Δομικός χαρακτηρισμός του πολυσακχαρίτη Cistanche Deserticola και της προστατευτικής του επίδρασης στην υψηλή γλυκόζη HK -2 τραυματισμό κυττάρων

1.2.5.8 Ανίχνευση δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης

Τα κύτταρα HK -2 ενοφθαλμίστηκαν σε 6- καλά πλάκες και καλλιεργημένες. Μετά την αντίστοιχη διέγερση, το μέσο καλλιέργειας στις πλάκες 6- αναρροφάται και μια ισχυρή θετική ομάδα ελέγχου (POS) προστέθηκε στην ομάδα κάτω από το "1.2.5.6". Ξεπλύνετε μία φορά με PBS, προσθέστε 1 ml μέσου κυτταρικής καλλιέργειας και 1 ml JC -1 Η λύση εργασίας χρώσης αναμίχθηκε καλά και τοποθετήθηκε σε ένα φυτώριο κυτταρικής καλλιέργειας στο σκοτάδι για 20 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με JC -1 ρυθμιστικό χρώσης (1 χ) και οι εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού.

 

 

 

 

Οφέλη Cistanche

 

1.2.5.9 HOECHST33258 Μέθοδος για την ανίχνευση της απόπτωσης των κυττάρων

Οι κυτταρικές διαφάνειες τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6- και κύτταρα HK -2 στη φάση λογαριθμικής ανάπτυξης στο 6- καλά πλάκες σε πυκνότητα κυττάρων 1 χ 105 κυττάρων/φρεατίου. Μετά την αντίστοιχη παρέμβαση φαρμάκου, χρησιμοποιήθηκε το κιτ χρώσης Hoechst33258 για χρώση. Η απόπτωση των κυττάρων ανιχνεύθηκε και οι εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού.

 

1.2.5.10 στύπωμα Western για ανίχνευση

Η έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζεται με την οδό σηματοδότησης TLR4/NF-κΒ αναλύθηκε με ομαδοποίηση και θεραπεία των κυττάρων σύμφωνα με τη μέθοδο κάτω από το "1.2.5.6". Μετά από αυτό, η συνολική πρωτεΐνη στα κύτταρα εκχυλίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης. Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ποσοτικοποίησης πρωτεΐνης διικονινικού οξέος (BCA) και η πρωτεΐνη μετουσώθηκε και αποθηκεύτηκε σε ψυγείο -20.
10% Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου 10% θειικού νατρίου (SDS-PAGE), μεταφορά μεμβράνης πολυβινυλιδενίου (PVDF), βάλτε τη μεμβράνη σε ρυθμιστικό που περιέχει Tris που περιέχει Tris -20}
Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα TRIS με θάλαμο TRIS με Tween -20 (TBST) και μπλοκαρίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πρωτογενή αντισώματα σε TLR4, NF-κΒ ρ65, ρ-ΝΡ-κΒ ρ65 και -actin χρησιμοποιήθηκανανίχνευση του νεφρού ιστού(Τα αντισώματα αραιώθηκαν σε διάλυμα TBST σε αναλογία όγκου 1: 2000) σε 4 μοίρες κατά τη διάρκεια της νύχτας. TBST
Η μεμβράνη αραιώθηκε με δευτερογενές αντίσωμα (διάλυμα αντισώματος και TBST αραιώθηκε σε αναλογία όγκου 1: 2000) και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά το πλύσιμο της μεμβράνης 3 φορές με TBST, προστέθηκε αντιδραστήριο ECL φωτοβόλο για ανίχνευση και η έκφραση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με απεικόνιση πηκτής. Το λογισμικό Image J χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει την τιμή του γκρι πρωτεϊνών, με την -actin ως εσωτερική αναφορά.

1.3 Επεξεργασία δεδομένων

Το λογισμικό SPSS 23. Χρησιμοποιήθηκε δοκιμή Shapiro-Wilk για τη δοκιμή της κανονικότητας των δειγμάτων δεδομένων και η δοκιμή Brown-Forsythe ή Bartlett χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η ομοιογένεια της διακύμανσης των δεδομένων δείγματος. Τα δεδομένα μέτρησης με κανονική κατανομή και ομοιογένεια της διακύμανσης εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση. (x ± s) Υποδεικνύει την περιγραφή, χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA για τη δοκιμή και η μέθοδος του Dunnett χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση ζευγαριών αν στατιστικά σημαντική.
Για τις μετα -hoc ζεύγη συγκρίσεις των άνισων διακυμάνσεων, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος T3 του Dunnett, με το P <0 0 5 που υποδεικνύει μια στατιστικά σημαντική διαφορά και p <0,01 που υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων.

