Περίληψη
Να διερευνηθεί τα συνεργιστικά ανασταλτικά αποτελέσματα τουΚιστάνχη η ερημικήφαινυλαιθανοειδή γλυκοσίδια (PHGs) και glabridin (GLA) στην χρωματισμό του δέρματος, η βέλτιστη αναλογία μάζας των PHG με GLA προδιαγράφεται προκαταρκτικά διαλογήin vitroΟι δοκιμασίες αναστολής της δραστικότητας τυροσινάσης, 1, 1- διφαινυλ -2- picrylhydrazyl (dpph) ριζών και 2,2'-azino-bis (3- αιθυλβενζοζολίνη {{8} σουλφονικό οξύ) (abts) ριζοσπαστικά radiments. Περαιτέρω αξιολογήσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τρία κυτταρικά μοντέλα:

Ένα μοντέλο μελανογένεσης B16F10 που προκαλείται από UVB για την αξιολόγηση της αναστολής της μελανίνης μέσω της δραστικότητας τυροσινάσης και της περιεκτικότητας σε μελανίνη.

Ένα φλεγμονώδες μοντέλο HACAT που προκαλείται από το λιποπολυσακχαρίτη (LPS) για την αξιολόγηση των αντιφλεγμονωδών επιδράσεων μετρώντας την ιντερλευκίνη -6 (IL -6) και την καταστολή του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF-).

Ένα επαγόμενο μοντέλο οξειδωτικού στρες Hacat που προκαλείται από το AAPH (2,2'-azobis (2- Αμιδινοπροπανοπροπανοπροπανοπροπάνιο) για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής δραστικότητας μέσω της ενίσχυσης της υπεροξειδίου δισμουτάσης (SOD) και της καταλάσης (CAT).

Η βέλτιστη αναλογία μάζας PHGS/GLA ταυτοποιήθηκε μέσω αυτών των μοντέλων. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τα διαλύματα PHGS/GLA (που παρασκευάστηκαν σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά, PBS, ρΗ 6,8) σε αναλογίες μάζας 1: 1, 5: 1 και 10: 1 εμφάνισαν σημαντική αναστολή τυροσινάσης και συνεργιστικά αντιοξειδωτικά αποτελέσματα. Τα ποσοστά αναστολής τυροσινάσης ήταν 94,37%, 92,93%και 88,06%αντίστοιχα. Τα ποσοστά καθαρισμού ριζών DPPH ανήλθαν σε 89,44%, 88,72%και 88,10%. Τα ποσοστά καθαρισμού ABTS⁺ ήταν 100,13%, 100,01%και 99,87%. Στα 25 μ.Γ./ml σε DMEM, τα PhGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) δεν έδειξαν κυτταροτοξικότητα προς τα κύτταρα B16F10 ή HACAT. Εμφανίζεται η λύση PHGS/GLA (1: 1) DMEMανώτερη αναστολή τυροσινάσης(23,80% υπολειμματική δραστηριότητα), σημαντικάΜειωμένη περιεκτικότητα σε μελανίνη(30,90%) και ξεπέρασε άλλες αναλογίες και μονοθεραπείες στην καταστολή της IL -6/TNF-απελευθέρωσης και ενίσχυσης της δραστηριότητας SOD/CAT. Ο συνεργιστικός συνδυασμός των PHG και GLA ανακουφίστηκε αποτελεσματικάΥπερχρωματισμός συγγενών αναστέλλοντας τη μελανογένεση, μείωση της φλεγμονής καιενίσχυση της αντιοξειδωτικής χωρητικότητας.

Λέξεις -κλειδιά
Καπετάνιοςερημική φαινυλαιθανοειδή γλυκοσίδια; Glabridin; συνεργιστική επίδραση. αντι-μελανογένεση. αντιοξειδωτικό; αντιφλεγμονώδες. Φαρμακευτικές πρώτες ύλες

 

 

 

Καπετάνιοςερημική εξάγωΥψηλού επιπέδουφαινυλαιθανοειδή γλυκοσίδια για λεύκανση του δέρματος

Whatsapp μας για περισσότερες λεπτομέρειες

 

Πειραματικό τμήμα

1.1 Υλικά, αντιδραστήρια και όργανα

Κύτταρα μελανώματος ποντικούB16F10 (αρ. Κατάλογος: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Ανθρώπινα αθανατοποιημένα κερατινοκύτταραHACAT (Καταλόγος αριθ.: ICELL-H066), ICELL BIOSCIENCE Inc., Shanghai, Κίνα.

