Οι αντιγηραντικές επιδράσεις της Ludwigia Octovalvis σε ποντίκια Drosophila Melanogaster και SAMP8 Μέρος 1

ΑφηρημένηΕρευνήσαμε τις αντιγηραντικές επιδράσεις του Ludwigia octovalvis (Jacq.) Το PH Raven (Onagraceae), είναι ένα εκχύλισμα που καταναλώνεται ευρέως ως υγιεινό ποτό σε πολλές χώρες. Χρησιμοποιώντας τη μύγα των φρούτων, Drosophila melanogaster, ως πρότυπο οργανισμό, δείξαμε ότι το εκχύλισμα L. octovalvis (LOE) επέκτεινε σημαντικά τη διάρκεια ζωής της μύγας σε μια δίαιτα υψηλή, αλλά όχι χαμηλή σε θερμίδες, υποδεικνύοντας ότι το LOE μπορεί να ρυθμίσει τη διάρκεια ζωής μέσω ενός διατροφικού περιορισμού ( DR)-σχετιζόμενη οδός. Το LOE εξασθένησε επίσης τη σχετιζόμενη με την ηλικία γνωστική έκπτωση τόσο στις μύγες όσο και στο ποντίκι 8 (SAMP8) με επιρρεπή στη γήρανση, χωρίς να προκαλέσει εμφανείς αρνητικούς συμβιβασμούς, συμπεριλαμβανομένης της πρόσληψης νερού, της πρόσληψης τροφής, της γονιμότητας ή της αυθόρμητης κινητικής δραστηριότητας. Το LOE περιείχε υψηλά επίπεδα πολυφαινολών και φλαβονοειδών, τα οποία διαθέτουν ισχυρή δράση σάρωσης ριζών DPPH και αποδείχθηκε ότι μειώνουν την οξειδωτική βλάβη και τη θνησιμότητα που προκαλείται από το paraquat στις μύγες. Οι αναλύσεις αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC-MS) εντόπισαν 17 γνωστά μόρια, εκ των οποίων η σιτοστερόλη και το σκουαλένιο ήταν τα δύο πιο άφθονα. Περαιτέρω αποδείξαμε ότι η -σιτοστερόλη θα μπορούσε να παρατείνει τη διάρκεια ζωής, πιθανώς μέσω της ενεργοποίησης της ενεργοποιημένης από AMP πρωτεϊνικής κινάσης (AMPK) στο λιπώδη σώμα των ενήλικων μυγών. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το LOE είναι μια ισχυρή αντιγηραντική παρέμβαση με δυνατότητα θεραπείας διαταραχών που σχετίζονται με την ηλικία.

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και μπορεί να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου, να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες και επίσης έχει μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο cistanches herba

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Λέξεις-κλειδιάLudwigia octovalvis. Ο διατροφικός περιορισμός. Διάρκεια ζωής. AMPK

Εισαγωγή

Η κατανόηση της γήρανσης είναι μια μεγάλη πρόκληση της εποχής μας, δεδομένων των δημογραφικών τάσεων και των προβλεπόμενων βαρών μιας κοινωνίας μεγαλύτερης ηλικίας. Μελέτες που διερευνούν ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία, όπως οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες, οι καρκίνοι και οι καρδιαγγειακές παθήσεις, έχουν ήδη δώσει σημαντικές γνώσεις για τη γήρανση του ανθρώπου. Ο διαιτητικός περιορισμός (DR), με μείωση της πρόσληψης θερμίδων χωρίς υποσιτισμό ή αλλαγή στην ισορροπία των διαιτητικών συστατικών, είναι γνωστό ότι είναι η πιο αποτελεσματική παρέμβαση για την παράταση της υγιούς διάρκειας ζωής σε όλα τα είδη, από μαγιά έως μύγες και θηλαστικά (Lin et al. 2000; Wood et al. 2004· Bonkowski et al. 2006· Wu et al. 2013). Στα τρωκτικά, το DR μπορεί να αυξήσει σημαντικά τη διάρκεια ζωής σε κανονικά ποντίκια και βραχύβια επιρρεπή στη γήρανση 8 (SAMP8) ποντίκια (Weinduch and Walford 1982; Choi and Kim 2000; Simons et al. 2013). Στις μύγες, μπορεί επίσης να παρατηρηθεί μια εντυπωσιακή επέκταση της διάρκειας ζωής (Zheng et al. 2005; Soh et al. 2013). Αν και μελέτες σε πρωτεύοντα θηλαστικά (πίθηκος rhesus) δεν έχουν ακόμη δώσει οριστικά αποτελέσματα σχετικά με την επίδραση της DR στη θνησιμότητα, είναι σαφές ότι η DR σε πιθήκους παράγει ευεργετικά φυσιολογικά αποτελέσματα παρόμοια με εκείνα που παρατηρούνται σε τρωκτικά και μύγες (Colman et al. 2009; Mattison et al. al. 2012). Έχει αποδειχθεί ότι η επιμήκυνση της διάρκειας ζωής με DR πιθανώς προκαλείται μέσω πολλών γενετικών οδών που περιλαμβάνουν την αίσθηση και το μεταβολισμό των θρεπτικών ουσιών, όπως η ινσουλίνη/IGF, οι sirtuins (Sir), η SKN-1, ο στόχος της ραπαμυκίνης και η ενεργοποιημένη από AMP κινάση πρωτεΐνης (AMPK) μονοπάτια (Lin et al. 2000; Kaeberlein et al. 2005; Bishop and Guarente 2007; Alcedo and Kenyon 2004; Stenesen et al. 2013). Φαίνεται ότι οι Sir2/Sirt1 (Lin et al. 2004) και AMPK (Xiao et al. 2011) μπορούν να ενεργοποιηθούν με αυξημένες αναλογίες AMP/ATP, ADP/ATP ή NAD/NADH, αντανακλώντας χαμηλότερη κυτταρική ενεργειακή κατάσταση. Αυτά, με τη σειρά τους, προκαλούν μια σειρά γεγονότων σηματοδότησης κατάντη που μετατρέπουν τη μεταβολική κατάσταση των κυττάρων από την κατανάλωση ενέργειας στην αποθήκευση και παραγωγή ενέργειας.

