Η μεταγραφομετρία ενός κυττάρου αποκαλύπτει διαταραγμένες αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου του φίλτρου νεφρού μετά από πρώιμο και εκλεκτικό τραυματισμό των ποδοκυττάρων

Αποτελέσματα

Single-Cell Profiling of >29,000 Κύτταρα νεφρού εμπλουτισμένα με σπειραματοειδή

Τρέχοντα πρωτόκολλα ενός κυττάρου γιαταυτοποίηση ολόκληρου του νεφρού<2.5% glomerular cells,9 and although a καθαρισμένο σπειραματικό παρασκεύασμαΗ χρήση μαγνητικών σφαιριδίων εμπλουτίζει αυτόν τον πληθυσμό,22 αποτυγχάνει να συλλάβει άλλο κύτταροτύπους νεφρούπου μπορεί να έχει ενδιαφέρον. Χρησιμοποιήθηκε μια μέθοδος κοσκινίσματος για τον ταυτόχρονο εμπλουτισμό των σπειραμάτων και τη σύλληψη πρόσθετων τύπων κυττάρων νεφρού για να επεκταθούν αυτά τα ευρήματα και να αναπτυχθεί μια λεπτομερής κατανόηση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου εντός του σπειράματος στο πλαίσιο ολόκληρου του κυτταρικού τοπίου του νεφρού, πριν και μετά τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων.

Για τον εντοπισμό των πρώιμων μεταγραφικών επιδράσεων της αφαίρεσης των ποδοκυττάρων με έναν ειδικό τύπο κυττάρου, το scRNAseq πραγματοποιήθηκε μενεφρικό ιστόαπό WT και iCTCFpod / ποντίκια που συλλέχθηκαν με σειριακό κοσκίνισμα μετά από 1 εβδομάδα θεραπείας με δοξυκυκλίνη (Εικόνα 1Α). Ο νεφρικός ιστός από τέσσερα ζώα WT (τέσσερα βιολογικά αντίγραφα) και τέσσερα iCTCFpod/ζώα απέδωσε συνολικά 14.783 WT και 14.727 iCTCFpod/κύτταρα προφίλ μετά το φιλτράρισμα (Συμπληρωματικό Σχήμα S1, A και B, Συμπληρωματικοί πίνακες S1 και S2). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν για την αφαίρεση των επιδράσεων λόγω του αριθμού των UMI και του ποσοστού των μιτοχονδριακών αναγνώσεων. Μετά την ενσωμάτωση των WT και iCTCFpod/δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκε χαμηλή ανάλυση ομαδοποίησης για τον εντοπισμό εννέα συστάδων (Εικόνα 1Β). Βιολογικά αντίγραφα WT και iCTCFpod / δείγματα κατανεμήθηκαν σε όλα τα cluster (Συμπληρωματικό Σχήμα S2, AC). Όλοι οι κυτταρικοί τύποι του σπειράματος, καθώς και οι επιπρόσθετοι τύποι κυττάρων των νεφρών, ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας καθιερωμένους και προερχόμενους από δεδομένα δείκτες (Εικόνα 1C, Συμπληρωματικός Πίνακας S3, Συμπληρωματικό Σχήμα S3A).

Τα σπειραματικά κύτταρα, που αντιπροσωπεύουν συνολικά το 82,1% όλων των ανακτημένων κυττάρων [36,9% ποδοκύτταρα, 42,1% σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα (GECs), 2,7% μεσαγγειακά κύτταρα και 0,36% PECs] απομονώθηκαν και επανασυστοιχήθηκαν (Εικόνα 1D) . Ταυτοποιήθηκαν τέσσερις ομάδες ποδοκυττάρων, πέντε συστάδες GECs και μία συστάδα μεσαγγειακών κυττάρων και PECs, που εκφράζουν κανονικούς δείκτες κυτταρικού τύπου (Εικόνα 1Ε, Συμπληρωματικό Σχήμα S3B). Βιολογικά αντίγραφα του WT και του iCTCFpod / δείγματα κατανεμήθηκαν σε όλα τα cluster (Συμπληρωματικό Σχήμα S2, DF, Συμπληρωματικός Πίνακας S4). Όπως αναμενόταν, δεδομένου ότι η ειδική για τα ποδοκύτταρα διαγραφή CTCF οδηγεί σε ιστολογικά ανιχνεύσιμη απώλεια ποδοκυττάρων σε 2 εβδομάδες,13 iCTCFpod/δείγματα περιείχαν χαμηλότερο ποσοστό ποδοκυττάρων από τα δείγματα WT (Εικόνα 1ΣΤ, Συμπληρωματικός Πίνακας S5). iCTCFpod / δείγματα είχαν 13,1% λιγότερα podo κύτταρα, 11,9% περισσότερα GECs και 1,5% περισσότερα μεσαγγειακά κύτταρα από τα δείγματα WT (Συμπληρωματικός Πίνακας S5). συνεισφέρουν οι PEC<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

