Οι ευεργετικές επιδράσεις της βερμπασκοσίδης από το βότανο Cistanche

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Η βερμπασκοσίδη προστατεύει τα ποντίκια από την αέρια γάγγραινα κλωστριδίων αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της άλφα τοξίνης και της περφριγολυσίνης Ο

Η αέρια γάγγραινα, που προκαλείται κυρίως από το αναερόβιο βακτήριο Clostridium perfringens (C. perfringens), προκαλεί θάνατο εντός 48 ωρών από την έναρξη. Περιορισμένες θεραπευτικές στρατηγικές είναι διαθέσιμες και σχετίζεται με εξαιρετικά υψηλή θνησιμότητα. Τόσο η άλφα-τοξίνη C. perfringens (CPA) όσο και η περφρινγκολυσίνη Ο (PFO) είναι σημαντικοί παράγοντες λοιμογόνου δράσης στην ανάπτυξη αερίου γάγγραινας, υποδηλώνοντας ότι αποτελούν θεραπευτικούς στόχους. Εδώ, το βρήκαμεβερμπασκοσίδη, a φαινυλοπροπανοειδές γλυκοσίδιοευρέως διανεμημένο σε Κινεζικά φυτικά φάρμακα Cistanche, θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά τη βιολογική δραστηριότητα τόσο του CPA όσο και του PFO σε αιμολυτικούς προσδιορισμούς.

Ο ολιγομερισμός του PFO αναστέλλεται αξιοσημείωτα από τη βερμπασκοσίδη. Αν και δεν παρατηρήθηκε αντιβακτηριακή δράση,βερμπασκοσίδηη θεραπεία προστάτευσε τα κύτταρα Caco-2 από τις βλάβες που προκαλούνται από το CPA και το PFO. Επιπλέον, μολυσμένα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μεβερμπασκοσίδηέδειξε σημαντικάμετριάστηκε η ζημιά, μειωμένο βακτηριακό φορτίο, καιμειωμένη θνησιμότητα. Συνοψίζοντας,Η βερμπασκοσίδη έχει αποτελεσματική θεραπευτική δράση κατά της λοιμογόνου δράσης του C. perfringens τόσο in vitro όσο και in vivoστοχεύοντας ταυτόχρονα CPA και PFO. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική και μια πιθανή ένωση μολύβδου για λοιμώξεις από C. perfringens, ιδιαίτερα αέρια γάγγραινα.

Λέξεις-κλειδιά: άλφα-τοξίνη, αντι-λοιμώξεις, Clostridium perfringens, αέρια γάγγραινα, περφρινγκολυσίνη Ο, βερμπασκοσίδη

Το Clostridium perfringens (C. perfringens) είναι ένα gram-θετικό αναερόβιο βακτήριο που είναι ευρέως κατανεμημένο στη φύση και στο ανθρώπινο έντερο (Fraser and Collee, 1975). Το C. perfringens μπορεί να εκκρίνει τέσσερις κύριες τοξίνες ( , , ε, και Ì) και αναλόγως χωρίζεται σε πέντε ορότυπους, A–E (Titball, 2005). Στους ανθρώπους, το C. perfringens μπορεί να προκαλέσει μια ποικιλία ασθενειών, όπως τροφική δηλητηρίαση και γάγγραινα με αέρια, η τελευταία εκ των οποίων μπορεί επίσης να εμφανιστεί σε ζώα, όπως γάτες, βοοειδή, σκύλοι, πρόβατα, άλογα και κατσίκες (Verherstraeten et al. , 2015). Η περίοδος επώασης της αέριας γάγγραινας είναι σύντομη και η μόλυνση μπορεί να εγκατασταθεί εντός 6-8 ωρών (Uzal et al., 2015). Πιο σοβαρά, περισσότερο από το 50 τοις εκατό των μολυσμένων θα συνεχίσουν να αναπτύσσουν συστηματική τοξιναιμία, οδηγώντας τελικά σε θάνατο. Έτσι, χωρίς την έγκαιρη και αποτελεσματική χορήγηση θεραπείας, η αέρια γάγγραινα μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές οικονομικές απώλειες (Low et al., 2018). Ωστόσο, οι συνήθεις θεραπείες, όπως η αντιβιοτική θεραπεία και η χειρουργική θεραπεία για την αέρια γάγγραινα, έχουν όλες ορισμένα μειονεκτήματα, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, της αντοχής στα αντιβιοτικά και του ακρωτηριασμού των ασθενών (Park et al., 2010; Osman and Elhariri, 2013). Έτσι, είναι απαραίτητο να βρεθούν νέες μέθοδοι ή ιδέες για τη θεραπεία της αέριας γάγγραινας.

