Περίληψη

Οι διαταραχές της υπερμελάγχρωσης του δέρματος, όπως το μέλασμα, οι πανάδες και η μεταφλεγμονώδης υπερμελάγχρωση (PIH), προκαλούνται συχνά από την υπεριώδη ακτινοβολία Β (UVB), τον δερματικό τραυματισμό και την τοπική φλεγμονή του δέρματος. Η υπερβολική εναπόθεση μελανίνης βλάπτει την εμφάνιση του δέρματος και επηρεάζει αρνητικά την ψυχολογική ευεξία του ασθενούς. Οι συμβατικοί αποχρωματιστικοί παράγοντες όπως η υδροκινόνη στοχεύουν κυρίως την τυροσινάση με δράση μονής λειτουργίας και ενέχουν καλά τεκμηριωμένους κινδύνους για την ασφάλεια. Τα φυσικά βοτανικά μείγματα πολλαπλών στόχων έχουν αναδειχθεί ως πολλά υποσχόμενες εναλλακτικές λύσεις για τη σύγχρονη λειτουργική σύνθεση καλλυντικών.

Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs) είναι βιοενεργά συστατικά που απομονώνονται απόCistanche deserticola, ένα πολύ γνωστό φαρμακευτικό βότανο από άνυδρες περιοχές της ερήμου. Γλαβριδίνη (Gla), μια πρενυλιωμένη ισοφλαβάνη που εξάγεται απόGlycyrrhiza glabra, αναγνωρίζεται ευρέως ως μια φυσική ένωση υψηλής δραστικότητας που δίνει λάμψη στο δέρμα. Αυτή η έρευνα διερεύνησε συστηματικά τη συνεργιστική απόδοση κατά της υπερμελάγχρωσης των PhGs σε συνδυασμό με τη γλαβριδίνη. Για τον προκαταρκτικό έλεγχο αναλογίας μάζας εφαρμόστηκαν in-vitro βιοχημικές δοκιμασίες, συμπεριλαμβανομένων των δοκιμών αναστολής τυροσινάσης, DPPH και ABTS⁺ δέσμευσης ελεύθερων ριζών. Τρία κυτταρικά μοντέλα κατασκευάστηκαν περαιτέρω: Μοντέλο μελάγχρωσης κυττάρων μελανώματος ποντικού B16F10 με ακτινοβολία UVB. Φλεγμονώδες μοντέλο κερατινοκυττάρων HaCaT που διεγείρεται από λιποπολυσακχαρίτες (LPS). Μοντέλο οξειδωτικού στρες HaCaT που προκαλείται από AAPH. Οι δείκτες που καλύπτουν τη δραστηριότητα της ενδοκυτταρικής τυροσινάσης, την περιεκτικότητα σε μελανίνη, την προφλεγμονώδη απελευθέρωση κυτοκίνης (IL-6, TNF-), τη δραστικότητα ενζύμου υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) και καταλάσης (CAT) ποσοτικοποιήθηκαν. Ο υπολογισμός του δείκτη συνδυασμού (CI) εφαρμόστηκε για να προσδιοριστεί ποσοτικά η συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο βοτανικών εκχυλισμάτων.

Μεταξύ των δοκιμασμένων αναλογιών, οι αναλογίες μάζας m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 και 10:1 εμφάνισαν σημαντική κατασταλτική και αντιοξειδωτική συνέργεια της τυροσινάσης. Σε συνολική συγκέντρωση 0,4 g/L σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό pH 6,8 (PBS), τα ποσοστά αναστολής της τυροσινάσης έφτασαν το 94,37 % (1:1), το 92,93 % (5:1) και το 88,06 % (10:1). Τα αντίστοιχα ποσοστά σάρωσης ριζών DPPH ήταν 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. Οι ικανότητες δέσμευσης ριζών κατιόντων ABTS+ πέτυχαν 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Σε συγκέντρωση εργασίας 25 ug/mL, και τα τρία σκευάσματα ένωσης δεν εμφάνισαν σημαντική κυτταροτοξικότητα προς τις κυτταρικές γραμμές B16F10 και HaCaT. Η αναμεμειγμένη ομάδα 1:1 δημιούργησε ανώτερη συνολική αποτελεσματικότητα: η υπολειπόμενη ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης μειώθηκε στο 23,80%, η σχετική περιεκτικότητα σε μελανίνη μειώθηκε στο 30,90%. Επιπλέον, τα PhGs/Gla (1:1) άσκησαν την ισχυρότερη καταστολή στην έκκριση IL-6 και TNF και αποκατέστησαν στο μέγιστο βαθμό τη δράση των αντιοξειδωτικών ενζύμων SOD και CAT. Πειραματικά αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι τα PhGs σε συνδυασμό με τη γλαβριδίνη επιτυγχάνουν συνεργιστικά αποτελέσματα κατά της υπερμελάγχρωσης μέσω τριών οδών: αναστολή της βιοσύνθεσης μελανίνης, μετριασμός της φλεγμονής του δέρματος και αντιμετώπιση του οξειδωτικού στρες. Η αναλογία μάζας 1:1 προσφέρει βέλτιστη ολοκληρωμένη βιολογική απόδοση. Αυτή η μελέτη παρέχει πειραματικά στοιχεία που υποστηρίζουν την εφαρμογή τουCistancheΣύνθετα υλικά φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων-γλαβριδίνης σε καθαρή ομορφιά, φυτικής προέλευσης ανάπτυξη πρώτων υλών λευκαντικής περιποίησης δέρματος.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanche deserticolaΦαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες; glabridin; συνεργιστική επίδραση? κατά της υπερμελάγχρωσης· αντιοξειδωτικό; αντιφλεγμονώδης καλλυντικές βοτανικές πρώτες ύλες

