Απστρυποκρίνομαι

Ιστορικό: Όλο και περισσότερες μελέτες αναφέρουν τη θεραπευτική επίδραση των εξωσωμάτων που προέρχονται από μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSC) από τα οποία χαρακτηρίζονται η πρωτεΐνη και το miRNA. Ωστόσο, τα προφίλ πρωτεϊνικής και miRNA των εξωσωμάτων που προέρχονται από ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (hESCs) και πολυδύναμα βλαστοκύτταρα που προκαλούνται από τον άνθρωπο (hiPSCs) παραμένουν ασαφή.

Ο γλυκοσίδης του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και πνευμονικούς ιστούς πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και μπορεί να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου, να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες και επίσης έχει μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο Anti-aging Cistanche Powder Bulk

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Μέθοδοι: Σε αυτήν τη μελέτη, απομονώσαμε εξωσώματα από hESCs, hiPSCs και μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (hUC-MSCs) μέσω κλασικής υπερφυγοκέντρησης και ενός φίλτρου 0.{22-μm, ακολουθούμενη από συντηρητική ταυτοποίηση. Η διαδοχική επισήμανση ετικετών μάζας και η ποσοτικοποίηση σχετικών πεπτιδίων χωρίς ετικέτα καθόρισαν μαζί την πρωτεομική τους. Πραγματοποιήθηκε αλληλουχία υψηλής απόδοσης για τον προσδιορισμό των προφίλ miRNA. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση βιοπληροφορικής για να εντοπίσουμε τις κυρίαρχες βιολογικές διεργασίες και μονοπάτια που διαμορφώνονται από φορτία εξωσώματος. Τέλος, το western blot και το RT-qPCR πραγματοποιήθηκαν για την ανίχνευση των πραγματικών φορτίων πρωτεϊνών και miRNA σε τρεις τύπους εξωσωμάτων.

Αποτελέσματα: Με βάση τη μελέτη μας, τα φορτία από τρεις τύπους εξωσωμάτων συμβάλλουν σε εξελιγμένες βιολογικές διεργασίες. Συγκριτικά, τα εξωσώματα hESC (hESC-Exos) ήταν ανώτερα στη ρύθμιση της ανάπτυξης, του μεταβολισμού και της αντιγήρανσης, και τα εξωσώματα hiPSC (hiPSC-Exos) είχαν παρόμοιες βιολογικές λειτουργίες με τα hESC-Exos, ενώ τα εξωσώματα hUC-MSCs (hUC-MSC-Exos). συνέβαλε περισσότερο στη ρύθμιση του ανοσοποιητικού.

συμπεράσματα: Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στη μελέτη μας βοηθούν στον καθορισμό των πρωτεϊνικών και miRNA τοπίων τριών εξωσωμάτων, την πρόβλεψη των βιολογικών τους λειτουργιών μέσω συστηματικής και ολοκληρωμένης ανάλυσης δικτύου σε επίπεδο συστήματος και αποκαλύπτουν τις αντίστοιχες πιθανές εφαρμογές τους σε διαφορετικά πεδία για τη βελτιστοποίηση της επιλογής των εξωσωμάτων σε προκλινικά και κλινικά δοκιμές.

Λέξεις-κλειδιά: Ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, Ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα, Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου, Εξωσώματα, Proteomics, miRNA

Εισαγωγή

Τα εξωκυτταρικά κυστίδια (EVs) είναι μικροσκοπικά κυστίδια που εκκρίνονται ενεργά από κύτταρα, που περιέχουν κυρίως εξωσώματα, μικροκυστίδια (MVs) και αποπτωτικά σώματα [40, 56, 57]. Κατανέμονται ευρέως σε πολλά σωματικά υγρά, όπως το σάλιο, το μητρικό γάλα, το αίμα, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, η χολή και τα ούρα [57]. Μεταξύ αυτών, τα εξωσώματα έχουν λιπιδική διπλοστιβάδα με διάμετρο 40-200 nm, πυκνότητα άνωσης 1,13-1,18 g/ml στη βαθμίδα σακχαρόζης και εμφάνιση σε σχήμα κυπέλλου κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο [21, 53]. Διάφορες βιοδραστικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, των νουκλεϊκών οξέων και των λιπιδίων, παρέχουν τη λειτουργία διακυτταρικής επικοινωνίας των εξωσωμάτων μεταξύ των κυττάρων [16, 17]. Η διπλοστοιβάδα λιπιδίων είναι ένας ευαίσθητος φραγμός που προστατεύει τα περιεχόμενα των εξωσωμάτων από τον ενζυματικό εκφυλισμό του σωματικού υγρού [49]. Σταθερά εξωσώματα μπορούν να μεσολαβήσουν σε περίπλοκες φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες μέσω της παρακρινικής δραστηριότητας, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης οργάνων και αναπαραγωγής, παρουσίασης αντιγόνου, νευρωνικής επικοινωνίας, ανοσοαπόκρισης, ρύθμισης γήρανσης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού [57, 62].

