμα. Τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα 12 μετά τη χειρουργική επέμβαση UUO, οι νεφροί εγχύθηκαν in situ με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά και συλλέχθηκαν δείγματα ιστού από τον νεφρό UUO και τον αντίπλευρο νεφρό για ιστολογία και ανάλυση Western blot.

Σε ξεχωριστές μελέτες, WT και mg53^-/-ποντίκια υποβλήθηκαν σε UUO ή ψευδή χειρουργική επέμβαση και θανατώθηκαν την 7η ημέρα μετά την επέμβαση. Το MG53 χορηγήθηκε σε ποντίκια χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση θεραπείας με βάση τα κύτταρα.39 μακροφάγα RAW 264,7 μολύνθηκαν με σωματίδια ιού της κερασιάς που εξαρτώνται από τη δοξυκυκλίνη (DOX) Ad tPA-MG53- για 24 ώρες. Τα μολυσμένα κύτταρα (σε συγκέντρωση {{10}} /100 ml αλατούχου ορού ανά ποντίκι) εγχύθηκαν στη φλέβα της ουράς σε ποντικούς αμέσως μετά τη χειρουργική επέμβαση (ένεση την ημέρα 0). Τα ποντίκια έλαβαν 4 ενέσεις RAW κυττάρων με μεταγωγή Ad-tPA-MG53 τις ημέρες 0, 1, 3 και 6. Αμέσως μετά την ημέρα της ένεσης κυττάρων 0, τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε μια ομάδα που έλαβε και σε μια ομάδα που δεν έλαβε DOX (2 mg/ml σε διάλυμα σακχαρόζης 5 τοις εκατό) στο πόσιμο νερό τους για 7 ημέρες και στη συνέχεια θανατώθηκαν. Δείγματα ιστού από τον νεφρό UUO και τον ετερόπλευρο νεφρό συλλέχθηκαν για αναλύσεις ιστολογίας, RNA και πρωτεΐνης.

Στατιστικές αναλύσεις Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος -SD. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση εντός ομάδων χρησιμοποιώντας το Student's t-test κατά τη σύγκριση 2 πειραματικών βασικών ερευνών H Li et al.: Το MG53 ρυθμίζει το NF-kB στην ίνωση νεφρού 2 Kidney International (2021) -, ----ομάδες και 1-τρόπος ανάλυση διακύμανσης για περισσότερες από 2 ομάδες (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Bonferroni ή Holm-Sidak ad hoc. Μια τιμή P < 0,05="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="">

Συμπληρωματικές μέθοδοι Πλήρεις μέθοδοι που περιλαμβάνουν ιστολογική αξιολόγηση, μετρήσεις κρεατινίνης ορού, κατασκευές πλασμιδίου, κυτταροκαλλιέργεια και απομόνωση πρωτογενών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων, προετοιμασία αδενοϊού και κυτταρική λοίμωξη, δοκιμασία πυρηνικής μετατόπισης NF kB p65, ανοσοϊστοχημεία και συνεστιακές εικόνες, NF-kB reportertokinsayferase, Η συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσοπροσροφητική δοκιμασία, η κλασμάτωση ιστού, η ανοσοστύπωση, η συνανοσοκαθίζηση, η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Συμπληρωματικός Πίνακας S1) και η παραγωγή rhMG53 περιλαμβάνονται στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

εκχύλισμα cistanche tubulosa: θεραπεία νεφρικής νόσου

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Τα ποντίκια με αφαίρεση του MG53 αναπτύσσουν νεφρική ίνωση που εξαρτάται από την ηλικία

Συγκρίναμε την επίδραση της γήρανσης στη λειτουργία των νεφρών και την ίνωση σε mg53^-/-και ποντίκια WT. Επιβεβαιώσαμε την προηγούμενη παρατήρησή μας ότι παρόλο που τα επίπεδα κρεατινίνης ορού νεαρών ποντικών (2 μηνών) με και χωρίς MG53 δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά, μεγαλύτερα (16-20 μηνών) mg53-/-Τα ποντίκια εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη κρεατινίνη ορού από τους μάρτυρες WT που ταιριάζουν με την ηλικία (Εικόνα 1α). Με βάση τη χρώση με τριχρωμία, βρήκαμε ότι mg53-/-Τα ποντίκια είχαν περισσότερη νεφρική ίνωση σε σύγκριση με τα ποντίκια WT, ξεκινώντας από την ηλικία των 5 μηνών και συνεχίζοντας μέχρι την ηλικία των 20 μηνών (Εικόνα 1β και γ). Η ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της επίδρασης της κατάλυσης MG53 στη διήθηση λευκοκυττάρων, μονοκυττάρων και μακροφάγων σε νεφρούς ποντικού 2-μηνών και 5-μηνών (Εικόνα 1δ και ε). Τα νεφρά από νεαρά ποντίκια WT και mg53-/- είχαν παρόμοια επίπεδα ενδονεφρικών λευκοκυττάρων, αλλά βρέθηκαν σημαντικά περισσότερα φλεγμονώδη κύτταρα σε mg53 / νεφρούς από νεφρούς WT σε ποντίκια 5-μηνών.