ΝΕΑ ΒΟΤΑΝΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΓΕΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ

Η Ειδική για Ποδοκύτταρα Επαγώγιμη Διαγραφή CTCF οδηγεί σε αλλαγές γονιδιακής έκφρασης σε όλους τους τύπους σπειραματοειδών κυττάρων

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορικής έκφρασης σε καθεμία από τις 11 ομάδες που συγκρίνουν κύτταρα iCTCFpod/ και WT (Συμπληρωματικός Πίνακας S6). Τα γονίδια θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένα εάν βρεθούν σε τουλάχιστον 10% των κυττάρων σε ένα δεδομένο σύμπλεγμα, με ελάχιστη απόλυτη αλλαγή λογαριασμών 0.1 και προσαρμοσμένο P < 0. 05. Το Ctcf εκφράστηκε διαφορικά σε καθεμία από τις τέσσερις ομάδες ποδοκυττάρων, με μέσες αλλαγές στο ημερολόγιο αναλογίας 0,390, 0,189, 0,331 και 0,303, αντίστοιχα. Οι αριθμοί των κυττάρων σε κάθε συστάδα υποβλήθηκαν σε δειγματοληψία και η ανάλυση διαφορικής έκφρασης επαναλήφθηκε για να συγκριθεί ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ των 11 συστάδων. Οι ομάδες ποδοκυττάρων είχαν τα πιο διαφορικά εκφρασμένα γονίδια, ακολουθούμενα από τα GEC-1 και GEC-2 (Εικόνα 1G). Οι υπόλοιπες τρεις ομάδες GECs, μαζί με τα μεσαγγειακά κύτταρα και τα PECs, είχαν πολύ λιγότερα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (Εικόνα 1G), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα GEC-1 και GEC-2, μεταξύ όλων των σπειραματικών συστάδων, επηρεάστηκαν περισσότερο από τα επακόλουθα της διαγραφής του CTCF που προκαλείται από τραυματισμό των ποδοκυττάρων.

Προγράμματα γονιδίων που σχετίζονται με ασθένειες που εντοπίζονται σε ειδικές ομάδες ποδοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων

Αυτή η μελέτη προσπάθησε αρχικά να εξετάσει πώς οι επιμέρους ομάδες ποδοκυττάρων ανταποκρίνονται στον τραυματισμό. Ένα διάγραμμα Venn των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε καθεμία από τις τέσσερις ομάδες ποδοκυττάρων αποκάλυψε ότι το ποδοκύτταρο 1 είχε τα πιο μοναδικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια από τις τέσσερις ομάδες ποδοκυττάρων (Εικόνα 2Α, Συμπληρωματικός Πίνακας S7). Η παρατήρηση ότι μία από τις τέσσερις ομάδες ποδοκυττάρων επηρεάστηκε περισσότερο είναι σύμφωνη με προηγούμενα ιστολογικά δεδομένα που υποδεικνύουν ότι δεν επηρεάζονται όλα τα ποδοκύτταρα με την ίδια σοβαρότητα έναντι του τραυματισμού και υπογραμμίζει τη δύναμη του scRNAseq να χαρακτηρίζει μοριακά την ετερογένεια των κυτταρικών καταστάσεων εντός του ίδιου τύπου κυττάρου.23