Ο σχηματισμός και η απελευθέρωση των εξωσωμάτων είναι μια πλήρως ρυθμιζόμενη διαδικασία και η ταξινόμηση των περιεχομένων που είναι εγκλωβισμένα σε εξωσώματα πραγματοποιείται με την κινητοποίηση διαφόρων πρωτεϊνών [22, 47]. Πολλαπλές πρωτεΐνες είναι ζωτικής σημασίας για το σχηματισμό εξωσωμάτων, το οποίο περιέχει το σύμπλεγμα ενδοσωμικής ταξινόμησης που απαιτείται για τη μεταφορά (ESCRT), τετρασπανίνες (CD9, CD63 και CD81), γονίδιο που συνδέεται με την απόπτωση 2-αλληλεπιδρούσα πρωτεΐνη X (Alix) και ευαισθησία όγκου γονίδιο 101 (TSG101) [38, 55]. Η ενδοκυτταρική διακίνηση των εξωσωμάτων καθοδηγείται από τη συλλογική δραστηριότητα μιας σειράς πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των μοριακών διακοπτών RAB GTPase και των κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, όπως η ακτίνη και η τουμπουλίνη [24]. Στη συνέχεια, η έκκριση των εξωσωμάτων συμπληρώνεται από το σύμπλεγμα SNARE και την οικογένεια συναπτοταγμίνης [22]. Η έρευνα έχει καθορίσει ότι η εκβλάστηση και η αποβολή των εξωσωμάτων εξαρτώνται από τη δραστηριότητα του ασβεστίου και τη στρατολόγηση ESCRT [15]. Ως αγγελιοφόρος, η απελευθέρωση εξωσωμάτων εμπλέκεται στη διασταύρωση των κυττάρων ως απόκριση στην κυτταρική φυσιολογία και παθολογικές αλλαγές, όπως ενεργοποίηση, αλλαγή pH, υποξία, βλάβη από ακτινοβολία ή κυτταρικό στρες [61].

Για να αποκαλυφθούν τα συστατικά των εξωσωμάτων και οι πιθανές φυσιολογικές και παθολογικές λειτουργίες τους, χρησιμοποιούνται συχνά πρωτεομικές, μεταγραφικές και άλλες τεχνικές για τη μελέτη των εξωσωμάτων RNA και πρωτεϊνών από διαφορετικά είδη, ιστούς και κύτταρα [44]. Η ανάλυση εξωσωμικής πρωτεϊνικής τυπικά περιλαμβάνει τρία στάδια: την απομόνωση, τον καθαρισμό και τον χαρακτηρισμό των εξωσωμάτων, την ταυτοποίηση των πρωτεϊνικών συστατικών χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας και την ανάλυση ακατέργαστων δεδομένων [14]. Η κυτταρική κατάσταση επηρεάζει σημαντικά την πρωτεϊνική σύνθεση και την αφθονία των εξωσωμάτων. Προς το παρόν, χρησιμοποιούνται ποσοτικές πρωτεομικές τεχνικές για την ανάλυση του χαρακτηρισμού και της αφθονίας των πρωτεϊνών για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός που βρίσκεται κάτω από την παραγωγή εξωσωμάτων και να εμβαθύνουν την κατανόησή μας για τους φυσιολογικούς και παθολογικούς ρόλους των εξωσωμάτων στα κύτταρα [39]. Μεταξύ αυτών, χρησιμοποιούνται ευρέως τεχνολογίες ποσοτικής πρωτεϊνικής που βασίζονται στη φασματομετρία μάζας, κυρίως συμπεριλαμβανομένων μεθόδων χωρίς επισήμανση και σημασμένων με σταθερά ισότοπα [13, 42]. Τα miRNA είναι μικρά βιοενεργά μόρια που συνδέονται στενά με διάφορες δραστηριότητες της ζωής. Η τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης χαρακτηρίζεται από υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια και έχει ευρεία εφαρμογή στον προσδιορισμό αλληλουχίας miRNA (18–30 nt) [6]. Δεδομένης της ανάπτυξης της τρέχουσας τεχνολογίας, δεν υπάρχει κανένα εμπόδιο στην ανατομή των προφίλ πρωτεΐνης και miRNA των εξωσωμάτων.