Επιπλέον, η ανοσοϊστοχημεία για την ακτίνη και τη φιμπρονεκτίνη ενός λείου μυός, 2 πρωτεΐνες εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας που βρίσκονται συνήθως σε περιοχές νεφρικής ίνωσης, έδειξε ενισχυμένη (3- έως 8-πλάσια) χρώση στα σπειράματα και στο διάμεσο σωληνάριο των νεφρών από {4}}ποντίκια μηνών mg53-/- σε σύγκριση με 10-ποντίκια WT μηνών (Συμπληρωματικό Σχήμα S1).

Η UUO προκαλεί επιδεινωμένη φλεγμονή των νεφρών και ίνωση σε mg53-/- ποντικών Τα επίπεδα MG53 νεφρού που ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωση αυξήθηκαν σημαντικά 7 ημέρες μετά την UUO (Εικόνα 2α). Οι νεφροί mg53- /- UUO εμφάνισαν υπερβολική ίνωση, με 30 τοις εκατό επιπλέον χρωματισμένη με τρίχρωμη περιοχή, από τους νεφρούς WT UUO (Εικόνα 2β).

Το MG53 ρυθμίζει την ενεργοποίηση του NF-kB και τον πυρηνικό εντοπισμό του p65

Η δραστηριότητα του NF-kB (ρ65) αξιολογήθηκε στο μοντέλο UUO. Ο αριθμός του συνολικού p65 (t-p65) αυξήθηκε σημαντικά στους νεφρούς UUO από WT και mg53 / ποντίκια, αλλά η ενεργοποίηση NF-kB, που εκτιμήθηκε ως φωσφορυλίωση του p65, ήταν μεγαλύτερη (16- φορές) στο mg53 / UUO νεφρό από το νεφρό WT UUO (2-πλάσιο) σε σύγκριση με ζώα που χειρουργούνται εικονικά (Εικόνα 3α). Αναλύσαμε τα σχετικά επίπεδα RNA του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα b1 (TGF-b1), του αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (PAI{-1) και του κολλαγόνου τύπου Ι άλφα 1 (Col1a1) στον αποφρακωμένο νεφρό.40 Εμείς ανίχνευσε χαμηλά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε εικονικά ζώα και παρόμοια επαγωγή (TGF-b1, w10 φορές, PAI-1, w40 φορές· Col1a1, w40 φορές) στον νεφρό UUO από WT και mg53 / (Εικόνα 3β). Για να εξεταστεί η χωρική κατανομή του MG53 στον φλοιό των νεφρών υπό κανονικές συνθήκες, αναλύθηκαν κλάσματα νεφρικού ιστού. Τακτικά λαμβάναμε 10-πλάσια ποσότητα ολικής πρωτεΐνης κυτοσόλης από τη συνολική εκχυλισμένη πυρηνική πρωτεΐνη. Τα επίπεδα t-p65 ήταν συγκρίσιμα στο κυτοσολικό κλάσμα μεταξύ ποντικών WT και mg53-/-, αλλά ήταν μεγαλύτερα στο πυρηνικό κλάσμα των mg53-/- ποντικών (Εικόνα 3γ). Το MG53 ανιχνεύθηκε στο κλάσμα του κυτοσόλης (με την τουμπουλίνη ως δείκτη κυτοσόλης). Απροσδόκητα, μια σημαντική ποσότητα MG53 ανιχνεύθηκε στο πυρηνικό κλάσμα (με την ιστόνη Η3 ως δείκτη πυρηνικού κλάσματος).

Για να επιβεβαιώσουμε αυτό το εύρημα, εξετάσαμε επίσης τον εντοπισμό του MG53 σε κλάσματα σκελετικών μυών (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Αναπαράγαμε τις προηγούμενες μελέτες μας στις οποίες το MG53 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και στη σαρκολεμματική μεμβράνη (τριφωσφατάση νατρίου-καλίου αδενοσίνης ως δείκτης του κλάσματος μεμβράνης)22,23,25 αλλά επίσης ανίχνευσε εμπλουτισμένο πυρηνικό MG53 από σκελετικούς μύες.