1. Εισαγωγή

Η υπερβολική συσσώρευση μελανίνης στα επιδερμικά στρώματα έχει ως αποτέλεσμα ετερογενείς φαινοτύπους μελάγχρωσης του δέρματος, συμπεριλαμβανομένου του μέλασμα, των εφελίδων και της μεταφλεγμονώδους υπερμελάγχρωσης (PIH) Ψάξτε για... Πολλοί εξωγενείς και εγγενείς παράγοντες που οδηγούν συμβάλλουν στην παθολογική υπερπαραγωγή μελανίνης. Η υπεριώδης ακτινοβολία UVB αντιπροσωπεύει την κύρια περιβαλλοντική ενεργοποίηση. το τραύμα του δέρματος και οι χρόνιες τοπικές φλεγμονώδεις αποκρίσεις ενισχύουν περαιτέρω τις χρωστικές διαταραχές. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των επιδερμικών κερατινοκυττάρων και των μελανοκυττάρων κυριαρχεί στην εξέλιξη της χρωστικής. Κατά την εξωτερική διέγερση, τα ενεργοποιημένα κερατινοκύτταρα απελευθερώνουν δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και προφλεγμονώδεις μεσολαβητές. Αυτά τα μόρια σηματοδότησης διαχέονται και δρουν σε γειτονικά μελανοκύτταρα, ρυθμίζοντας προς τα πάνω την καταλυτική δραστηριότητα τυροσινάσης, επιταχύνοντας τη σύνθεση μελανίνης και προάγοντας τη μεταφορά μελανοσωμάτων προς τα κερατινοκύτταρα, δημιουργώντας τελικά ορατές μελαγχρωματικές αλλοιώσεις στην επιφάνεια του δέρματος. Συνεπώς, η αποτελεσματική παρέμβαση για την υπερμελάγχρωση δεν μπορεί απλώς να επικεντρωθεί στην αναστολή της τυροσινάσης. Οι πολυτροπικές θεραπευτικές στρατηγικές θα πρέπει να καλύπτουν ταυτόχρονα την αναστολή της μελανογένεσης, την αντιφλεγμονώδη παρέμβαση και την εξουδετέρωση του οξειδωτικού στρες.

Παραδοσιακά συνθετικά δραστικά λεύκανσης του δέρματος, όπως η υδροκινόνη, προσφέρουν αποχρωματιστική αποτελεσματικότητα κυρίως με άμεση καταστολή της τυροσινάσης. Ωστόσο, οι μηχανισμοί ενός στόχου περιορίζουν την πρακτική απόδοση και η μακροχρόνια τοπική εφαρμογή υδροκινόνης μπορεί να προκαλέσει ερεθισμό του δέρματος, δερματίτιδα εξ επαφής και πιθανούς κινδύνους για την ασφάλεια, περιορίζοντας το εύρος χρήσης καλλυντικού επιπέδου. Τα φυσικά βιοσυστατικά που προέρχονται από φυτά προσελκύουν αυξανόμενο ενδιαφέρον από τους παρασκευαστές καλλυντικών και τους καταναλωτές για τα ήπια προφίλ τους και τις φαρμακολογικές δράσεις πολλαπλών δρόμων. Τα σύνθετα μείγματα διαφορετικών βοτανικών εκχυλισμάτων είναι ικανά να παράγουν συνεργιστικά βιολογικά αποτελέσματα, ενισχύοντας τη συνολική αποτελεσματικότητα, ενώ μειώνουν τις απαιτήσεις αποτελεσματικής δοσολογίας, γεγονός που ανοίγει νέες τεχνικές κατευθύνσεις για έρευνα καλλυντικών-πρώτων υλών κατά της μελάγχρωσηςGoogle

Cistanche deserticola, που ονομάζεται συνήθως «τζίνσενγκ της ερήμου», είναι ένα κλασικό τονωτικό βότανο στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Οι σύγχρονες φυτοχημικές έρευνες αποκαλύπτουν ότι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs) αποτελούν το κύριο φαρμακολογικά ενεργό κλάσμα του, με αντιπροσωπευτικές ενώσεις εχινακοσίδη και ακτεοσίδη. Δημοσιευμένη φαρμακολογική έρευνα καταδεικνύει ότι τα PhG διαθέτουν ισχυρή αντιοξειδωτική ικανότητα, αντιφλεγμονώδη βιοδραστικότητα και μέτριο δυναμικό αναστολής της τυροσινάσης, υπονοώντας προοπτικές εφαρμογής σε δερματολογικά υλικά περιποίησης δέρματος. Η γλαβριδίνη είναι μια χαρακτηριστική ισοφλαβονοειδής ένωση που απομονώνεται απόGlycyrrhiza glabraρίζα, γνωστή στη βιομηχανία καλλυντικών ως "λευκαντικός χρυσός". Καταστέλλει δυναμικά τη μελανογένεση και ταυτόχρονα ρυθμίζει τους δερματικούς φλεγμονώδεις καταρράκτες. Από τη θεωρητική σκοπιά της παραδοσιακής ιατρικής,Cistancheτρέφει την ουσία των νεφρών και τονώνει το γιανγκ, ενώ οι ρίζες γλυκόριζας τονώνουν τη σπλήνα και καθαρίζουν τη θερμοτοξίνη. Η συνδυασμένη χρήση συμμορφώνεται με τις αρχές συμβατότητας των ενώσεων των φυτικών δερματολογικών θεραπειών.

Η μηχανιστική υπόθεση υποστηρίζει ότι ο συνδυασμός PhGs-γλαβριδίνης μπορεί να ρυθμίζει τη μελάγχρωση του δέρματος μέσω τρόπων πολλαπλών στόχων και πολλαπλών διαδρομών: από κοινού αναστολή της καταλυτικής λειτουργίας της τυροσινάσης για την αποκοπή της προέλευσης παραγωγής μελανίνης. σβήσιμο της συσσώρευσης αντιδραστικών ειδών οξυγόνου· περιορίζοντας την υπεραπελευθέρωση του προφλεγμονώδους παράγοντα, έτσι ώστε να διακοπεί η ενίσχυση σήματος που προκαλείται από ROS και κυτοκίνη για ενεργοποίηση μελανοκυττάρων. Μέχρι σήμερα, λίγες ερευνητικές εργασίες έχουν αναφέρει συστηματικά συνεργιστική αξιολόγηση κατά της υπερμελάγχρωσης για αυτό το δυαδικό μείγμα.

Αυτό το άρθρο επιχειρεί να διερευνήσει τις συνδυαστικές βιολογικές επιδράσεις μεταξύCistancheφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες και γλαβριδίνη. Πρώτα εφαρμόστηκαν βιοχημικά πειράματα in-vitro αναστολής ενζύμου και σάρωση ριζών. Κατασκευάστηκαν τρία αντιπροσωπευτικά κυτταρικά μοντέλα που μιμούνται την εναπόθεση χρωστικής, τη φλεγμονή του δέρματος και την οξειδωτική βλάβη για την πολυδιάστατη αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας. Η μεθοδολογία συνδυαστικού δείκτη εφαρμόστηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων συνεργίας ή ανταγωνισμού. Στόχος μας ήταν να προσδιορίσουμε τη βέλτιστη αναλογία μάζας ένωσης, να αποσαφηνίσουμε τους λειτουργικούς μηχανισμούς τριπλής λειτουργίας και να παρέχουμε υποστήριξη πειραματικών δεδομένων για την ανάπτυξη φυσικών συνεργιστικών πρώτων υλών καλλυντικών που φωτίζουν το δέρμα.