Τα hESC και hiPSCs έχουν υψηλή δυνατότητα διαφοροποίησης [36]. Ωστόσο, η άμεση εφαρμογή τους στη θεραπεία είναι περιορισμένη λόγω του κινδύνου κακοήθειας και ηθικών ζητημάτων [31]. Αντίθετα, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSC) έχουν ευρύτερη εφαρμογή για παρέμβαση σε πολλαπλές ασθένειες σε κλινικές συνθήκες [8]. Ωστόσο, η άμεση χρήση τους εξακολουθεί να αντιμετωπίζει αρκετούς περιορισμούς, όπως χαμηλό ποσοστό επιβίωσης, ανοσολογική απόρριψη και ζητήματα ασφάλειας [8, 43]. Επί του παρόντος, έχει δοθεί μεγάλη προσοχή στα εξωσώματα λόγω της βιοασφάλειας, της σταθερότητάς τους, της μη ανευπλοειδικότητας και της χαμηλής ανοσογονικότητάς τους [51]. Προηγούμενες μελέτες έχουν τεκμηριώσει τη σύγκριση συστατικών των MSC που προέρχονται από διαφορετικούς ιστούς και τα εξωσώματά τους που περιέχουν πρωτεωμικά προφίλ και προφίλ miRNA [59]. Gong et al. απεικόνισε επίσης το ρυθμιστικό δίκτυο των εξωκυττάριων κυστιδίων hESC (EVs) όσον αφορά το πρωτεϊνό, αλλά μόνο σε μονοπάτια που σχετίζονται με τη γήρανση χωρίς εστίαση σε άλλα [19]. Questa et al. υφαίνει τον πρωτεομικό άτλαντα EV των hiPSC που προέρχονται από ινοβλάστες ανθρώπινης ακροποσθίας (HFFs) [45]. Αν και αυτές οι μελέτες έχουν αναφέρει εν μέρει τα πρωτεϊνικά συστατικά των EVs, δεν επικεντρώθηκαν αποκλειστικά στα εξωσώματα και η περιεκτική πρωτεομική τους ανάλυση δεν είναι σαφώς διατυπωμένη. Συγκεκριμένα, τα προφίλ miRNA δεν έχουν ακόμη περιγραφεί. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, τα εξωσώματα που απομονώθηκαν από hESCs, hiPSCs και hUC-MSCs επιλέχθηκαν στην παρούσα μελέτη για περαιτέρω έρευνα στοχεύοντας τα προφίλ πρωτεώματος και miRNA τους για να αποκτήσουν νέες γνώσεις για την έρευνα και την κλινική τους εφαρμογή.

Μέθοδοι

Παρασκευή και χαρακτηρισμός εξωσωμάτων

Τα hESC και τα hiPSC καλλιεργήθηκαν σε μέσο ncTarget (αρ. κατ. RP01020; Nuwacell. Ltd, Κίνα), ενώ η 3η γενιά των hUC-MSC καλλιεργήθηκε σε μέσο hMSC αποστολής χωρίς ορό (αρ. κατ. RP02010, Nuwacell. Ltd, Κίνα). Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν 350 mL του υπερκειμένου των κυττάρων στη φάση λογαριθμικής ανάπτυξης (~80 τοις εκατό συρροή) για καθαρισμό εξωσώματος. Τα εξωσώματα εκχυλίστηκαν με μια σειρά αναγνωρισμένων φυγοκέντρησης και υπερφυγοκέντρησης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34, 52]. Εν συντομία, τα ρυθμισμένα μέσα (CM) συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση βαθμίδωσης (300×g για 10 λεπτά, 2000×g για 15 λεπτά, 10, 000×g για 30 λεπτά) για διαχωρισμό κυτταρικά υπολείμματα. Τα εξωσώματα σφαιροποιήθηκαν από τα συλλεχθέντα υπερκείμενα στους 100, 000×g για 70 λεπτά χρησιμοποιώντας έναν ρότορα Ti45 (Beckman Coulter, ΗΠΑ). Στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε PBS για την επόμενη διήθηση χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο μεμβράνης 0,{21}μm MF-Millipore™ (Sigma, ΗΠΑ). Το διήθημα υποβλήθηκε σε υπερφυγοκέντρηση στα 100,000xg για 70 λεπτά. Το τελικό ίζημα εξωσώματος επαναιωρήθηκε σε PBS για την επόμενη ανάλυση. Ένα σύστημα δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) (Wyatt Technology, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της συγκέντρωσης και του μεγέθους των απομονωμένων εξωσωμάτων.