Δεδομένων των πρακτικών ορίων για τους ανθρώπους στην άσκηση του DR στην καθημερινή καθημερινή ζωή, η ανάπτυξη των μιμητικών DR έχει αναδειχθεί ως ένα συναρπαστικό πεδίο για την έρευνα κατά της γήρανσης. Τα συμπληρώματα διατροφής που περιέχουν θρεπτικές ενώσεις ή φυτικά εκχυλίσματα μπορεί να είναι σε θέση να παρέχουν ασφαλείς και αποτελεσματικές παρεμβάσεις για την παράταση της υγιούς ζωής. Εκχυλίσματα φρούτων από νεκταρίνια και μήλα, καθώς και εκχυλίσματα βοτάνων από Rhodiola rosea και Curcuma longa, έχει ήδη αποδειχθεί ότι παρατείνουν τη διάρκεια ζωής στις μύγες των φρούτων, μέσω της μείωσης της οξειδωτικής βλάβης (Boyd et al. 2011; Peng et al. 2011; Schriner et al. 2009· Lee et al. 2010· Schriner et al. 2013). Τα κύρια συστατικά που προσδιορίζονται σε αυτά τα φυτά που προάγουν την υγεία ως πιθανά υποψήφια για τις επιδράσεις που επιμηκύνουν τη διάρκεια ζωής είναι οι πολυφαινόλες, οι οποίες έχουν τη δυνατότητα να δρουν ως σαρωτές ελεύθερων ριζών ή ως δραστικές ως προς την οξειδοαναγωγή χηλικές ουσίες μετάλλων (Galleano et al. 2010). Η ρεσβερατρόλη, μια πολυφαινολική ένωση που βρίσκεται σε μεγάλο βαθμό στη φλούδα των κόκκινων σταφυλιών, είναι το πιο γνωστό παράδειγμα αυτής της κατηγορίας μορίων και έχει αποδειχθεί ότι παρατείνει τη διάρκεια ζωής ειδών τόσο εξελικτικά απομακρυσμένων όσο οι Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanobranchius και Nothobranchius, furzeri (Howitz et al. 2003; Wood et al. 2004; Valenzano et al. 2006). Αν και οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες της ρεσβερατρόλης έχουν αποδειχθεί, τα συσσωρευμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι αυτή η ένωση μπορεί επίσης να δράσει ως ισχυρός ενεργοποιητής για πολλά γονίδια που σχετίζονται με τη μακροζωία, συμπεριλαμβανομένου του Sir2/Sirt1 που αναφέρθηκε παραπάνω (Hubbard et al. 2013).