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Αντιδραστήρια, στελέχη κυττάρων και εργαστηριακά όργανα

Η κυτταρική σειρά μελανώματος ποντικού B16F10 (STCC20013G-1) αγοράστηκε από τη Saierbio Co., Ltd. Το απαθανατισμένο ανθρώπινο επιδερμικό κερατινοκύτταρο HaCaT (iCell‑h066) ελήφθη από την iCell Bioscience Inc.CistancheΟι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs) και η γλαβριδίνη (Gla) προμηθεύονταν εμπορικά από την Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Τυροσινάση μανιταριού, αρμπουτίνη, L-τυροσίνη, L-DOPA, DPPH, άλας διαμμωνίου ABTS, L‑ΑΑΑμίνη Τα X‑100, DMSO και άλλα χημικά αντιδραστήρια αναλυτικής ποιότητας προέρχονται από κύριους προμηθευτές βιοχημικών αντιδραστηρίων. Τα αναλώσιμα κυτταροκαλλιέργειας περιελάμβαναν μέσο DMEM με υψηλή περιεκτικότητα σε γλυκόζη, βόειο εμβρυϊκό ορό, μείγμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης. Τα κιτ ανάλυσης ELISA που στοχεύουν τα κιτ ανίχνευσης ανθρώπινης IL-6, TNF-, CAT και ολικού-SOD προμηθεύτηκαν από αντίστοιχους κατασκευαστές βιοτεχνολογίας.

Ο βασικός εργαστηριακός εξοπλισμός περιείχε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πλήρους μήκους κύματος Multiskan FC, θερμοκοιτίδα Heracell 371 CO₂ (Thermo Fisher). Καθαριστικό υπερήχων KQ‑200VDB. υδατόλουτρο σταθερής θερμοκρασίας· Φούρνος αμμοβολής DHG‑9246A. KN4006B Όργανο υπεριώδους ακτινοβολίας UVB με ακτινοβολία εξόδου 8 mW/cm².

2.2 Παρασκευή διαλύματος δείγματος

Μητρικά διαλύματα PhGs και γλαβριδίνης παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS 6,8 ή 50 % (v/v) διαλύτη αιθανόλης-νερού, σειριακά αραιωμένα σε συγκεντρώσεις εργασίας: 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,1 g/L, 0,1 g/L, 0,1 g/L. g/L, 1,6 g/L, 2,0 g/L. Εννέα σύνθετες ομάδες διαμορφώθηκαν σε σταθερή ολική συγκέντρωση μάζας 0,4 g/L με ποικίλες αναλογίες μάζας m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:20, 1:40 Gla (4G/40, σχεδιασμός) PhGs/Gla (1:40).

Για δοκιμές κυτταρικών πειραμάτων, δείγματα σκόνης διαλύθηκαν σε μέσο DMEM χωρίς ορό για να παρασκευαστούν σειρές διαλυμάτων συγκέντρωσης εργασίας.

2.3 Βιοχημικές In-vitro Αναλύσεις

2.3.1 Δοκιμασία Αναστολής Τυροσινάσης

50 μL διαλύματος δείγματος, 50 μL pH 6,8 PBS και 50 μL 1 g/LL διαλύματος υποστρώματος τυροσίνης προστέθηκαν διαδοχικά σε κάθε φρεάτιο σε μικροπλάκα 96 φρεατίων. Η προεπώαση συνεχίστηκε κάτω από υδατόλουτρο 37 μοιρών για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, συμπληρώθηκαν 50 μL διαλύματος τυροσινάσης μανιταριού 0,4 g/L (200 U/mL) και η επώαση συνεχίστηκε στους 37 βαθμούς για 10 λεπτά. Η αρμπουτίνη λειτούργησε ως ουσία θετικού ελέγχου, το τυφλό μάρτυρα υιοθέτησε ρυθμιστικό διάλυμα PBS pH 6,8. Η τιμή απορρόφησης μετρήθηκε κάτω από μήκος κύματος 490 nm σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Τύπος υπολογισμού του ρυθμού αναστολής της τυροσινάσης:

Ποσοστό αναστολής τυροσινάσης (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction-control) / (A_blank − A_blank‑control)]} × 100 %

Όπου: A_reaction: απορρόφηση που περιέχει δείγμα, υπόστρωμα, PBS και τυροσινάση. A_reaction-control: απορρόφηση δείγματος, υποστρώματος και PBS χωρίς ένζυμο. A_blank: απορρόφηση υποστρώματος, PBS και τυροσινάσης. A_blank-control: απορρόφηση μόνο για υπόστρωμα και ρυθμιστικό διάλυμα PBS.

2.3.2 Προσδιορισμός σάρωσης ελεύθερων ριζών DPPH

Η σκόνη DPPH διαλύθηκε σε άνυδρη αιθανόλη για να παρασκευαστεί υγρό εργασίας DPPH 0,2 mmol/L. PhGs, γλαβριδίνη και ουσία αναφοράς βιταμίνης C διαλύθηκαν σε διαλύτη 50 % αιθανόλης-νερού για να σχηματιστούν μητρικά διαλύματα βαθμίδωσης συγκέντρωσης. Δείγματα δυαδικού μίγματος με εννέα αναλογίες μάζας αναμίχθηκαν ομοιόμορφα. Κάθε φρεάτιο έλαβε 100 μL υγρού δείγματος συν 100 μL διαλύματος εργασίας DPPH. Μετά από σχολαστική ανάμειξη, η μικροπλάκα διατηρήθηκε μακριά από το φως σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 30 λεπτά. Η ένδειξη απορρόφησης καταγράφηκε στα λ = 517 nm. Η βιταμίνη C λειτούργησε ως θετικός έλεγχος, κάθε πειραματική ομάδα επαναλήφθηκε για 3 βιολογικά αντίγραφα. Τύπος ρυθμού σάρωσης DPPH:

Ποσοστό σάρωσης DPPH (%)={1 − [(A1 − A3) / A2]} × 100 %

A1: απορρόφηση δείγματος + υγρό εργασίας DPPH. A2: απορρόφηση 50 % αιθανόλης + υγρό εργασίας DPPH. A3: απορρόφηση διαλύματος δείγματος αναμεμειγμένο με διαλύτη αιθανόλης 50%.