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM)

Πραγματοποιήθηκε σάρωση TEM για να περιγράψει τη μορφολογία απομονωμένων εξωσωμάτων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα εκ νέου εναιωρημένα εξωσώματα (1 μg σε 10 μΙ PBS) φυτεύτηκαν σε ένα επικαλυμμένο με άνθρακα πλέγμα χαλκού (200-πλέγμα) και αφέθηκαν να προσροφηθούν σε αυτό για 2 λεπτά, ακολουθούμενα από δύο πλύσεις με διπλά απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, τα πλέγματα χρωματίστηκαν αρνητικά με 8 μL διαλύματος οξικού ουρανυλίου 2 τοις εκατό για 1 λεπτό. Μετά από φυσική ξήρανση, τα δείγματα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα Tecnai Spirit (Thermo Fisher, ΗΠΑ) στα 120 kV.

Δυναμική σκέδαση φωτός

Η κατανομή μεγέθους των εξωσωμάτων περιγράφηκε μέσω ανάλυσης παρακολούθησης νανοσωματιδίων χρησιμοποιώντας ένα δυναμικό σκεδαστή φωτός (Wyatt Technology, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (271-DPN), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως[23]. Εν συντομία, το ίζημα εξωσώματος επαναιωρήθηκε σε 100 μL PBS. Δέκα, 50 μL από τα παραπάνω εξωσώματα προστέθηκαν σε 1450 μL PBS και στροβιλίστηκαν για 30 δευτερόλεπτα. Τα εξωσώματα (1,5 mL) μεταφέρθηκαν σε κυψελίδα μιας χρήσης για εξισορρόπηση στους 25 βαθμούς για 30 δευτερόλεπτα. Η τιμή του δείκτη διάθλασης του μέσου διασποράς ήταν 1,37 και τόσο ο μέσος όρος Ζ όσο και η πολυδιασπορά (PDI) καθόρισαν το μέγεθος των σωματιδίων του εξωσώματος. Ελήφθησαν μετρήσεις ανεξάρτητες από το δέντρο για κάθε δείγμα.

Σήμανση Tandem Tag Mass (TMT) και ανάλυση σχετικής ποσοτικοποίησης πεπτιδίων (LFQ) χωρίς ετικέτα

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 και Π<0.05) and label-free (at least two tests results>0 και P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), καθώς και στατιστική σημασία (Σ<0.05), were classified as enriched in exosomes.

Ανάλυση προφίλ miRNA

Το ολικό RNA εξήχθη από απομονωμένα εξωσώματα χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης miRNA mirVana™ (αρ. κατ. AM1560, Thermo Fisher, ΗΠΑ). Τα δείγματα RNA υποβλήθηκαν σε ποιοτική επιθεώρηση για τον προσδιορισμό μικροσυστοιχίας miRNA που πραγματοποιήθηκε από την LC-Bio Technology Co., Ltd. Η ανάλυση των ακατέργαστων δεδομένων πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [9]. Τα διαφορικά εκφρασμένα miRNA επιλέχθηκαν ως υποψήφια miRNA σε τιμή p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) και μέγιστη ελεύθερη ενέργεια<−10 (miRanda).

Βιοπληροφορική ανάλυση

Τα ακατέργαστα δεδομένα υποβλήθηκαν σε ανάλυση χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού Maxquant (v1.6.0) και τα δεδομένα του Swiss-Prot_Ανθρώπινα δεδομένα ορίστηκαν ως αναφορά (20.600 πρωτεΐνες) (Proteome ID: UP000005640) . Οι ταυτοποιημένες πρωτεΐνες χαρτογραφήθηκαν στην Οντολογία Γονιδίων (GO) και στην Εγκυκλοπαίδεια Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG) με βάση τους όρους ανάλυσης KOBAS [60] για να προσδιοριστούν οι βιολογικές και λειτουργικές τους ιδιότητες. Το λογισμικό Cytoscape και το πακέτο igraph σε λογισμικό R (έκδοση 3.6.1) χρησιμοποιήθηκαν για τη σχεδίαση του συνυφασμένου δικτύου εξωσωματικών πρωτεϊνών ή miRNA μεταξύ των μονοπατιών σηματοδότησης.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η ποσοτική επαναληψιμότητα των πρωτεϊνών και των miRNAs αυξήθηκε μέσω της ανάλυσης κύριου συστατικού (PCA), της σχετικής τυπικής απόκλισης και του συντελεστή συσχέτισης Pearson. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μη ζευγαρωμένο Student's t-test. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Οι τιμές P θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές στο *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Αποτελέσματα