Η αέρια γάγγραινα κλωστριδίων είναι η κεραυνοβόλος μολυσματική ασθένεια που προκαλείται κυρίως από την αλληλεπίδραση μιας τοξίνης C. perfringens (CPA) και της περφρινγκολυσίνης Ο (PFO) (Hifumi et al., 2018). Το CPA, που ανήκει στην οικογένεια των βακτηριακών ενζύμων ψευδαργύρου-φωσφολιπάσης Metallo, παράγεται από όλα τα C. perfringens, κωδικοποιείται από τα χρωμοσώματα, είναι μια κύρια τοξίνη στο C. perfringens και εμφανίζει δραστηριότητες τόσο της φωσφολιπάσης C όσο και της σφιγγομυελινάσης (van Bunderen et al. , 2010· Masataka et al., 2015). Στη δεκαετία του 1990, οι Awad et al. (1995) χρησιμοποίησαν μεταλλάκτες CPA για να δοκιμάσουν ένα μοντέλο ποντικού με αέρια γάγγραινα και διαπίστωσαν ότι τα στελέχη που δεν είχαν το γονίδιο CPA έδειξαν μειωμένη παθογένεια και λιγότερη βλάβη ιστού μετά τη μόλυνση. Αυτή η εργασία επιβεβαίωσε ότι η CPA είναι η κύρια τοξίνη στην αέρια γάγγραινα. Το 2000, ο Alberto διεξήγαγε εις βάθος μελέτες κατασκευάζοντας ένα μοριακό μοντέλο μεταλλαγμάτων α-τοξίνης και τριών βρόχων στην C-τερματική περιοχή και η αιμολυτική δραστηριότητα και η κυτταροτοξικότητα των μεταλλαγμάτων μειώθηκαν σε σύγκριση με εκείνα του άγριου τύπου. Αποδείχθηκε ότι η δραστικότητα σφιγγομυελινάσης και η Ο-τερματική περιοχή είναι απαραίτητα για μυοτοξικότητα in vivo (Alape-Giron et al., 2000). Το PFO, μια εξαρτώμενη από τη χοληστερόλη κυτολυσίνη (CDC), αλληλεπιδρά με την κυτταρική μεμβράνη ως μονομερές και το παρασκευασμένο σύμπλοκο στη συνέχεια εισάγεται στη διπλή στιβάδα της μεμβράνης με ολιγομερισμό, τελικά λύοντας τα κύτταρα ξενιστές (Johnson and Heuck, 2014). Αν και το PFO δεν είναι απαραίτητο για τη θνησιμότητα, μπορεί να προκαλέσει κυτταροτοξικότητα μακροφάγων στα πρώιμα στάδια της μυονέκρωσης και είναι σημαντικό για το σχηματισμό θρόμβων στα τελευταία στάδια της μόλυνσης, συμβάλλοντας στην παθογένεση της αέριας γάγγραινας (Verherstraeten et al., 2015). Το CPA μπορεί να συνδυαστεί με το PFO για να βλάψει τα ουδετερόφιλα που συσσωρεύονται στο μολυσμένο σημείο και να προκαλέσει δυσλειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων, οίδημα και ισχαιμία, οδηγώντας τελικά σε υποξία των ιστών και παρέχοντας ένα ευνοϊκό αναερόβιο περιβάλλον για την ανάπτυξη και την αναπαραγωγή του C. perfringens (Bryant and Stevens, 1996 ). Έτσι, αυτή η μελέτη στοχεύει CPA και PFO και στοχεύει να αποκαλύψει μια νέα μέθοδο για τη θεραπεία της αέριας γάγγραινας.