Το MG53 αλληλεπιδρά με το p65 για τον έλεγχο της μεταγραφικής δραστηριότητας που προκαλείται από τον παράγοντα νέκρωσης όγκου α- Για να επιβεβαιώσουμε τα αποτελέσματα της κλασματοποίησης των ιστών μας, πραγματοποιήσαμε τις ακόλουθες ανοσοϊστοχημικές μελέτες. Σε καλλιεργημένα WT εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα, η ρ65 βρέθηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα αλλά εντοπίστηκε στους πυρήνες απουσία MG53 (Εικόνα 4α). Όταν αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LPS (5 mg) για 8 ώρες, η έκκριση προφλεγμονώδους κυτοκίνης ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε mg53/κύτταρα από τα κύτταρα WT (Εικόνα 4β).

Επειδή αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το MG53 μπορεί να αλληλεπιδράσει με το p65 για να ρυθμίσει την έκφραση φλεγμονώδους κυτοκίνης, μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ του p65 και του MG53 αξιολογήθηκε με προσδιορισμούς συνανοσοκαταβύθισης χρησιμοποιώντας κύτταρα HEK293 συνεπιμολυνθέντα με Flag-p65 και HA-MG53. Δείξαμε μια ασθενή αλληλεπίδραση (Εικόνα 4γ). Η συνεπιμόλυνση των πλασμιδίων GFP-p65 και RFP-MG53 και η συνεστιακή ανάλυση επιβεβαίωσαν τον εντοπισμό των p65 και MG53 (Εικόνα 4δ). Στη συνέχεια ποσοτικοποιήσαμε εάν το MG53 επηρεάζει τη μεταγραφική δραστηριότητα του NF-kB (p65) μετά τη διέγερση του TNF, μετρώντας τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης από μια σταθερή κυτταρική γραμμή μεταγραφικής αναφοράς NF-kB/{293-GFP-Luc που επιμολύνθηκε παροδικά με οποιονδήποτε φορέα pHM6 ή HA-MG53. Τα κύτταρα ανταποκριτές περιέχουν ένα μορφομετατρεπόμενο φακοϊό αναφοράς έκφρασης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας που οδηγείται από έναν ελάχιστο προαγωγέα κυτταρομεγαλοϊού σε συνδυασμό με 4 αντίγραφα συναινετικών στοιχείων μεταγραφικής απόκρισης NF-kB (θέση kB) ανάντη. Απουσία TNF-a, ανιχνεύτηκε πολύ χαμηλή ενδογενής δραστηριότητα λουσιφεράσης στα κύτταρα αναφοράς που εκφράζουν πρωτεΐνες MG53. Το MG53 κατέστειλε τη μεταγραφική δραστηριότητα NF-kB (ρ65) που προκλήθηκε από TNF-a κατά περίπου 40 τοις εκατό (Εικόνα 4e).

Η υπερέκφραση του MG53 απέτρεψε την πυρηνική μετατόπιση του NF-kB p65 κατά τη θεραπεία με TNF-a Το NF-kB p65 μετατοπίστηκε στον πυρήνα κατά τη θεραπεία με TNF-a στο επιθήλιο του εγγύς σωληναριού του νεφρού. κατά τη διέγερση του TNF-a, υπερεκφράσαμε το MG53 σε κύτταρα HKC-8 είτε μέσω ιικής μεταγωγής εξαρτώμενης από το DOX Ad-tPA-MG53 είτε μέσω θεραπείας με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο MG53 (rhMG53). Χρησιμοποιώντας ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα για MG, μετά την επαγωγή που εξαρτάται από το DOX, το MG53 ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα. Το MG53 ήταν παρόν σε πολύ υψηλό επίπεδο σε κύτταρα HKC-8 που είχαν μετατραπεί από Ad-tPA-MG53,

ισοδύναμο με 1 ng rhMG53/mg κυτταρικού λύματος. Αντίθετα, το HKC-8 κατέλαβε και εξέφρασε πολύ μικρότερη ποσότητα rhMG53 (Εικόνα 5α). Η πρόσληψη της σημασμένης με φθορισμό FL rhMG53 από το HKC-8 επιβεβαιώθηκε με ομοεστιακή μικροσκοπία (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Μετά την αγωγή με TNF-a, ο χρόνος για τη μέγιστη ενεργοποίηση του ρ65 ήταν 15 έως 30 λεπτά (Εικόνα 5β). Υπό βασικές συνθήκες, το NF-kB p65 βρισκόταν κυρίως στο κυτταρόπλασμα και η υπερέκφραση του MG53 δεν το άλλαξε (Εικόνα 5c και d). Ωστόσο, μετά τη διέγερση του TNF-a, το p65 μετατοπίστηκε στους πυρήνες των κυττάρων HKC-8 που δεν υπερεκφράζουν το MG53. Συγκριτικά, η πυρηνική μετατόπιση της ρ65 μειώθηκε κατά 33 τοις εκατό (στα κύτταρα που έλαβαν rhMG53) σε 50 τοις εκατό (μεταδιεγερθέντα κύτταρα στα οποία χορηγήθηκε DOX) σε κύτταρα που υπερέκφραζαν το MG53 (Εικόνα 5γ και δ).