Απομόνωση και ταυτοποίηση εξωσωμάτων

Η καλλιέργεια και η ταυτοποίηση τριών ανθρώπινων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων περιγράφηκαν στο Πρόσθετο Αρχείο 1. Τα εξωσώματα απομονώθηκαν από τα ρυθμισμένα μέσα τριών τύπων βλαστοκυττάρων (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S1) και ταυτοποιήθηκαν με βάση τη μορφολογία, το μέγεθος σωματιδίων, τη συγκέντρωση, και δείκτες επιφάνειας [19]. Το TEM αποκάλυψε ότι αυτά τα εξωσώματα είχαν μορφολογία σε σχήμα κυπέλλου (Εικ. 1Α) και το DLS αποκάλυψε ότι η κατανομή μεγέθους τους ήταν εντός 50-200 nm (Εικ. 1Β). Η κηλίδωση Western έδειξε ότι τα απομονωμένα εξωσώματα έφεραν τους θετικούς δείκτες CD63, TSG101 και HSP70 αλλά όχι τον αρνητικό δείκτη καλνεξίνη (Εικ. 1C). Κάθε hESC είχε παρόμοια απόδοση εξωσώματος με αυτή των hiPSC και και τα δύο ήταν υψηλότερα από αυτά των hUC-MSCs (Εικ. 1D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αντιπροσωπευτικά εξωσώματα συνελήφθησαν, χωρίς διαφορές στο σχήμα. Ωστόσο, βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των συγκεντρώσεων των εξωσωμάτων που απομονώθηκαν από τους τρεις τύπους βλαστοκυττάρων.

Βιοπληροφορική κοινών και κορυφαίων πρωτεϊνών

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (δοκιμασία χωρίς ετικέτα). Τέλος, επιλέχθηκαν 554, 437 και 911 σπόροι για την ανάλυση των πρωτεϊνικών προφίλ των hESC-Exos, hiPSC-Exos και hUC-MSC-Exos, αντίστοιχα (Επιπλέον αρχείο 1: Σχήμα S3A). Στη συνέχεια, αυτοί οι υποψήφιοι υποβλήθηκαν σε ανάλυση διαγράμματος Venn για την επιλογή κοινών πρωτεϊνών (Επιπρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S3B). Η ανάλυση βιοπληροφορικής αποκάλυψε ότι οι 303 κοινές πρωτεΐνες κυριαρχούσαν στη ρύθμιση σε αυτές τις οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταροσκελετού της ακτίνης, της εστιακής προσκόλλησης, του PI3K-AKT, του μεταβολισμού του άνθρακα, κ.λπ. (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S3C). Η ανάλυση GO έδειξε επίσης ότι οι κοινές πρωτεΐνες εμπλουτίστηκαν σε εξωκυτταρικό εξώσωμα, μεμβράνη, δέσμευση πρωτεϊνών και εξωκυτταρική περιοχή, (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (δοκιμή χωρίς ετικέτα) (Εικ. 2Α). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, 163, 187 και 451 πρωτεΐνες εξετάστηκαν στα hESC-Exos, hiPSC-Exos και hUC-MSC-Exos, αντίστοιχα (Επιπλέον αρχείο 1: Σχήμα S3E). Στη συνέχεια περιγράψαμε την καμπύλη αφθονίας έκφρασης των τριών τύπων εξωσωμάτων και προσδιορίσαμε τα δέκα κορυφαία γονιδιακά σύμβολα φορτωμένων πρωτεϊνών σε εξωσώματα (Εικ. 2Β). ThΟι υψηλά φορτισμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε βιοπληροφορική με βάση τον αλγόριθμο KOBAS. Τα πρωτεώματα των τριών τύπων εξωσωμάτων εμπλέκονταν όλα σε ένα σύνθετο ρυθμιστικό δίκτυο μονοπατιών σηματοδότησης και τα κορυφαία 20 μονοπάτια ταξινομήθηκαν στη συνέχεια με βάση την τιμή -log10 (P-value) (Εικ. 2C–E). Όλα τα πρωτεώματα εμπλουτίστηκαν στην αλληλεπίδραση εξωκυτταρικής μήτρας (ECM)-υποδοχέα και στα μονοπάτια σηματοδότησης PI3K-AKT. Η ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) αποκάλυψε ότι οι κορυφαίες πρωτεΐνες τόσο στο hESC-Exos όσο και στο hiPSC-Exos ήτανεμπλουτίστηκαν στον κυτταρικό κύκλο και στη μεταβολική οδό, ενώ οι πρωτεΐνες με κορυφαία φόρτωση στο hUC-MSC-Exos εμπλουτίστηκαν σε μονοπάτια που σχετίζονται με τη ρύθμιση της ανοσίας (Εικ. 2F-H).