Ludwigia octovalvis (Jacq.) PH Το Raven (Onagraceae) έχει ευρεία εξάπλωση σε τροπικές περιοχές πολλών χωρών σε όλο τον κόσμο. Αν και η πλήρης χημική σύνθεση του L. octovalvis δεν έχει περιγραφεί πλήρως, αυτό το φυτό έχει μακρά ιστορία χρήσης ως φυτικό φάρμακο για τη θεραπεία διαφόρων καταστάσεων, όπως οιδήματα, νεφρίτιδα και υπόταση. Μεγάλοι πληθυσμοί στην Ασία καταναλώνουν εκχύλισμα L. octovalvis (LOE) ως υγιεινό ποτό καθημερινά. Η τοξικολογική αξιολόγηση σε ποντίκια έχει προτείνει ότι η χρόνια θεραπεία με LOE μπορεί να παρέχει ανοσορυθμιστικές, ηπατοπροστατευτικές και καρδιαγγειακές προστατευτικές ιδιότητες, χωρίς παρατηρήσιμες παρενέργειες (Kadum Yakob et al. 2012). Επιπλέον, το LOE έχει αναφερθεί ότι έχει αντιβακτηριακή και αντικαρκινική δράση (Chen et al. 1989· Chang et al. 2004). Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τις αντιγηραντικές επιδράσεις του LOE, χρησιμοποιώντας τόσο μύγες φρούτων όσο και ποντίκια SAMP8 ως πρότυπο οργανισμούς. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το LOE μπορεί να αναπτυχθεί ως παρέμβαση κατά της γήρανσης.

Μέθοδοι

Προετοιμασία LOE

Ολόκληρα φυτά του L. octovalvis συλλέχθηκαν συνήθως κατά τη θερινή περίοδο και τα αποξηραμένα φυτά ελήφθησαν από τον τοπικό Σταθμό Βελτίωσης Γεωργίας και την Taiwan Herbal Biopharma Company Ltd. στην Ταϊβάν. Ο ποιοτικός έλεγχος για το L. octovalvis παρακολουθήθηκε από την Taiwan Herbal Biopharma Company Ltd. και ένα δείγμα κουπονιού (Αριθ. 034) κατατέθηκε στο ερμπάριο της Hsiehyu Biotech Company Ltd. Για την παρασκευή LOE, 100 g σκόνης L. octovalvis εμποτίστηκαν σε 400 ml αιθανόλης 95 τοις εκατό όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς και στη συνέχεια εκχυλίστηκε δύο φορές στους 55 βαθμούς για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε (στα 8,000×g για 5 λεπτά) και διηθήθηκε (TOYO Νο. 1) για να αφαιρεθούν τα υπολείμματα. Το LOE λήφθηκε μετά από διαδικασία αποσυμπίεσης.

Αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (GC-MS)

Η ανάλυση GC-MS του LOE διεξήχθη χρησιμοποιώντας αέριο χρωματογράφο HP- 6890 και ανιχνευτή εκλεκτικής μάζας HP-5973 (MSD, Agilent Technologies), εξοπλισμένο με στήλη τριχοειδούς αερίου χρωματογραφίας HP-5MS (12,5 m×0.2 mm ID, 0.33 μm πάχος φιλμ) (J&W Scientific). Ο όγκος έγχυσης ήταν 2 ul σε λειτουργία χωρίς διαχωρισμό και η θερμοκρασία εισόδου ήταν 290 βαθμοί . Ως φέρον αέριο χρησιμοποιήθηκε ήλιο (ταχύτητα ροής 0,6 ml/min) και η θερμοκρασία του φούρνου προγραμματίστηκε ως εξής: αρχική θερμοκρασία: 35 βαθμούς, αυξήθηκε κατά 5 βαθμούς/λεπτό στους 90 βαθμούς, στη συνέχεια κατά 10 βαθμούς/λεπτό στους 200 βαθμούς , και τέλος κατά 20 μοίρες /λεπτό σε 290 μοίρες, όπου διατηρήθηκε για 8 λεπτά. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε λειτουργία EI, με τάση ιονισμού σταθερή στα 70 eV. Η λήψη σάρωσης (m/z 45-550) του MSD πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό HP Chemistation.

2,2-Διφαινυλ-1-πικρυυλυδραζυλ (DPPH) ριζική σαρωτική δραστηριότητα και συνολική περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες και φλαβονοειδή

Η δραστηριότητα δέσμευσης ριζών DPPH μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως (Brand-Williams et al. 1995). Εν συντομία, 100 ul διαφορετικών συγκεντρώσεων LOE, ασκορβικού οξέος, ρεσβερατρόλης, σκουαλενίου ή - σιτοστερόλης (Sigma) προστέθηκαν σε 200 ul 100 μM DPPH σε 96-πλάκες μικροβυθισμάτων για να επιτευχθούν οι τελικές συγκεντρώσεις των 0, 1, 5, 10 και 50 ug/ml. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μια μείωση στην απορρόφηση μετρήθηκε στα 520 nm σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (AccuReader 965). Τα συνολικά φαινολικά συστατικά του LOE προσδιορίστηκαν με το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu, χρησιμοποιώντας γαλλικό οξύ ως πρότυπο (Slinkard and Singleton 1977). Ολόκληρη η περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή μετρήθηκε με χρωματομετρικό προσδιορισμό χλωριούχου αργιλίου, με τη ρουτίνη να χρησιμοποιείται ως πρότυπο (Shih et al. 2010).