Πραγματοποιήθηκε μια ανάλυση υπερεκπροσώπησης για τον εντοπισμό προγραμμάτων γονιδίων που εμπλουτίστηκαν ως συνέπεια της απώλειας CTCF στο σύμπλεγμα των ποδοκυττάρων 1 (Συμπληρωματικός Πίνακας S8). Οι κορυφαίοι εμπλουτισμένοι όροι οπτικοποιήθηκαν με έναν χάρτη εμπλουτισμού για τη ομαδοποίηση αμοιβαία επικαλυπτόμενων συνόλων γονιδίων (Εικόνα 2Β). Μια εξέχουσα ομάδα εμπλουτισμένων όρων ήταν οι μιτοχονδριακές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης ATP, της μιτοχονδριακής οργάνωσης, της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και της οξειδωτικής φωσφορικής σύνδεσης (Εικόνα 2Β). Αυτά τα δεδομένα επεκτείνουν πρόσφατες εργασίες που υποδεικνύουν τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία ως σημάδι τραυματισμού των ποδοκυττάρων.24 Επιπλέον, η ανθρώπινη γενετική έχει επισημάνει τη σημασία των μιτοχονδριακών λειτουργιών στα ποδοκύτταρα, συμπεριλαμβανομένων αρκετών μεταλλάξεων στην οδό βιοσύνθεσης CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, και ADCK4) που προκαλούν νεφρωσικό σύνδρομο, κυρίως σε παιδιά.25,26 Ως εκ τούτου, έχει υποστηριχθεί ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία των ποδοκυττάρων μπορεί να αντιπροσωπεύει μια προεξέχουσα κυτταρική κατάσταση που σχετίζεται με όλες τις ασθένειες που προέρχονται από απώλεια ποδοκυττάρων.24 Τα δεδομένα υποστηρίζουν αυτήν την έννοια σε μεμονωμένη - ανάλυση κυττάρων, υποδηλώνοντας ότι η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων μπορεί να αντιπροσωπεύει την πιο πρώιμη κατάσταση τραυματισμού σε έναν συγκεκριμένο πληθυσμό ποδοκυττάρων, οδηγώντας σε απώλεια ποδοκυττάρων.

Πραγματοποιήθηκε μια ανάλυση υπερεκπροσώπησης για τον εντοπισμό προγραμμάτων γονιδίων που εμπλουτίστηκαν ως συνέπεια της απώλειας CTCF στο σύμπλεγμα των ποδοκυττάρων 1 (Συμπληρωματικός Πίνακας S8). Οι κορυφαίοι εμπλουτισμένοι όροι οπτικοποιήθηκαν με έναν χάρτη εμπλουτισμού για τη ομαδοποίηση αμοιβαία επικαλυπτόμενων συνόλων γονιδίων (Εικόνα 2Β). Μια εξέχουσα ομάδα εμπλουτισμένων όρων ήταν οι μιτοχονδριακές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης ATP, της μιτοχονδριακής οργάνωσης, της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και της οξειδωτικής φωσφορικής σύνδεσης (Εικόνα 2Β). Αυτά τα δεδομένα επεκτείνουν πρόσφατες εργασίες που υποδεικνύουν τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία ως σημάδι τραυματισμού των ποδοκυττάρων.24 Επιπλέον, η ανθρώπινη γενετική έχει επισημάνει τη σημασία των μιτοχονδριακών λειτουργιών στα ποδοκύτταρα, συμπεριλαμβανομένων αρκετών μεταλλάξεων στην οδό βιοσύνθεσης CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, και ADCK4) που προκαλούν νεφρωσικό σύνδρομο, κυρίως σε παιδιά.25,26 Ως εκ τούτου, έχει υποστηριχθεί ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία των ποδοκυττάρων μπορεί να αντιπροσωπεύει μια προεξέχουσα κυτταρική κατάσταση που σχετίζεται με όλες τις ασθένειες που προέρχονται από απώλεια ποδοκυττάρων.24 Τα δεδομένα υποστηρίζουν αυτήν την έννοια σε μεμονωμένη - ανάλυση κυττάρων, υποδηλώνοντας ότι η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων μπορεί να αντιπροσωπεύει την πιο πρώιμη κατάσταση τραυματισμού σε έναν συγκεκριμένο πληθυσμό ποδοκυττάρων, οδηγώντας σε απώλεια ποδοκυττάρων.