Cistanche φαινυλαιθανοειδή γλυκοσίδες (PHGs)καιGlabridin (GLA), Σανξί, Tianxingjian Βιολογική Χημική Τεχνολογία Α.Ε.

Τυροσινάση, Ηφασί ΒΑSΦ Βιοτεχνολογία Α.Ε.

Arbutin (ARB)καιL-τυροσίνης, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Σαγκάη, Κίνα.

1, 1- διφαινύλιο -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Ιαπωνία.

2,2'-azino-bis (3- αιθυλβενζοθειαζολίνη -6- σουλφονικό οξύ) αλάτι διαμμοούμου (Abts), Σαγκάη Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Ασκορβικό οξύ (VC), Tianjin Damao Chemical Reagent Factory.

Υπερβουλίτηκαιάνυδρη αιθανόλη, Tianjin Zhiyuan Chemical Reasent Co., Ltd.

Υδροξείδιο νατρίου, Chengdu Huayi Pharmaceutical Έκδοχο Κατασκευή Co., Ltd.

Φωσφορικό dipotassium, Σαγκάη Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-dopa, Σαγκάη Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Κιτ Κύλης Καταμέτρησης -8 (CCK8), Πεκίνο Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), 2,2'-azobis (2- μεθυλπροπιναμιδίνη) Διϋδροχλωρίδιο (AAPH),λιποπολυσακχαρίτης (LPS), Πεκίνο Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

Μέσο υψηλής γλυκόζης DMEM, Thermo Fisher Scientific (Κίνα).

Εμβρυϊκός ορός βοοειδών (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Διάλυμα πενικιλλίνης, Σαγκάη Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Ανθρώπινη il -6 elisa κιτ, ανθρώπινο κιτ TNF-ELISA,ανθρώπινη γάτα elisa κιτΠερίπου, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Συνολική δοκιμασία δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD), Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Όλα τα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικών βαθμών.

Χρησιμοποιούνται όργανα:

Multiskan FC Full-Length Microplate ReaderκαιHeracell 371 CO2 Incubator, Thermo Fisher Scientific, ΗΠΑ.

KQ -200 VDB Ultrasonic Cleaner, Kunshan υπερήχων Instruments Co., Ltd.

DVKW-D -2 Ψηφιακό θερμοστατικό υδατό, Πεκίνο Yongguangming Medical Instrument Factory.

DHG -9246 Ένα ηλεκτρικό θερμοστατικό φούρνο ξήρανσης έκρηξης, Σαγκάη Jinghong Πειραματικός Εξοπλισμός Co., Ltd.

KN4006B UVB Ultraviolet Radiation Instrument(ένταση ακτινοβολίας: 8 MW/cm2), Xuzhou Kenuo Medical Intrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Μέθοδοι

Πρώτον, τα PHG και GLA διαλύθηκαν είτε σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS, pH =6.{0}}. 0 0 1, 0.. Στη συνέχεια, τα phgs και το gla αναμίχθηκαν σε αναλογίες τουm (phgs): m (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 και 1:40, για την προετοιμασία διαλυμάτων PHGS/GLA με συνολική συγκέντρωση μάζας0.4 g/L, ετικέτα ωςPhgs/gla (40: 1) ~ phgs/gla (1:40), αντίστοιχα.

 

1.3 βιοχημικά πειράματα

1.3.1 Δοκιμασία αναστολής δραστικότητας τυροσινάσης

Σε ένα 96- καλά πλάκα,50 μΐ του διαλύματος δείγματος δοκιμής, 50 μΐ PBS (ph =6. 8),50 μΐ διαλύματος L-τυροσίνης (1 g/L)προστέθηκαν διαδοχικά. Η πλάκα επωάστηκε σε λουτρό 37 μοιρών για 10 λεπτά. Τότε,5 0 μL διαλύματος τυροσινάσης (0,4 g/L, ισοδύναμο με 200 U/ml)Προστέθηκε και η πλάκα επωάστηκε και πάλι στο υδατόλουτρο 37 μοιρών για άλλα 10 λεπτά.

