Η παρατεταμένη τοπική αναστολή της θρομβίνης διατηρεί τη νεφρική μικροαρχιτεκτονική και τη λειτουργία μετά την έναρξη της οξείας νεφρικής βλάβης

Επικοινωνία: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ο Ian Vargas et al

Αφηρημένη

Οξεία νεφρική βλάβηΗ διαχείριση (ΑΚΙ) παραμένει κυρίως υποστηρικτική καθώς κανένας συγκεκριμένος θεραπευτικός παράγοντας που να κατευθύνεται σε μοναδικές οδούς σηματοδότησης δεν έχει επιτύχει σε κλινικές δοκιμές. Εδώ, αναφέρουμε ότι η αναστολή της θρομβίνης και της φλεγμονώδους σηματοδότησης με τη χρήση νανοσωματιδίων υπερφθοράνθρακα στοχευμένων στη θρομβίνη (PFC NP) τοπικής δράσης προστατεύει τα νεφρικά αγγεία και ρυθμίζει σε μεγάλο βαθμό διάφορες φλεγμονώδεις διεργασίες που προκαλούν τραυματισμό νεφρικής ισχαιμίας-επαναδιάχυσης. Κάθε PFC NP συμπλοκοποιήθηκε με~13.650 αντίγραφα του άμεσου αναστολέα θρομβίνης, PPACK (προλίνη-φαινυλαλανίνη-αργινίνη-χλωρομεθυλ-κετόνη). Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μετά την έναρξη του AKI με PPACK PFC NP εμφάνισαν μειωμένες διηθήσεις VCAM-1, ICAM-1, προστανοειδές PGD2, M-CSF, IL-6 και μαστοκύτταρα. Η μικροαγγειακή αρχιτεκτονική, οι σωληνοειδείς βασικές μεμβράνες και τα εξαρτήματα περιγράμματος βούρτσας διατηρήθηκαν καλύτερα. Η μη επαναιμάτωση μειώθηκε όπως υποδεικνύεται από τη μειωμένη παγίδευση ερυθρών αιμοσφαιρίων και τον μη αιμικό σίδηρο.Νεφρόη λειτουργία και η σωληναριακή νέκρωση βελτιώθηκαν στις 24 ώρες έναντι της ομάδας ελέγχου που δεν έλαβε θεραπεία, υποδηλώνοντας ένα όφελος για τη διπλή αναστολή της θρόμβωσης και της φλεγμονής από το PPACK PFC NP.

Λέξεις-κλειδιά: Οξεία νεφρική βλάβη; Θρόμβωση; Φλεγμονή; Νανοσωματίδια υπερφθοράνθρακα; Βλάβη σκάφους

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Οξεία νεφρική βλάβη(AKI) είναι ένα συχνό κλινικό πρόβλημα τόσο σε νέους όσο και σε ηλικιωμένους με αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης και απαράδεκτα υψηλό ποσοστό θνησιμότητας που δεν έχει βελτιωθεί ουσιαστικά εδώ και δεκαετίες. ονεφρόως συνέπεια ενός αριθμού προσβολών, συμπεριλαμβανομένων της υπότασης, της σήψης, των τοξινών, κ.λπ.3 Το AKI προκαλεί μια σύνθετη πανοπλία παθοφυσιολογικών μοριακών παικτών και σηματοδοτικών γεγονότων σε μια διαδικασία ασθένειας που εξελίσσεται με την πάροδο του χρόνου σε στάδια.3–6 Επιλεκτική και ειδική μοριακά στοχευμένη ιατρική θεραπείες για ΑΚΙ δεν υπάρχουν ακόμη, παρά την πιεστική ιατρική ανάγκη.7 Πράγματι, μετά από χρόνια προκλινικών και κλινικών ερευνητικών προσπαθειών, οι τρέχουσες θεραπείες παραμένουν ουσιαστικά υποστηρικτικές.

Εδώ υποθέτουμε ότι οι θεραπευτικές παρεμβάσεις που βασίζονται σε νανοσωματίδια που στοχεύουν στη θρομβίνη που μπορούν να διατηρήσουν τη μικροαγγειακή ακεραιότητα και τη λειτουργία φραγμού και ταυτόχρονα να μειώσουν τη φλεγμονώδη σηματοδότηση θα ωφελήσουν τα αποτελέσματα του AKI. Η θρομβίνη είναι ένα κύριο αθηρογόνο και επουλωτικό μόριο πληγών που οδηγεί πολλά άλλα φλεγμονώδη μόρια που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση του ενδοθηλίου μετά από τραυματισμό, όπως η οξειδάση NF-κB, 8 NADPH,⁹

και άλλοι μέσω υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάση (PAR-1) τόσο στο ενδοθήλιο όσο και στα μακροφάγα.10,11 Όλοι οι τύποι κυττάρων στονεφρόβίωσε αλλαγές στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης, οι οποίες περιλαμβάνουν αυξημένη έκφραση δεικτών τραυματισμού και αναπτυξιακών γονιδίων όπως φαίνεται από τους Rudman-Melnick et al σε μια μελέτη αλληλουχίας μονοκυττάρου χρόνου για μονόπλευρη ισχαιμία-επαναιμάτωσηνεφρότραυματισμός.12 Επιπλέον, μια μελέτη τρωκτικών αλληλουχίας RNA μονού πυρήνα σε αμφοτερόπλευρη νεφρική βλάβη ισχαιμίας-επαναιμάτωσης13 εντόπισε έναν συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων εγγύς σωληνάριο που υπερέκφραζε γονίδια προφλεγμονής και προφηβωτικά μετά από τραυματισμό θερμής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η φλεγμονή πρέπει να αντιπροσωπεύει έναν χρήσιμο θεραπευτικό στόχο. Παρόλο που ο σχηματισμός συμπαγών ενδαγγειακών θρόμβων φαίνεται ασυνήθιστος στο AKI, υποθέσαμε περαιτέρω ότι ο μετριασμός της μικροαγγειακής προπηκτικής δραστηριότητας μέσω τοπικά δρώντων ισχυρών ανταγωνιστών νανοσωματιδίων αντι-θρομβίνης14-17 μπορεί να βελτιώσει τη ροή του αίματος, να μειώσει τη "μη επαναρροή" και να εξασθενήσει τη φλεγμονώδη σηματοδότηση. νεφρική λειτουργία.

