Επιλεκτική κυτταροτοξικότητα της φυτικής ουσίας ακτεοσίδης κατά των καρκινικών κυττάρων και οι μηχανιστικές γνώσεις της

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Χριστίνα Χειμωνίδη κ.ά

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Τα φυσικά προϊόντα χαρακτηρίζονται από εξαιρετική δομική ποικιλομορφία και ως εκ τούτου προσφέρουν μια μοναδική πηγή για τον εντοπισμό νέων αντικαρκινικών παραγόντων. Εδώ αναφέρουμε ότι η φυτική ουσίαακτεοσίδηΗ απομόνωση με προηγμένες φυτοχημικές μεθόδους από τα φύλλα Lippia citriodora έδειξε ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα έναντι των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων. δρούσε σε συνέργεια με διάφορους κυτταροτοξικούς παράγοντες και ευαισθητοποιούσε τα χημειοανθεκτικά καρκινικά κύτταρα.Ακτεοσίδηδεν ήταν τοξικό σε φυσιολογικά κυτταρικά πλαίσια, ενώ αύξησε το οξειδωτικό φορτίο, επηρέασε τη δραστηριότητα των πρωτεοστατικών μονάδων και κατέστειλε τις μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας σε κυτταρικές σειρές όγκου. Η ενδοπεριτοναϊκή ή από του στόματος χορήγηση (μέσω πόσιμου νερού) ακτεοσίδης σε μοντέλο ποντικού μελανώματος ρύθμισε προς τα πάνω τις αντιοξειδωτικές αποκρίσεις στους όγκους. Ωστόσο, μόνο η ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και προκάλεσε αντικαρκινικά αντιδραστικές ανοσοαποκρίσεις. Αναλύσεις αναγνώρισης/ποσοτικοποίησης φασματομετρίας μάζας αποκάλυψαν ότι η ενδοπεριτοναϊκή χορήγησηακτεοσίδηοδήγησε σε σημαντικά υψηλότερη, σε σύγκριση με την από του στόματος χορήγηση, τη συγκέντρωση της ένωσης στο πλάσμα και στους όγκους των ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία, υποδηλώνοντας ότι η in vivo αντικαρκινική της δράση εξαρτάται από την οδό χορήγησης και την επιτευχθείσα συγκέντρωση στον όγκο. Τέλος, μελέτες μοριακής μοντελοποίησης και δοκιμές ενζυματικής δραστηριότητας έδειξαν ότιακτεοσίδηαναστέλλει την πρωτεϊνική κινάση C. Συμπερασματικά, η ακτεοσίδη υπόσχεται ως χημικό ικρίωμα για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών παραγόντων.

Λέξεις-κλειδιά:Ακτεοσίδη, Καρκίνος, Φυσική ένωση, Οξειδωτικό στρες, Πρωτεόσταση, Ανοσοτροποποίηση

ακτεοσίδη κιστάνχης

1. Εισαγωγή

Η καρκινογένεση χαρακτηρίζεται από την απορρύθμιση πολλών οδών σηματοδότησης των κυττάρων και σχετίζεται με αυξημένο κυτταρικό οξειδωτικό, αντιγραφικό, μεταβολικό, γονοτοξικό και πρωτεοτοξικό στρες [1]. Για να προσαρμοστούν και να ξεπεραστούν αυτοί οι φαινότυποι στρες, τα κακοήθη κύτταρα ρυθμίζουν προς τα πάνω (εκτός από τα ογκογονίδια) αρκετές μη ογκογόνες οδούς με στόχο είτε την καταστολή είτε (τουλάχιστον) την ανακούφιση του συνεχιζόμενου στρες. Μεταξύ των διαφόρων μη ογκογόνων οδών που βρέθηκαν να ρυθμίζονται συχνά προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης είναι οι μονάδες του δικτύου πρωτεόστασης (PN) μαζί με τις κυτταρικές αντιοξειδωτικές αποκρίσεις [2,3].