Κυτταρική καλλιέργεια και αναλύσεις Western blot

Κύτταρα Drosophila Schneider (S2) αναπτύχθηκαν στους 25 βαθμούς σε μέσο Schneider's Drosophila (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό απενεργοποιημένου με θερμότητα (Gibco). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις LOE και -σιτοστερόλης (Sigma) υπό κανονικές (1× μέσο, ​​όπως παραπάνω) συνθήκες ανάπτυξης ή υπό συνθήκες DR (0,5× μέσο, ​​1:1 αραίωση του μέσου 1× σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά ( PBS)) για 12 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης φωσφόρου-ΑΜΡΚ και -τουμπουλίνης (αντισώματα από την τεχνολογία Cell Signaling Technology) αναλύθηκαν με στύπωμα Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Wang et al. 2005).

Δοκιμασίες για μύγες και διάρκεια ζωής

Οι μετοχές Canton-S (CS), w1118, fat body GeneSwitch driver S106 (Bloomington Stock Center #8151) και UASAMPK.RNAi (Bloomington Stock Center #32371) αυξήθηκαν σε τυπικά τρόφιμα σακχαρόζης/μαγιά/καλαμποκάλευρο . Οι παρθένες S106 διασταυρώθηκαν με αρσενικά UASAMPK.RNAi σε πειράματα κλονισμού AMPK. Για δοκιμές διάρκειας ζωής, μύγες που είχαν κλείσει μέσα σε 48 ώρες (περίπου 100 αρσενικά και 100 θηλυκά) μεταφέρθηκαν σε ένα κλουβί πληθυσμού 1-l και διατηρήθηκαν σε επωαστήρα με υγρασία, ελεγχόμενη θερμοκρασία με 12-h on/ κύκλος σβησίματος φωτός στις 25 μοίρες (Wang et al. 2009). Παρέχονταν φρέσκα τρόφιμα κάθε δεύτερη μέρα και βαθμολογούνταν ο αριθμός και το φύλο των νεκρών μυγών. Οι τροφές με πολλές και λίγες θερμίδες περιείχαν 15 ή 5 τοις εκατό τόσο δεξτρόζης όσο και μαγιάς, αντίστοιχα. Άγαρ δύο τοις εκατό και 0,23 τοις εκατό Tegosept (Apex) προστέθηκαν σε όλα τα τρόφιμα. Στα τρόφιμα που περιγράφονται σε κάθε πείραμα προστέθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις LOE, σκουαλενίου, -σιτοστερόλης, RU486 (Mifepristone, Sigma) ή ελέγχου φορέα.

Σίτιση, γονιμότητα και αυθόρμητη κινητική δραστηριότητα των μυγών

Οι μύγες δέκα ημερών που διατηρήθηκαν σε τροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε θερμίδες που περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις LOE μεταφέρθηκαν σε φρέσκα φιαλίδια της ίδιας τροφής, με την προσθήκη 0.5 τοις εκατό FD&C αρ. 1 μπλε διατροφική βαφή. Μετά από 24 ώρες, 10 μύγες ομογενοποιήθηκαν σε ένα μόνο σωληνάριο που περιείχε PBS και η ποσότητα της χρωστικής που λαμβάνεται προσδιορίστηκε με φασματοφωτόμετρο για απορρόφηση της βαφής στα 625 nm. Η γυναικεία γονιμότητα προσδιορίστηκε με ημερήσια καταμέτρηση των αυγών που παράγονται από τρία ζεύγη ζευγαρώματος. Οι μύγες περνούσαν καθημερινά σε νέα φιαλίδια που περιείχαν κατάλληλη τροφή και ο αριθμός των αυγών που γεννήθηκαν καταμετρούνταν και καταγραφόταν για τις πρώτες 20 ημέρες της ενήλικης ζωής. Για την παρακολούθηση των επιπέδων δραστηριότητας, γυάλινα φιαλίδια που περιείχαν μία μόνο αρσενική μύγα στην κατάλληλη πηγή τροφής τοποθετήθηκαν σε θαλάμους καταγραφής κίνησης που έχουν κυκλικούς δακτυλίους πηγών υπέρυθρου φωτός. Τα διαλείμματα δέσμης καταγράφονται ως δραστηριότητα (TriKinetics). Τα δεδομένα καταγράφονταν κάθε 20 δευτερόλεπτα σε περίοδο 72- ωρών. Οι συσκευές παρακολούθησης δραστηριότητας στεγάστηκαν στον επωαστήρα που περιγράφηκε παραπάνω.