Σε αυτή τη μελέτη, δύο αναστολείς τοξίνης υποβλήθηκαν σε διαλογή από 17 φυσικές ενώσεις με αιμόλυση για να βρεθεί ένας πιθανός αναστολέας της αέριας γάγγραινας. Τα αιμολυτικά δεδομένα για διάφορες ενώσεις φαίνονται στον Πίνακα 1. Μεταξύ των 17 ειδών φυσικών ενώσεων, η βερμπασκοσίδη έχει την καλύτερη ανασταλτική δράση και στις δύο τοξίνες, και επομένως επιλέξαμε τη βερμπασκοσίδη ως την ένωση στόχο για αυτήν τη μελέτη. Η βερμπασκοσίδη διανέμεται ευρέως σε διάφορα κινεζικά φυτικά φάρμακα βότανα όπως το κιστάνσε και απομονώθηκε και εξήχθη απόVerbascosideαπό έναν Ιταλό επιστήμονα το 1963 (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Μελέτες έχουν δείξει ότιΗ βερμπασκοσίδη έχει πολλές βιολογικές και φαρμακολογικές επιδράσεις, όπωςαντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές, αντιβακτηριακές, αντικαρκινικές, αντιμυκητιακές και χηλικές ιδιότητες, καιμπορεί να χρησιμοποιηθεί σε καλλυντικά δέρματοςκαιτοπικά παρασκευάσματα.Άλλες αναφορές έχουν δείξει ότι η βερμπασκοσίδη μπορεί να απορροφηθεί πλήρως μέσα σε 1 ώρα και να φτάσει σε υψηλή συγκέντρωση στο αίμα και ότι η βιοδιαθεσιμότητά της κατά την παράδοση μέσω διαφόρων μεθόδων ένεσης δεν υπερβαίνει το 25 τοις εκατό (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). Με βάση τις προαναφερθείσες φαρμακολογικές δραστηριότητες, αυτή η μελέτη βρήκε και μελέτησε την ανασταλτικήεπιδράσεις της βερμπασκοσίδηςστην αέρια γάγγραινα μέσω μιας σειράς πειραμάτων in vitro και in vivo.

Η βερμπασκοσίδη ανέστειλε την αιμολυτική δράση του PFO και του CPA

Ορισμένα φλαβονοειδή έχουν αναφερθεί ότι είναι αποτελεσματικοί αναστολείς κατά των τοξινών που σχηματίζουν πόρους (Li et al., 2013; Wang et al., 2017; Zhou et al., 2017). Εδώ, η βερμπασκοσίδη, ένα φαινυλοπροπανοειδές, βρέθηκε ότι αναστέλλει την αιμολυτική δράση και των τοξινών PFO και CPA που εκκρίνονται από το C. perfringens. Όταν οι συγκεντρώσεις της βερμπασκοσίδης κυμαίνονταν από 2 έως 32 |ig/mL, η θεραπεία με βερμπασκοσίδη ανέστειλε σημαντικά την αιμολυτική δράση αυτών των τοξινών με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι η βερμπασκοσίδη είναι ένας αποτελεσματικός αναστολέας τόσο του PFO όσο και του CPA.

Η βερμπασκοσίδη δεν επηρεάζει την ανάπτυξη του C. perfringens

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 |ig/mL. Ομοίως, τα αποτελέσματα της καμπύλης βακτηριακής ανάπτυξης (Εικόνα 2Β) δείχνουν ότι η βερμπασκοσίδη δεν επηρεάζει την κανονική ανάπτυξη των βακτηρίων. Μαζί, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η θεραπεία με βερμπασκοσίδη δεν έχει καμία επίδραση στη βιωσιμότητα του C. perfringens στις συγκεντρώσεις που απαιτούνται για την αναστολή της δραστηριότητας PFO και CPA.