Arbutin (ARB)χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος καιPBS (ph =6. 8)χρησιμοποιήθηκε ως κενός έλεγχος.

Η απορρόφηση του διαλύματος στο490 νανομετραμετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάνων και ο ρυθμός αναστολής τυροσινάσης in vitro (%) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (1).

 

 

Στον τύπο:

Μια αντίδραση _είναι η απορρόφηση του διαλύματος δείγματος που περιέχει διάλυμα διαλύματος L-τυροσίνης, PBS και τυροσινάσης.

A _ Έλεγχος αντίδρασηςείναι η απορρόφηση του διαλύματος δείγματος που περιέχει διάλυμα L-τυροσίνης και PBS χωρίς διάλυμα τυροσινάσης.

A _ κενόείναι η απορρόφηση του διαλύματος που περιέχει διάλυμα διαλύματος L-τυροσίνης, PBS και τυροσινάσης χωρίς το δείγμα.

A _ κενό έλεγχοείναι η απορρόφηση του διαλύματος που περιέχει διάλυμα L-τυροσίνης και PBS χωρίς το διάλυμα δείγμα και τυροσινάση.

1.3.2 Προσδιορισμός της δραστηριότητας καθαρισμού ελεύθερων ριζών DPPH

Πρώτον, {{0}}. 0197 g (0,05 mmol) DPPH ζυγίστηκε με ακρίβεια και διαλύθηκε σε 250 ml άνυδρου αιθανόλης για την παρασκευή ενός διαλύματος εργασίας DPPH με συγκέντρωση0. 2 mmol/l.

Στη συνέχεια, τα PHG και GLA διαλύθηκαν σε 50% αιθανόλη για την παρασκευή διαλυμάτων αιθανόλης των PHG και GLA με συγκεντρώσεις μάζας{0}}. 0 0 1, 0.. Τα διαλύματα αιθανόλης του VC παρασκευάστηκαν με τον ίδιο τρόπο.

Στη συνέχεια, τα διαλύματα αιθανόλης των PHG και GLA αναμίχθηκαν σε αναλογίες τουm (λύση phgs): m (διάλυμα GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Για να ληφθούν 9 διαλύματα αιθανόλης των PHGS/GLA με διαφορετικές αναλογίες μάζας, επισημασμένα ωςPhgs/gla (40: 1) ~ phgs/gla (1:40).

Τελικά,100 μΐ κάθε διαλύματος δείγματοςκαι100 μΐ της λύσης λειτουργίας DPPHπροστέθηκαν σε μια πλάκα {0}} καλά, αναμειγνύονται ομοιόμορφα και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Η απορρόφηση στο517 νμμετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών. Το VC χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Ο ρυθμός καθαρισμού ελεύθερων ριζών DPPH (%) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (2).

 

Στον τύπο:

A1είναι η απορρόφηση του διαλύματος δείγματος + διάλυμα εργασίας DPPH.

A2είναι η απορρόφηση 50% διαλύματος αιθανόλης + DPPH.

A3είναι η απορρόφηση του διαλύματος δείγματος + 50% αιθανόλη.

 

1.3.3 Προσδιορισμός της δραστηριότητας καθαρισμού ελεύθερων ριζών ABTS⁺

Πρώτα,1 g (1,82 mmol) του ABTSδιαλύθηκε σε απιονισμένο νερό για να παρασκευαστεί ένα διάλυμα εργασίας ABTS με τελική συγκέντρωση7.4 mmol/L. 0. 5 g υπερουλφικού καλίουδιαλύθηκε σε απιονισμένο νερό για να παρασκευαστεί ένα διάλυμα εργασίας υπερχειοφόρου καλίου με τελική συγκέντρωση2.6 μμολ/Λ. Οι ίσοι όγκοι του διαλύματος λειτουργίας ABTS και του διαλύματος υπερπαμβικού καλίου αναμειγνύονται και αφέθηκαν να αντιδράσουν στο σκοτάδι για 12 ώρες για να προετοιμαστούν η λύση εργασίας Abts⁺.