2 αποτελέσματα και ανάλυση

2.1 Προσδιορισμός της ολικής ζάχαρης, του ουρικού οξέος και της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες του CDPS

Η εξίσωση γραμμικής παλινδρόμησης της περιεκτικότητας σε πολυσακχαρίτη ήταν: y=5. 7628x - 0 0004, r=0. Το πείραμα έδειξε ότι μεταξύ 7 και 70 μg/mL, υπήρχε μια καλή γραμμική σχέση μεταξύ της τυπικής συγκέντρωσης γλυκόζης (Χ) και της τιμής απορρόφησης (Υ). Το υπολογιζόμενο ποσοστό περιεκτικότητας σε πολυσακχαρίτη στο δείγμα είναι: 81,02%.
Η εξίσωση γραμμικής παλινδρόμησης του τυπικού ουρονικού οξέος είναι: y=1. 1571x + 0 0015, r=0. Το πείραμα έδειξε ότι μεταξύ 20 και 100 μg/mL, υπήρχε μια καλή γραμμική σχέση μεταξύ της πρότυπης συγκέντρωσης ουρικού οξέος (x) και της τιμής απορρόφησης (y). Η περιεκτικότητα σε ουρρονικό οξύ στο δείγμα είναι: 4,43%.
Η τυπική εξίσωση γραμμικής παλινδρόμησης πρωτεΐνης είναι: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. Το πείραμα έδειξε ότι μεταξύ 20 και 1 00 μg/mL, υπήρχε μια καλή γραμμική σχέση μεταξύ της τυπικής συγκέντρωσης πρωτεΐνης (Χ) και της τιμής απορρόφησης (Υ). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες στο δείγμα είναι: 4,00%.

 

2.2 Κατανομή μοριακού βάρους των CDPs

Το μοριακό βάρος των CDPs προσδιορίστηκε με ανίχνευση χρωματογραφίας διαπερατότητας υψηλής απόδοσης. Με το RT AS (x) και το LGMP AS (y), η εξίσωση της καμπύλης βαθμονόμησης LGMP-RT υπολογίστηκε ως: y=-0. 1951x + 11. RT IS (x), LGMW είναι (y), η εξίσωση καμπύλης βαθμονόμησης LGMW-RT είναι: y=-0. 1973x + 11. RT IS (x), LGMN IS (y), η καμπύλη βαθμονόμησης LGMN-RT Η εξίσωση είναι: y=-0. Με βάση την τυπική καμπύλη, λαμβάνεται ο τύπος υπολογισμού για τον υπολογισμό του μοριακού βάρους κάθε δείγματος. Το φάσμα μοριακού βάρους του δείγματος έχει ως εξής και τα αποτελέσματα υπολογισμού παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1.

 

 

2.3 Σύνθεση μονοσακχαρίτη CDPS

Τα CDPs αναλύθηκαν με χρωματογραφία ιόντων και το χρωματογράφημα παρουσιάζεται στο σχήμα 2. Συγκρίνοντας τα φάσματα με εκείνα των προτύπων μονοσακχαρίτη, τα CDP αποτελούνται κυρίως από γλυκόζη, γαλακτόζη, ριανόζη, μαννόζη και σακχαρόζη. , Αραβινόζη. Η μοριακή αναλογία είναι 0. 734 0 5: 0. Από τη μοριακή αναλογία, μπορεί να φανεί ότι τα CDP αποτελούνται κυρίως από γλυκόζη, γαλακτόζη και ριανόζη. Μεταξύ αυτών, η γλυκόζη αντιπροσωπεύει το 73,405%, η γαλακτόζη αντιπροσωπεύει το 5,381%και η Rhamnose αντιπροσωπεύει το 5,02%.