Τα κρίσιμα ζητήματα που αντιμάχονται την εφαρμογή άμεσων αναστολέων θρομβίνης για την πρόληψη της βλάβης νεφρικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (IRI) περιλαμβάνουν τις πιθανές τοξικές παρενέργειές τους και τον συστηματικό κίνδυνο αιμορραγίας. Όσον αφορά τη θρόμβωση, οι συμβατικές αντιπηκτικές θεραπείες δεν ήταν ιδιαίτερα επιτυχείς, αν και η διαλυτή θρομβομοντουλίνη μπορεί να ασκήσει αντιπροστατευτικές δράσεις,18,19 όπως μπορεί να ενεργοποιήσει την πρωτεΐνη C,20,21 και την αντιθρομβίνη III,22, αν και με πιθανές επιπλοκές υπερβολικής αιμορραγίας.21 Επιπλέον, τόσο στον πόλεμο όσο και dabigatran έχουν συσχετιστεί με νεφρική τοξικότητα.^23,24Ωστόσο, το γεγονός ότι αυτές οι αντιπηκτικές προσεγγίσεις δεν έχουν ακόμη πετύχει κλινικά δεν μειώνει τη δυνητική αξία της θρομβίνης ως στόχου, λόγω των διπλών λειτουργιών της τόσο στην πήξη όσο και στη φλεγμονή. Αν και δεν υπάρχει κλινική μελέτη σχετικά με τη θεραπεία με VEGF για το AKI, μια προκλινική μελέτη έδειξε ότι ο VEGF είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής στην επαναπροστασία κατά τη διάρκεια της AKI,25 που υποστηρίζει περαιτέρω τον προτεινόμενο υποθετικό θεραπευτικό μηχανισμό διατήρησης νεφρικών αγγείων για την προστασία της νεφρικής λειτουργίας κατά τη διάρκεια της AKI.

Έχουμε αναπτύξει μια σταθερή, βιοσυμβατή και μη νεφροτοξική πλατφόρμα νανοσωματιδίων υπερφθοράνθρακα (PFC NP) που αναστέλλει τη δραστηριότητα πρωτεάσης της θρομβίνης χωρίς να προκαλεί αιμορραγική διάθεση. πυρήνα και ένα εξωτερικό κέλυφος φωσφολιπιδικής-επιφανειοδραστικής ουσίας και με διάμετρο από ~160-250 nm. Σε πρόσφατες προκαταρκτικές μελέτες AKI, χορηγήσαμε PFC NP αντι-θρομβίνης ως προθεραπεία για να επιβεβαιώσουμε ότι η θρομβίνη είναι ένας πολύτιμος στόχος για την επιτάχυνση της αποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας εν μέρει με τη διατήρηση της μικροαγγειακής ακεραιότητας και τη μείωση της μη επαναιμάτωσης στην IRI όταν χορηγείται πριν από την ισχαιμία-επαναδιάχυση τραυματισμός.16 Το αντιθρομβινο PFC NPS προστατεύει επίσης τα νεφρικά αλλομοσχεύματα από IRI και εμφανίζει σημαντική μείωση στο ποσοστό της παρεγχυματικής σωληναριακής νέκρωσης που σχετίζεται με αυξημένη μακροζωία νεφρού μετά τη μεταμόσχευση.27 Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν αυτό το νανοσωματίδιο κατά της θρόμβωσης είναι ακόμα αποτελεσματικό μετά την έναρξη της ΑΚΙ, η οποία αντιπροσωπεύει ένα εντελώς διαφορετικό σύνολο πληθυσμών ασθενών.

Αντίστοιχα, στην παρούσα εργασία, επιδιώξαμε να επεκτείνουμε τη χρήση αυτής της προσέγγισης σε καθιερωμένη AKI μετά την IRI για να διασαφηνίσουμε τις δυνατότητές της για κλινική μετάφραση. Για απόδειξη της ιδέας, χρησιμοποιούμε το PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-χλωρομεθυλοκετόνη) ως το τμήμα αντιθρομβίνης για σύζευξη με το PFC NP, το οποίο αποδείξαμε ότι αποτρέπει τη σηματοδότηση θρομβίνης και τη μικροαγγειακή θρόμβωση σε μοντέλα αθηροσκλήρωσης και οξείας νεφρικής βλάβης. AKI).14-17 Η ίδια η PPACK είναι ένας πολύ γνωστός άμεσος και μη αναστρέψιμος αναστολέας θρομβίνης, ο οποίος σε ελεύθερη μορφή αποβάλλεται πολύ γρήγορα από το νεφρό για να είναι χρήσιμος ως θεραπευτικός παράγοντας.14,15 Εδώ διευκρινίζουμε τις πρώιμες παθοφυσιολογικές αποκρίσεις σε Η θεραπεία PPACK PFC NP που περιορίζει τα φλεγμονώδη συμβάντα σηματοδότησης τόσο στους νεφρούς όσο και συστηματικά, διατηρεί τη νεφρική μικροαρχιτεκτονική και μειώνει τη αγγειακή βλάβη. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι αυτή η βασισμένη σε νανοσωματίδια θεραπευτική προσέγγιση για την τρέχουσα AKI θα μπορούσε να θέσει το στάδιο για την κλινική ανάπτυξη ενός παράγοντα αντιθρομβίνης που ασκεί τοπικά περιορισμένα πλειοτροπικά αποτελέσματα και μπορεί να χορηγηθεί με ασφάλεια στις πρώιμες φάσεις του AKI.

Μέθοδοι

Σκεύασμα νανοσωματιδίων

Τα νανοσωματίδια υπερφθοράνθρακα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως.14 Εν συντομία, ένα μίγμα λιπιδίων 98,5 mol τοις εκατό L- - φωσφατιδυλοχολίνης αυγού και 1,5 mol τοις εκατό 1,2-διστεαροϋλ σνγλυκερο{{8}φωσφοαιθανολαμίνης καρβοξυ(πολυαιθυλενογλυκόλη)-2000] (άλας νατρίου) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) παρασκευάστηκε σε χλωροφόρμιο: μεθανόλη (3:1), πριν ξηρανθεί για να σχηματίσει λιπιδικό φιλμ υπό κενό. Το λιπιδικό φιλμ (2 τοις εκατό (β/όγκ)) στη συνέχεια συνδυάστηκε με PFOB (20 τοις εκατό (όγκος/όγκος)) (Exfluor Research Corp.) (γλυκερίνη 1,7 τοις εκατό (β/όγκ)) (Sigma, St. Louis, ΜΟ ), και νερό MilliQ, πριν γαλακτωματοποιηθούν (Microfluidics Inc) σε πάγο για 4 λεπτά στα 20,000 psi. Για να λειτουργικοποιήσουμε το νανοσωματίδιο με σύζευξη PPACK, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο σύζευξης αμίνης-καρβοξυλίου. Τα νανοσωματίδια (1 ml) αναμίχθηκαν πρώτα με 2 mg EDCI 1-[3-(Διμεθυλαμινο)προπυλ]-3-μεθυοδιδίου αιθυλικού καρβοδιιμιδίου (Sigma, St. Louis, MO) για 1 ώρα , πριν προσθέσετε 12,5 mg PPACK (BACHEM, Torrance, CA) σε θερμοκρασία δωματίου τροχιακού αναδευτήρα όλη τη νύχτα. Πραγματοποιήθηκε αιμοκάθαρση με αποκοπή μοριακού βάρους 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) για την απομάκρυνση της περίσσειας EDCI και PPACK. Λεπτομερής μέθοδος σύνθεσης συμπεριλήφθηκε στα Συμπληρωματικά Υλικά.