Μία από τις κύριες ομάδες εμπλουτισμένων όρων από την ανάλυση υπεραναπαράστασης (Εικόνα 2Β) ήταν η κυτταροσκελετική οργάνωση καθώς και ένας σχετικός μεμονωμένος εμπλουτισμένος όρος για την προσκόλληση κυττάρου-μήτρας. Ο κυτταροσκελετός ακτίνης παίζει ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση της μοναδικής και πολύπλοκης δομής των ποδοκυττάρων και η προσκόλληση στο GBM είναι απαραίτητη για τη λειτουργία των ποδοκυττάρων.27 Οι ώριμες εστιακές συμφύσεις περιέχουν εκατοντάδες πρωτεΐνες που συνδέουν τον κυτταροσκελετό της ακτίνης, τη δέσμευση της μήτρας του υποδοχέα, την ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος και πολυμερισμός ακτίνης. Ένα από τα πιο ρυθμιζόμενα γονίδια στο ποδοκύτταρο 1 ήταν το Rhpn1 (Συμπληρωματικό Σχήμα S4A), ένα ουσιαστικό συστατικό για την καθιέρωση της δυναμικής του κυτταροσκελετού των ποδοκυττάρων και τη διατήρηση της αρχιτεκτονικής διαδικασίας του ποδιού του ποδοκυττάρου. ρυθμίστηκε προς τα πάνω στο σύμπλεγμα των ποδοκυττάρων 1 (Εικόνα 2C, Συμπληρωματικό Σχήμα S4B). Ένα γονίδιο για ένα πρόσθετο συστατικό του συμπλόκου, το Actr2, ρυθμίστηκε επίσης προς τα πάνω τόσο στο ποδοκύτταρο 1 όσο και στο ποδοκύτταρο 4. Επιπλέον, το Wasl, του οποίου το πρωτεϊνικό προϊόν, N-WASP, ενεργοποιεί το σύμπλεγμα Arp2/3 και απαιτείται για τη συντήρηση των διεργασιών του ποδιού του ποδοκυττάρου in vivo29, ρυθμίστηκε επίσης προς τα πάνω στο ποδοκύτταρο 1, το ποδοκύτταρο 3 και το ποδοκύτταρο 4. Ο ρυθμιστής του κυτταροσκελετικού συστήματος Arhgdia, του οποίου η διαγραφή σχετίζεται με το νεφρωσικό σύνδρομο σε ποντικούς, ρυθμίστηκε προς τα κάτω στο ποδοκύτταρο 1 (Εικόνα 2C). Τα επίπεδα έκφρασης δύο Rho GTPases

Εικόνα 3 Το σύμπλεγμα ποδοκυττάρων ρυθμίζει προς τα πάνω το Col4a5. Α: Το Col4a5 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω σε επαγώγιμα κύτταρα ποδοκυττάρου 1 με ειδική διαγραφή CTCF (iCTCFpod / ) σε σύγκριση με κύτταρα ποδοκυττάρου 1 άγριου τύπου (WT). Οι υποδοχείς κολλαγόνου τύπου IV ɑ5 (COL4A5) εκφράστηκαν έντονα σε μεσαγγειακά κύτταρα και σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα (GEC) υποομάδες 1 έως 4. Το μέγεθος της αιχμής του βέλους αντιπροσωπεύει τη σχετική έκφραση του υποδοχέα. Β: Ποσοτικοποίηση της αλυσιδωτής αντίδρασης υβριδισμού (HCR). Το Col4a5 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω στα κύτταρα που εκφράζουν iCTCFpod / Nphs2-σε σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν WT Nphs{{20}}. Αξιολογήθηκαν τέσσερα WT και τέσσερα iCTCFpod / ποντίκια. Όλα τα σπειράματα από τρεις εικόνες ποσοτικοποιήθηκαν. C: Έκφραση Col4a5 σε σπειράματα WT και iCTCFpod/ζώα όπως αξιολογήθηκε με HCR. *P < 0,0001 (t-test δύο ουρών με διόρθωση Welch). Αρχική μεγέθυνση, 40; 63 (μεγεθύνσεις εγκιβωτισμένων περιοχών) (Γ). Ράβδοι ζυγαριάς Z 50 mm (C). IFI, ανοσοφθορισμού απεικόνιση.

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 μοναδικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (Συμπληρωματικό Σχήμα S6A, Συμπληρωματικός Πίνακας S9). Η ανάλυση υπερβολικής αναπαράστασης έδειξε ότι τα μοναδικά διαφορετικά εκφραζόμενα γονίδια στο GEC-1 εμπλουτίστηκαν σε προγράμματα γονιδίων για μετανάστευση και προσκόλληση κυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα S6, B και C, Συμπληρωματικός Πίνακας S10). Αυτές οι αναλύσεις αποκάλυψαν τις πιο πρώιμες μεταγραφικές αλλαγές που συμβαίνουν στα GECs ως απόκριση στον τραυματισμό των ποδοκυττάρων.