 

Σημείωση: Man.Mannose, Glc Ν. Υδροχλωρική, Rha.rhamnose, Glc-ua.glucuronic οξύ, Gal-ua.galacturonic οξύ, Gal Ν. Υδροχλωρική, GLC.Glucose, Gal.galactose, Xyl.xylose, ARA. Arabinose, Fuc.fucose.

2.4 CDPS Fourier Πυρήρη ανάλυση

Η κορυφή κοντά σε 3246 cm -1 προκαλείται από την δόνηση του OH της ομάδας υδροξυλίου, η κορυφή απορρόφησης κοντά στα 2900 cm -1 είναι η κορυφή δόνησης CH, και η κορυφή απορρόφησης στα 1594 cm {{9} είναι το c=o o stenging δονήσεις, η κορυφή του cdps της {{10} o} o { 1374.31 cm -1: Αυτή η κορυφή απορρόφησης μπορεί να σχετίζεται με τη δόνηση παραμόρφωσης των δεσμών CH, ειδικά στις ομάδες πολυσακχαριτών μεθυλο (-Ch3) ή μεθυλενίου (-H 2-). Η κορυφή απορρόφησης στα 1018,38 cm -1 μπορεί να σχετίζεται με τη δόνηση τεντώματος του δεσμού CO, ο οποίος συνήθως βρίσκεται στους δεσμούς αιθέρα ή στους δεσμούς των πολυσακχαριτών. Τρεις αδύναμες κορυφές απορρόφησης στην περιοχή 1200-1000 cm -1 υποδεικνύουν την παρουσία πυρανόζης σε CDPs. Οι κορυφές απορρόφησης στα 870 και 930 cm -1 δείχνουν ότι οι γλυκοσιδικοί δεσμοί τύπου μπορεί να υπάρχουν σε CDPs. Δείτε το σχήμα 3.

 

2.5 τοξικές επιδράσεις του CDP σε φυσιολογικά HK -2 κύτταρα

Σε σύγκριση με το CON, στις 24 ώρες μετά τη χορήγηση, η βιωσιμότητα των κυττάρων άρχισε να μειώνεται σημαντικά αφού η συγκέντρωση CDPS έφτασε τα 1000 ug/ml (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Συζήτηση και Συμπέρασμα

Πολυσακχαρίτεςείναι πολυμερή υψηλού μοριακού βάρους που αποτελούνται από περισσότερους από 10 μονοσακχαρίτες. Έχει αναφερθεί ότι έχουν πολυσακχαρίτεςΑνοσο-μεταμορφωτικά, αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και υπογλυκαιμικά αποτελέσματα[15]. Ως μία από τις κύριες φαρμακολογικά δραστικές ουσίες στο Cistanche Deserticola, τα CDPs έχουν σημαντική φαρμακευτική αξία. Αυτή η μελέτη χαρακτήρισε προκαταρκτικά τη δομή των CDPs και διαπίστωσε ότι μπορούν να βελτιώσουν τη βλάβη των κυττάρων HK -2 που προκαλούνται από υψηλό περιβάλλον ζάχαρης.

 