Το μοντέλο οξείας νεφρικής βλάβης

Ενήλικα ποντίκια C57BL/6 (n=22) υποβλήθηκαν σε αμφοτερόπλευρη θερμή νεφρική ισχαιμία-επαναιμάτωση για να προκληθεί οξεία νεφρική βλάβη. Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με κοκτέιλ κεταμίνης (85 mg/kg) και ξυλαζίνης (13 mg/kg) πριν υποβληθούν σε λαπαροτομία για να προκληθεί θερμή ισχαιμία για 17 λεπτά. Εισήχθη μια μέση κοιλιακή τομή για να εκτεθούν τόσο η νεφρική αρτηρία όσο και η φλέβα. Η νεφρική ισχαιμία προκλήθηκε από αποφρακτικούς σφιγκτήρες τόσο στην αρτηρία όσο και στη φλέβα για περιορισμό της ροής του αίματος στο νεφρό. Η επιτυχής διακοπή της ροής του αίματος στα νεφρά επιβεβαιώθηκε οπτικά με μια αλλαγή του χρώματος των νεφρών από ροζ σε σκούρο μωβ. Η θερμοκρασία του σώματος των ποντικών διατηρήθηκε στους 37 βαθμούς χρησιμοποιώντας ένα σύστημα θέρμανσης μικρού ζώου. Οι σφιγκτήρες απελευθερώθηκαν μετά από 17 λεπτά για να επιτρέψουν την αποκατάσταση της ροής του αίματος στα νεφρά, κάτι που επιβεβαιώθηκε από την αλλαγή του χρώματος των νεφρών σε ροζ. Το χειρουργικό τραύμα στη συνέχεια κλείστηκε σε στρώματα και τα ζώα παρακολουθήθηκαν και επέστρεψαν στο κλουβί μετά από ελεύθερη μετακίνηση. Μετά από επαναιμάτωση για 2 ώρες, μία εφάπαξ δόση PPACK

PFC NP ({{0}}.5 ml/kg PFC NP· 0,05 mg/kg PPACK) ή απλό (μάρτυρα) PFC NP χορηγήθηκε ενδοφλεβίως με ένεση στην ουραία φλέβα. Εφόσον η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι μια εφάπαξ προληπτική δόση PPACK PFC NP εμφάνιζε νεφρικά προστατευτικά αποτελέσματα,16 εφαρμόσαμε μια θεραπεία με μία δόση μετά την έναρξη της ΑΚΙ για να αξιολογήσουμε την νεφρική προστατευτική της δράση. Οι διαδικασίες και τα πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα.

Συλλογή και συντήρηση ιστού 24 ώρες μετά τη χορήγηση νανοσωματιδίων, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι νεφροί εκχυλίστηκαν για ανάλυση. Πριν από την αφαίρεση του νεφρού για ιστολογικές και μοριακές αξιολογήσεις, συλλέχθηκε αίμα μέσω καρδιακής παρακέντησης για ανάλυση ορού κατάντη και, στη συνέχεια, κάθε ποντίκι εγχύθηκε συστηματικά με φυσιολογικό ορό (Cat#: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) έως ότου υπολειπόταν αίμα ξεπλύθηκε από τα νεφρά. Για τη συλλογή ορού, το πλήρες αίμα θρομβώθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, πριν φυγοκεντρηθεί στα 2000 ×g για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς. Ο ορός που συλλέχθηκε αποθηκεύτηκε στους -80 βαθμούς πριν από τις αξιολογήσεις αζώτου ουρίας αίματος και κυτοκίνης. Για ιστολογική ανάλυση, οι αποκομμένοι νεφροί στερεώθηκαν σε φορμαλίνη 10 τοις εκατό, πριν από την επεξεργασία του ιστού, την ενσωμάτωση σε παραφίνη και την τομή. Για αξιολογήσεις εικοσανοειδών, οι αποκομμένοι νεφροί ανατέμθηκαν περαιτέρω για να διαχωριστεί ο φλοιός και ο μυελός, προτού καταψυχθούν γρήγορα σε υγρό άζωτο και αποθηκευτούν στους -80 βαθμούς για ανάλυση.

Ιστολογία

Λεπτομερής ιστολογική χρώση και μέθοδοι ανάλυσης δεδομένων συμπεριλήφθηκαν στα Συμπληρωματικά Υλικά. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες αποπαραφινώθηκαν και επανυδατώθηκαν πριν από χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, Χρώση Περιοδικού Οξέος Schiff (PAS) (Cat#: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), Χρώση Prussian Blue Iron, Ανοσοϊστοχημική χρώση για οπτικοποίηση CD{2}, VC και έκφραση ICAM-1 και χρώση μαστοκυττάρων-ηωσινοφίλων (Cat#: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Τα δεδομένα χρώσης ισοτύπου ελέγχου IgG κουνελιού παρουσιάζονται στα συμπληρωματικά σχήματα 2 και 3 για να καταδειχθεί η ειδικότητα των αποτελεσμάτων ανοσοϊστοχημικής χρώσης. Όλες οι μικροσκοπικές εικόνες αποκτήθηκαν με τις ίδιες ρυθμίσεις ισχύος και τις ίδιες παραμέτρους ψηφιοποίησης. Πραγματοποιήθηκαν μικροσκοπικές αξιολογήσεις με μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου Olympus εξοπλισμένο με ψηφιακή κάμερα DP27 για την καταγραφή εικόνων παθολογικών τομών σε μεγέθυνση 20× ή 40×. Διπλή-τυφλή ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε σε όλες τις εικόνες.

Ουρικό άζωτο αίματος (BUN)

Οι μετρήσεις BUN πραγματοποιήθηκαν με κιτ χρωματομετρικής ανίχνευσης αζώτου ουρίας (BUN) (Cat#: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Παρασκευή και ανάλυση εικοσανοειδών

Τα εικοσανοειδή εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη διαδικασία εκχύλισης και αναλύθηκαν με UPLC ESI-MS/MS όπως περιγράφηκε προηγουμένως.28 Λεπτομερείς μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη συμπεριλήφθηκαν στα Συμπληρωματικά Υλικά.

Αξιολόγηση κυτοκινών ορού

Μια προσαρμοσμένη συστοιχία κυτοκινών αγοράστηκε από την R&D Systems (Minneapolis, MN) και αξιολογήθηκε με το Luminex 200 (Northbrook, IL) ακολουθώντας τις οδηγίες του εγχειριδίου χρήστη.

Στατιστική

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Η στατιστική ανάλυση για κάθε πείραμα συνοψίζεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1. Χρησιμοποιήθηκε δοκιμή t δύο όψεων ή μονόδρομη ANOVA με δοκιμή Scheffe. Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις συσχέτισης για επιλεγμένα ζεύγη μετρήσεων για τον υπολογισμό μιας τιμής Pearsonian r. Η στατιστική σημασία των διαφορών αποδόθηκε στο P <>

Αποτελέσματα

Η θεραπεία PPACK PFC NP βελτιώνει τη λειτουργία των νεφρών μετά την έναρξη τηςοξεία νεφρική βλάβη.