Η υιοθέτηση μεταφοράς των τροποποιημένων κυττάρων RAW στο μοντέλο UUOmouse πραγματοποιήθηκε με 1 - 106 κύτταρα που χορηγήθηκαν μέσω ένεσης στη φλέβα της ουράς αμέσως μετά τη χειρουργική επέμβαση UUO. Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε μια ομάδα που έλαβε κανονικό πόσιμο νερό (-DOX) και σε μια ομάδα που έλαβε DOX (2 mg/ml) σε πόσιμο νερό. Τα ποντίκια UUO έλαβαν RAW κάθε άλλη μέρα για συνολικά 4 ενέσεις. Τα νεφρά συλλέχθηκαν 7 ημέρες μετά την επέμβαση.

Τα ποντίκια στα οποία έγινε έγχυση με μηχανική RAW ακολουθούμενη από επαγωγή DOX εμφάνισαν σημαντικά μειωμένη (κατά 30 τοις εκατό) ίνωση των νεφρών σε σύγκριση με αυτά που δεν έλαβαν κύτταρα ή αυτά που εγχύθηκαν με μηχανικά κύτταρα RAW αλλά χωρίς επαγωγή Dox (66 τοις εκατό ινωτική περιοχή, Εικόνα 6α και β).

Μόνο ένας μικρός πληθυσμός RAW/Ad-tPA-MG53 επέζησε από την επιτήρηση του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος μέχρι το τέλος των πειραμάτων. Η χρώση ανοσοϊστοχημείας επιβεβαίωσε ότι η έκφραση MG53 που προκαλείται από τη θεραπεία με DOX προκλήθηκε από RAW στον νεφρό (Εικόνα 6γ). Είναι ενδιαφέρον ότι οι νεφροί UUO από ποντίκια με έγχυση RAW και MG53 που προκλήθηκε από DOX εμφάνισαν χαμηλότερη αναλογία p-65/t-p65 (κατά περίπου 40 τοις εκατό ) από αυτούς που είτε δεν έλαβαν RAW είτε από αυτούς που έλαβαν RAW χωρίς DOX (Εικόνα 6δ και ε). Το μειωμένο επίπεδο p-p65 επιβεβαιώθηκε με χρώση ανοσοϊστοχημείας p-p65 (S536) των νεφρών UUO (Εικόνα 6f). Πιστεύουμε ότι το κυκλοφορούν MG53 που χορηγείται από το Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX και η πρόσληψη από τα εγγύς κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων θα μπορούσε να συμμετάσχει στη μείωση του p-p65 (S536) και στη μείωση της φλεγμονής των νεφρών UUO. Σε σύγκριση με τους νεφρούς μόνο με UUO, η έκφραση TGF-b1, PAI- 1 και Col1a1 αυξήθηκε σημαντικά στους νεφρούς UUO από ποντίκια που είχαν εγχυθεί με RAW χωρίς DOX (χωρίς επαγωγή MG53). Η ανύψωση αυτών των προφιβωτικών γονιδίων θα μπορούσε να αποδοθεί στην επαγωγή μιας ισχυρής αντίδρασης αλλομοσχεύματος από κύτταρα που έχουν εγχυθεί σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς. Ωστόσο, οι νεφροί UUO από ποντικούς στους οποίους έγινε έγχυση RAW και στους οποίους δόθηκε DOX (επαγωγή MG53) εξέφρασαν σημαντικά χαμηλότερο (60 τοις εκατό –72 τοις εκατό μείωση) PAI-1 και σχετικά χαμηλότερα επίπεδα TGF-b1 και Col1a1 από ποντίκια χωρίς θεραπεία με DOX (Εικόνα 6 g).