Παβλοβιανή οσφρητική συνειρμική βραχυπρόθεσμη μνήμη των μυγών

Οι μύγες σε διαφορετικές ηλικίες εκπαιδεύτηκαν με έκθεση σε ηλεκτροσόκ (70 V) που συνδυάστηκε με μία οσμή για 60 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, οι μύγες εκτέθηκαν σε μια δεύτερη οσμή χωρίς ηλεκτροσόκ για 60 δευτερόλεπτα. Οι μύγες αφέθηκαν να ξεκουραστούν για 45 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμή λαβύρινθου Τ για 2 λεπτά, στην οποία έπρεπε να επιλέξουν μεταξύ των δύο μυρωδιών. Οι οσμές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μεθυλοκυκλοεξανόλη (1:1, 000 αραίωση σε ορυκτέλαιο) και ή οκτανόλη (1,5:1,000 αραίωση σε ορυκτέλαιο). Για όλα τα πειράματα, πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον πέντε συνεδρίες για κάθε ζεύγος οσμή-ηλεκτροσόκ. Όλα τα δεδομένα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και εμφανίζονται ως ποσοστό του δείκτη μνήμης για κάθε ομάδα. Ο δείκτης απόδοσης υπολογίστηκε αφαιρώντας τον αριθμό των μυγών που εισέρχονταν στον βραχίονα στον οποίο η μυρωδιά ζευγαρώθηκε με το ηλεκτροσόκ από τον αριθμό που εισήλθε στον αντίθετο βραχίονα, όπου η οσμή δεν συνδυάστηκε με το ηλεκτροσόκ, και διαιρώντας με τον συνολικό αριθμό των μυγών.

Οξειδωτικό στρες που προκαλείται από paraquat και προσδιορισμός 4-υδροξυ-2-ονομαστικής (HNE)

Οι μύγες δέκα ημερών που διατηρήθηκαν σε τροφή με πολλές θερμίδες που περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις LOE μεταφέρθηκαν σε φιαλίδια με διηθητικό χαρτί εμποτισμένο σε διάλυμα 0 ή 20 mM paraquat και 6 τοις εκατό δεξτρόζης. Ο αριθμός των νεκρών μυγών καταμετρούνταν κάθε 3 έως 4 ώρες. Στις 12 ώρες, συλλέχθηκαν μερικές από τις μύγες που υποβλήθηκαν σε αγωγή με paraquat και η HNE μετρήθηκε με το κιτ ELISA Adduct OxiSelect™ HNE (Cell Biolabs), σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή.

Των ζώων

Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα ακολουθούσαν τους τοπικούς κανονισμούς για τη δεοντολογία των ζώων. Τα ποντίκια SAMP8 εκτράφηκαν και διατηρήθηκαν στο Modular Animal Caging System® (Alternative Design) και η τροφή τους αποστειρώθηκε με ακτινοβολία γάμμα. Το δωμάτιο είχε έναν κύκλο φωτός 12-h on/off, με τη σκοτεινή φάση να ξεκινά στις 8 μ.μ. Για τα ποντίκια, το LOE προστέθηκε στο πόσιμο νερό σε τελικές συγκεντρώσεις 0, 50 και 100 ug/ ml. Η πρόσληψη τροφής, η κατανάλωση νερού και η αλλαγή στο σωματικό βάρος παρακολουθούνταν τακτικά.

Παρασκευή RNA, σύνθεση cDNA και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR)

Ολικό RNA παρασκευάστηκε από τουλάχιστον 30 μύγες χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen). Το RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DNase και μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας oligo-d(T)15 (Invitrogen) και ανάστροφη μεταγραφάση SuperScript III (Invitrogen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Chou et al. 2013). Οι αντιδράσεις qPCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συστήματα PCR πραγματικού χρόνου StepOnePlus (Applied Biosystems), SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) και ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές ήταν CAAG AGCTATCTGCCTCGACTTCAA και CACATTTCGA AAAACTCCATGATGAT και CATCAGATGATGATGATGATGATGATGATGA TGTCGCTG AAGAAGTC για GAPDH. Διεξήχθη μια αντίδραση PCR δύο σταδίων με μετουσίωση στους 95 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση και επέκταση σε συνδυασμό στους 60 βαθμούς για 1 λεπτό σε σύνολο 40 κύκλων. Το επίπεδο έκφρασης mRNA κάθε γονιδίου στόχου σε σύγκριση με το GAPDH ποσοτικοποιήθηκε με αφαίρεση: Cttarget − CtGAPDH=ΔCt. Μια διαφορά ενός κύκλου PCR ισοδυναμεί με διπλή αλλαγή στο επίπεδο έκφρασης του mRNA. Η μοναδικότητα των αμπλικονίων επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας καμπύλες διάστασης.