2.3.3 Δοκιμασία καθαρισμού κατιόντων ABTS⁺ Radical-Scavenging

7,4 mmol/L μητρικό διάλυμα ABTS και 2,6 mmol/L διάλυμα υπερθειικού καλίου αναμίχθηκαν εξίσου, επωάστηκαν σε σκοτεινό περιβάλλον για 12 ώρες για να παραχθεί σταθερό αντιδραστήριο εργασίας ABTS+. Τα διαλύματα δειγμάτων διαμορφώθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που περιγράφονται στην ενότητα 2.3.2. 40 μL διαλύματος δείγματος και 160 μL υγρού εργασίας ABTS+ μεταφέρθηκαν με πιπέτα σε φρεάτια μικροπλάκας. Μετά από επώαση προστατευμένη από το φως για 6 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 734 nm. Τύπος ρυθμού δέσμευσης ριζών ABTS⁺:

Ποσοστό καθαρισμού ABTS⁺ (%)={1 − [(A1 − A3) / A2]} × 100 %

A1: απορρόφηση του διαλύματος δείγματος συν το διάλυμα εργασίας ABTS+. A2: απορρόφηση απιονισμένου νερού αναμεμειγμένου με αντιδραστήριο εργασίας ABTS+. A3: τιμή απορρόφησης για διάλυμα δείγματος αναμεμειγμένο με καθαρό διαλύτη απιονισμένου νερού.

2.4 Διαδικασίες κυτταροκαλλιέργειας

Κύτταρα μελανώματος B16F10 και κερατινοκύτταρα HaCaT καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10 % ορό εμβρύου-βόειου και 1 % πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Παράμετροι επωαστήρα: 37 μοίρες, 5 % όγκο κλάσμα CO2, σχετική υγρασία 70 %. Η διέλευση των κυττάρων και η ανανέωση του μέσου πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την πυκνότητα κυτταρικής ανάπτυξης που παρατηρήθηκε σε ανεστραμμένο οπτικό μικροσκόπιο. Τα κύτταρα σε φάση λογαριθμικής ανάπτυξης συλλέχθηκαν για επακόλουθη σπορά σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων.

2.5 Καθιέρωση Τριών Κυψελών Λειτουργικών Μοντέλων

2.5.1 Μοντέλο μελάγχρωσης B16F10 που προκαλείται από την UVB

Μετά από 1 ώρα προεπεξεργασίας με το αντίστοιχο μέσο δείγματος, η επιφάνεια του κυτταρικού στρώματος καλύφθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Η ένταση ακτινοβολίας UVB ορίστηκε ως 8 mW/cm², απόσταση ακτινοβολίας 3 cm, διάρκεια ακτινοβολίας 110 s. Η κανονική ομάδα έλαβε το ίδιο μέσο χωρίς παρέμβαση ακτινοβολίας UVB. Η ομάδα ελέγχου μοντέλου έλαβε προεπεξεργασία PBS ακολουθούμενη από έκθεση σε ίση δόση UVB χωρίς συμπλήρωμα δείγματος.

2.5.2 Μοντέλο φλεγμονώδους ενεργοποίησης HaCaT με τη μεσολάβηση LPS

Τα κύτταρα HaCaT προεπωάστηκαν με μέσο DMEM δείγματος δοκιμής για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το διάλυμα λιποπολυσακχαρίτη LPS συμπληρώθηκε για να επιτευχθεί η τελική συγκέντρωση των 20 ug/mL και η συγκαλλιέργεια διήρκεσε άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα της ομάδας μοντέλου προκλήθηκαν με LPS χωρίς προεπεξεργασία δείγματος. Η κανονική ομάδα διατήρησε τη συνηθισμένη πλήρη-μέτρια καλλιέργεια.

2.5.3 Μοντέλο οξειδωτικού στρες με ενεργοποιημένο HaCaT AAPH

Τα κύτταρα έλαβαν προεπώαση δείγματος 24 ωρών. Το αντιδραστήριο AAPH προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας, τελική συγκέντρωση 25 mmol/L, συνεχίζοντας την επώαση για 24 ώρες. Η ομάδα ελέγχου μοντέλου διεγέρθηκε από AAPH χωρίς παρέμβαση δείγματος. Η ομάδα φυσιολογικού ελέγχου αναπτύχθηκε υπό κανονικές μέσες συνθήκες.

Όλες οι ομάδες κυτταρικών μοντέλων περιείχαν τρία τεχνικά αντίγραφα φρεάτια.

2.6 Δοκιμή κυτταροτοξικότητας (μέθοδος CCK‑8)

Το κυτταρικό εναιώρημα ρυθμίστηκε σε πυκνότητα 1 × 104 κύτταρα/mL και εμβολιάστηκε σε μικροπλάκες 96 φρεατίων. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων, χορηγήθηκε μέσο δείγματος βαθμίδωσης συγκέντρωσης και η επώαση συνεχίστηκε για 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες. Το αντιδραστήριο ανίχνευσης CCK‑8 αναμεμειγμένο με φρέσκο ​​μέσο DMEM (κλάσμα όγκου 10 %) αντικατέστησε το παλιό μέσο, ​​η επώαση συνεχίστηκε για 60 λεπτά. Η συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας μέτρησε την απορρόφηση σε μήκος κύματος 450 nm. Τύπος υπολογισμού για το σχετικό ποσοστό βιωσιμότητας κυττάρων:

Κυτταρική βιωσιμότητα (%)=[(A_samp − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_sample: απορρόφηση κυττάρων που περιέχουν φρεάτιο, αντιδραστήριο CCK-8 και μέσο δείγματος. A_blank: απορρόφηση για το μέσο καλλιέργειας συν CCK‑8 χωρίς σπαρμένα κύτταρα. A_0: απορρόφηση κυττάρων και αντιδραστήριο CCK-8 που καλλιεργήθηκαν με τυφλό μέσο (χωρίς δείγματα δοκιμής).

2.7 Ποσοτικοποίηση Δραστικότητας Ενδοκυτταρικής Τυροσινάσης

Μετά από 48 ώρες επεξεργασίας εγκατάστασης μοντέλου, το κυτταρικό υπερκείμενο απορρίφθηκε. Η μονοστοιβάδα κυττάρων πλύθηκε δύο φορές με pH 7,4 PBS. 50 μL 1 % διάλυμα λύσης Triton X-100 προστέθηκε ανά φρεάτιο. Η μικροπλάκα καταψύχθηκε στους -80 βαθμούς στο ψυγείο για 30 λεπτά, στη συνέχεια αποψύχθηκε σε συνθήκες θερμοκρασίας δωματίου για πλήρη ρήξη της κυτταρικής μεμβράνης. Η θεραπεία προθέρμανσης στους 37 βαθμούς διήρκεσε 5 λεπτά. Συμπληρώθηκε υπόστρωμα L-DOPA (10 mmol/L, 10 μL). Η μικροπλάκα επωάστηκε για 1 ώρα μέσα στον επωαστήρα CO2. Η απορρόφηση ανιχνεύθηκε στα 475 nm για τον υπολογισμό της σχετικής ενδοκυτταρικής δραστηριότητας τυροσινάσης.