Στη συνέχεια, διαλύματα αιθανόλης των PHGS, GLA και VC, καθώς και διαλύματα αιθανόλης PHGS/GLA με αναλογίες τουPhgs/gla (40: 1) ~ phgs/gla (1:40), παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε στην ενότητα 1.3.2.

Τελικά,40 μΐ κάθε διαλύματος δείγματοςκαι160 μΐ της λύσης εργασίας Abts⁺προστέθηκαν σε μια πλάκα 96- καλά, αναμεμειγμένη ομοιόμορφα και αντέδρασε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 6 λεπτά. Η απορρόφηση του διαλύματος στο734 νμμετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών.

Το ποσοστό καθαρισμού ελεύθερων ριζών ABTS⁺ υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (3).

 

 

Στον τύπο:

A1είναι η απορρόφηση του διαλύματος δείγματος + λύση εργασίας ABTS⁺.

A2είναι η απορρόφηση του απιονισμένου νερού + ABTS⁺ Λύση εργασίας.

A3είναι η απορρόφηση του διαλύματος δείγματος + απιονισμένο νερό.

1.4 πειράματα κυττάρων

1.4.1 Κυτταρική καλλιέργεια

Μετά την αναζωογόνηση των κυττάρων B16F10 και HACAT, σπέρθηκαν σε μέσο υψηλής γλυκόζης DMEM (που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και διάλυμα 1% πενικιλλίνης-στροφομυκίνης) και καλλιεργήθηκε στο37 βαθμοί, 5% CO2,70% υγρασίαΣε ένα φυτώριο για 24 ώρες. Η κατάσταση ανάπτυξης των κυττάρων παρατηρήθηκε υπό μικροσκόπιο και πραγματοποιήθηκαν μεσαίες μεταβολές ή διέλευση ανάλογα με τις απαραίτητες με βάση την κατάσταση ανάπτυξης των κυττάρων.

1.4.2 Πειραματική ομαδοποίηση

Η λογαριθμική φάση B16F10 και τα κύτταρα HACAT σπέρθηκαν σε 96- καλά πλάκες σε κατάλληλη πυκνότητα κυττάρων και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες για να επιτρέψουν την προσκόλληση των κυττάρων. Δείγματα διαλύματα με διαφορετικές συγκεντρώσεις παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μέσο DMEM.

Οι πειραματικές ομάδες ήταν οι εξής:

Κανονική ομάδα

Μοντέλο ομάδας

Ομάδα χαμηλής δόσης PHGS(125 ug/ml)

Ομάδα μέσης δόσεων PHGS(250 ug/ml)

Ομάδα υψηλής δόσης PHGS(500 ug/ml)

Ομάδα χαμηλής δόσης GLA(6.25 UG/ml)

Ομάδα μέσης δόσης GLA(12,5 ug/ml)

Ομάδα υψηλής δόσης GLA(25 ug/ml)

Ομάδα PHGS/GLA (1: 1)(25 ug/ml)

Ομάδα PHGS/GLA (5: 1)

Ομάδα PHGS/GLA (10: 1)

Για τοΜοντέλο χρωματισμού που προκαλείται από UVB σε κύτταρα B16F10, τα κύτταρα ομάδας μοντέλων υποβλήθηκαν σε αγωγή με30 μΐ PBS (ph =7. 4)και ακτινοβολείται κάτω από ένα UVB Ultraviolet Radiation Instrument στο3 cm κάτω από τη συσκευήγια110 δευτερόλεπτα. Οι πειραματικές ομάδες υποβλήθηκαν σε προκατεργασία με100 μΐ διαφορετικών διαλυμάτων δείγματοςγια 1 ώρα πριν προσθέσετε30 μΐ PBSκαι ακτινοβολία κάτω από τη συσκευή UVB για 110 δευτερόλεπτα. Η κανονική ομάδα υποβλήθηκε σε αγωγή συνεχώς με μέσο DMEM υψηλής γλυκόζης και η κενή ομάδα δεν περιείχε κύτταρα αλλά αντικαταστάθηκε με ίση ποσότητα μέσου.

