Μελέτη σχετικά με τη νευροενδοκρινική ανοσοποιητική λειτουργία του Cistanche Deserticola και των προϊόντων του στον ατμό οίνου ρυζιού σε μοντέλο αρουραίου που προκαλείται από γλυκοκορτικοειδή-Ⅰ

1. Εισαγωγή

Cistanche έρημος, το οποίο ονομάζεται «τζίνσενγκ της ερήμου», είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο που χρησιμοποιείται εδώ και αιώνες ως τονωτικό γιανγκ βότανο γιατονώνοντας τα νεφρά και ενισχύοντας το γιανγκ[1]. Οκτώ είδη και μία παραλλαγή τουCistanche Herba έχουν καταγραφεί στην Κίνα και μόνοCistanche deserticolaYC Ma καιCistanche tubulosa(Schenk) Wight καταγράφονται στην Κινεζική Φαρμακοποιία [2]. Φαρμακολογικές μελέτες έδειξαν ότιCistanches Herbaεμφάνισε νευροπροστατευτικό [3], ανοσοτροποποιητικό [4], καρδιοπροστατευτικό [5], αντικόπωση [6], αντιφλεγμονώδες [7], ηπατοπροστατευτικό [8], αντιοξειδωτικό [9], αντιβακτηριακό [10], καθαρτικό [11] και αντικαρκινικό επιπτώσεις [12]. Το ευρύ φάσμα των αναφερόμενων βιολογικών δραστηριοτήτων αυτού του γένους έχει αποδοθεί στη σύνθετη και ποικίλη φυτοχημική του σύνθεση.Cistanche deserticolaπεριέχει γλυκοσίδες φαινυλαιθανόλης, ιριδοειδή, πολυσακχαρίτες [13], κ.λπ. Η περιεκτικότητα σε φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες είναι η υψηλότερη στα αρχικά φαρμακευτικά υλικά [14].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΑΝΩΝΥΣΗ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Η επεξεργασία του κινεζικού Materia Medica (CMM) είναι μια παραδοσιακή φαρμακευτική τεχνική για την εκπλήρωση των διαφορετικών απαιτήσεων για την επεξεργασία, τη διανομή και την παρασκευή παρασκευασμάτων σύμφωνα με την παραδοσιακή κινεζική ιατρική θεωρία. Αυτά τα επεξεργασμένα προϊόντα ονομάζονται κομμάτια αφέψημα, τα οποία χρησιμοποιούνται σε κλινικές. Η επεξεργασία στοχεύει στην ενίσχυση της αποτελεσματικότητας στη μείωση της τοξικότητας των ακατέργαστων φαρμάκων. Το 2015 η Κινεζική Φαρμακοποιία κατέγραψε ότι οι χοντρές φέτες Cistanche (CD) και το Cistanche με κρασί στον ατμό ρυζιού (WCD) θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως κομμάτια αφεψήματος στην κλινική. Η ερευνητική μας ομάδα έδειξε ότι η καθαρτική δράση ανακουφίστηκε και η αντιγήρανση και η αναζωογονητική δράση των νεφρών ενισχύθηκαν μετά τον ατμό του Cistanche με κρασί από ρύζι [15].

Η λειτουργία του άξονα υποθάλαμος-υπόφυση-επινεφρίδια-θύμος αδένας (HPAT) είναι διαταραγμένη στο σύνδρομο ανεπάρκειας νεφρού-yang [16]. Οι ασθενείς με ανεπάρκεια νεφρού-yang έχουν επίσης εκτεταμένη δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού. Η δυσλειτουργία του άξονα HPA σχετίζεται στενά με την ανοσοανεπάρκεια. Η θεωρία νευροενδοκρινικού-ανοσοποιητικού δικτύου (NEI) δείχνει ότι το ανοσοποιητικό και το νευροενδοκρινικό σύστημα μοιράζονται πολλούς συνδέτες και υποδοχείς [17] και ο υποθάλαμος θεωρείται ο άξονας για τη σύνδεση του νευροενδοκρινικού συστήματος με το ανοσοποιητικό σύστημα.