Η σύνθετη δομή των πολυσακχαριτών σχετίζεται στενά με τη βιολογική τους δραστηριότητα, μεταξύ των οποίων ο τύπος και η αναλογία των μονοσακχαριτών, η σχετική μοριακή μάζα πολυσακχαριτών και ο τύπος των γλυκοσιδικών δεσμών είναι βασικοί παράγοντες που επηρεάζουν [16]. Η μέτρια σχετική μοριακή μάζα δίνει στους πολυσακχαρίτες πιο δραστικές θέσεις και μπορεί να παρουσιάζουν ισχυρότερη βιολογική δραστηριότητα.
Ωστόσο, το μεγάλο μοριακό βάρος θα αυξήσει τη διαμεμβρανική αντίσταση, την απορρόφηση πολυσακχαριτών παρεμπόδισης και θα επηρεάσει τη δραστηριότητα. Αντιστρόφως, οι πολυσακχαρίτες μικρού μοριακού βάρους μπορεί να μην είναι σε θέση να σχηματίσουν αποτελεσματικές ενεργές δομές, με αποτέλεσμα τη μειωμένη δραστηριότητα [17]. Κατά την εξερεύνηση της βιολογικής δραστικότητας των πολυσακχαριτών, είναι απαραίτητο να εξεταστεί διεξοδικά η σύνθεση μονοσακχαριτών, η σχετική μοριακή μάζα και ο τύπος γλυκοσιδικού δεσμού [18]. Σε αυτή τη μελέτη, η χρωματογραφία ιόντων διαπίστωσε ότι τα CDP αποτελούνται κυρίως από γλυκόζη, γαλακτόζη και ριανόζη, η οποία είναι σύμφωνη με την αναφορά των Xu et al. [19]. Τα μέσου μέσου βάρους βάρους των CDP που μετρήθηκαν με χρωματογραφία υψηλής απόδοσης υγρού πηκτώματος ήταν 3444, 4198 και 8031 ​​kDa, αντίστοιχα. Τα μοριακά βάρη τριών πολυσακχαριτών Cistanche από τέσσερα φαρμακευτικά υλικά τύπου Cistanche που μετρήθηκαν από τους Yang et αϊ. [20] ήταν παρόμοια. Τα CDPs ενδέχεται να περιέχουν γλυκοσιδικούς δεσμούς τύπου τύπου και μπορεί να περιέχουν -γλυκόζη ή -ManNose. Οι πολυσακχαρίτες που αποτελούνται από -γλυκόζη ή -ManNose αναγνωρίζονται ευκολότερα από τον υποδοχέα 4 (TLR4) ή TLR2 [21].
Το DN είναι μια από τις πιο σοβαρές μικροαγγειακές επιπλοκές του διαβήτη και η παθογένεσή του συνδέεται στενά με το οξειδωτικό στρες, τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και την απόπτωση των κυττάρων [22]. Αυτή η μελέτη διερεύνησε την προστατευτική επίδραση των CDP σε κύτταρα HK -2} ρυθμίζοντας την οδό σηματοδότησης TLR4/NF-κΒ και τον μοριακό της μηχανισμό.