Η συστηματική χορήγηση rhMG53 μετριάζει την ενεργοποίηση του NF-kB και την ανάπτυξη ίνωσης σε ποντικούς που υποβλήθηκαν σε UUO

Δοκιμάσαμε εάν το rhMG53 εμφάνιζε παρόμοιο αντιϊνωτικό αποτέλεσμα με τη μηχανική θεραπεία κυττάρων RAW που περιγράφηκε προηγουμένως. Τα προηγούμενα φαρμακοκινητικά μας δεδομένα έδειξαν τη σύντομη, κυκλοφορούσα ημιζωή (περίπου 90 λεπτά σε τρωκτικά) του rhMG53.42 Τα ποντίκια ανέχτηκαν χρόνια χορήγηση 2 έως 6 mg/kg

rhMG5326,37 καλά, επομένως χρησιμοποιήθηκε η στρατηγική χορήγησης που φαίνεται στο Σχήμα 7α. Τα ποντίκια UUO έλαβαν τυχαία είτε φορέα (αλατόνερο) είτε rhMG53 (2 mg/kg) ημερησίως για τις πρώτες 7 ημέρες μετά το χειρουργείο και στη συνέχεια κάθε δεύτερη μέρα έως ότου θανατώθηκαν την ημέρα 12. Οι ψευδείς και οι ετερόπλευροι νεφροί εμφάνισαν περίπου ισοδύναμο t-p65 και τα επίπεδα έκφρασης της φιμπρονεκτίνης, με τα επίπεδα p-p65 ελαφρώς αυξημένα στους ετερόπλευρους νεφρούς σε σύγκριση με τους ψευδείς νεφρούς. Μετά την UUO, η t-p65 του νεφρού αυξήθηκε. Σε σύγκριση με ζώα που έλαβαν αλατούχο διάλυμα, η αναλογία p-65/t-p65 στους νεφρούς UUO των ζώων που έλαβαν rhMG53-μειώθηκε κατά περίπου 37 τοις εκατό , ενώ το IkBa αυξήθηκε κατά περίπου 27 τοις εκατό (Εικόνα 7β και ντο). Επιπλέον, η φιμπρονεκτίνη μειώθηκε κατά περίπου 33 τοις εκατό (Εικόνα 7β και γ). Η ανοσοϊστοχημεία επιβεβαίωσε ότι το rhMG53 υπήρχε στους νεφρούς UUO μετά τη θεραπεία (Εικόνα 7δ). Η ολική ίνωση μειώθηκε σε νεφρούς UUO που έλαβαν θεραπεία με rhMG{53- (Εικόνα 7e). Ωστόσο, η έκφραση RNA των TGF-b1, PAI-1 και Col1a1 ήταν παρόμοια σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία είτε με αλατούχο διάλυμα είτε με rhMG53 (Εικόνα 7f).

Το cistanche είναι αποτελεσματικό στη θεραπεία της νεφρικής δυσλειτουργίας

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η MG53 είναι μια πρωτεΐνη TRIM εμπλουτισμένη με μυς, η οποία αρχικά αναγνωρίστηκε ως εξέχον συστατικό του μηχανήματος επιδιόρθωσης της πλασματικής μεμβράνης. μυοκίνη.32 Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι το MG53 μπορεί να ελέγξει τη φλεγμονή κατά τη διάρκεια βλάβης ιστού σε απομακρυσμένα όργανα.27,29,33,35-37 Η παρούσα έρευνα επεκτείνει το πεδίο της προστασίας οργάνων με τη μεσολάβηση MG53-στο νεφρό. Συμπεραίνουμε ότι το MG53 μπορεί να μετριάσει την ενδονεφρική φλεγμονή και την ίνωση των νεφρών αναστέλλοντας την επαγόμενη από κυτοκίνη ενεργοποίηση του προφλεγμονώδους και προφλεγμονώδους μεταγραφικού παράγοντα NF-kB. Αυτό το συμπέρασμα βασίζεται στις ακόλουθες παρατηρήσεις: (i) γενετική διαγραφή του MG53 σε φυσιολογικά ποντίκια.

οδήγησε σε μείωση της νεφρικής λειτουργίας καθώς τα ποντίκια γερνούσαν, η οποία συνοδεύτηκε από αύξηση της ίνωσης των νεφρών και διήθηση του νεφρού από λευκοκύτταρα και μακροφάγα. (ii) σε ένα μοντέλο νεφρικής βλάβης UUO ποντικού, οι αποφρακμένοι νεφροί ποντικών με ανεπάρκεια MG53-εμφάνισαν περισσότερη ίνωση και φλεγμονή από ποντίκια με πλήθος MG53-. (iii) Η παραγωγή TNF-a και ιντερλευκίνης-6 από εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με LPS εξασθενήθηκαν παρουσία MG53. (iv) η θεραπεία με ή η υπερέκφραση του MG53 σε μια εγγύς σωληναριακή επιθηλιακή κυτταρική σειρά μείωσε την επαγόμενη από τον TNFa ενεργοποίηση NF-kB μπλοκάροντας την πυρηνική μετατόπιση του συστατικού p65 του-kB (το MG53 βρέθηκε να συνδέεται απευθείας με το p65, αν και ασθενώς). και (ν) η φωσφορυλίωση της ρ65, ένα απαραίτητο βήμα στην ενεργοποίηση του NF-kB, μειώθηκε στους αποφρακμένους νεφρούς ποντικών UUO που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ανασυνδυασμένο MG53 που διεγείρεται να υπερεκφράζει το MG53 σε μακροφάγους. Επιπλέον, ο αναστολέας της ενεργοποίησης του NF-kB, IkBa, αυξήθηκε στους αποφραγμένους νεφρούς ποντικών UUO στους οποίους έγινε ένεση ανασυνδυασμένου MG53.