2.8 Ενδοκυτταρική μέτρηση περιεχομένου μελανίνης

Η μέθοδος διάσπασης NaOH υιοθετήθηκε για την ανίχνευση της περιεκτικότητας σε μελανίνη. Μετά την παρέμβαση μοντέλου 72 ωρών, το υπερκείμενο της καλλιέργειας αφαιρέθηκε, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα PBS. 100 μL 1 mol/L υδατικό διάλυμα NaOH που περιέχει 10 % DMSO. Η μικροπλάκα επωάστηκε σε φούρνο στους 90 βαθμούς για 60 λεπτά για πλήρη διάλυση μελανίνης. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 490 nm για να υπολογιστεί το σχετικό ποσοστό περιεκτικότητας σε μελανίνη.

2.9 Ανίχνευση φλεγμονωδών παραγόντων και δεικτών αντιοξειδωτικών ενζύμων

Μετά από 48 ώρες επεξεργασίας μοντέλου, τα κύτταρα HaCaT ξύστηκαν και συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν για τη συλλογή του υπερκειμένου των κυττάρων. Τα εμπορικά κιτ ELISA χρησιμοποιήθηκαν για τον ποσοτικό προσδιορισμό των συγκεντρώσεων IL-6 και TNF-προφλεγμονώδους-κυτοκίνης. Για τη δοκιμή αντιοξειδωτικών-ενζύμων, τα σφαιρίδια κυττάρων υποβλήθηκαν σε επαναλαμβανόμενους κύκλους κατάψυξης-απόψυξης για να επιτευχθεί ο κυτταρικός κατακερματισμός. Συνθήκη φυγοκέντρησης: 12 000 r/min, 4 μοίρες, 10 λεπτά. Το υπερκείμενο κλάσμα συλλέχθηκε για να προσδιοριστεί η ζωτικότητα SOD και το περιεχόμενο ενζύμου CAT σύμφωνα με τις λειτουργικές προδιαγραφές του κιτ.

2.10 Ανάλυση συνδυασμού δείκτη (CI).

Ο αλγόριθμος συνδυαστικού δείκτη Chou-Talalay (CI) εφαρμόστηκε για να κριθεί η συνεργιστική/προσθετική/ανταγωνιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των PhG και της γλαβριδίνης στο πλαίσιο δοκιμών αναστολής τυροσινάσης και αντιοξειδωτικών:

CI=D1/DX1 + D2/DX2

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 αντιπροσωπεύει ανταγωνιστική αλληλεπίδραση. CI ≈ 1 σημαίνει προσθετική επίδραση. CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα των πειραματικών μετρήσεων εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (Μέση τιμή ± SD). Το λογισμικό GraphPad Prism 9.5.0 πραγματοποίησε στατιστικούς υπολογισμούς. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση πολλών ομάδων. P‑value< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Αποτελέσματα και Συζήτηση

3.1 In-vitro Ανασταλτική Απόδοση Τυροσινάσης PhGs, Γλαβριδίνης και Δυαδικών Μιγμάτων

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

Σε συνολική συγκέντρωση 0,4 g/L για διάλυμα ένωσης PBS, τα PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) παρείχαν ποσοστό αναστολής της τυροσινάσης 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Και οι δύο αναλογίες 5:1 και 1:1 ξεπέρασαν την αποτελεσματικότητα αναστολής των PhG ενός συστατικού (36,92 %) και της γλαβριδίνης ενός συστατικού (92,71 %) στην αντιστοίχιση της συνολικής συγκέντρωσης μάζας. Η ομάδα 1:1 πέτυχε μέγεθος αναστολής συγκρίσιμο με την αρμπουτίνη θετικού ελέγχου. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα υπολογισμού της τιμής CI: m(PhGs):m(Gla) που κυμαίνεται από 40:1 έως 1:1 δημιούργησε CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, εκδηλώνοντας ανταγωνιστική αλληλεπίδραση.

Οι φαινολικές υδροξυλομάδες αποτελούν το βασικό λειτουργικό τμήμα για την ανασταλτική ικανότητα της τυροσινάσης. Τα PhG περιέχουν δομικά θραύσματα ορθο-διυδροξυφαινυλίου ικανά να χηλώνουν ιόντα χαλκού εντός του καταλυτικού-ενεργού θύλακα τυροσινάσης, παρεμποδίζοντας ανταγωνιστικά τη σύνδεση υποστρώματος-ενζύμου. Ο σκελετός ισοφλαβάνης γλαβριδίνης φέρει ομάδες 2-ΟΗ και 4-ΟΗ στον Β-δακτύλιο του, δομικά ανάλογο με τον αρωματικό υδροξυλο-υποκατεστημένο δακτύλιο L-τυροσίνης/L-DOPA, επιτρέποντας την ανταγωνιστική κατάληψη της περιοχής ενεργού ενζυμικής θέσης. Μετά την ανάμειξη των ενώσεων, η σωρευτική ποσότητα φαινολικού-υδροξυλίου αυξάνεται. Εν τω μεταξύ, δύο μόρια μπορεί να προσκολληθούν σε διακριτές θέσεις δέσμευσης της πρωτεΐνης τυροσινάσης, ενισχύοντας από κοινού την ανασταλτική αποτελεσματικότητα.

3.2 Αντιοξειδωτική δράση καθαρισμού ριζών των δειγμάτων δοκιμής

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. Τα PhGs είναι άφθονα σε τμήματα της ομάδας καφεοϋλίου και της 3,4-διυδροξυφαινυλαιθανόλης, με συστήματα συζευγμένου διπλού δεσμού που ενισχύουν την απόδοση εξουδετέρωσης των ελεύθερων ριζών. Το πλαίσιο φλαβονοειδών γλαβριδίνης παρέχει επίσης ομάδες υδροξυλίου και εκτεταμένη αρχιτεκτονική συζευγμένου δακτυλίου για τη σταθεροποίηση μη ζευγαρωμένων ηλεκτρονίων από είδη αντιδρώντος οξυγόνου.

Τρεις υποσχόμενες ομάδες ενώσεων PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) παρουσίασαν εξαιρετική απόδοση σάρωσης DPPH‑ και ABTS‑. Το ποσοστό σάρωσης του ABTS+ έφτασε σχεδόν το 100 %, υποδηλώνοντας σχεδόν πλήρη εξάλειψη των ελεύθερων ριζών κατιόντων. Διαφορετικές αναλογίες μάζας παράγουν ποικίλες καταστάσεις μοριακής αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο μορίων, οδηγώντας σε διαφορές στην κατάσταση έκθεσης της ομάδας υδροξυλίου και καταλήγοντας σε απόκλιση του αντιοξειδωτικού συνεργιστικού μεγέθους.