Σε αυτή τη μελέτη, επαναλάβαμε την ανεπάρκεια νεφρού-yang σε αρουραίους-μοντέλους με εξωγενή έγχυση κορτικοστεροειδών και διερευνήσαμε τον μηχανισμό της ανεπάρκειας νεφρού-yang σε απόκριση σε διαφορετικά επεξεργασμένα προϊόντα του Cistanche deserticola από την οπτική γωνία της ενδοκρινο-ανοσολογικής λειτουργίας.

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Υλικά και Αντιδραστήρια

Το Cistanche deserticola συλλέχθηκε από το Alasan Neimenggu το 2019.5 και αναγνωρίστηκε ως οι αποξηραμένοι σαρκώδεις μίσχοι του Cistanche deserticola YC Ma από τον καθηγητή Yanjun Zhai (Σχολή Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής Liaoning, Κίνα). Τα δείγματα κουπονιών διατηρήθηκαν στο Κέντρο Τεχνολογίας Μηχανικής Επεξεργασίας Liaoning.

Πρότυπες ενώσεις ajugol αγοράστηκαν από την Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα). κιστανοσίδη F,εχινακοσίδη, κιστανοζίτη Α και ισοακτεοσίδηαγοράστηκαν από τη Must Company (Σιτσουάν Κίνα). Το acteoside αγοράστηκε από την Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Κίνα). Ακετονιτρίλιο και μεθανόλη ποιότητας MS αγοράστηκαν από την Merck KGaA (Darmstadt, Γερμανία). Το μυρμηκικό οξύ ποιότητας HPLC αγοράστηκε από τη Merck KGaA (Darmstadt, Γερμανία). Το κρασί από ρύζι αγοράστηκε από την Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Κίνα).

Κορτικοστερόνη (CAS: 50-22-6, καθαρότητα > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), χάπια chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), ACTH, CRH, T, IL{{ Τα κιτ ανίχνευσης ELISA 2}}, IFN-c, TNF-, IL{-2 και IL-10 αγοράστηκαν από την Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Το κιτ ELISA κορτιζόλης αρουραίου παρασχέθηκε από την BOSK Co., αντίσωμα CD4 αρουραίου, αντίσωμα CD8a (αρ. 561833 και 559976), λύμα RBC (Solarbio, R1010), ρυθμιστικό διάλυμα PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM και - ακτίνη προς τα πάνω και κατάντη παρασχέθηκαν από το κιτ αντίστροφης μεταγραφής Guangzhou Invitrogen Co. (αρ. RR037A) και το κιτ σύνθεσης cDNA (αρ. 10000068167) από την Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Χλωροφόρμιο, ισοπροπανόλη, 75% ουρεθανόλη Το διάλυμα ήταν όλα αναλυτικά καθαρό και παρήχθη από την Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Το υπερκαθαρό νερό παρήχθη από το σύστημα Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, ΗΠΑ).

2.2. Πειραματικά Όργανα

Ένας δείκτης ενζύμου (Thermo, μοντέλο 3530911931), αυτόματη συσκευή πλύσης πλακών (μοντέλο HBS- 4009), μετρητής δύναμης ώθησης-έλξης ψηφιακής οθόνης (μοντέλο VICTOR- 50N), φυγόκεντρος κατάψυξης υψηλής ταχύτητας (μοντέλο Sigma 3k15 ), υπερμικροφασματοφωτόμετρο (μοντέλο B-50Q), ενισχυτής γονιδίου (μοντέλο L96G), ποσοτική PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο (μοντέλο StepOne), κυτταρόμετρο ροής (μοντέλο AC66051710132), μικροτόμος παραφίνης (μοντέλο Laikaly), μικροσκόπιο , μοντέλο BS-53) και ένα όργανο καθαρού νερού (μοντέλο F7JA36507).

2.3. Προετοιμασία δειγμάτων για UPLC-Q-TOF-MS και Φαρμακολογικά Πειράματα

Το WCD υποβλήθηκε σε επεξεργασία από την ίδια παρτίδαCistanche έρημοςστο εργαστήριό μας. Για την παρασκευή του WCD, ξηρά τεμάχια CD (πάχους 5 mm) (100 g) εγχύθηκαν με κρασί ρυζιού (30 mL), βράστηκαν στον ατμό σε υψηλή πίεση (1,25 kPa) για 4 ώρες και στη συνέχεια ξηράνθηκαν στους 55 βαθμούς.