Η βερμπασκοσίδη προστατεύει τα κύτταρα από βλάβες που προκαλούνται από PFO ή CPA

Η άλφα-τοξίνη Clostridium perfringens και το PFO στο C. perfringens είναι οι κύριες τοξίνες που προκαλούν αέρια γάγγραινα. Έτσι, εξετάστηκε επίσης εάν η βερμπασκοσίδη θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα από αυτές τις δύο τοξίνες. Αρχικά, πραγματοποιήσαμε δοκιμή κυτταροτοξικότητας με το φάρμακο βερμπασκοσίδη, το οποίο δεν κατέστρεψε τα κύτταρα (Εικόνα 3Α). Στη συνέχεια, αυτή η ένωση προστέθηκε στο σύστημα συν-καλλιέργειας κυττάρων και PFO ή CPA. VΗ ερβασκοσίδη ανέστειλε την κυτταροτοξικότητα αυτών των δύο τοξινώνσε κελιά Caco{{0}}. Σε σύγκριση με δείγματα που δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βερμπασκοσίδη, η βλάβη που προκλήθηκε από τις τοξίνες στα κύτταρα Caco-2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βερμπασκοσίδη σε 0.5 Jig/mL μειώθηκε σημαντικά με τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Ειδικά για την πρωτεΐνη PFO, τα κύτταρα προστατεύτηκαν αποτελεσματικά σε συγκέντρωση φαρμάκου 0,25 ig/mL (Ρ < 0,05).="" μια="" επακόλουθη="" δοκιμασία="" βιωσιμότητας/θανάτου="" κυττάρου="" (εικόνες="" 3d-k)="" χρησιμοποιήθηκε="" περαιτέρω="" για="" να="" αποδειχθεί="" αυτό="" το="" προστατευτικό="" αποτέλεσμα.="" όπως="" αναμενόταν,="" η="" θεραπεία="" με="" βερμπασκοσίδη="" προστατεύει="" ορατά="" από="" κυτταρικό="" τραυματισμό="" που="" προκαλείται="" από="" pfo="" ή="" cpa.="" συνολικά,="" τα="" αποτελέσματά="" μας="" έδειξαν="" ότι="" η="" βερμπασκοσίδη="" αναστέλλει="" σημαντικά="" την="" κυτταρική="" βλάβη="" που="" προκαλείται="" από="" το="" pfo="" ή="" το="" cpa="" με="" δοσοεξαρτώμενο="">

Η βερμπασκοσίδη αναστέλλει την αιμολυτική δραστηριότητα PFO μειώνοντας τον ολιγομερισμό της

Η αιμολυτική δράση του PFO πρέπει να συνοδεύεται από την εμφάνιση ολιγομερισμού και σχηματισμού πόρων (Johnson and Heuck, 2014). Εδώ, ο ολιγομερισμός του PFO προκλήθηκε από KCl και αίμα κουνελιού και ανιχνεύθηκε ολιγομερισμός PFO (Εικόνα 4), αποκαλύπτοντας μια μειωμένη ένταση ζώνης ολιγομερισμού όταν η συγκέντρωση του βερμπασκοσίδη αυξήθηκε. Μαζί, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με βερμπασκοσίδη αναστέλλει τον ολιγομερισμό του PFO και συνεπώς μειώνει την αιμολυτική δραστηριότητα αυτής της τοξίνης.