Η μικροσκοπική εξέταση της γενικής εμφάνισης των νεφρών 24 ώρες μετά τη θεραπεία με PFC NP με αντιθρομβίνη (PPACK) μετά την επαναιμάτωση, έδειξε βελτίωση της βλάβης στην εγκατεστημένη AKI (Εικόνα 1, AB). Ο τραυματισμός στις 24 ώρες εντοπίστηκε κυρίως στη φλοιομυελική συμβολή του νεφρού και τα εγγύς σωληνάρια ήταν κατά προτίμηση κατεστραμμένα. Το πρότυπο του τραυματισμού ήταν αυτό της νέκρωσης πηκτικού τύπου. Υπήρξε μια μικρή φλεγμονώδης διήθηση στο χρονικό σημείο 24-ωρών. Η ποσοτικοποίηση της σωληναριακής βλάβης σε τομές βαμμένες με H&E (Εικόνα 1, Γ) αποκάλυψε ότι τα ποντίκια που έλαβαν PPACK PFC NP εμφάνισαν συνολική μείωση 33,95 τοις εκατό στην οξεία σωληναριακή νέκρωση (ATN) έναντι των ποντικών ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με NP (24,44 ± 1,76 τοις εκατό έναντι 37.{{{{ 16}} ± 4,96 τοις εκατό αντίστοιχα· P=0.035). Το Σχήμα 1, D δείχνει ότι τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία εμφάνισαν μείωση 44,03 τοις εκατό στο BUN κατά 24 ώρες (110,96 ± 6,21 mg/dL έναντι 62,10 ± 8,71 mg/dL για NP ελέγχου έναντι PPACK PFC NP· P=0.002) . Αυτά τα πρώιμα ευεργετικά αποτελέσματα αντικατοπτρίζουν την προστασία που παρατηρούσαμε προηγουμένως με προθεραπευτικά σχήματα κατά της θρομβίνης στις 24 ώρες,16 υποδηλώνοντας ότι η θρομβίνη συνεχίζει να παίζει κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη της ΑΚΙ πέρα ​​από την αρχική ισχαιμική προσβολή.

Το Σχήμα 2 απεικονίζει τις τοπικές αποκρίσεις των δομών βασικής μεμβράνης και βούρτσας στη θεραπεία κατά της θρομβίνης που βασίζεται στον ημι-ποσοτικό προσδιορισμό της χρώσης PAS. Το Σχήμα 2, το AC δείχνει ότι η θεραπεία αύξησε το ποσοστό των σπειραμάτων με ανέπαφες βασικές μεμβράνες από 51,43 τοις εκατό ± 2,61 τοις εκατό σε 70.{10}} τοις εκατό ± 3,09 τοις εκατό (P=0,00033). Το Σχήμα 2, DF απεικονίζει τη βαθύτερη ζημιά που υπέστησαν τα σωληνωτά περιγράμματα βούρτσας όπου μόνο μια μειοψηφία διατήρησε πλήρως άθικτα περιγράμματα βούρτσας στις 24 ώρες. Ωστόσο, η θεραπεία βελτίωσε την ακεραιότητα του περιγράμματος της βούρτσας κατά 50,79 τοις εκατό (P=0.015). Η θεραπεία μείωσε τη συνολική έκταση των συσσωματωμάτων πρωτεΐνης κατά 54,09 τοις εκατό (P=0.032) (Εικόνα 2, GI), η οποία μπορεί να αναμένεται ότι θα αποτρέψει τη σωληναριακή συμφόρηση για τη διατήρηση της νεφρικής λειτουργίας.

Η θεραπεία PPACK PFC NP διατήρησε την αγγειακή ακεραιότητα μετά την έναρξη της IRI

Για να ποσοτικοποιηθεί η δυνατότητα του PPACK PFC NP να προστατεύει τα αγγειακά στοιχεία, τομές νεφρών χρωματίστηκαν για CD31.

Το Σχήμα 3 απεικονίζει τον μεγαλύτερο επιπολασμό της χρώσης CD31 στις 24 ώρες στον φλοιό και το μυελό ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PPACK NP έναντι του NP ελέγχου (Εικόνα 3, Α και D έναντι Β και Ε). Στις φλοιώδεις περιοχές, η χρώση με CD31 περιλάμβανε 4,28 τοις εκατό ± 0, 62 τοις εκατό των υποβληθέντων σε θεραπεία έναντι 1,75 τοις εκατό ± 0, 34 τοις εκατό για τα ζώα ελέγχου (P=0.0{{ 25}}18), ή σχετική αύξηση 144,57 τοις εκατό (Εικόνα 3, Γ). Σε μυελικές περιοχές, η χρώση CD31 περιλάμβανε 3,24 τοις εκατό ± 0,38 τοις εκατό για τα ζώα που έλαβαν PPACK NP έναντι 1,91 τοις εκατό ± 0,29 τοις εκατό για τα ζώα ελέγχου που έλαβαν NP (P=0,0073) ή μια σχετική αύξηση 88,81 τοις εκατό (Εικόνα 3, F) . Η μικροσκοπική εκτίμηση της αγγειακής ακεραιότητας δεν αποκάλυψε αξιόλογη αρτηριακή νέκρωση στο χρονικό σημείο των 24-ωρών.

Η εμφάνιση των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC) στις μικροσκοπικές εικόνες διέφερε μεταξύ των ποντικών PPACK NP και των ποντικών ελέγχου που έλαβαν NP στις 24 ώρες (Εικόνα 4). Επειδή τα ποντίκια εγχύθηκαν συστηματικά για να ξεπλύνουν το αίμα σε διαχύσιμα νεφρικά εδάφη, η παρουσία ερυθρών αιμοσφαιρίων έδειξε είτε συσσώρευση εντός μικροαγγειακών αγωγών με κακή διάχυση είτε διάμεση εξαγγείωση, ή πιθανώς και τα δύο. Στα σπειράματα (Εικόνα 4, ΑΒ), τα ερυθρά αιμοσφαίρια παρατηρήθηκαν εντός αγγειακών τούφων αλλά σπάνια στην κάψουλα του Bowman στις 24 ώρες. Η θεραπεία μείωσε τον επιπολασμό των σπειραματικών ερυθροκυττάρων κατά 40,78 τοις εκατό (P=0.007) (Εικόνα 3, C). Στο μυελό (Εικόνα 4, DE), δεν ήταν δυνατό να καθοριστεί μια οριστική θέση για τα ερυθρά αιμοσφαίρια με βάση τις κηλίδες H&E, αλλά η θεραπεία μείωσε τον συνολικό επιπολασμό των ερυθρών αιμοσφαιρίων κατά 34,92 τοις εκατό (P=0.049) (Εικόνα 4, F) .

Για την περαιτέρω οριοθέτηση των συνεπειών της εναπόθεσης και παγίδευσης RBC, πραγματοποιήθηκε χρώση σιδήρου χωρίς αιμικό χρώμα με Prussian Blue. Οι κηλίδες σιδήρου ήταν θετικές τόσο στις σπειραματικές όσο και στις σωληναριακές κυτταρικές δομές. Η θεραπεία μείωσε τον επιπολασμό του σιδήρου και στον φλοιό (44,23 τοις εκατό μείωση, P=0.022) (Εικόνα 5, AC) και στον μυελό (μείωση 50,50 τοις εκατό, P=0,006) (Εικόνα 5, DF ) στις 24 ώρες, σύμφωνα με την επίδραση της θεραπείας κατά της θρομβίνης στην παγίδευση των ερυθρών αιμοσφαιρίων.