Για τοΜοντέλο φλεγμονής που προκαλείται από LPS σε κύτταρα Hacat, η ομάδα μοντέλου υποβλήθηκε σε θεραπεία20 UG/ML LPS PBS Solutionγια 24 ώρες. Οι πειραματικές ομάδες υποβλήθηκαν σε προκατεργασία με100 μΐ διαφορετικών διαλυμάτων δείγματοςγια 24 ώρες πριν προσθέσετε20 UG/ML LPS διάλυμαγια άλλες 24 ώρες. Η κανονική ομάδα υποβλήθηκε σε συνεχή αγωγή με μέσο DMEM υψηλής γλυκόζης και η κενή ομάδα δεν περιείχε κύτταρα αλλά αντικαταστάθηκε με ίση ποσότητα μέσου.

Για τοΜοντέλο οξειδωτικού στρες που προκαλείται από AAPH σε κύτταρα hacat, η ομάδα μοντέλου υποβλήθηκε σε θεραπεία25 mmol/l διάλυμα AAPHγια 24 ώρες. Οι πειραματικές ομάδες υποβλήθηκαν σε προκατεργασία με100 μΐ διαφορετικών διαλυμάτων δείγματοςγια 24 ώρες πριν προσθέσετε25 mmol/l διάλυμα AAPHγια άλλες 24 ώρες. Η κανονική ομάδα υποβλήθηκε σε συνεχή αγωγή με μέσο DMEM υψηλής γλυκόζης και η κενή ομάδα δεν περιείχε κύτταρα αλλά αντικαταστάθηκε με ίση ποσότητα μέσου.

Κάθε ομάδα δημιουργήθηκε με3 Αντιγραφή πηγαδιώνκαι καλλιεργήθηκε στο37 βαθμοί, 5% CO2,70% υγρασίασε ένα φυτώριο.

1.4.3 Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Η κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τοΜέθοδος CCK8. Η λογαριθμική φάση B16F10 και τα κύτταρα HACAT αφομοιώθηκαν με0. 25% θρυψίνηγια 3 λεπτά. Αφού η πέψη σταμάτησε με το μέσο, ​​τα κύτταρα επανειλημμένα πιπέτα για να παρασκευάσουν ένα εναιώρημα κυττάρων με πυκνότηταΚύτταρα 1 × 10⁴/mL. Τα κύτταρα ήταν ομοιόμορφα σπέρθηκαν σε 96- καλά πλάκες στο100 μΐ ανά πηγάδι, και PBS προστέθηκε στα περιφερειακά πηγάδια. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων, προστέθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις δείγματος διαλύματος, με3 αντιγραφούν πηγάδια ανά ομάδα, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο37 βαθμοί, 5% CO2,70% υγρασίαγια24, 48 και 72 ώρεςπριν απορρίψει το μέσο.

Για όλες τις ομάδες,100 μΐ μέσου υψηλής γλυκόζης CCK8 DMEM (που περιέχει 10% CCK8)προστέθηκε και επωάστηκε για60 λεπτά. Η απορρόφηση του διαλύματος στο450 nmμετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (4).

 

Στον τύπο:

A _είναι η απορρόφηση του φρεατίου που περιέχει τα κύτταρα, το διάλυμα CCK8 και το διάλυμα δείγματος.

A _ κενόείναι η απορρόφηση του διαλύματος που περιέχει φρεάτιο και του διαλύματος CCK8 αλλά χωρίς κύτταρα.

A0είναι η απορρόφηση του φρεατίου που περιέχει τα κύτταρα και το διάλυμα CCK8 αλλά χωρίς το διάλυμα δείγματος.

1.4.4 Δοκιμασία δραστηριότητας τυροσινάσης

Η μέθοδος L-DOPA χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της δραστικότητας τυροσινάσης. Μετά τη θεραπεία των κυττάρων για48 ώρεςΌπως περιγράφεται στην ενότητα 1.4.2, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα πηγάδια πλύθηκαν δύο φορές με PBS (ph =7. Τότε,50 μΐ 1% Triton x -100 λύσηπροστέθηκε σε κάθε πηγάδι και τοποθετήθηκε αμέσως σε καταψύκτη -80 μοιρών για30 λεπτά. Τα κύτταρα αποψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για να προκαλέσουν λύση.