Νέα αναγνώριση αντικειμένων, λαβύρινθος ανυψωμένου Τ και δοκιμές ανοιχτού πεδίου

Για τη δοκιμή αναγνώρισης νέου αντικειμένου, τα ποντίκια εξοικειώθηκαν αρχικά σε ένα ανοιχτό κουτί (50 cm×25 cm×50 cm) για 10 λεπτά την ημέρα για δύο συνεχόμενες ημέρες, χωρίς να υπάρχουν αντικείμενα. Την τρίτη ημέρα, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στο κουτί για 2 λεπτά και στη συνέχεια παρουσιάστηκαν δύο παρόμοια αντικείμενα σε κάθε ποντίκι. Ο χρόνος που αφιερώθηκε στην εξερεύνηση κάθε αντικειμένου καταγράφηκε κατά την επόμενη 5-λεπτή περίοδο (που ορίζεται ως η προπόνηση). Στη συνέχεια, τα ποντίκια επέστρεψαν στο κλουβί του σπιτιού τους. Μία, δύο ή τρεις ώρες αργότερα, τα ίδια ζώα δοκιμάστηκαν ξανά για 5 λεπτά στο κουτί με ένα οικείο και νέο αντικείμενο (που ορίζεται ως η συνεδρία δοκιμής μνήμης). Ο δείκτης διάκρισης αντικειμένων υπολογίστηκε αφαιρώντας τον χρόνο που αφιερώθηκε στην εξερεύνηση ενός οικείου αντικειμένου από τον χρόνο που αφιερώθηκε στην εξερεύνηση ενός νέου αντικειμένου και διαιρώντας τον με τον συνολικό χρόνο που αφιερώθηκε στην εξερεύνηση και των δύο αντικειμένων.

Ο λαβύρινθος ανυψωμένου Τ τροποποιήθηκε από προηγούμενες μελέτες (Cruz-Morales et al. 2008; De-Mello and Carobrez 2002; Maia et al. 2010; Santos et al. 2006; Takahashi et al. 2005). Αποτελούνταν από έναν βραχίονα που περικλείεται από τοίχους ύψους 15 cm, κάθετους σε δύο αντίθετους ανοιχτούς βραχίονες. Οι τρεις βραχίονες είχαν ίσες διαστάσεις (30 cm×5 cm) και ολόκληρη η συσκευή ήταν ανυψωμένη 50 cm πάνω από το πάτωμα. Την ημέρα της εκπαίδευσης, κάθε ποντίκι τοποθετήθηκε στο περιφερικό άκρο του κλειστού βραχίονα, στραμμένο προς τη διασταύρωση των βραχιόνων, και του αφέθηκε να εξερευνήσει τον κλειστό βραχίονα. Η δοκιμή τελείωσε όταν το ποντίκι είτε μπήκε στα ανοιχτά μπράτσα (και τα τέσσερα πόδια ήταν στην περιοχή του ανοιχτού βραχίονα) είτε παρέμεινε στον κλειστό βραχίονα για 300 δευτερόλεπτα. Ο αριθμός των δοκιμών που απαιτούνται για την επίτευξη του κριτηρίου αποφυγής χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της μαθησιακής ικανότητας των ποντικών κατά τη διάρκεια των εκπαιδευτικών συνεδριών. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τις προπονήσεις, τα ποντίκια επανεκτέθηκαν στον κλειστό βραχίονα και ο χρόνος που παρέμειναν στον κλειστό βραχίονα καταγράφηκε ως αξιολόγηση της διατήρησης μνήμης.

Η δοκιμή ανοιχτού πεδίου πραγματοποιήθηκε σε ανοιχτό κουτί (50 cm×25 cm×50 cm). Κάθε ποντίκι τοποθετήθηκε στο κέντρο του ανοιχτού πεδίου και του αφέθηκε να εξερευνήσει ελεύθερα τη συσκευή για 1 ώρα. Η κατεύθυνση και η ταχύτητα ταξιδιού κάθε ποντικιού καταγράφηκαν με αυτοματοποιημένη παρατήρηση (Διαγνωστικά και Ερευνητικά Όργανα).