Η θεραπεία με PPACK PFC NP μείωσε την τοπική και συστηματική φλεγμονή μετά την έναρξη της ΑΚΙ

Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της θρομβίνης στη διατήρηση της ενδοθηλιακής ενεργοποίησης και της τοπικής φλεγμονής στον νεφρό, ποσοτικοποιήσαμε τόσο το ICAM-1 όσο και το VCAM-1. Η έκφραση VCAM-1 στον φλοιό δεν άλλαξε με τη θεραπεία με PPACK (Εικόνα 6, AC). Ωστόσο, η έκφραση VCAM- 1 στον μυελό μειώθηκε σημαντικά κατά 65,25 τοις εκατό (Ρ=0.011) μετά τη θεραπεία (Εικόνα 6, DF). Ενισχυμένη έκφραση του ενδοθηλιακού ICAM-1 παρατηρήθηκε τόσο στον φλοιό όσο και στον μυελό σε ποντικούς ελέγχου που έλαβαν NP (Εικόνα 7, Β και Ε). Το ICAM-1 μειώθηκε από τη θεραπεία κατά 36,89 τοις εκατό (P=0.0083) στον φλοιό (Εικόνα 7, AC) και κατά 31,17 τοις εκατό (P {= 0,030) στο μυελό (Εικόνα 7 , DF).

Για να σκιαγραφήσουμε τον ρόλο της θρομβίνης στη ρύθμιση των φλεγμονωδών βιοδραστικών λιπιδίων στην πρώιμη εξέλιξη του ΑΚΙ, πραγματοποιήσαμε λιπιδομικές αναλύσεις σε ιστούς που εξήχθησαν ξεχωριστά από τον φλοιό και το μυελό στις 24 ώρες. Οι συμπληρωματικοί πίνακες 2 και 3 παραθέτουν τις συγκεκριμένες μοριακές αναλύσεις, την περιοχή των νεφρών και τους τύπους του υποκειμένου (ΑΚΙ που έχει υποστεί αγωγή, ΑΚΙ χωρίς θεραπεία ή φυσιολογικό χωρίς ΑΚΙ). Ο συμπληρωματικός Πίνακας 4 παραθέτει τη μέση ποσοστιαία μεταβολή από την υγιή φυσιολογική γραμμή βάσης για κάθε λιπίδιο στον φλοιό και το μυελό. Γενικά, τόσο οι φλοιώδεις όσο και οι μυελικές περιοχές παρουσίασαν αποκλίνουσα έκφραση σχεδόν όλων των βιοδραστικών λιπιδίων που αξιολογήθηκαν σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς νεφρούς (Συμπληρωματικοί πίνακες 2 και 3) και σχεδόν όλα τα σηματοδοτικά λιπίδια είχαν τάση μετατόπισης προς φυσιολογικά επίπεδα μετά τη θεραπεία με αντιθρομβίνη. Ως απλοποιημένη μέτρηση για την περιφερειακή φλεγμονή (Συμπληρωματικός Πίνακας 4), η μέση ποσοστιαία μεταβολή για όλα τα λιπίδια ήταν 65,13 τοις εκατό και 38,60 τοις εκατό για τον φλοιό και 136,42 τοις εκατό και 90,76 τοις εκατό για το μυελό στις ομάδες ελέγχου NP και PPACK NP αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι η φλεγμονή σε ο μυελός ξεπέρασε αυτό για τον φλοιό σύμφωνα με τις λιπιδομικές αναλύσεις.

Αν και οι τάσεις επίλυσης ήταν εμφανείς μετά τη θεραπεία για όλα σχεδόν τα είδη λιπιδίων, τα περισσότερα δεν πληρούσαν στατιστική σημασία. Ωστόσο, αξιοσημείωτη σε αυτές τις δοκιμές ήταν η σημαντική απόκριση του PDG2, η οποία μειώθηκε κατά 47,62 τοις εκατό στον φλοιό (Εικόνα 8, Α) (Ρ=0.012) και 50,21 τοις εκατό στον μυελό (Εικόνα 8, Β) ( P=0.0249), αντίστοιχα. Με βάση αυτήν την παρατήρηση, ποσοτικοποιήσαμε τον επιπολασμό των διηθητικών μαστοκυττάρων, τα οποία είναι μια γνωστή εξέχουσα πηγή φλεγμονώδους PGD2. Το Σχήμα 8, CE δείχνει ότι η θεραπεία με αντιθρομβίνη μείωσε το περιεχόμενο των μαστοκυττάρων σε ολόκληρο το τμήμα του νεφρού κατά 54,27 τοις εκατό (P=0.002) στις 24 ώρες. Αυτό συμφωνεί με τις παρατηρούμενες μειώσεις στο VCAM-1 και το ICAM-1 (Εικόνες 6 και 7) ως ενεργοποιημένα μαστοκύτταρα που εκφράζουν LFA-1 (αντιγόνο 1 που σχετίζεται με τη λειτουργία των λεμφοκυττάρων) και VLA (πολύ αργά αντιγόνο) προσδένουν μόρια προσκόλλησης ειδικά για τον ιστό για μετεμψύχωση σε φλεγμονώδεις ιστούς.29,30 Επιπλέον, οι σχετιζόμενες με μαστοκύτταρα χημειοκίνες/κυτοκίνες όπως το M-CSF και το IL-6 υπορυθμίστηκαν ταυτόχρονα από νανοσωματίδια κατά της θρομβίνης. Μετά τη θεραπεία με PPACK NP, ο ορός M-CSF και IL-6 μειώθηκαν κατά 36,60 τοις εκατό (P=0,0448) και 27,44 τοις εκατό (P=0,0454), αντίστοιχα, σε σύγκριση με η ομάδα ελέγχου που δεν υποβλήθηκε σε αγωγή (Εικόνα 8, ΣΤ).