Η γενετική διαγραφή του MG53 σε φυσιολογικά ποντίκια ήταν επιτρεπτή στις δυσμενείς επιπτώσεις της γήρανσης στα νεφρά. Αυτό υποδηλώνει ότι η παρουσία ενδογενούς MG53 παρέχει ένα βασικό επίπεδο προστασίας κατά τη γήρανση. Ομοίως, η απώλεια του ενδογενούς MG53 έκανε το AKI λόγω απόφραξης χειρότερο. Ο νεφρός UUO συσσώρευσε MG53, αντανακλώντας πιθανώς την απομακρυσμένη δραστηριότητα μυοκίνης από τους σκελετικούς μυς. Παραμένει ασαφές πώς ο μυς MG53 μπορεί να στρατολογηθεί στο νεφρό κατά τη διάρκεια τραυματισμού. Ωστόσο, ένας κατεστραμμένος νεφρός συχνά αναπτύσσει υποξία και υφίσταται οξειδωτικό στρες,^44,45σήματα που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν για τη στρατολόγηση MG53. Εάν ναι, αυτός ο άξονας «μυϊκού-νεφρού-ανοσοποιητικού κυττάρου» θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για να μετριάσει τη βλάβη των νεφρών.46 Εναλλακτικά, τα νεφρικά κύτταρα εκφράζουν όντως χαμηλά επίπεδα MG53 κατά την έναρξη,²⁶και, κατά τη διάρκεια οξέος ή χρόνιου τραυματισμού, η παραγωγή MG53 θα μπορούσε να ρυθμιστεί προς τα πάνω.

Το NF-kB είναι ένας εξέχων μεταγραφικός οδηγός της φλεγμονής και της ίνωσης σε νεφρική βλάβη και γήρανση.^14,17,47,48Μας ζητήθηκε να διερευνήσουμε εάν τα αποτελέσματα του MG53 θα μπορούσαν να προκληθούν μέσω NF-kB επειδή η παρουσία του MG53 στο πυρηνικό διαμέρισμα των ομογενοποιημένων νεφρών υποδηλώνει τη δυνατότητα μεταγραφικής παρεμβολής. Ο πυρηνικός εντοπισμός του MG53 δεν είναι χωρίς προηγούμενο. Σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο που υπερέκφραζε το MG53 του μυοκαρδίου, το πυρηνικό MG53 ρύθμισε την έκφραση του ενεργοποιημένου από τον πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος υποδοχέα άλφα σε μεταγραφικό επίπεδο και επηρέασε τον καρδιακό μεταβολισμό των λιπιδίων. μέσω της μείωσης των προφλεγμονωδών κυτοκινών, της απόπτωσης και του οξειδωτικού στρες στα γηρασμένα καρδιομυοκύτταρα.³⁷

Ο μοριακός μηχανισμός του τρόπου με τον οποίο το MG53 ρυθμίζει την πυρηνική/κυτταροπλασματική κινητοποίηση του p65 παραμένει ασαφής. Το MG53 δεν περιέχει σήμα πυρηνικού εντοπισμού, αλλά περιέχει 3 υποτιθέμενα σήματα εξαγωγής πυρηνικών πλούσιων σε λευκίνη Ν-τερματικού άκρου, ένα μοτίβο που αναγνωρίζεται από την εξαγωγική πρωτεΐνη της πυρηνικής εξαγωγής.⁵⁰Η άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ MG53 και p65 ήταν μάλλον αδύναμη ως η μόνη ή κύρια διασπαστική επίδραση του MG53 στην ενεργοποίηση του NF-kB. Αν και το MG53 φαίνεται να επηρεάζει τη δυναμική νουκλεοκυτταροπλασματική μετατόπιση των κρίσιμων συστατικών του NF-kB, οι ακριβείς μηχανισμοί απομένουν να προσδιοριστούν.