Σύγκριση κατά ζεύγη εξωσωμικής πρωτεομικής

Για να αξιολογήσουμε τη διαφορά μεταξύ κάθε δύο εξωσώματος πρωτεώματος, κατασκευάσαμε ένα διάγραμμα Venn για να αναγνωρίσουμε τις μοναδικές και επικαλυπτόμενες ομάδες γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Τα κοινά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες υποβλήθηκαν στη συνέχεια στην ανάλυση ηφαιστείου και θερμικού χάρτη και σε GSEA και οι διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες φιλτράρθηκαν στο Ρ<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Η σύγκριση μεταξύ hESC-Exos και hUC-MSC- 1: Εικ. S4 D) αποκάλυψε ότι μοναδικές συστάδες γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του hESC-Exos εμπλέκονται κυρίως σε EGFR, TGF-, κυτταρικό κύκλο, ρύθμιση πολυδυναμίας και Wnt σηματοδότηση (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S4E). Αντίθετα, οι μοναδικές συστάδες hUC-MSC-Exos εμπλουτίστηκαν σε πολλά μονοπάτια σηματοδότησης που σχετίζονται με την ανοσορύθμιση, όπως το σύστημα συμπληρώματος, η ρύθμιση της φλεγμονής και η μικροβιακή μόλυνση (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S4F). Οι επικαλυπτόμενες ομάδες εμπλουτίστηκαν σε μεγάλο βαθμό στην αλληλεπίδραση ECM-υποδοχέα, στους καταρράκτες συμπληρώματος και πήξης και στη σηματοδότηση PI3K-AKT (Εικ. 3D). Η γραφική παράσταση του ηφαιστείου απεικονίζει τις διαφορές μεταξύ hESC-Exos και hUC-MSC-Exos (Εικ. 3Ε). Οι ρυθμισμένες προς τα πάνω πρωτεΐνες στο hUC-MSC-Exos (Σύμαξη 1) εμπλέκονταν κυρίως στην απόκριση του συμπληρώματος, στη δραστηριότητα των φυσικών κυττάρων φονέων και στη σηματοδότηση Rap1 και PPAR. Αντίθετα, οι hESC-Exos ρυθμισμένες προς τα πάνω πρωτεΐνες εμπλέκονταν κυρίως στη σηματοδότηση PI3K-AKT, MAPK και AMPK (Εικ. 3F). Η GSEA επιβεβαίωσε την υψηλότερη ρυθμιστική ικανότητα του hiPSC-Exos σε πολυδύναμη (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S6A και D) και εκείνη του hESC-Exos στην ανοσορύθμιση, συμπεριλαμβανομένης της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από φυσικά κύτταρα φονείς (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S6B και E) και ρύθμιση του COVID19-SARS-CoV2 (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S6C και F).

Η σύγκριση hiPSC-Exos και hUC-MSC-Exos (Επιπρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S4G) αποκάλυψε ότι το μοναδικό σύνολο γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη hiPSCExos συσχετίστηκε σημαντικά με τη μη ομόλογη τελική ένωση, τον μεταβολισμό TGF- και βιταμίνης Β6 (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S4H), ενώ αυτό του hUC-MSC-Exos εμπλέκεται κυρίως σε μονοπάτια που σχετίζονται με την ανοσορύθμιση (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S4I). Οι επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες τους συμμετείχαν επίσης στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων ECM-υποδοχέα, στους καταρράκτες συμπληρώματος και πήξης και στη σηματοδότηση PI3K-AKT (Εικ. 3G). Η γραφική παράσταση του ηφαιστείου παρουσιάζει τις διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες (Εικ. 3Η). Οι πρωτεΐνες Cluster 1 στον θερμικό χάρτη έδειξαν ότι το hUCMSC-Exos ρύθμιζε κυρίως την ανοσολογική απόκριση και το μονοπάτι σηματοδότησης AMPK ενώ το hiPSC-Exos ρύθμιζε κυρίως τον κυτταρικό κύκλο και τις οδούς σηματοδότησης ινσουλίνης, Hippo και mTOR (Εικ. 3 I). Η GSEA υποστήριξε περαιτέρω τον κυρίαρχο ρόλο του hiPSC-Exos στη ρύθμιση των αναπτυξιακών διαδικασιών (Πρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S7A και D) και στη διατήρηση της πολυδύναμης (Πρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S7B και E), ενώ τα hUC-MSC-Exos ήταν εμπλέκονται κυρίως στη διαδικασία ανοσορύθμισης (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S7C και F).