Αρκετές ενδιαφέρουσες συσχετίσεις προέκυψαν από το σύνολο δεδομένων που σχετίζονται με τη διήθηση των μαστοκυττάρων, την αγγειακή βλάβη και τη νεφρική λειτουργία για τις συνολικές συνδυασμένες ομάδες ζώων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία και χωρίς θεραπεία και στις περιοχές του φλοιού και του μυελού. Μια έμμεση σχέση μεταξύ BUN και CD31 (r=0.75, P=0.000009), υποδεικνύοντας ότι η επιδείνωση της νεφρικής ανεπάρκειας συσχετίστηκε με μεγαλύτερο αγγειακό κίνδυνο (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, Α). Υπήρχε μια άμεση σχέση μεταξύ των αριθμών μαστοκυττάρων και του BUN (r=0.71, P=0.004), υποδεικνύοντας μια προοδευτική μείωση

νεφρικής λειτουργίας σε συνδυασμό με διήθηση μαστοκυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, Β). Παρατηρήθηκε μια έμμεση σχέση μεταξύ του αριθμού των μαστοκυττάρων και του CD31 (r=0.59, P=0.002), υποδεικνύοντας ότι η αγγειακή βλάβη επιδεινώθηκε με αυξημένη διήθηση μαστοκυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, C). Τέλος, παρατηρήθηκε μια άμεση σχέση μεταξύ του αριθμού των μαστοκυττάρων και της συνολικής έκφρασης ICAM-1 (r=0.54, P=0.008), σύμφωνα με την προσδοκία ότι τα μόρια αγγειακής προσκόλλησης που ρυθμίζονται προς τα πάνω θα προωθεί την επιστροφή των μαστοκυττάρων σε τραυματισμένους ιστούς (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, Δ). Μια ακόμη πιο στενή άμεση σχέση αφορούσε την έκφραση του μυελικού VCAM και τον αριθμό των μαστοκυττάρων (r=0.69, P=0.009· δεδομένα δεν εμφανίζονται).

Συζήτηση

Παρά τις προσπάθειες δεκαετιών για την αναζήτηση αποτελεσματικής διαχείρισηςοξεία νεφρική βλάβη, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 τμήματα κατά της θρομβίνης σε θέσεις μικροαγγειακής θρόμβωσης και ενεργοποίησης PAR-1 (πρόσθετη περιγραφή στα Συμπληρωματικά Υλικά), μια στρατηγική ενίσχυσης που δεν μπορεί να επιτευχθεί με τη στοιχειομετρία 1:1 των συμβατικών ελεύθερων παραγόντων που αναστέλλουν τη θρομβίνη, συμπεριλαμβανομένου του PPACK.

Το παρόν σύνολο δεδομένων δείχνει ότι η οξεία βλάβη νεφρικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης δεν έχει ολοκληρωθεί 2 ώρες μετά την επαναιμάτωση και η θρομβίνη παραμένει στόχος υψηλής αξίας σε κατεστραμμένους ιστούς μετά την επαναιμάτωση. Προηγούμενες προσπάθειες των συνεργατών του Molitoris και άλλων υποστηρίζουν τη συνεχιζόμενη προσπάθεια σχεδιασμού ασφαλών μεθόδων για την άμεση αναστολή της θρομβίνης στην ΑΚΙ.^18,31–33Από την προηγούμενη εργασία μας για την προεπεξεργασία του AKI με PPACK PFC NP, γνωρίζουμε ότι τα νανοσωματίδια κατά της θρομβίνης παρέχουν διαρκή επιτήρηση έναντι της τοπικά ενεργοποιημένης θρομβίνης που διατηρεί την αγγειακή ακεραιότητα, μειώνει σημαντικά το φαινόμενο μη επαναρροής κατά ~50 τοις εκατό και αναστρέφει γρήγορα τη νεφρική δυσλειτουργία κατά 24 hrs.16 Λαμβάνοντας μαζί με τα παρόντα δεδομένα, είναι σαφές ότι τα νανοσωματίδια αντι-θρομβίνης συνεχίζουν να αποκτούν πρόσβαση σε κατεστραμμένους αλλά βιώσιμους νεφρικούς ιστούς πολύ μετά την επαναιμάτωση για να αποτρέψουν πρόσθετη αγγειακή και σωληναριακή βλάβη. Προηγούμενες αναφορές ότι ποντίκια νοκ-άουτ PAR-1 υποφέρουν μειωμένη βλάβη νεφρικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης συμφωνούν επίσης με τη στρατηγική μας για την ισχυρή και επίμονη φαρμακολογική αναστολή της ενεργοποίησης του PAR-1 στο AKI μέσω της αναστολής της θρομβίνης.³⁴

Η προστασία των νεφρικών αγγειακών δομών (Εικόνα 3), του περιγράμματος της βούρτσας και της βασικής μεμβράνης (Εικόνα 2) που παρέχεται από την αντιθρομβίνη PFC NP, σε συμφωνία με τα προηγούμενα δεδομένα μας που δείχνουν ότι η θεραπεία με αντιθρομβίνη προκαλεί 2x βελτίωση στην αιμάτωση στις φλοιομυελικές περιοχές στο Το AKI,16 επιβεβαιώνει ένα αναδυόμενο όφελος από τη βελτίωση της νεφρικής μικροαγγειοπάθειας. Αν και η ακριβής φύση της βλάβης στα περισωληνάρια τριχοειδή και φλεβίδια δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί σε αυτά τα πρώιμα χρονικά σημεία μετά την επαναιμάτωση, περιγράφεται η ενισχυμένη διαπερατότητα των αγγείων και η ενεργοποίηση της ενδοθηλιακής προαποπτωτικής κασπάσης-3, καθώς και η μείωση του σήματος για το CD31 (PECAM),35 που ρυθμίζει την ακεραιότητα της ενδοθηλιακής σύνδεσης.36 Η σύνθεση και η έκφραση του CD31 σε κυτταρικές συνδέσεις ρυθμίζονται προς τα κάτω από φλεγμονώδεις κυτοκίνες που εκφράζονται από ενεργοποιημένα μαστοκύτταρα (TNF- και IFN-), τα οποία ενισχύουν την αγγειακή διαπερατότητα.^37,38Επιπλέον, η επαγωγή ιστικού παράγοντα από τη θρομβίνη μέσω της ενεργοποίησης του PAR-1 ρυθμίζεται από το CD31, και τα ποντίκια με νοκ-άουτ CD31 εμφανίζουν αυξημένη σωληναριακή επιθηλιακή και ενδοθηλιακή απόπτωση, αυξημένη εναπόθεση ινώδους και έκφραση ιστικού παράγοντα.³⁹Συνεπώς, η ικανότητα του PPACK PFC NP να διατηρεί την έκφραση του CD31 μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για τον περιορισμό της συνεχιζόμενης ενεργοποίησης του καταρράκτη πήξης και για τη διατήρηση της ενδοθηλιακής ακεραιότητας.