Μετά την προαγωγία στο37 βαθμοίγια5 λεπτά, 10 μΐ διαλύματος 10 mmol/L L-dopaπροστέθηκε σε κάθε πηγάδι και επωάστηκε στο37 βαθμοί, 5% CO2 και 70% υγρασίαγια1 ώρα. Η απορρόφηση στο475 νανομετραμετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκετρεις φορές, και η δραστικότητα τυροσινάσης (%) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (5).

Στον τύπο:

Ένα πείραμα _είναι η απορρόφηση του φρεατίου που περιέχει κύτταρα και του διαλύματος δείγματος υπό ακτινοβολία UVB.

A _ κανονικόείναι η απορρόφηση των κυττάρων που περιέχουν πηγάδι και του διαλύματος δείγματος χωρίς ακτινοβολία UVB.

A _ κενόείναι η απορρόφηση του μέσου που περιέχει πηγάδι αλλά χωρίς κύτταρα.

 

1.4.5 Μέτρηση περιεχομένου μελανίνης

Η μέθοδος λύσης NaOH χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της περιεκτικότητας σε μελανίνη. Μετά τη θεραπεία των κυττάρων για72 ώρεςΌπως περιγράφεται στην ενότητα 1.4.2, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα πηγάδια πλύθηκαν δύο φορές με PBS.100 μΐ υδατικού διαλύματος ΝαΟΗ που περιέχει 10% DMSO (1 mol/L)προστέθηκε σε κάθε πηγάδι και το πιάτο τοποθετήθηκε σε έναΦούρνος 90 μοιρώνγια1 ώρα. Η απορρόφηση στο490 νανομετραμετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκετρεις φορές, και η περιεκτικότητα σε μελανίνη (%) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (5).

 

1.5 Μέτρηση φλεγμονωδών παραγόντων και δεικτών οξειδωτικού στρες

Μετά τη θεραπεία των κυττάρων για48 ώρεςΌπως περιγράφεται στην ενότητα 1.4.2,Κύτταρα hacatΑπό κάθε ομάδα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ξύστρα κυττάρων, φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Οι συγκεντρώσεις των IL -6 και TNF- μετρήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες των κιτ ELISA.

Μετά τη θεραπεία των κυττάρων για48 ώρες, Τα κύτταρα HaCat συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ξύστρα κυττάρων, υποβλήθηκαν σε επαναλαμβανόμενους κύκλους απόψυξης για να προκαλέσουν λύση κυττάρων και φυγοκεντρήθηκαν στο12, 000 rpm για 10 λεπτά σε 4 μοίρες. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και οι δραστηριότητες τουΧΛΟΟΤΑΠΗΤΑΣκαι συγκεντρώσειςΓΑΤΑμετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τις οδηγίες ELISA Kit.

 

1.6 Μέτρηση δείκτη συνδυασμού

ΟΜέθοδος συνδυασμού (CI)[20] χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί εάν ο συνδυασμός των PHG και GLA σε διαφορετικές αναλογίες μάζας εμφάνισε συνεργιστικές επιδράσεις στην αναστολή της δραστικότητας και της αντιοξείδωσης της τυροσινάσης. Ο δείκτης συνδυασμού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (6).

 

Στον τύπο:

D1καιD2αντιπροσωπεύουν τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις (G/L) των δύο φαρμάκων στη θεραπεία συνδυασμού που απαιτείται για την επίτευξηX% δραστηριότητα.

Dxαντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση (g/l) κάθε μεμονωμένης ουσίας όταν χρησιμοποιείται μόνη της για να επιτευχθείX% δραστηριότητα.

ΟΛογισμικό Compusynχρησιμοποιήθηκε για υπολογισμούς:

CI> 1υποδεικνύει ένα ανταγωνιστικό αποτέλεσμα.

CI {0}}υποδεικνύει ένα πρόσθετο αποτέλεσμα.

CI <1υποδεικνύει ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα.

 

1.7 Ανάλυση δεδομένων

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως"Μέση ± τυπική απόκλιση (x̄ ± s)", και οι συζητήσεις βασίστηκαν στις μέσες τιμές.

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώνταςGraphPad Prism 9.5. 0. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA (ανάλυση διακύμανσης) για συγκρίσεις μεταξύ πολλαπλών ομάδων. ΕΝΑP-value <0. 05θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.