Η βερμπασκοσίδη προστατεύει τα ποντίκια από τη μόλυνση του C. perfringens

Καθιερώθηκε ένα μοντέλο γάγγραινας των μυών του ποδιού ποντικού για να προσδιοριστεί εάν η προστασία που παρατηρήθηκε in vitro μπορούσε επίσης να παρατηρηθεί in vivo. Τα πόδια των μολυσμένων με ATCC13124-ποντικών ήταν Αντίθετα, ο αριθμός των φλεγμονωδών κυττάρων στην ομάδα του φαρμάκου μειώθηκε σημαντικά και ο ιστός ήταν άθικτος μετά τη θεραπεία με βερμπασκοσίδη. Επιπλέον, ο αριθμός των βακτηρίων που αποικίστηκαν στους μύες των ποδιών μειώθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με βερμπασκοσίδη. Όπως φαίνεται στα αποτελέσματα του πειράματος, το 93,33 τοις εκατό των μολυσμένων ποντικών πέθαναν 32 ώρες μετά τη μόλυνση. Όπως αναμενόταν, το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών που έλαβαν βερμπασκοσίδη αυξήθηκε κατά 33,33 τοις εκατό , καθώς μόνο το 60 τοις εκατό των μολυσμένων ποντικών πέθανε (P=0.015 από μια δοκιμή λογαριασμών). Επιπλέον, η θεραπεία με βερμπασκοσίδη καθυστέρησε την κορύφωση της περιόδου θανάτου κατά σχεδόν 8 ώρες (από 32 ώρες για τα ποντίκια που είχαν μολυνθεί με ATCC σε 40 ώρες για τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με βερμπασκοσίδη) και θα μπορούσε έτσι να παρατείνει τον πολύτιμο χρόνο που απαιτείται για την κλινική διάσωση. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε ποντίκια, η βερμπασκοσίδη μπορεί να παρέχει συστημικά αποτελεσματική προστασία έναντι της αέριας γάγγραινας που προκαλείται από το C. perfringens.

Ως gram-θετικό αναερόβιο βακτήριο, το C. perfringens είναι ευρέως κατανεμημένο στη φύση και μπορεί να εκκρίνει μια ποικιλία τοξινών, που μπορεί να οδηγήσει σε μια ποικιλία ασθενειών σε ανθρώπους και ζώα, συμπεριλαμβανομένης της αέριας γάγγραινας (Fraser and Collee, 1975; Verherstraeten et al. ., 2015). Η αέρια γάγγραινα προκαλείται κυρίως από το συνδυασμό των τοξινών α και θήτα που εκκρίνει το C. perfringens, το οποίο μπορεί να οδηγήσει στο θάνατο μολυσμένων ζώων, με αποτέλεσμα μεγάλες οικονομικές απώλειες. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, αποτελεσματικές μέθοδοι για τη θεραπεία της αέριας γάγγραινας περιλαμβάνουν το υπερβαρικό οξυγόνο, τη χειρουργική επέμβαση και τα αντιβιοτικά. Μεταξύ αυτών, η χειρουργική επέμβαση μπορεί να προκαλέσει σημαντική σωματική βλάβη στους ασθενείς και να έχει πολύ δυσάρεστο αντίκτυπο στη μετεγχειρητική ζωή. Πολυάριθμα γονίδια αντοχής στην τετρακυκλίνη έχουν βρεθεί σε απομονώσεις C. perfringens από τη Σουηδία, τη Νορβηγία, τη Δανία και άλλα μέρη. Έτσι, χρειάζονται νέες στρατηγικές ή παράγοντες για την καταπολέμηση αυτής της βακτηριακής λοίμωξης (Park et al., 2010· Osman and Elhariri, 2013). Σε αυτή τη μελέτη, το φαινυλοπροπανοειδές βερμπασκοσίδη, το οποίο διαφέρει από τις παραδοσιακές αντιβακτηριακές θεραπείες (αντιβιοτικά), θα μπορούσε να αναστείλει την αιμολυτική δράση τόσο του CPA όσο και του PFO, δύο σημαντικών τοξινών που σχηματίζουν πόρους που συμβάλλουν καθοριστικά στην παθογένεια του C. perfringens. Σε κυτταρικό επίπεδο, η βερμπασκοσίδη θα μπορούσε επίσης να προστατεύσει αποτελεσματικά τα κύτταρα Caco-2 από αυτές τις δύο τοξίνες σε χαμηλές συγκεντρώσεις (0.25-2 ig/mL). Συγκεκριμένα, η βερμπασκοσίδη θα μπορούσε να μειώσει τις δραστηριότητες των τοξινών αναστέλλοντας τον ολιγομερισμό του PFO. Αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να παρέχουν επαρκή βασικά δεδομένα για in vivo έρευνα.