Υπάρχει ένας τοπικός σύνδεσμος μεταξύ φλεγμονής και πήξης στη φάση επέκτασης του AKI που περιορίζει την τριχοειδική αιμάτωση του έξω μυελού προκαλώντας παρατεταμένη περιφερειακή ισχαιμία/υποξία, η οποία στη συνέχεια εμποδίζει την επισκευή και την αναγέννηση των σωληναριακών κυττάρων.4 Παρατεταμένη μείωση του αριθμού μικροαγγείων στην εσωτερική λωρίδα του έξω μυελού στο AKI υποδηλώνει ότι η βλάβη του αγγείου συνεχίζεται και η σηματοδότηση VEGF καταστέλλεται.^40–42Επιπλέον, υπάρχουν άφθονες ενδείξεις ότι η αγγειακή αραίωση προκαλεί χρόνια υποξία που οδηγεί σε προοδευτική σωληναρισιακή διάμεση ίνωση.⁴³Στο μοντέλο οξείας ισχαιμίας/τραυματισμού αρουραίου, τα εγγύς σωληνάρια είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην υποξία που εκδηλώνεται με απομάκρυνση των κυττάρων των σωληναρίων και ακόμη και ολική αποσύνθεση, η οποία προκαλεί υπερβολική θνησιμότητα.44,45 Πράγματι, η ομάδα του Humphrey έχει επίσης δείξει ότι το νεφρικό μικροαγγειακό κλάδεμα είναι προάγγελος χρόνια νεφρική νόσος.⁴⁶

Τα δεδομένα μας επιβεβαιώνουν επίσης ότι η αγγειακή βλάβη προάγει την παγίδευση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και την εναπόθεση μη αίμης (Εικόνες 4 και 5) που μπορεί να επιδεινώσουν τη χρόνια νεφρική νόσο,⁴⁷αλλά που επιδέχεται θεραπεία με αντιθρομβίνη. Η πηγή σιδήρου των ιστών τόσο στα σπειραματικά όσο και στα σωληναριακά κύτταρα (Εικόνα 5) προήλθε αναμφίβολα από τη διάσπαση των RBC σε αυτές τις περιοχές ως συνέπεια αιμορραγίας ή/και μικροαγγειακής θρόμβωσης, που συνάδει με μια εικόνα αγγειακού συμβιβασμού που μετριάζεται με θεραπεία με αντιθρομβίνη. Αντίστοιχα, προσεγγίσεις που διατηρούν την αγγειακή ακεραιότητα μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα κρίσιμο πρώτο βήμα προς τη διατήρηση των γραμμών τροφοδοσίας για θρεπτικά υποστρώματα που διευκολύνουν την ταχύτερη επούλωση των κατεστραμμένων σωληνοειδών δομών.

Είναι ενδιαφέρον ότι το PPACK PFC NP φαίνεται να προσφέρει πρώιμη προστασία των αγγειακών δομών και να εξασθενεί διάφορους δείκτες φλεγμονής (Εικόνες 6 και 7, Συμπληρωματικοί πίνακες 2-4) τόσο στον φλοιό όσο και στον μυελό. Σε παραδοσιακές πειραματικές μελέτες του AKI, ο φλοιός θεωρείται ότι είναι πιο ανθεκτικός στη βλάβη από τον μυελό λόγω της χαμηλότερης μεταβολικής ζήτησης, ωστόσο η ενεργοποίηση του ενδοθηλίου και η παθοφυσιολογική φλεγμονή εμφανίζονται ευρέως όπως αποδεικνύεται από τις λιπιδομικές και ιστοχημικές αναλύσεις μας. Επιπλέον, η ευρεία εναπόθεση μη αιμικού σιδήρου ως υποπροϊόν της διάσπασης των παγιδευμένων RBC τόσο στον φλοιό όσο και στο μυελό – και τον μετριασμό της από νανοσωματίδια κατά της θρομβίνης – συμφωνεί με ένα γενικευμένο μοτίβο φλεγμονής και βλάβης, ακόμη και αν ο φλοιός μπορεί να αποδειχθεί περισσότερα επηρεάζεται παροδικά και ήπια από ότι ο μυελός κατά τη διάρκεια της νόσου.

Η εκπληκτική πρώιμη απόκριση της διήθησης των μαστοκυττάρων εντός 24 ωρών (Εικόνα 8) υποδηλώνει σημαντικό ρόλο για τα φλεγμονώδη κύτταρα εκτός από τους παραδοσιακούς παίκτες όπως τα ουδετερόφιλα και τα μακροφάγα. Τα μαστοκύτταρα συνήθως θεωρούνται ως μεσολαβητές αλλεργικών αποκρίσεων, αλλά υπάρχει μια σειρά βιβλιογραφίας σχετικά με τις παθοφυσιολογικές επιπτώσεις τους στην οξεία και χρόνια νεφρική βλάβη.^48–52 Αν και τα ουδετερόφιλα είναι πρώιμα ανταποκρινόμενα στον τραυματισμό των ιστών, τα μακροφάγα δεν εισέρχονται στην εικόνα παρά αργότερα στη φλεγμονώδη διαδικασία, υποδηλώνοντας ότι τα μαστοκύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρώιμη φάση της ΑΚΙ. Πράγματι, οι Danelli et al έχουν δείξει ότι η αποκοκκίωση των μαστοκυττάρων συμβαίνει νωρίς στην ΑΚΙ και ότι η εξάντληση των μαστοκυττάρων κατά τη στιγμή της επαγωγής της ΑΚΙ αλλά όχι 48 ώρες αργότερα προσδίδει μακροπρόθεσμη ευεργετική επίδραση στη νεφρική λειτουργία, την ατροφία και την ίνωση.⁵³Παρόμοια συμπεράσματα κατέληξαν οι Tong et al σε διαδικασίες μαστοκυττάρων σταθεροποιημένων με χρωμολίνη που πραγματοποιήθηκαν πριν από την επαναιμάτωση.54 Ο Summers έδειξε ότι τα ποντίκια με έλλειψη ιστιοκυττάρων (KitW-sh/W-sh) υποφέρουν λιγότερο ισχαιμικό τραυματισμό από ό,τι οι άγριοι τύποι και ότι επεξεργάζονται μειωμένα επίπεδα χημειοελκυστικών λευκοκυττάρων.⁵⁵

Τα μαστοκύτταρα εκφράζουν υποδοχείς ενεργοποιημένους από πρωτεάση Τα μαστοκύτταρα εκφράζουν ενεργοποιημένους από πρωτεάση υποδοχείς (PARs) που μπορούν να ενεργοποιηθούν από τη θρομβίνη για να αποκοκκοποιηθούν και να εκκενωθούν ένα πλήθος προσχηματισμένων χημειοκινών, κυτοκινών και βιοδραστικών λιπιδίων.56-58 Η θρομβίνη προκαλεί επίσης προσκόλληση μαστοκυττάρων στη μήτρα πρωτεΐνες (π.χ. φιμπρονεκτίνη) και έκφραση ιντερλευκίνης (π.χ. IL-6) μέσω αλληλεπιδράσεων PAR- 1.⁵⁹Μετά την αναστολή της θρομβίνης, παρατηρήσαμε μειωμένα επίπεδα PGD2 που συνάδουν με μια σχετική εξάντληση των μαστοκυττάρων επειδή το PGD2 είναι ένα κύριο βιοδραστικό εικοσανοειδές που εκκρίνεται από τα μαστοκύτταρα σε αντιδράσεις αλλεργικού τύπου.60 Επιπλέον, η μείωση της ρύθμισης του ICAM-1 και Το VCAM-1 μετά από θεραπεία με νανοσωματίδια κατά της θρομβίνης συνάδει με μειωμένη διήθηση μαστοκυττάρων καθώς εκφράζουν LFA-1 και VLA και χρησιμοποιούν μόρια προσκόλλησης για να αποκτήσουν είσοδο στον ιστό.^29,30