Οι χονδροειδείς σκόνες CD και WCD εμποτίστηκαν σε 10 φορές 95% αιθανόλη για 0,5 ώρα, εκχυλίστηκαν με αναρροή 3 φορές κάθε φορά για 1 ώρα και διηθήθηκαν και τα διηθήματα συνδυάστηκαν 3 φορές. Η αιθανόλη ανακτήθηκε υπό μειωμένη πίεση και το εκχύλισμα ελήφθη για χορήγηση. Το εκχύλισμα (1 mL) προστέθηκε σε 50% μεθανόλη, φέρνοντας τον συνολικό όγκο στα 20 mL, και αποθηκεύτηκε στους 4 βαθμούς για ανάλυση περιεχομένου.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Συνθήκες για την ανάλυση των εκχυλισμάτων CD και WCD

2.4.1. LCThMS Αναλυτικές Συνθήκες

Το σύστημα UPLC-MSThMS με το λογισμικό MassLynx 4.1 Analyst χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση της λήψης και επεξεργασίας δεδομένων. Η αναλυτική στήλη ήταν Acquity UPLC BEH C18 (1{{1{{0}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) σε θερμοκρασία 40 βαθμών C. Η κινητή φάση ήταν 0.1% υδατικό διάλυμα μυρμηκικού οξέος (Α) και ακετονιτρίλιο που περιείχε 0.1% μυρμηκικό οξύ (Β). Η βαθμίδα έκλουσης ήταν 0.00–1.00 min με 3% B, 1.01–2.00 min με 3%–11.5% B, 2.01–3.{{29 }} min με 12% B, 3,01–4.00 min με 15% B, 4,01–5.00 min με 20% B, 5,01–6.00 min με 22 % B, 6,01–8.00 min με 25% B και 8,01–9.00 min με 10% B. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 mLTh min και ο όγκος έγχυσης ήταν 1,0 μL.

Το τριπλό τετραπλό φασματόμετρο μάζας Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, ΜΑ, ΗΠΑ) εξοπλισμένο με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) χρησιμοποιήθηκε στον τρόπο λειτουργίας αρνητικών ιόντων. Το αέριο αποδιάλυσης ήταν άζωτο με ρυθμό ροής 500 LThh σε θερμοκρασία 250 βαθμών. Όλες οι ανιχνευθείσες ενώσεις μετρήθηκαν στον τρόπο παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM). Ο Πίνακας 1 δείχνει τις ενεργειακές παραμέτρους και ο Πίνακας 2 δείχνει τις καμπύλες βαθμονόμησης για τα αναλυόμενα εξαρτήματα.

2.4.2. Παρασκευή Ουσιών Αναφοράς

Tubuloside A (3.02 mg), εχινακοσίδη (3.00 mg), 2'-acetylakteoside (2.34 mg), ακτεοσίδη (2.45 mg), ισοακτεοσίδη (0.61 mg), cistanoside F ( 2,14 mg), σαλιδροζίτη (3,39 mg), γενιποσιδικό οξύ (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) και καταλπόλη (2,39 mg) διαλύθηκαν σε μεθανόλη για να παρασκευαστεί ένα αποθεματικό διάλυμα. Το μητρικό διάλυμα αραιώθηκε με μεθανόλη για να ληφθούν οι κατάλληλες συγκεντρώσεις για τα πρότυπα διαλύματα εργασίας. Όλα τα παρασκευασμένα διαλύματα αποθηκεύτηκαν στους 4 βαθμούς πριν από τη χρήση.

2.5. Προετοιμασία και Ομαδοποίηση Ζωικών Μοντέλων

Αρσενικοί αρουραίοι SD (180–220 g) αγοράστηκαν από τη Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Animal permit number: SCXK (Liao) 2015–0001. Όλοι οι αρουραίοι διατηρήθηκαν με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό στους 25 βαθμούς και σχετική υγρασία 30-50%. Τα ζώα στεγάστηκαν για 7 ημέρες πριν από τα πειράματα.