3.3 Αξιολόγηση κυτταροτοξικότητας των PhGs, της γλαβριδίνης και των μικτών παρασκευασμάτων

Η δοκιμή κυτταροτοξικότητας CCK-8 έδειξε ότι τα PhG εντός του εύρους συγκέντρωσης 62,5 ~ 500 ug/mL και η γλαβριδίνη 6,25 ~ 25 ug/mL δεν προκάλεσαν προφανή μείωση βιωσιμότητας για τις κυτταρικές σειρές B16F10 και HaCaT. Κάτω από συνθήκες συνολικής συγκέντρωσης μάζας 25 ug/mL, τρεις ομάδες αναλογίας ένωσης PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) διατήρησαν υψηλή κυτταρική βιωσιμότητα, χωρίς ανιχνεύσιμη κυτταροτοξική δράση και στα δύο στελέχη κυττάρων. Συνεπώς, επιλέχθηκαν 25 ug/mL ως ασφαλής συγκέντρωση εργασίας για μετέπειτα αξιολόγηση της κυτταρικής λειτουργίας. Για τις ομάδες ενός παράγοντα, η χαμηλή-/μέτρια-/υψηλή δόση PhGs ορίστηκε ως 125 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/mL. glabridin χαμηλή-/μέτρια-/υψηλή δόση: 6,25 ug/mL, 12,5 ug/mL, 25 ug/mL.

3.4 Επίδραση στην ενδοκυτταρική δράση της τυροσινάσης και στην περιεκτικότητα σε μελανίνη σε κύτταρα B16F10 που διεγείρονται από την UVB

Μετά τη θεραπεία με ακτινοβολία UVB, η ομάδα-μοντέλο B16F10 εμφάνισε στατιστικά σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της ενδοκυτταρικής τυροσινάσης και στη συσσώρευση μελανίνης (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Σε ενοποιημένη συνολική συγκέντρωση 25 ug/mL, οι ομάδες ενώσεων εμφάνισαν ανώτερα βιολογικά αποτελέσματα σε σχέση με τις αντίστοιχες ενός συστατικού. Μεταξύ τριών αναλογιών, το PhGs/Gla (1:1) απέδωσε το βέλτιστο αποτέλεσμα: η υπολειπόμενη ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης μόνο 23,80 %, η σχετική περιεκτικότητα σε μελανίνη μειώθηκε στο 30,90 %. Η στατιστική σύγκριση αποκάλυψε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με ομάδες ενώσεων 5:1 και 10:1. Η αναλογία 1:1 έδειξε εξέχουσα συνεργιστική ενίσχυση για τον περιορισμό της βιοσύνθεσης μελανίνης εντός των μελανοκυττάρων.

Η ακτινοβολία UVB προκαλεί ενδογενή μελανογονικό καταρράκτη σηματοδότησης των μελανοκυττάρων, ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα MITF και επάγοντας περαιτέρω την υπερέκφραση της πρωτεΐνης τυροσινάσης. Τα αποτελέσματα του κυτταρικού πειράματός μας επικύρωσαν ότι τα PhGs σε συνδυασμό με γλαβριδίνη θα μπορούσαν να αντιστρέψουν αποτελεσματικά την επαγόμενη από την UVB ενεργοποίηση της τυροσινάσης και να μειώσουν την παραγωγή μελανίνης.

3.5 Αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα στα κερατινοκύτταρα HaCaT που προκαλούνται από LPS

Η διέγερση LPS αύξησε έντονα την έκκριση IL-6 και TNF-προφλεγμονώδους-κυτταροκίνης στην ομάδα μοντέλου HaCaT (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). Το σκεύασμα 1:1 δημιούργησε μέγιστη μείωση για την απελευθέρωση IL-6 και TNF, υπερβαίνοντας το ανασταλτικό αποτέλεσμα που επιτυγχάνεται με ξεχωριστή εφαρμογή PhGs ή γλαβριδίνης.

Εξήγηση του μοριακού μηχανισμού: Το τμήμα φαινολικού-υδροξυλίου PhGs καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες που προκαλούν φλεγμονή. Επιπλέον, τα PhGs μπορούν να παρεμβαίνουν στους καταρράκτες ενδοκυτταρικής σηματοδότησης NF-κB και MAPK για να περιορίσουν τη μεταγραφή του προφλεγμονώδους γονιδίου. Η γλαβριδίνη αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της ενεργοποιημένης από το στρες κινάσης JNK και της ρ38, εμποδίζοντας τη μεταγωγή φλεγμονώδους σήματος προς τα κάτω. Η μεμονωμένη ουσία μπορεί απλώς να καταστέλλει εν μέρει την ενεργοποίηση της οδού φλεγμονώδους σήματος. Ο δυαδικός συνδυασμός παρεμβαίνει ταυτόχρονα σε πολλούς κόμβους εντός του δικτύου φλεγμονώδους σηματοδότησης, επιτυγχάνοντας συνεργιστική αντιφλεγμονώδη απόδοση.

Η δερματική φλεγμονή χρησιμεύει ως κρίσιμος οδηγός ανάντη για την εμφάνιση PIH. Οι φλεγμονώδεις κυτοκίνες που εκκρίνονται από τα κερατινοκύτταρα δρουν ως παρακρινικοί αγγελιοφόροι σηματοδότησης, διεγείροντας τα γειτονικά μελανοκύτταρα για να επιταχύνουν την παραγωγή μελανίνης και τη μεταφορά μελανοσωμάτων. Ο αποτελεσματικός μετριασμός της επιδερμιδικής φλεγμονής είναι απαραίτητος για την πρόληψη και τη βελτίωση των βλαβών υπερμελάγχρωσης. Επομένως, το αντιφλεγμονώδες πλεονέκτημα της ένωσης PhGs-glabridin προσδίδει πρόσθετη αξία για την εφαρμογή καλλυντικού υλικού κατά της μελάγχρωσης.