Ένας συγκεκριμένος παθογόνος ρόλος για την ίδια την PGD2 στην εξέλιξη της νεφρικής IRI δεν έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα, αλλά χρησιμεύει ως σαφής βιοδείκτης για την ενεργοποίηση των μαστοκυττάρων.⁵²Στην πνευμονική φλεγμονή, το PDG2 έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την έκφραση της προφλεγμονώδους κυτοκίνης των μακροφάγων μέσω των υποδοχέων της (DP1 και DP2), οι οποίοι στη συνέχεια ενεργοποιούν την εισροή ουδετερόφιλων.61 Η παρατήρησή μας για αυξημένο M-CSF και IL-6 (Εικόνα 8) στο AKI που ρυθμίζονται προς τα κάτω από το PPACK PFC NP μέσω καταστολής μαστοκυττάρων θα ήταν συνεπείς με έναν τέτοιο υποτιθέμενο μηχανισμό. Ωστόσο, καθώς τα μαστοκύτταρα είναι γνωστό ότι απελευθερώνουν πλήθος παραγόντων δυνητικά επιβλαβών για τη νεφρική λειτουργία, 51,52 οποιοσδήποτε αριθμός υπεύθυνων καθοριστικών παραγόντων μπορεί να αποτελέσει αντικείμενο μελλοντικής μελέτης για έλεγχο με αναστολή θρομβίνης ή άλλους μοριακά στοχευμένους παράγοντες. Συνεπώς, παρεμβάσεις που καθυστερούν την πρώιμη έλξη και αποκοκκίωση των μαστοκυττάρων θα μπορούσαν να είναι εξαιρετικά προστατευτικές για την αγγειακή ακεραιότητα και τη νεφρική λειτουργία, όπως εκδηλώνεται με τοπική αναστολή θρομβίνης στα παρόντα δεδομένα.

Περιορισμοί

Αυτές οι μελέτες δεν σχεδιάστηκαν για να αποσαφηνίσουν τα διαρκή οφέλη της αναστολής της θρομβίνης, καθώς το μοντέλο AKI επικεντρώνεται στην έγκαιρη προστασία από την IRI και τους σχετικούς μηχανισμούς. Το εάν τα μακροπρόθεσμα οφέλη μιας δόσης νανοσωματιδίων κατά της θρομβίνης μπορεί να περιορίσουν την εξέλιξη σε χρόνια νεφρική νόσο ξεφεύγει από το πεδίο εφαρμογής της παρούσας έκθεσης και θα απαιτούσε διαφορετικό πειραματικό μοντέλο και υπόθεση. Επιπλέον, το χρονικό παράθυρο ευκαιρίας για την επίτευξη λειτουργικής ανάκαμψης με την αναστολή της θρομβίνης στη φάση επέκτασης του ΑΚΙ δεν εξετάζεται εδώ, αλλά αποτελεί αντικείμενο ενδιαφέροντος για μελλοντικές μελέτες. Σε ποιο βαθμό οι κύριες ευεργετικές επιδράσεις της τοπικής αναστολής θρομβίνης στο AKI οφείλονται στην καταστολή της ενεργοποίησης των μαστοκυττάρων παραμένει εικαστικό, αλλά θα μπορούσε να ελεγχθεί σε επόμενες λεπτομερείς μηχανιστικές μελέτες. Ωστόσο, αν και οι σημαντικές γραμμικές συσχετίσεις μεταξύ των αριθμών των μαστοκυττάρων, CD31 και BUN δεν καθορίζουν απαραίτητα την αιτία και το αποτέλεσμα, η συμφωνία τους υποστηρίζει μια ισχυρή σχέση μεταξύ των μαστοκυττάρων και της αγγειακής βλάβης στα πρώιμα στάδια της νεφρικής IRI. Τέλος, η χρήση του PPACK ως τμήματος κατά της θρομβίνης δεν είναι παρά ένα παράδειγμα ενός συζευγμένου θεραπευτικού συστατικού που μπορεί να χορηγηθεί με ασφάλεια και τοπικά σε μια νανοδομή για να υποτάξει τη σηματοδότηση της θρομβίνης. Αναφορές

1. Benoit SW, Devarajan P. Οξεία νεφρική βλάβη: αναδυόμενες φαρμακοθεραπείες στις τρέχουσες κλινικές δοκιμές. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. Νέες θεραπείες για οξεία νεφρική βλάβη. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. Κυτταρική παθοφυσιολογία ισχαιμικής οξείας νεφρικής βλάβης. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Παθοφυσιολογία ισχαιμικής οξείας νεφρικής βλάβης. Nat Rev Nephrol 2011; 7:189-200.

5. Bonventre JV. Παθοφυσιολογία ΑΚΙ: τραυματισμός και φυσιολογική και ανώμαλη αποκατάσταση. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB, et al. Ξεπερνώντας τα μεταφραστικά εμπόδια στην οξεία νεφρική βλάβη: μια αναφορά από ένα εργαστήριο NIDDK. Clin J Am Soc Nephrol 2018; 13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. Πρόσφατες εξελίξεις στην οξεία νεφρική βλάβη και οι συνέπειες και οι επιπτώσεις της στη χρόνια νεφρική νόσο. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. Blocking NF-kappaB: ένα φλεγμονώδες ζήτημα. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. Η μετενεργοποίηση Nox1 του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα προάγει την αποβολή Ν-καντερίνης και τη μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne ΡΑ, Schneider Η, et αϊ. Η θρομβίνη προκαλεί επιλεκτικά τη μεταγραφή γονιδίων σε ανθρώπινα μονοκύτταρα που εμπλέκονται στη φλεγμονή και την επούλωση τραυμάτων. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, ten Cate H. Είναι η θρομβίνη βασικός παίκτης στον λαβύρινθο της «πηκτικής αθηρογένεσης»; Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA, et al. Το προφίλ ενός κυττάρου του AKI σε ένα μοντέλο ποντικού αποκαλύπτει νέες μεταγραφικές υπογραφές, προφιβρωτικό φαινότυπο και διαφωνία επιθηλίου προς στρωματικό. Journal of the American Society of Nephrology: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Το προφίλ των κυττάρων της οξείας νεφρικής βλάβης ποντικού αποκαλύπτει διατηρημένες κυτταρικές αποκρίσεις στον τραυματισμό. Proc Natl Acad Sci ΗΠΑ 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Τα νανοσωματίδια υπερφθοράνθρακα που αναστέλλουν τη θρομβίνη παρέχουν μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία και την απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού της οξείας θρόμβωσης. Journal of thrombosis and hemostasis: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams Τ, Lanza G, Tollefsen D, et al. Τα νανοσωματίδια που αναστέλλουν τη θρομβίνη αποτελούν γρήγορα ευέλικτες και ανιχνεύσιμες αντιπηκτικές επιφάνειες. Nanotechnology 2014; 25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette Μ, Hu L, et αϊ. Τα νανοσωματίδια αντιθρομβίνης βελτιώνουν την επαναιμάτωση των νεφρών και προστατεύουν τη λειτουργία των νεφρών μετά από τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73