Η μοντελοποίηση της διακυτταρικής επικοινωνίας αποκαλύπτει βασικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ τύπων κυττάρων σε απόκριση στον πρώιμο τραυματισμό των ποδοκυττάρων

Έχοντας εντοπίσει διαταραγμένα γονιδιακά προγράμματα σε πολλές διακριτές ομάδες κυττάρων, η μελέτη προσπάθησε στη συνέχεια να κατανοήσει πώς η διασταύρωση σπειραματικών κυττάρων-κυττάρου επηρεάστηκε από τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων. Η μελέτη εξέτασε αρχικά τον κατάλογο των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε συστάδες ποδοκυττάρων, GEC και μεσαγγειακών κυττάρων. Η έκφραση δύο βασικών αυτοκρινών προσδεμάτων προεπιβίωσης, των Vegfa και Pdgfb, καθώς και η έκφραση του υποδοχέα PDGFB, Pdgfrb, διακόπηκαν (Συμπληρωματικός Πίνακας S6). Η έκφραση του Vegfa μειώθηκε σε όλες τις ομάδες ποδοκυττάρων (μέση αλλαγή στο ημερολόγιο μεταξύ 0.034 και 0.149). Αντίθετα, η έκφραση Pdgfb αυξήθηκε σε όλα τα συμπλέγματα GEC (μέση μεταβολή ημερολογιακής αναδίπλωσης μεταξύ 0.{11}}31 και 0,140) και ο υποδοχέας Pdgfrb ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε μεσαγγειακά κύτταρα (μέση μεταβολή ημερολογιακής αναδίπλωσης του 0,155). Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι ο τραυματισμός των ποδοκυττάρων οδηγεί σε μειωμένη έκφραση του προσδέματος προεπιβίωσης Vegfa, επηρεάζοντας αρνητικά τα GEC. Για να αντισταθμίσουν, τα GECs μπορεί να ρυθμίσουν προς τα πάνω τον συνδέτη προεπιβίωσης Pdgfb, ενεργοποιώντας τα μεσαγγειακά κύτταρα να ρυθμίσουν προς τα πάνω τον υποδοχέα Pdgfrb.

Το NicheNet, ένας νέος αλγόριθμος που συμπεραίνει πώς οι αλληλεπιδράσεις υποδοχέα συνδέτη που προέρχονται από δεδομένα έκφρασης μπορεί να επηρεάσουν συγκεκριμένους στόχους ενσωματώνοντας προϋπάρχουσα γνώση των δικτύων σηματοδότησης και ρύθμισης, χρησιμοποιήθηκε για τη βαθύτερη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων συνδέτη-υποδοχέα και των υποτιθέμενων γονιδίων στόχων τους.20 Το NicheNet εφαρμόστηκε σε μοντέλο στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ποδοκυττάρων και των GECs, καθώς και των μεσογειακών κυττάρων και των GECs που θα μπορούσαν δυνητικά να προκαλέσουν διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (γονίδια στόχοι) σε GECs στο πλαίσιο τραυματισμού των ποδοκυττάρων (Εικόνα 4Α). Για αυτήν την ανάλυση, όλες οι συστάδες κάθε τύπου κυττάρου συνδυάστηκαν σε ένα ενιαίο σύμπλεγμα. Οι κορυφαίοι προβλεπόμενοι συνδέτες που εκφράζονται από μεσαγγειακά κύτταρα και/ή ποδοκύτταρα ήταν η πλειοτροφίνη (Ptn), η αγγειοποιητίνη 2 (Angpt2), το Col4a1, το μόριο προσκόλλησης των αγγειακών κυττάρων 1, η μορφογενετική πρωτεΐνη των οστών 4 (Bmp4), η Ephrin B1, ο αυξητικός παράγοντας συνδετικού ιστού και το semaphoring 3e (Sema3e) (Εικόνα 4Β). Το πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων GEC μέσω των οποίων είναι γνωστό ότι δρουν αυτοί οι συνδέτες χαρτογραφήθηκαν δίπλα στην ανάλυση δραστικότητας συνδέτη. Επιπλέον, χαρτογραφήθηκαν επίσης τα προβλεπόμενα γονίδια-στόχοι που εκφράστηκαν διαφορετικά σε iCTCFpod / GEC σε σύγκριση με τους ελέγχους WT. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 4Β συνοψίζονται ως κυκλικά διαγράμματα στο Σχήμα 4, Γ και Δ.