3.6 Αντιοξειδωτική-ενζυμική-ρυθμιστική ικανότητα υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες που προκαλείται από AAPH

Η ομάδα μοντέλου οξειδωτικού στρες AAPH έδειξε εμφανή μείωση της ενδοκυτταρικής ζωτικότητας του αντιοξειδωτικού-ενζύμου SOD και CAT (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Το δέρμα που εκτίθεται στην υπεριώδη ακτινοβολία παράγει μεγάλη ποσότητα αντιδραστικών ειδών οξυγόνου. Η περίσσεια ROS όχι μόνο οξειδώνει άμεσα τα βιομόρια που σχετίζονται με τη σύνθεση της μελανίνης, αλλά επίσης ενεργοποιεί πολλαπλές οδούς μελανογόνου σηματοδότησης. Το ενδογενές αντιοξειδωτικό-ενζυμικό σύστημα (SOD, CAT) αποτελεί τον κύριο αμυντικό φραγμό για την εξάλειψη των ενδοκυτταρικών ROS. Όταν το οξειδωτικό στρες κατακλύζει την εγγενή αντιοξειδωτική ικανότητα, η συσσώρευση ROS επιταχύνει την εξέλιξη της μελάγχρωσης. Η ένωση PhGs-glabridin όχι μόνο καθαρίζει άμεσα τις ελεύθερες ρίζες μέσω χημικής αντίδρασης φαινολικού-υδροξυλίου, αλλά επίσης επιδιορθώνει τη λειτουργία του κυτταρικού αντιοξειδωτικού-ενζυμικού συστήματος, ανακουφίζοντας τη βλάβη από το οξειδωτικό στρες από δύο διαστάσεις. Οι διαφορετικοί λόγοι μάζας αλλάζουν το μοτίβο μοριακής αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο φυσικών μορίων, με αποτέλεσμα την ασυμφωνία στην τελική ρυθμιστική αποτελεσματικότητα των αντιοξειδωτικών.

3.7 Συζήτηση για τον ολοκληρωμένο μηχανισμό για τη συνεργιστική κατά της υπερμελάγχρωσης

Η παθολογική διαδικασία της υπερμελάγχρωσης του δέρματος σχηματίζει ένα πολύπλοκο δίκτυο σηματοδότησης: η ακτινοβολία UVB δρα τόσο στα μελανοκύτταρα όσο και στα γύρω κερατινοκύτταρα. Τα κερατινοκύτταρα απελευθερώνουν ROS και προφλεγμονώδεις κυτοκίνες. Αυτά τα βιοσήματα ενεργοποιούν περαιτέρω τα μελανοκύτταρα, ρυθμίζουν προς τα πάνω τη δραστηριότητα της τυροσινάσης, ενισχύουν τη βιοσύνθεση μελανίνης και διευκολύνουν τη μεταφορά των μελανοσωμάτων προς τα επιδερμικά κερατινοκύτταρα, οδηγώντας τελικά σε ορατή εναπόθεση χρωστικής στην επιφάνεια του δέρματος. Συνεπώς, η αναστολή της τυροσινάσης ενός στόχου δεν μπορεί να αναστρέψει πλήρως την παθολογική μελάγχρωση. Η στρατηγική παρέμβασης πολλαπλών οδών θα πρέπει να ενσωματώνει την αναστολή της μελανογένεσης, την αντιφλεγμονώδη και την αντιοξειδωτική προστασία.

Τα πειραματικά μας αποτελέσματα έδειξαν ότι τα PhGs σε συνδυασμό με τη γλαβριδίνη πραγματοποιούν πολυτροπική παρέμβαση κατά της υπερμελάγχρωσης:

Να καταστέλλουν άμεσα την καταλυτική δράση της τυροσινάσης μέσα στα μελανοκύτταρα για να αναστέλλουν την πηγή βιοσύνθεσης μελανίνης.

Αναστέλλουν την υπερέκκριση προφλεγμονώδους κυτοκίνης από τα κερατινοκύτταρα, αποκόπτοντας το σήμα παρακρινής φλεγμονώδους διέγερσης προς τα μελανοκύτταρα.

Εξαλείψτε την περίσσεια ειδών αντιδραστικού οξυγόνου και ανακτήστε την ενδογενή αντιοξειδωτική-ενζυμική δράση SOD/CAT, μετριάζοντας την ενίσχυση της χρωστικής που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες.

Η αναλογία m(PhGs):m(Gla) = 1:1 εμφάνισε βέλτιστη ολοκληρωμένη συνεργιστική απόδοση σε σχέση με τη βιοχημική αναστολή ενζύμων, την απομάκρυνση ριζών, το μοντέλο χρωστικής μελανοκυττάρου, το μοντέλο φλεγμονής κερατινοκυττάρων και το οξειδωτικό μοντέλο. Αυτή η αναλογία ξεπέρασε τις ομάδες 5:1 και 10:1 σε όλους σχεδόν τους δείκτες δοκιμών. Η συνέργεια μπορεί να προέρχεται από συμπληρωματικά μοριακά δομικά χαρακτηριστικά: τα PhGs και η γλαβριδίνη διαθέτουν διακριτά πλαίσια φαινολικού σκελετού, αλληλεπιδρώντας με διαφορετικές πρωτεΐνες-στόχους (τυροσινάση, κινάσες σηματοδότησης φλεγμονής, μονοπάτια που σχετίζονται με αντιοξειδωτικά-ένζυμα). Μετά την ανάμειξη ενώσεων, η κατάσταση έκθεσης φαινολικού-υδροξυλίου βελτιστοποιείται μέσω διαμοριακής αλληλεπίδρασης, ενισχύοντας τη συνολική βιολογική δραστηριότητα.

Για την πρακτική προοπτική της βιομηχανίας καλλυντικών, οι συνεργιστικές πρώτες ύλες βοτανικής ένωσης αποφέρουν δύο σημαντικά οφέλη. Πρώτον, το συνεργιστικό αποτέλεσμα επιτρέπει τη μείωση της απαιτούμενης δόσης για κάθε μεμονωμένο δραστικό συστατικό, μειώνοντας το κόστος της σύνθεσης. Δεύτερον, το λειτουργικό προφίλ πολλαπλών οδών ταιριάζει με τον πολύπλοκο παθολογικό μηχανισμό της κλινικά παρατηρούμενης υπερμελάγχρωσης του δέρματος, όπως η PIH και το μέλασμα, προσφέροντας θεωρητική βάση για την ανάπτυξη υψηλής αποτελεσματικότητας φυσικών καλλυντικών φόρμουλας για τη λεύκανση του δέρματος.