Εκατό αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε 10 ομάδες: ομάδα τυφλού ελέγχου (BC), ομάδα ελέγχου μοντέλου (MC), ομάδα θετικού ελέγχου (PC), ομάδα ελέγχου κρασιού ρυζιού (WC), ομάδα CD υψηλής δόσης (CD -HD) ομάδα, ομάδα μεσαίας δόσης CD (CD-MD), ομάδα CD χαμηλής δόσης (CD-LD), ομάδα WCD υψηλής δόσης (WCD-HD), ομάδα μέσης δόσης WCD (WCD-MD) και Ομάδα χαμηλής δόσης WCD (WCD-LD). Οι δόσεις των CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD και CD-LDThWCD-LD ήταν 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) και 1,37 gTh (kg ∙ d), αντίστοιχα. Η δόση για την ομάδα PC ήταν 1,646 gTh (kg ∙ d) και για την ομάδα WC, 1 mLTh100 g για 40 ημέρες. Την 6η ημέρα μετά τη χορήγηση, στους αρουραίους έγινε υποδόρια ένεση με το υδατικό εναιώρημα κορτικοστερόνης (κορτικοστερόνη + 0.1% διμεθυλοσουλφοξείδιο + 0.1% Tween-80 + 0.9% χλωριούχο νάτριο) εκτός για τον όμιλο BC [18]. Η συγκέντρωση της κορτικοστερόνης ήταν 5 gThL και η δόση ήταν 0,1 mLTh100 g. Στους αρουραίους στην ομάδα BC χορηγήθηκε φυσιολογικό ορό + 0.1% διμεθυλοσουλφοξείδιο + 0.1% Tween- 80 + 0.9% χλωριούχο νάτριο με ένεση στην ίδια δόση.

2.6. Προσδιορισμός Λειτουργιών Άξονα HPA

2.6.1. Δοκιμή βάρους, θερμοκρασίας και ισχύος συγκράτησης

Μια δοκιμή βάρους γινόταν κάθε 3 ημέρες και η θερμοκρασία μετρήθηκε κάθε 6 ημέρες. κατά τη διάρκεια του πειράματος. Την 39η ημέρα, η μέγιστη δύναμη του οπίσθιου άκρου μετρήθηκε με ένα μετρητή λαβής. Οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε λείες πλατφόρμες, κάνοντας το πίσω άκρο τους να πιάσει το κοντάρι. Οι αρουραίοι θα αρπάξουν ενστικτωδώς οποιοδήποτε αντικείμενο για να αποτρέψουν την κίνηση προς τα πίσω όταν τραβιέται η ουρά έως ότου η δύναμη έλξης υπερβεί τη λαβή. Όταν ο αρουραίος έχασε τη λαβή του, ο προενισχυτής μπορούσε αυτόματα να καταγράψει τη μέγιστη δύναμη λαβής.

2.6.2. Προσδιορισμός του επιπέδου T, CRH, ACTH, CORT και κορτιζόλης στον ορό

Μία ώρα μετά την τελευταία χορήγηση, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ενός διαλύματος ουρεθάνης (20 gTh100 mL). Στη συνέχεια, τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν στους 3500 r για 15 λεπτά για να ληφθεί ο ορός και αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς. Οι συγκεντρώσεις Τ, CRH, ACTH, CORT και κορτιζόλης μετρήθηκαν με κιτ ELISA αρουραίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.6.3. Παρατηρήσεις με μικροσκόπιο

Η μορφολογική δομή του ιστού των επινεφριδίων παρατηρήθηκε με χρώση HE. Ο ιστός των επινεφριδίων στερεώθηκε σε 10% παραφορμαλδεΰδη, αφυδατώθηκε σε αιθανόλη, έγινε διαφανής με διάλυμα ξυλενίου, ενσωματώθηκε με συμβατικές μεθόδους, κόπηκε σε φέτες πάχους 4 μm, αποκηρυώθηκε με διάλυμα ξυλενίου, ενυδατώθηκε με βαθμίδα αιθανόλης και στη συνέχεια χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη και eos διάλυμα χρώσης. Αφού έγινε διαφανής με ξυλόλιο, η πλάκα σφραγίστηκε με ουδέτερο κόμμι και παρατηρήθηκε σε μικροσκόπιο.