Αρκετοί συνδέτες, υποδοχείς και γονίδια στόχοι ήταν αξιοσημείωτοι από αυτή την ανάλυση. Η πλειοτροφίνη, ένας συνδέτης που εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στα μεσαγγειακά κύτταρα (Εικόνα 4Β), είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας που μπορεί να δεσμεύσει και να αναστείλει τον υποδοχέα πρωτεϊνικής φωσφατάσης τυροσίνης τύπου Β, διεγείροντας τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω αυξημένου Tek (Tie2)/Angpt137 και Kdr (Vegfr2)/Vegfa σηματοδότηση. Κατά συνέπεια, το Tek ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω στα GEC (Εικόνα 4Β). Το Angpt2, που εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στα μεσαγγειακά κύτταρα, είναι ένας ανταγωνιστικός συνδέτης του Tek, αναστέλλοντας τη δέσμευση του Angpt1.39 Επειδή η σηματοδότηση Angpt1 είναι γνωστό ότι προάγει την επιβίωση των ποδοκυττάρων και η διαταραχή της αναλογίας Angpt1/Angpt2 συμβάλλει στην ανάπτυξη DKD,40 αυτός ο συνδέτης Η ανάλυση υποδοχέα φάνηκε να δείχνει τη δυσπροσαρμοστική σηματοδότηση Tek στα GECs ως μία από τις πρώτες συνέπειες του τραυματισμού των ποδοκυττάρων

Αυτή η μελέτη βρήκε επίσης εξέχουσες αλλαγές στην έκφραση του κολλαγόνου τύπου IV σε αρκετά σπειραματικά κύτταρα (Εικόνα 4Β). Φυσιολογικά παράγονται από υγιή ποδοκύτταρα, τα ετεροτριμερή του κολλαγόνου IV μεταβαίνουν από ɑ1ɑ1ɑ2 σε ɑ3ɑ4ɑ5 κατά τη διάρκεια της σπειραματικής ανάπτυξης, η οποία είναι απαραίτητη για τον σωστό σχηματισμό και τη σωστή λειτουργία του GBM. DKD.41,42 Στην τρέχουσα ανάλυση, το Col4a1 εκφράστηκε τόσο από μεσαγγειακά κύτταρα όσο και από GECs (μέση έκφραση του θερμικού χάρτη προσδέματος) (Εικόνα 4Β) και ρυθμίστηκε ειδικά προς τα πάνω σε iCTCFpod / GEC σε σύγκριση με τους ελέγχους WT. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα GEC ρυθμίζουν προς τα πάνω το Col4a1 στο πλαίσιο τραυματισμού των ποδοκυττάρων, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε ένα πιο άκαμπτο, ινωτικό GBM που συμβάλλει στην ανάπτυξη τμηματικής σκλήρυνσης.33

Το Bmp4 ήταν ένας εξαιρετικά εκφρασμένος μεσαγγειακός συνδέτης που ταυτοποιήθηκε με ανάλυση NicheNet (Εικόνα 4, BD). Οι BMPs παίζουν βασικούς ρόλους στην ανάπτυξη και τη νόσο των νεφρών.43 Το Bmp4 ρυθμίζεται προς τα πάνω στο πλαίσιο της διαβητικής νεφροπάθειας σε αρουραίους,42 και η θεραπεία ποντικών με διαβήτη με ένα αντίσωμα anti-BMP4 αποτρέπει την προς τα πάνω ρύθμιση του Col4a1 και την επέκταση της μεσαγγειακής μήτρας .44 Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, βρέθηκε ότι το μεσαγγειακό Bmp4 ενεργοποιεί την έκφραση GEC Smad6 (Εικόνα 4Β). Η έκφραση του Smad6 προκαλείται από τα BMPs και σε έναν βρόχο αρνητικής ανάδρασης, το Smad6 αναστέλλει ειδικά τα BMPs, συμπεριλαμβανομένου του BMP4.45 Το Smad6 ρυθμίστηκε προς τα κάτω στα iCTCFpod / GECs σε σύγκριση με τους ελέγχους WT, υποδηλώνοντας αυξημένη σηματοδότηση BMP στα ενδοθηλιακά κύτταρα στη ρύθμιση τραυματισμού των ποδοκυττάρων .