Βιοπληροφορική επικαλυπτόμενων πρωτεωμάτων

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τα κοινά πρωτεώματα των τριών τύπων εξωσώματος. Συνολικά, 309 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη (Εικ. 4Α) υποβλήθηκαν σε αναλύσεις GO και KEGG. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κοινά σύνολα γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μεταξύ των τριών τύπων εξωσώματος εμπλέκονται κυρίως σε εξωκυτταρικές δραστηριότητες και βιολογικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένων μεταβολικών διεργασιών κυτταρικής πρωτεΐνης, δέσμευσης υποδοχέα σηματοδότησης, δέσμευσης ATP, δέσμευσης NAD, επούλωσης τραυμάτων και μεταβολικών διεργασιών λιπιδίων (Εικ. 4Β). Συνέβαλαν επίσης στην κατασκευή πολύπλοκων ρυθμιστικών δικτύων μονοπατιών σηματοδότησης όπως PI3K-AKT, γλυκόλυση/γλυκονεογένεση, Hippo, Oxytocin, HIF-1, κυτταρικός κύκλος και μονοπάτια AMPK (Εικ. 4C). Υπήρχαν περίπλοκες ρυθμιστικές σχέσεις μεταξύ αυτών των πρωτεομικών και κανονικών μονοπατιών σηματοδότησης (Εικ. 4D). Το διάγραμμα φυσαλίδων αποδεικνύει τη διαφορετική αφθονία κάθε συστάδας πρωτεΐνης στην κανονική οδό σηματοδότησης. Ενώ τα hESC-Exos και hiPSC-Exos μπορεί να έχουν ισχυρότερες ρυθμιστικές ικανότητες από το hUC-MSC-Exos όσον αφορά τον κυτταρικό κύκλο και τις οδούς σηματοδότησης AMPK, το hUC-MSC-Exos μπορεί να έχει εξέχουσες ρυθμιστικές επιδράσεις στα μονοπάτια σηματοδότησης VEGF και NF-κB (A αρχείο 1: Εικ. S8).

Η ανάλυση θερμικού χάρτη αποκάλυψε περαιτέρω διαφορές στην έκφραση κοινών πρωτεϊνών (Εικ. 4Ε). Στο σύμπλεγμα Α, οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στις οδούς σηματοδότησης των υποδοχέων PI3K-AKT, Hippo, VEGF και Β-κυττάρων εμπλουτίστηκαν σε hUC-MSCExos και hESC-Exos. Οι πρωτεΐνες στο Cluster B συμμετείχαν κυρίως στη ρύθμιση της σηματοδότησης PPAR, του μεταβολισμού της χοληστερόλης και της παραγωγής IgA και εξαντλήθηκαν στο hESC-Exos. Το hUC-MSC-Exos περιείχε κυρίως πρωτεΐνες Cluster C, οι οποίες ρύθμιζαν την απόκριση του συμπληρώματος, τη μικροβιακή μόλυνση, τη σηματοδότηση HIF-1, τη σηματοδότηση MAPK, τις μεταβολικές οδούς και την οδό NF-κB. Οι πρωτεΐνες στο Cluster d, οι οποίες εμπλουτίστηκαν σε hiPSC-Exos, συμμετείχαν στη ρύθμιση της σηματοδότησης Ras, της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και της σηματοδότησης mTOR. Οι πρωτεΐνες στο Cluster e ήταν πιο άφθονες τόσο στο hiPSC-Exos όσο και στο hESC-Exos από ότι στο hUC-MSCExos και συμμετείχαν σε πολλαπλές μεταβολικές διεργασίες, όπως ο κύκλος κιτρικών, ο κυτταρικός κύκλος, η σηματοδότηση της ινσουλίνης, ο μεταβολισμός των λιπαρών οξέων και η σηματοδότηση AMPK . Οι πρωτεΐνες στο Cluster f συμμετείχαν στη ρύθμιση της επαναρρόφησης ασβεστίου, της γλυκόλυσης/γλυκονεογένεσης, της αδρενεργικής σηματοδότησης και του μεταβολισμού του πυροσταφυλικού και εξαντλήθηκαν τόσο στο hUC-MSCExos όσο και στο hiPSC-Exos. Οι πρωτεΐνες στις διάφορες ομάδες παρατίθενται στο πρόσθετο αρχείο 4.