2.6.4. Ανοσοϊστοχημική χρώση του Bax, Bcl-2, Κασπάσης-3, Fas και FasL πρωτεΐνης έκφραση στα επινεφρίδια

Τομές επινεφριδίων αρουραίου στερεωμένες με φορμαλίνη, ενσωματωμένες σε παραφίνη, αποπαραφινώθηκαν και επανυδατώθηκαν αφού κόπηκαν σε πάχος 4 μm. Για τον αποκλεισμό της ενδογενούς δραστηριότητας υπεροξειδάσης, οι τομές προεπωάστηκαν σε μπλοκ υπεροξειδίου του υδρογόνου για 10 λεπτό. Τα τμήματα βυθίστηκαν σε κιτρικό 0.01 Μ (ρΗ 6,0) και θερμάνθηκαν μέχρι βρασμού. Η διαδικασία επαναλήφθηκε μετά από 5-10 λεπτά. Μετά την ψύξη, οι τομές πλύθηκαν με PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 φορές, αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 5 λεπτά και πλύθηκαν με PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 φορές. Το διάλυμα αποκλεισμού 5% BSA προστέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και η περίσσεια υγρού στο τμήμα ανακινήθηκε 20 λεπτά αργότερα. Αραιωμένα πρωτογενή αντισώματα ειδικά για FasTh FasL, Bcl-2ThBax και κασπάση-3 (1:100 αραιωμένο με PBS) προστέθηκαν και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 1 ώρα ή 4 βαθμούς όλη τη νύχτα. Οι τομές πλύθηκαν 2-3 φορές με PBS (pH 7,2-7,6). Στη συνέχεια, προστέθηκε βιοτινυλιωμένη αντι-ποντικιού IgG κατσίκας και οι τομές ξηράνθηκαν στους 20-37 βαθμούς για 20 λεπτά και πλύθηκαν με PBS (ρΗ 7,2-7,6) 4 φορές για 5 λεπτά. Μετά από σχολαστική πλύση σε PBS, οι τομές επωάστηκαν με ένα μείγμα αντιδραστηρίων Α και Β για 30 λεπτά, επωάστηκαν με PBS για 45 λεπτά και τελικά αναπτύχθηκαν με υπόστρωμα DAB (DAKO) για 30 λεπτά πριν αντιχρωματιστούν ελαφρά με αιματοξυλίνη, αφυδατωθούν. και τοποθετήθηκε.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΑΙΣΘΗΣΗΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Προσδιορισμός Ανοσιακών Λειτουργιών

2.7.1. Υπολογισμός Δείκτη Ανοσοποιητικού Οργάνου

Μία ώρα μετά την τελευταία χορήγηση, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση διαλύματος ουρεθάνης (20 gTh100 mL), και στη συνέχεια ο σπλήνας και ο θύμος αδένας αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν αμέσως σε αποστειρωμένη κουκούλα. Οι συντελεστές βάρους της σπλήνας ή του θύμου (%) � βάρος σπλήνας ή θύμου αδένα (mg) Βάρος σώματος (g).

2.7.2. Ανίχνευση υποομάδων Τ λεμφοκυττάρων στο Περιφερικό αίμα

Τα σπληνοκύτταρα και τα αιμοκύτταρα επωάστηκαν με τα μονοκλωνικά αντισώματα αντι-CD4 (PE) και αντι-CD8 (FITC) για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Προστέθηκαν 2 mL λύματος ερυθροκυττάρων και το διάλυμα αναμίχθηκε με στροβιλισμό. Το διάλυμα αφέθηκε στο σκοτάδι για 10 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε, και στη συνέχεια το διάλυμα πλύθηκε 3 φορές με παγωμένο PBS και εναιωρήθηκε εκ νέου σε διαπερατό διάλυμα PBS. Τουλάχιστον 10,000 κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής εντός 1 ώρας από κάθε χρώση Mab.