Ένας από τους συνδετήρες προτεραιότητας που ταυτοποιήθηκαν στα ποδοκύτταρα ήταν ο Sema3e (Εικόνα 4, BD). Οι σημαφορίνες κατηγορίας 3 είναι εκκρινόμενες πρωτεΐνες που λειτουργούν σε μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης, της λεμφαγγειογένεσης και της νόσου.46 Το Sema3a ρυθμίζεται προς τα πάνω στην ανθρώπινη DKD,47 και το Sema3g αναγνωρίστηκε πρόσφατα ως γονίδιο ειδικό για τα ποδοκύτταρα που προστατεύει τα ποδοκύτταρα από φλεγμονή in vivo. 48 Ο ρόλος του Sema3e στα ποδοκύτταρα παραμένει ασαφής. Η τρέχουσα ανάλυση αποκάλυψε ένα προηγουμένως μη αναγνωρισμένο ζεύγος υποδοχέα-συνδέτη όπου το Podocyte Sema3e αλληλεπιδρά με το plexinD1 στα GECs για να ενεργοποιήσει αρκετούς κατάντη γονιδιακούς στόχους στο πλαίσιο τραυματισμού των ποδοκυττάρων (Εικόνα 4, C και D).

Μεταξύ πολλών πρόσφατα ταυτοποιημένων γονιδίων-στόχων GEC, τα Hes1 και Cx3cl1 βρέθηκαν επίσης στα προγράμματα γονιδίων προσκόλλησης που εμπλουτίστηκαν σε GEC-1 (Εικόνα 4, BD, Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Το Hes1 είναι στόχος σηματοδότησης Notch, το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στον αναπτυσσόμενο νεφρό, αλλά η επανενεργοποίηση μπορεί να οδηγήσει σε ίνωση.49 Η Cx3cl1 είναι μια χημειοκίνη που παράγεται κυρίως από το σπειραματικό ενδοθήλιο που δρα ως χημειοελκτικό και μόριο προσκόλλησης για τον υποδοχέα του, Cx3cr1, το οποίο εκφράζεται πανταχού παρόν σε μονοπύρηνα και κυκλοφορικά λεμφικά λευκοκύτταρα.50 Cx3cl1 έχει εμπλακεί σεποικιλία νεφρικών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένωνDKD, IgA νεφροπάθεια και σπειραματονεφρίτιδα.50 Τα Hes1 και Cx3cl1 ρυθμίστηκαν και τα δύο προς τα πάνω στα iCTCFpod / GECs σε σύγκριση με τους ελέγχους WT, υποδηλώνοντας ότι τα GEC ανταποκρίνονται στον τραυματισμό των ποδοκυττάρων ρυθμίζοντας προς τα πάνω προγράμματα προφλεγμονώδους και προϊδρωσικής δράσης.

Τέλος, επειδή πολλοί από τους συνδέτες και τους στόχους που προσδιορίστηκαν στην ανάλυση NicheNet εμπλέκονται στο DKD, τόσο σε μοντέλα τρωκτικών όσο και σε ανθρώπους, το σύνολο δεδομένων συγκρίθηκε με ένα σύνολο μεταγραφικών δεδομένων μεμονωμένων πυρήνων της πρώιμης ανθρώπινης DKD.10 έγινε σύγκριση γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ομάδων κυττάρων ανθρώπου και ποντικού. Από τα 138 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια σε ανθρώπινα DKD GECs, 25 γονίδια ταυτοποιήθηκαν επίσης σε iCTCFpod / ενδοθηλιακά κύτταρα ποντικού, συμπεριλαμβανομένου του Col4a1 (Συμπληρωματικό Σχήμα S7, Συμπληρωματικός Πίνακας S11). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα προγράμματα ενδοθηλιακών κυττάρων που συχνά διακόπτονται στην ανθρώπινη DKD μπορούν να ανακεφαλαιωθούν εν μέρει στο μοντέλο ποντικού της πρώιμης σπειραματικής βλάβης μέσω εκλεκτικής αφαίρεσης των ποδοκυττάρων. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι, εκτός από τα ποδοκύτταρα, μπορεί να υπάρχουν πιθανοί στόχοι και θεραπευτικές στρατηγικές για το ενδοθηλιακό ειδικό για την αναστολή ή την επιβράδυνση της εξέλιξης πολύπλοκων και εξαιρετικάδιαδεδομένες νεφρικές παθήσεις, όπωςDKD.