Το κρίσιμο αποτέλεσμα της επαναπροστασίας με τη μεσολάβηση MG53-φαίνεται ότι είναι η μείωση της ινωτικής αναδιαμόρφωσης μέσω της εξασθένησης της φλεγμονής που προκαλείται από NF-kB. Η ίνωση των νεφρών είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει την παθολογική εναπόθεση διαφόρων πρωτεϊνών ECM.51 MG53 φάνηκε να έχει σαφείς επιδράσεις στην ινονηκτίνη πρωτεΐνης ECM. Η φιμπρονεκτίνη αυξήθηκε στους νεφρούς UUO με έλλειψη MG53 και μειώθηκε σε ποντικούς UUO που έλαβαν MG53. Η έκφραση άλλων πρωτεϊνών ECM παρουσία και απουσία MG53 είναι πιο δύσκολο να κατανοηθεί. Στο παρελθόν αποδείξαμε ότι το rhMG53 ρυθμίζει αρνητικά τη σηματοδότηση TGF-b1/Smad και καταστέλλει τη σύνθεση πρωτεϊνών ECM σε μια in vitro μελέτη. mg53 / ανεπαρκή ζώα. Αυτές οι μεταγραφές όντως μειώθηκαν στα ζώα UUO που προκλήθηκαν να υπερεκφράσουν MG53 μέσω της χορήγησης ποντικού που προκλήθηκε από ιούς

μακροφάγα, αλλά όταν χορηγήθηκε ανασυνδυασμένο MG53, δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση. Αυτό μπορεί απλώς να είναι μια περίπτωση επαρκούς δοσολογίας επειδή τα ενδονεφρικά επίπεδα MG53 που επιτεύχθηκαν ήταν πολύ μεγαλύτερα σε ζώα δεδομένου του φορέα μακροφάγου σε αντίθεση με το ανασυνδυασμένο MG53. Επιπλέον, τα επίπεδα πρωτεΐνης δεν μετρήθηκαν και τα μετα-μεταγραφικά συμβάντα θα μπορούσαν να τροποποιήσουν την ECM σε UUO. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να αποσαφηνιστεί ο αναδυόμενος ρόλος του MG53 στη ρύθμιση συγκεκριμένων πρωτεϊνών ECM. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη έδειξε ότι μια μυοκίνη μπορεί να βοηθήσει στη ρύθμιση της βασικής φλεγμονής σε ένα απομακρυσμένο όργανο όπως ο νεφρός και, στο πλαίσιο της νεφρικής βλάβης, μπορεί να βοηθήσει στην άμβλυνση και τον έλεγχο της φλεγμονής. Το σχήμα 8 παρουσιάζει ένα μοντέλο λειτουργίας του ρόλου του MG53 στην επαναπροστασία. Κατά τη διέγερση και το ισχαιμικό στρες που σχετίζονται με μοριακά μοτίβα (DAMP, όπως TNF-a) και μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με παθογόνο (PAMP, όπως LPS), το σηματαλόσωμα NF-kB ενεργοποιείται στο νεφρό. Το MG53 προστατεύει το νεφρό αναστέλλοντας τη φωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση της σηματοδότησης NF-kB, σταθεροποιώντας το IkBa και μειώνοντας την πυρηνική κινητοποίηση του p65, εμποδίζοντας την ενεργοποίηση προφλεγμονωδών προγραμμάτων. Αν και το ενδογενές MG53 μπορεί να μεσολαβεί σε αυτές τις επιδράσεις, προτείνουμε ότι μπορεί να παρασχεθεί πιο ισχυρή προστασία με τη χρήση του MG53 θεραπευτικά, κάτι που είναι εφικτό με βάση την ικανότητα του εξωγενούς MG53 να μειώνει τον τραυματισμό σε UUO. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να κατανοηθεί πώς μπορεί να γίνει κλινική εκμετάλλευση αυτής της μυοκίνης.

όφελος από το cistanche: προστασία του ήπατος και κατά της ίνωσης

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ

Η JM έχει μετοχικό συμφέρον στην TRIM-edicine, Inc., η οποία αναπτύσσει το rhMG53 για τη θεραπεία ανθρώπινων ασθενειών. Οι πατέντες για τη χρήση του MG53 κατέχονται από το Πανεπιστήμιο Rutgers και το Πανεπιστήμιο του Οχάιο. Όλοι οι άλλοι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR και P-HL) και το NIH R01-AG062896 (P-HL andBHR). Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε επίσης εν μέρει από ένα intramuralLockwood fund από το Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο (P-HL) και ένα βραβείο από το Εθνικό Κέντρο Προώθησης Μεταφραστικών Επιστημών (NCATS, P-HL, αριθμός βραβείου UL1TR002733). Το περιεχόμενο είναι αποκλειστικά ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύει απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του NCATS ή του NIH.

ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΑ ΣΥΓΓΡΑΦΕΑ,

Οι PD, P-HL, JM και BHR συνέλαβαν και/ή σχεδίασαν τις μελέτες. Οι HL, PD, P-HL, ZL και XZ πραγματοποίησαν τα πειράματα, απέκτησαν δεδομένα και πραγματοποίησαν ανάλυση δεδομένων. Οι PD, P-HL και BHR ερμήνευσαν τα αποτελέσματα. και οι P-HL και BHR συνέταξαν, αναθεώρησαν και ενέκριναν το χειρόγραφο. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν την τελική έκδοση.

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Συμπληρωματικό αρχείο (PDF) Συμπληρωματικές μέθοδοι.

Πίνακας S1.Αλληλουχίες εκκινητών. Εικόνα S1. mg53-/- ποντίκια εμφανίζουν βελτιωμένη εναπόθεση πρωτεΐνης ECM. Οι ιστοί των νεφρών που ταιριάζουν με την ηλικία (10 μηνών) άγριου τύπου (WT) και mg53- /- χρωματίστηκαν με 40 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI, μπλε, αριστερά πλαίσια), α- ακτίνη λείων μυών (SMA, πράσινο, δεύτερο πάνελ), φιμπρονεκτίνη (κόκκινο, τρίτο πάνελ) και συγχωνευμένα (δεξιά πλαίσια). Μπάρα ¼ 25 mm. Ποσοτικοποίηση της περιοχής νεφρικής ίνωσης (n ¼ 3 ανά ομάδα). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι -SD. Student's t-test. ***P <>

Εικόνα S2.Κατανομή του σκελετικού μυός MG53 μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Οι σκελετικοί μύες που προέρχονται από ποντίκια ormg53-/- άγριου τύπου (WT) κλασματοποιήθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με ένα προσαρμοσμένο αντίσωμα αντι-MG53 (3 mg λύματα) και δείκτες κυτταρικού διαμερίσματος (20 mg προϊόντα λύσης). Οι τριφωσφατάσες αδενοσίνης νατρίου-καλίου χρησιμοποιούνται ως δείκτης κυτταρικής μεμβράνης, η ιστόνη Η3 ως πυρηνικός δείκτης και η τουμπουλίνη ως δείκτης κυτοσόλης.

Εικόνα S3.Κύτταρα εγγύς νεφρικού σωληναρίου HKC-8 προσλαμβάνουν ειδικά το σημασμένο με AlexaFluor 647 rhMG53. Το rhMG53 (Trimedicine) και η αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA, ThermoFisher Scientific) επισημάνθηκαν με κιτ επισήμανσης αντισωμάτων Alexa Fluor(AF) (Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κύτταρα HKC-8 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλίο με γυάλινο πυθμένα Delta TPG (Bioptechs Inc.) σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) παρουσία επισημασμένων πρωτεϊνών, BSA-AF647 (αριστερά ) και rhMG53-AF647 (δεξιά), για 24 ώρες. Οι εικόνες στοίβας Z λήφθηκαν από ομοεστιακό μικροσκόπιο LSM780 (Zeiss). Οι εικόνες δείχνουν κελιά στο κάτω μέρος των πιάτων. Μπάρα ¼ 25 mm.

Εικόνα S4.Κατασκευή κυττάρων RAW για τη μεσολάβηση επαγώγιμης έκκρισης MG53. (Α) Κύτταρα RAW μολύνθηκαν με Ad-tPA-MG53 για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε αγωγή χωρίς (δοξυκυκλίνη [Dox]) ή με Dox (þDox, 1 mg/ml) για επιπλέον 24 ώρες για να προκληθεί έκφραση tPA-MG53. Οι συνεστιακές εικόνες έδειξαν την επαγωγή έκφρασης MG53 (κατά παραγγελία αντίσωμα αντι-MG53, κόκκινο, κάτω πάνελ) από κύτταρα RAW που μοιάζουν με μακροφάγους (χρώση F4/80, πράσινο, επάνω πάνελ). Μπάρες ¼ 25 mm. (B, C) Ανάλυση Western blot κυτταρολυμάτων (στην ποσότητα των 0.6, 3 και 6 mg) για επαγόμενη έκφραση tPA-MG53 και MG53 από μολυσμένα κύτταρα RAW (Β) και την αντίστοιχη καλλιέργεια συμπυκνώματα μέσων (σε όγκους 2, 5 και 10ml) (C). Διάφορες ποσότητες rhMG53 (στην ποσότητα των 0.2, 1, 0.05 και 0.025 ng) φορτώθηκαν ως πρότυπα. Mw, δείκτες μοριακού βάρους.