2.7.3. Προσδιορισμός του επιπέδου IL-10, IL-6, IL-2, TNF- και IFN-c στον ορό

Μία ώρα μετά την τελευταία χορήγηση, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση διαλύματος ουρεθάνης (20 gTh100 mL) και λήφθηκε αίμα από την κοιλιακή αορτή. Το αίμα φυγοκεντρήθηκε στους 3500 r για 15 λεπτά για να ληφθεί ο ορός και αποθηκεύτηκε στους -20 βαθμούς. Οι συγκεντρώσεις των IL-10, IL-6, IL-2, TNF- και IFN-c ανιχνεύθηκαν με κιτ ELISA αρουραίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.8. Έκφραση του CaM σε ιστούς υποθαλάμου και υποφυσίας

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από τους ιστούς του υποθαλάμου και της υπόφυσης με TRIZol. Η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε σε 10 μL ολικού RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ίσες ποσότητες cDNA αναλύθηκαν μέσω qPCR παρουσία χρωστικής δέσμευσης dsDNA (Promega, ΗΠΑ) και του συστήματος PCR πραγματικού χρόνου CFX 96 (Bio-Rad, ΗΠΑ) για να εξεταστούν τα διαφορετικά γονίδια υπό τις συνθήκες αρχικής ενεργοποίησης σε 95 μοίρες για 10 λεπτά, 40 κύκλοι μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα και επέκταση ανόπτησης στους 60 βαθμούς για 1 λεπτό.

Οι εκκινητές για CaM και -ακτίνη δίνονται στον Πίνακα 1, και η -ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη διαφορά στα κρίσιμα όρια (Ct) μεταξύ του γονιδίου στόχου και της -ακτίνης. Για την περιγραφή του αποτελέσματος χρησιμοποιήθηκε η ακόλουθη εξίσωση: ΔΔCt � (γονίδιο στόχος Ct - γονίδιο Ct-ακτίνης) πειραματική ομάδα − (γονίδιο στόχος Ct - γονίδιο Ct-ακτίνης) ομάδα ελέγχου. Στη συνέχεια συγκρίθηκαν τα επίπεδα mRNA κάθε δείγματος, χρησιμοποιώντας το γονίδιο στόχου έκφρασης 2- ΔΔCt. Τα αποτελέσματα κάθε ομάδας υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο (Πίνακας 3).

2.9. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS (έκδοση 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης επαναλαμβανόμενων μετρήσεων (ANOVA). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD) χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (έκδοση 6.0, San Diego, CA, USA). Οι διαφορές με τιμή P μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

3. Πειραματικά Αποτελέσματα

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalysis

Για να επιτευχθεί ο καλύτερος διαχωρισμός, το σχήμα κορυφής και ο σύντομος χρόνος ανάλυσης, οι χρωματογραφικές συνθήκες συμπεριλαμβανομένου του προγράμματος στήλης, κινητής φάσης και κλίσης μελετήθηκαν στο προκαταρκτικό μας πείραμα. Τα τυπικά χρωματογραφήματα με λειτουργία MRM παρουσιάζονται στο Σχήμα 1.

Από τον Πίνακα 4, μπορούμε να δούμε ότι τα περιεχόμενα των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων στο WCD αυξήθηκαν σε σύγκριση με εκείνα του CD, ειδικά για την εχινακοσίδη και την ακτεοσίδη, ενώ η περιεκτικότητα σε ιριδοειδή μειώθηκε στο WCD.