Αποτελέσματα

Η επέκταση της διάρκειας ζωής που προκαλείται από το LOE σχετίζεται με DR

Για να ελέγξουμε εάν το LOE έχει αντιγηραντική δράση in vivo, εξετάσαμε πρώτα τη διάρκεια ζωής των μυγών CS που εκτρέφονται σε τρόφιμα που περιέχουν διαφορετικές συγκεντρώσεις LOE. Οι αρσενικές μύγες CS σε τροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε θερμίδες είχαν μέση διάρκεια ζωής 41,5 ημέρες και η προσθήκη 50, 100 και 1,000 ug/ml LOE στις τροφές μυγών επέκτεινε τη διάρκεια ζωής των αρσενικών μυγών κατά 8,9, 16,1 και 9,6 τοις εκατό, αντίστοιχα (Εικ. 1α και Πίνακας 1). Οι θηλυκές μύγες CS με τροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε θερμίδες είχαν μέση διάρκεια ζωής μόνο 32,2 ημέρες, μικρή σε σύγκριση με τις αντίστοιχες αρσενικές τους. Ωστόσο, το LOE προκάλεσε ακόμη μεγαλύτερη επέκταση της διάρκειας ζωής στις θηλυκές μύγες CS, όπου 100 ug/ml LOE είχαν τη μεγαλύτερη επίδραση (24,2 τοις εκατό επέκταση, Εικ. 1β και Πίνακας 1) και 100 ug/ml LOE επέκτεινε επίσης τη διάρκεια ζωής τόσο στους αρσενικούς όσο και στους Το θηλυκό w1118 πετά, υποδηλώνοντας ότι η παρατεταμένη διάρκεια ζωής του LOE δεν περιορίζεται στο γενετικό υπόβαθρο CS (Εικ. 1c, d και Πίνακας 1).

Δεδομένου ότι το DR είναι μια καλά τεκμηριωμένη παρέμβαση για την παράταση της διάρκειας ζωής, θέλαμε να ελέγξουμε εάν τα αποτελέσματα μακροζωίας του LOE θα αλλοιωθούν από το DR. Οι αρσενικές και οι θηλυκές μύγες CS που εκτράφηκαν με τροφές χαμηλών θερμίδων εμφάνισαν 17,8 και 49,4 τοις εκατό αυξήσεις στη μέση διάρκεια ζωής, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τις μύγες CS που εκτράφηκαν με τροφές με πολλές θερμίδες (Εικ. 1e, f και Πίνακας 1). Ωστόσο, το LOE δεν προκάλεσε παράταση της διάρκειας ζωής πάνω από αυτό που έχει ήδη παρατηρηθεί για τις μύγες ελέγχου σε τρόφιμα χαμηλών θερμίδων (Εικ. 1e, f και Πίνακας 1), γεγονός που υποδηλώνει μια σχέση μεταξύ της επέκτασης της διάρκειας ζωής που προκαλείται από το LOE, υπονοώντας ότι αυτές οι παρεμβάσεις μπορεί να ενεργούν, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω των ίδιων οδών.

Η χρόνια θεραπεία LOE δεν προκαλεί αρνητικές ανταλλαγές

Δεδομένου ότι η επέκταση της διάρκειας ζωής που προκαλείται από το LOE συνδέεται δυνητικά με την οδό DR, εξετάσαμε εάν το LOE μπορεί να μειώσει την πρόσληψη τροφής στις μύγες και να οδηγήσει σε κατάσταση παρόμοια με DR. Παρακολουθήσαμε την πρόσληψη τροφής των μυγών χρησιμοποιώντας ένα τυπικό σύστημα προσθήκης βαφής στην τροφή τους (Wang et al. 2009). Κατά μέσο όρο, οι θηλυκές μύγες CS κατανάλωναν πολύ περισσότερη τροφή σε σύγκριση με τα αρσενικά που ταιριάζουν με την ηλικία, αλλά δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην πρόσληψη τροφής μεταξύ των μυγών ελέγχου και των μυγών που έλαβαν θεραπεία με LOE για οποιοδήποτε από τα δύο φύλα (Εικ. 2α).

Εκτός από τη μειωμένη πρόσληψη τροφής, οι παρεμβάσεις που παρατείνουν τη διάρκεια ζωής μπορεί να περιλαμβάνουν αρνητικές ανταλλαγές, όπως μειωμένη γονιμότητα και σωματική δραστηριότητα (Flatt et al. 2008; Wang et al. 2009; Sohal and Buchan 1981). Βρήκαμε ότι οι μύγες CS που υποβλήθηκαν σε αγωγή με LOE δεν έδειξαν καμία διαφορά στην παραγωγή αυγών για τις πρώτες 20 ημέρες της ενήλικης ζωής (Εικ. 2β). Τόσο οι μύγες CS που υποβλήθηκαν σε αγωγή με LOE όσο και οι μύγες ελέγχου έδειξαν επίσης φυσιολογικό κιρκάδιο ρυθμό και αυθόρμητη κινητική δραστηριότητα (Εικ. 2γ), όπως σημειώθηκε προηγουμένως (Wang et al. 2009).