4. Συμπέρασμα

Αυτή η έρευνα αξιολόγησε συστηματικά τη συνεργιστική βιοδραστικότητα κατά της υπερμελάγχρωσης τουΠροερχόμενο από Cistanche deserticolaφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs) σε συνδυασμό με γλαβριδίνη (Gla). Για τον πολυδιάστατο χαρακτηρισμό της αποτελεσματικότητας χρησιμοποιήθηκαν βιοχημικός έλεγχος in vitro και τρία αντιπροσωπευτικά κυτταρικά μοντέλα. Τα κύρια πειραματικά συμπεράσματα συνοψίζονται ως εξής:

Στο πλαίσιο των in vitro βιοχημικών αναλύσεων για την αναστολή της τυροσινάσης και τον καθαρισμό ελεύθερων ριζών, τα σκευάσματα ένωσης m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 παρουσίασαν ευνοϊκή ανασταλτική απόδοση και συνεργιστική δράση. Υπό συνολική συγκέντρωση 0,4 g/L σε pH 6,8 PBS, τα ποσοστά αναστολής της τυροσινάσης έφθασαν το 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). Ποσοστά σάρωσης ριζών DPPH: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. Ποσοστά απομάκρυνσης ριζών ABTS‑: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

Σε ασφαλή συγκέντρωση εργασίας 25 ug/mL, τα διαλύματα DMEM PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) δεν εμφάνισαν κυτταροτοξικότητα έναντι των κυττάρων μελανώματος B16F10 και των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων HaCaT. Μεταξύ αυτών των ομάδων, τα PhGs/Gla (1:1) πέτυχαν την καλύτερη ολοκληρωμένη αποτελεσματικότητα: η ενδοκυτταρική δραστηριότητα της τυροσινάσης μειώθηκε στο 23,80 %, η περιεκτικότητα σε μελανίνη μειώθηκε στο 30,90 %. Προκάλεσε την ισχυρότερη αναστολή της απελευθέρωσης IL-6, TNF-φλεγμονώδους κυτοκίνης και μέγιστη αποκατάσταση για τη ζωτικότητα του αντιοξειδωτικού-ενζύμου SOD και CAT. Η ομάδα αναλογίας μάζας 1:1 εμφάνισε προφανές συνεργιστικό αποτέλεσμα ενίσχυσης ανώτερο από τις ομάδες ενός παράγοντα και άλλες ομάδες αναλογίας ένωσης.

Το δυαδικό μείγμα PhGs και γλαβριδίνης ασκεί δράση κατά της υπερμελάγχρωσης του δέρματος μέσω τριών οδών: καταστέλλοντας τη βιοσύνθεση μελανίνης, ανακουφίζοντας την επιδερμική φλεγμονή και εξουδετερώνοντας τη βλάβη από το οξειδωτικό στρες. Η βέλτιστη αναλογία συνεργιστικής μάζας m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Αυτή η μελέτη παρέχει πειραματικά στοιχεία και τεχνική υποστήριξη για την ανάπτυξη πολυλειτουργικών πρώτων υλών καλλυντικών φυσικών φυτών για εφαρμογές λεύκανσης του δέρματος και κατά της μελάγχρωσης.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αριθ. επιχορήγησης. 82160772). Ευχαριστούμε το Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research για την υποστήριξη πειραματικής πλατφόρμας.

Αναφορές

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Διαχείριση υπερμελάγχρωσης: Τρέχουσες θεραπείες και αναδυόμενες θεραπείες[J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000-1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher D E. Μελάγχρωση του δέρματος και ο έλεγχός της: Από την υπεριώδη ακτινοβολία στα βλαστοκύτταρα[J]. Experimental Dermatology, 2021, 30(4):560-571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Θεραπεία μελάσμα: Μια συστηματική ανασκόπηση[J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816-1837.

[4] Hossain M R, Ansary T M, Komine M, et al. Οι διαφοροποιημένες φλεγμονώδεις οδοί που προκαλούνται από ερεθίσματα προκαλούν μελάγχρωση του δέρματος [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y, et al. Σύγκριση των ανασταλτικών ικανοτήτων της γαλλικής επιγαλλοκατεχίνης-3-γαλλικής και γαλλοκατεχίνης έναντι της τυροσινάσης και των συνδυασμένων επιδράσεών τους με το κοτζικό οξύ[J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad T F, et al. Στόχευση τυροσινάσης στην υπερμελάγχρωση: Τρέχουσα κατάσταση, περιορισμοί και μελλοντικές υποσχέσεις [J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A L, Delevoe C, Gilles-Marsens F, et al. Τα εξωσώματα που απελευθερώνονται από τα κερατινοκύτταρα ρυθμίζουν τη μελάγχρωση των μελανοκυττάρων [J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Εσωτερική και εξωγενής ρύθμιση της μελανογένεσης και της μελάγχρωσης του ανθρώπινου δέρματος [J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328-347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et al. Μια μηχανιστική προσέγγιση για την αξιολόγηση της τοξικότητας και του κινδύνου βαρέων μετάλλων, υδροκινόνης και μικροοργανισμών σε καλλυντικές κρέμες[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et al. Η ερεθιστική αντίδραση του δέρματος που προκαλείται από την υδροκινόνη θα μπορούσε να επιτευχθεί με την ενεργοποίηση των μαστοκυττάρων μέσω του συζευγμένου με τη μάζα υποδοχέα πρωτεΐνης G X2[J]. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R, et al. Βιβλιομετρική ανάλυση των επιδράσεων του ginseng στο δέρμα[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99-107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, et al. Πρόοδοι στις βιοϊατρικές λειτουργίες των φυσικών λευκαντικών ουσιών στη θεραπεία ασθενειών μελάγχρωσης του δέρματος[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J, et al. Συνεργική περιποίηση δέρματος από πολυφαινόλες Lonicera japonica και αιθανολικό εκχύλισμα Vaccinium vitis-idaea L.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, et al. Εφαρμογή συμπλεγμάτων πτητικού ελαίου Salvia miltiorrhiza και εκχυλίσματος πικραλίδας σε καλλυντικά[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen J R, Zhu X Y, Cui H Y, et al. Ανάλυση παραλλαγών ενεργών συστατικών και αντιοξειδωτικών δράσεων του Cistanche deserticola από διαφορετικές φυλές και μέρη στην επαρχία Xinjiang[J]. Food Industry Science and Technology, 2024, 45(21):227-233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y, et al. Tubuloside B, που απομονώθηκε από Cistanche tubulosa, ένας πολλά υποσχόμενος παράγοντας κατά της ενεργοποίησης των μακροφάγων Μ1 μέσω συνεργικής στόχευσης Mob1 και ERK1/2[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Μελέτη σχετικά με τους φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Herba cistanches διαδερμική χορήγηση και ανασταλτικές επιδράσεις στη σύνθεση μελανίνης σε μελάγχρωση που προκαλείται από Β σε καφέ ινδικό χοιρίδιο[D]. Urumqi: Ιατρικό Πανεπιστήμιο Xinjiang, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Συνεργικές λευκαντικές, αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις του συμπλέγματος γλαβριδίνης, ρεσβερατρόλης και πολδατίνης[J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024(3):99-107.233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Μελέτη και εφαρμογή της μεθόδου Chou-Talalay για συνδυασμό φαρμάκων κατά του όγκου[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449-453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Skin whitening agents: Medicinal chemistry view of tyrosinase inhibitors[J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403-425