Υπό συνθήκες υψηλής γλυκόζης, τα κύτταρα HK -2 παρουσιάζουν σημαντικό οξειδωτικό στρες [23]. Μελέτες έχουν διαπιστώσει ότι τα υψηλά επίπεδα ζάχαρης αυξάνουν σημαντικά την παραγωγή ενδοκυτταρικών ROS. Αυτή η υπερβολική ποσότητα ROS μπορεί να βλάψει άμεσα τα λιπίδια κυτταρικής μεμβράνης, οδηγώντας σε αύξηση του περιεχομένου του προϊόντος υπεροξείδωσης λιπιδίων MDA [24]. Ταυτόχρονα, οι δραστηριότητες των SOD και GSH-PX, σημαντικά αντιοξειδωτικά αμυντικά συστήματα, μειώθηκαν σημαντικά, υποδεικνύοντας ότι η αντιοξειδωτική ικανότητα των κυττάρων υπέστη σοβαρές ζημιές [25]. Αυτή η ανισορροπία στο σύστημα οξείδωσης-αντιοξειδώσεως προάγει περαιτέρω την έκφραση και την ενεργοποίηση του TLR4 [26]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερβολική ROS μπορεί να αναγνωριστεί από το TLR4 ως μοριακά πρότυπα που σχετίζονται με τον κίνδυνο (DAMPs), σχηματίζοντας βρόχο θετικής ανάδρασης [27]. Σε αυτή τη μελέτη, η προεπεξεργασία CDPs μείωσε σημαντικά τα επίπεδα ROS, τις αυξημένες δραστηριότητες SOD και GSH-PX και μειωμένο περιεχόμενο MDA. Αυτό το ολοκληρωμένο αντιοξειδωτικό αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι τα CDPs μπορεί να ρυθμίζουν τις αποκρίσεις οξειδωτικού στρες μέσω πολλαπλών στόχων.
Στην οδό σηματοδότησης TLR4/NF-κΒ, η ενεργοποιημένη TLR4 προάγει την ενεργοποίηση του συμπλέγματος IKK με την πρόσληψη πρωτεϊνών προσαρμογέα κατάντη, γεγονός που με τη σειρά του οδηγεί στη φωσφορυλίωση και την αποικοδόμηση του IκΒ [28]. Η παρούσα μελέτη παρατήρησε ότι η υψηλή γλυκόζη αύξησε σημαντικά το επίπεδο φωσφορυλίωσης του IκΒ, οδηγώντας στη μετατόπιση του NF-κΒ ρ65 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Μελέτες έχουν δείξει ότι η πυρηνική μετατόπιση του p65 όχι μόνο επιδεινώνει το οξειδωτικό στρες αλλά επηρεάζει επίσης τη μιτοχονδριακή λειτουργία [29].
Παρατηρήθηκε με τη χρώση JC -1 ότι η υψηλή θεραπεία γλυκόζης προκάλεσε σημαντική μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, δείχνοντας μετατόπιση από τον κόκκινο φθορισμό σε πράσινο φθορισμό, υποδεικνύοντας ότι η κλίση πρωτονίων μεταξύ των εσωτερικών και των εξωτερικών μεμβρανών των μιτοχονδρίων διαταράχθηκε. Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία επιδεινώνει περαιτέρω την παραγωγή ROS, σχηματίζοντας έναν φαύλο κύκλο [30]. Η προεπεξεργασία CDPs μπορεί να διατηρήσει τη σταθερότητα του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και αυτό το προστατευτικό αποτέλεσμα μπορεί να επιτευχθεί με την αναστολή της έκφρασης του TLR4 και της ενεργοποίησης του NF-κΒ.
Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και το επίμονο οξειδωτικό στρες οδηγούν τελικά σε απόπτωση των κυττάρων [31]. Η χρώση Hoechst αποκάλυψε ότι οι πυρήνες των κυττάρων στην ομάδα θεραπείας υψηλής γλυκόζης έδειξαν προφανείς τυπικές αποπτωτικές μορφολογικές μεταβολές όπως η συμπύκνωση, η συμπύκνωση και ο κατακερματισμός [32]. Αυτές οι αλλαγές σχετίζονται στενά με την ενδογενή οδό της μιτοχονδριακής με τη μεσολάβηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης: η απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης οδηγεί στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος C, την ενεργοποίηση του καταρράκτη κασπάσης και τελικά την κυτταρική απόπτωση [33]. Η πυρηνική μορφολογία των κυττάρων στην ομάδα προεπεξεργασίας CDPs ήταν βασικά φυσιολογική και η χρώση ήταν ομοιόμορφη, υποδηλώνοντας ότι τα CDPs εμπόδισαν την απόπτωση των κυττάρων διατηρώντας τη μιτοχονδριακή λειτουργία και αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες.
Συνοπτικά, αυτή η μελέτη ανίχνευσε συστηματικά δείκτες οξειδωτικού στρες (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), μιτοχονδριακή λειτουργία (JC -1) και απόπτωση των κυττάρων (Hoechst), σε συνδυασμό με τα μόρια βασικών μορίων σηματοδότησης TLR4/NF-κΒ που διευκρινίζει τον μηχανισμό των CDPs: CDPs:
Πρώτον, βελτιώνοντας την αντιοξειδωτική ικανότητα των κυττάρων, μειώνοντας το επίπεδο ROS και μειώνοντας την ενεργοποίηση του TLR4. Δεύτερον, αναστέλλοντας την έκφραση του TLR4 και τη φωσφορυλίωση του IκΒ, εμποδίζοντας την πυρηνική μετατόπιση του NF-κΒ. Τέλος, βελτιώνοντας τη λειτουργία των μιτοχονδρίων, αναστέλλοντας την απόπτωση των κυττάρων. Θάνατος, παίζοντας έτσι προστατευτικό ρόλο κατά της DN. Αυτό το συνεργιστικό αποτέλεσμα πολλαπλών στόχων καθιστά τα CDPs να δείχνουν καλές προοπτικές εφαρμογής στη θεραπεία του DN. Σε επόμενες μελέτες, η δομή πολυσακχαρίτη θα καθορίζεται περαιτέρω με περίθλαση ακτίνων Χ, φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού και φασματομετρία μάζας χρωματογραφίας αερίου. Επιπλέον, τα μέσα αποτελέσματα μοριακού βάρους δείχνουν ότι τα CDPs είναι ετερογενείς πολυσακχαρίτες. Στη συνέχεια, θα διαχωρίσουμε και θα καθαρίσουμε ομοιογενείς πολυσακχαρίτες, θα ανιχνεύσουμε τη δομή και τη βιολογική δραστηριότητα του πολυσακχαρίτη και θα διευκρινίσουμε τη σχέση δομής-δραστικότητας.