3.2. Κανονισμός για τη λειτουργία του άξονα HPA

3.2.1. Δοκιμή βάρους, θερμοκρασίας και ισχύος συγκράτησης

Οι αρουραίοι της ομάδας MC και των πειραματικών ομάδων εμφάνισαν συμπτώματα ανεπάρκειας νεφρού-yang σταδιακά μετά τη χορήγηση κορτικοστερόνης. Τα συμπτώματα, όπως απώλεια βάρους, υποθερμία, απώλεια λάμψης μαλλιών, πτώση του πνεύματος, καθυστέρηση στην απόκριση και σημαντική μείωση στην κατανάλωση νερού και δραστηριότητα, βελτιώθηκαν σημαντικά στις ομάδες CD και WCD. Το σχήμα 2(α) δείχνει τις αλλαγές βάρους. Το βάρος καθεμιάς από τις ομάδες φαρμάκων αυξήθηκε, ιδιαίτερα στις ομάδες CDHD και WCD-HD. Η αύξηση βάρους στην ομάδα MC ήταν η χαμηλότερη. Το Σχήμα 2(β) δείχνει τις αλλαγές θερμοκρασίας, οι οποίες ήταν οι χαμηλότερες στην ομάδα MC και η θερμοκρασία αυξήθηκε στις ομάδες WCD-HD, WCD-MD και WCD-LD.

Το Σχήμα 2(γ) δείχνει ότι η ισχύς συγκράτησης αυξήθηκε για την ομάδα BC και καθεμία από τις πειραματικές ομάδες και η ομάδα WCD-MD ήταν η υψηλότερη, γεγονός που έδειξε ότι τα σημάδια αδυναμίας που προκλήθηκαν από ανεπάρκεια νεφρού-yang βελτιώθηκαν μετά τη χορήγηση.

3.2.2. Επίπεδα T, CRH, ACTH, CORT και κορτιζόλης

Το Σχήμα 3 δείχνει ότι σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας BC, τα επίπεδα T, CRH, ACTH και CORT στον ορό του αρουραίου μειώθηκαν (P < 0.01) και τα επίπεδα κορτιζόλης μειώθηκαν (Ρ. < 0.05) στην ομάδα MC. Σε σύγκριση με αυτά της ομάδας MC, το επίπεδο Τ στις ομάδες WCD-HD και WCD-MD αυξήθηκε (P < 0.01), το επίπεδο CRH στο WCD-LD, Οι ομάδες WCD-MD και WC βελτιώθηκαν (P < {0.01), το περιεχόμενο ACTH αυξήθηκε στις ομάδες CD-HD, WCD-MD και WCD-HD (P <0,01), το επίπεδο CORT αναβαθμίστηκε στο Ομάδες CD-MD, WCD-MD και WCD-HD (P <0,01) και ενισχύθηκαν στις ομάδες CDHD και WCD-LD (P <0,05), και το επίπεδο κορτιζόλης αυξήθηκε σε καθεμία από τις ομάδες φαρμάκων.

3.2.3. Αποτελέσματα Παρατήρησης με Μικροσκόπιο

Ο ιστός των επινεφριδίων μπορεί να χωριστεί στο φλοιώδες στρώμα και στο στρώμα του μυελού. Οι φλοιώδεις στοιβάδες περιλαμβάνουν σφαιρικές, δεσμίδες και δικτυωτές στοιβάδες. Τα κύτταρα περιέχουν περισσότερα λιπίδια και η στιβάδα του μυελού αποτελείται κυρίως από κύτταρα φαιοχρωμοκυτώματος και μια μικρή ποσότητα ινώδους ιστού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, βρήκαμε ότι όλα ήταν φυσιολογικά στην ομάδα BC, ενώ στην ομάδα MC, ο φλοιός των επινεφριδίων είχε εμφανή υπερπλασία, κυτταρική ατροφία και αυξανόμενη πυκνότητα. Η βολβώδης λωρίδα πάχυνε και η ημιδιαφανής δεσμιδωτή ζώνη, η στενή δικτυωτή ζώνη και τα μικρότερα κύτταρα παρουσίασαν ανομοιόμορφο χρωματισμό και συμφόρηση τριχοειδών. Στην ομάδα PC, τα όρια του φλοιού και του μυελού ήταν ορατά. Τα κύτταρα των σφαιρικών και δεσμίδων ταινιών διατάσσονται ομοιόμορφα και η μορφολογική δομή είχε αποκατασταθεί. Η ίδια καλύτερη αποκατάσταση παρατηρήθηκε στις ομάδες WCD και τα αποτελέσματα στην ομάδα WCD-MD ήταν καλύτερα από εκείνα των ομάδων WCD-HD και WCD-LD. Η μορφολογία των επινεφριδίων στις ομάδες CD δεν ήταν τόσο καλή όσο στις ομάδες WCD.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%