Προφίλ miRNA των τριών τύπων εξωσώματος

Για τη διερεύνηση των προφίλ miRNA των τριών τύπων εξωσωμάτων, απομονώθηκε ολικό RNA από τα εξωσώματα για τη σύζευξη των άκρων 5' και 3' για επακόλουθη αντίστροφη μεταγραφή. Το cDNA που ελήφθη χρησιμοποιήθηκε για κατασκευή βιβλιοθήκης και ευρεία δοκιμή. Ο αριθμός ακεραιότητας RNA (RIN) ήταν 2,7, 2,6 και 2,6 στα hESC-Exos, hiPSC-Exos και hUC-MSC-Exos, αντίστοιχα (Επιπρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S9A). Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης RNA αποκάλυψε ότι το hESC-Exos κυριαρχούσε στο φορτίο RNA, ακολουθούμενο από το hiPSC-Exos και το hUC-MSCExos (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S9B). Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson (Πρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S9C) και PCA (Πρόσθετο αρχείο 1: Σχ. S9D) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτική αξιολόγηση της επαναληψιμότητας των miRNA. Χρησιμοποιήθηκαν χάρτες θερμότητας για να αναπαραστήσουν τα διαφορικά εκφρασμένα miRNA στους τρεις τύπους εξωσώματος (Επιπρόσθετο αρχείο 1: Εικ. S9E) και τον αριθμό των διαφορικά εκφραζόμενων miRNA στο P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Για τη διερεύνηση των miRNA που εμπλέκονται σε βιολογικές διεργασίες, τα κορυφαία miRNA φιλτράρονταν στο P<0.05 and read count>1000 για περαιτέρω πρόβλεψη γονιδίου στόχου. Τα εμπλουτισμένα γονίδια υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε αναλύσεις GO και KEGG. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα miRNA hESC-Exos επηρέασαν σημαντικά τις ακόλουθες διαδικασίες: Rap1, PI3K-AKT, ασβέστιο, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, κυτταρικός κύκλος, οδός σηματοδότησης AMPK, κ.λπ. (ανάλυση KEGG) (Εικ. 5D) και ο κυτταρικός κύκλος, η ανάπτυξη πολλαπλών οργανισμών, η ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος, η διαφοροποίηση των κυττάρων, η γήρανση, η σηματοδότηση Wnt και ο μεταβολισμός των λιπαρών οξέων. (βιολογική διεργασία) (Εικ. 5G). Ο εμπλουτισμός γονιδίου στόχου των miRNAs hiPSC-Exos έδειξε ότι οι ακόλουθες διεργασίες ρυθμίστηκαν σημαντικά: PI3K-AKT, Rap1, Ras, ασβέστιο, Hippo, cAMP και cGMP-PKG σηματοδοτική οδός κ.λπ. (ανάλυση KEGG) και ο κυτταρικός κύκλος, ανάπτυξη πολλαπλών οργανισμών, φωσφορυλίωση, διαφοροποίηση κυττάρων, κυτταρική μετανάστευση και απόκριση στην υποξία. (βιολογική διεργασία) (Εικ. 5Η). Στο ρυθμιστικό δίκτυο των miRNAs hUC-MSC-Exos, οι πιο εύλογες βιολογικές διεργασίες ήταν: Rap1, Ras, PI3K-AKT, ασβέστιο, cAMP, Hippo, ο κυτταρικός κύκλος, JAK-STAT και HIF{19}} οδός σηματοδότησης . (Ανάλυση KEGG) (Εικ. 5F), και φωσφορυλίωση, ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος, δέσμευση ATP, κυτταρική διαίρεση, μεταβολισμός λιπιδίων, συνδιέγερση Τ κυττάρων, επούλωση πληγών, δέσμευση NF-κΒ και φλεγμονώδης απόκριση. (βιολογική διεργασία) (Εικ. 5 I). Το δίκτυο των πέντε κορυφαίων miRNAs και οι ρυθμιστικές οδοί τους απεικονίστηκε επίσης (Επιπλέον αρχείο 1: Εικ. S10).

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】