Το LOE μειώνει τα ελλείμματα μνήμης που σχετίζονται με την ηλικία σε μύγες φρούτων και ποντίκια SAMP8

Η λειτουργική πτώση των νευρώνων είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό της διαδικασίας γήρανσης. Εξετάσαμε τη λειτουργική μνήμη των μυγών, χρησιμοποιώντας ένα Pavlovian οσφρητικό συσχετιστικό τεστ βραχυπρόθεσμης μνήμης. Οι μύγες CS σε τροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε θερμίδες εμφάνισαν σταδιακή γνωστική πτώση στις πρώτες 20 ημέρες της ενήλικης ζωής (Εικ. 3α). Αυτή η μείωση της μνήμης μετριάστηκε με DR, με μια στατιστικά σημαντική διαφορά που παρατηρήθηκε την ημέρα 20 (Εικ. 3a, b). Το LOE μείωσε επίσης την σχετιζόμενη με την ηλικία μείωση της μνήμης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, με τις μύγες με 100 ug/ml LOE να επιτυγχάνουν επίπεδο επίπεδο παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται για τις μύγες DR (Εικ. 3β).

Ερευνήσαμε περαιτέρω την προγνωστική επίδραση του LOE σε ποντίκια SAMP8, τα οποία είναι γνωστό ότι αναπτύσσουν πρώιμη έναρξη ελλειμμάτων στη μάθηση και τη μνήμη και έχουν αποδειχθεί ότι είναι ένα κατάλληλο μοντέλο για τη μελέτη θεμελιωδών μηχανισμών της νόσου του Alzheimer (Flood and Morley 1992, 1993 Chan et al. 2006, Takeda 2009). Στις δοκιμές αναγνώρισης νέων αντικειμένων, 3-ποντίκια SAMP8 μηνών εμφάνισαν μνήμη σταθερής αναγνώρισης έως και 3 ώρες μετά την προπόνηση, ξοδεύοντας περισσότερο χρόνο στο νέο αντικείμενο σε σύγκριση με το οικείο αντικείμενο (Εικ. 3γ, δ). Αυτή η διατήρηση μνήμης, ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σε 8-ποντίκια SAMP8 μηνών (Εικ. 3c, d). Η προσθήκη LOE (100 ug/ml) στο πόσιμο νερό για 5 μήνες (ξεκινώντας από 3 μηνών) ενίσχυσε σημαντικά τη διατήρηση μνήμης αναγνώρισης των ποντικών SAMP8, ακόμη και στις 3 ώρες μετά την προπόνηση (Εικ. 3δ). Η συμπλήρωση νερού 50 ug/ml LOE είχε λιγότερα ευεργετικά αποτελέσματα, αλλά ήταν σε θέση να βελτιώσει τη διατήρηση της μνήμης για έως και 2 ώρες (Εικ. 3δ).

Στις δοκιμές λαβύρινθου αυξημένου Τ, όλες οι ομάδες ποντικών απαιτούσαν παρόμοιο αριθμό δοκιμών εκπαίδευσης για να φτάσουν στο κριτήριο αποφυγής, υποδηλώνοντας ότι όλα τα ποντίκια είχαν παρόμοιες μαθησιακές ικανότητες (Εικ. 3e). Στις δοκιμές ανάκτησης μνήμης 24-h, μόνο ποντίκια SAMP8 ηλικίας 8-μηνών, αλλά όχι 3-μηνών, παρουσίασαν σημαντικό έλλειμμα στη διατήρηση της μνήμης (Εικ. 3στ). Αυτό το έλλειμμα μνήμης φόβου που σχετίζεται με την ηλικία στα ποντίκια SAMP8 θα μπορούσε επίσης να διασωθεί με ένα 5-μηνιαίο συμπλήρωμα LOE στο πόσιμο νερό (Εικ. 3στ). Οι προγνωστικές επιδράσεις του LOE που παρατηρήθηκαν παραπάνω δεν μπορούν να αποδοθούν σε οποιαδήποτε αλλαγή στη γενική κινητική δραστηριότητα των ποντικών, καθώς δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην ταχύτητα ταξιδιού ή στην απόσταση στις δοκιμές ανοιχτού πεδίου (Εικ. 3g και δεδομένα δεν φαίνονται). Τα ποντίκια SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με LOE 5-μήνα δεν εμφάνισαν καμία επίδραση στην πρόσληψη τροφής ή στην κατανάλωση νερού και καμία αλλαγή στο σωματικό βάρος (Εικ. 3h–j).

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】