Βασικά συστατικά του PN είναι οι δύο κύριοι μηχανισμοί αποικοδόμησης, δηλαδή η οδός Αυτοφαγίας-Λυσοσώματος (ALP) και η Ουμπικιτίνη-Πρωτεασωμική οδός (UPP), μαζί με το δίκτυο των κυτταρικών μοριακών συνοδών. Η ALP εμπλέκεται κυρίως στην αποικοδόμηση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων και κατεστραμμένων οργανιδίων [4], ενώ η UPP αποδομεί τις κανονικές βραχύβιες πρωτεΐνες και τις μη επισκευάσιμες λανθασμένες ή ξεδιπλωμένες πρωτεΐνες [5-8]. Το 26 Σευκαρυωτικό πρωτεάσωμα αποτελείται από τα ρυθμιστικά σωματίδια 19S (RP) και το σωματίδιο 20 Score (CP). Το τελευταίο αποτελείται από τέσσερις στοιβαγμένους επταμερικούς δακτυλίους (δύο τύπου που περιβάλλουν δύο τύπου) που σχηματίζουν μια δομή που μοιάζει με βαρέλι. Οι δραστηριότητες πεπτιδάσης πρωτεασώματος τύπου χυμοθρυψίνης (CT-L), τρυψίνης (TL) και τύπου κασπάσης (CL) εντοπίζονται στις 5, 2 και 1 πρωτεασωμικές υπομονάδες, αντίστοιχα [6]. Η αποδεδειγμένη κλινική αποτελεσματικότητα των αναστολέων πρωτεασώματος Bortezomib (Velcade®· επίσης ονομάζεται PS-341) και Carfifilzomib έναντι διαφόρων αιματολογικών κακοηθειών [9] έχει παράσχει την «απόδειξη της ιδέας» της στόχευσης της UPP ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου. Το πολύπλοκο δίκτυο κυτταρικών αντιοξειδωτικών αμυντικών μονοπατιών που συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης [3,10] περιλαμβάνει αντιοξειδωτικά ένζυμα, καθώς και αρκετούς μεταγραφικούς παράγοντες που κινητοποιούν τις κυτταροπροστατευτικές γονιδιωματικές αποκρίσεις. Αυτά περιλαμβάνουν το forkhead box O (Foxo) και τον πυρηνικό παράγοντα ερυθροειδές 2-σχετικό παράγοντα (Nrf-2). Το Nrf-2 είναι κεντρικό στην προστασία των κυττάρων από οξειδωτική ή/και ξενοβιοτική βλάβη καθώς διεγείρει την έκφραση των αντιοξειδωτικών και των γονιδίων φάσης II [11-13].

Εμείς και άλλοι προτείναμε πρόσφατα ότι η στόχευση αυτών των εξαρτήσεων όγκου (π.χ. πρωτεοστατικές μονάδες και/ή μονοπάτια απόκρισης αντιοξειδωτικών) ή η αύξηση των κυτταρικών επιπέδων ROS στο πλαίσιο ενός μετασχηματισμένου γονότυπου προσφέρει ένα πιθανό θεραπευτικό παράθυρο για την επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων [3 ,14]; Ως υποστήριξη, έχει αναφερθεί επιλεκτική θανάτωση καρκινικών κυττάρων από ένα μικρό μόριο που ρύθμιζε προς τα πάνω τα επίπεδα των κυτταρικών ROS [2]. Αναμένεται ότι συνδυαστικές προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένης και της ενεργοποίησης αντικαρκινικών ανοσοαποκρίσεων [15] πιθανότατα θα μεγιστοποιήσουν το θεραπευτικό παράθυρο που προσφέρεται με την αναστολή των αποκρίσεων PN και αντιοξειδωτικών ή/και αυξάνοντας τα κυτταρικά επίπεδα ROS.

Φυσικά προϊόντα (εκχυλίσματα ή καθαρές ενώσεις) (NPs) από διάφορες πηγές (φυτά, θαλάσσιοι οργανισμοί, μικροοργανισμοί, κ.λπ.) ελέγχονται για την ικανότητά τους να δρουν ως αντικαρκινικοί παράγοντες λόγω της εξαιρετικής δομικής ποικιλομορφίας και της χημικής πολυπλοκότητάς τους, καθώς και επειδή δρουν πλειοτροπικά διαμορφώνοντας διάφορες κυτταρικές οδούς σηματοδότησης [16]. Σύμφωνα με αναφορές, τα NPs ενεργοποιούν αντιφλεγμονώδεις, αντικαρκινικές και/ή αντιμεταστατικές αποκρίσεις [16,17] και επίσης αποφεύγουν την αντίσταση σε πολλά φάρμακα [18,19]. Μεταξύ αυτών, οι φαινολικές ενώσεις (συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων) έχουν προσελκύσει σημαντικό ενδιαφέρον λόγω του αναφερόμενου ρόλου τους στην πρόληψη και/ή τη θεραπεία διαφόρων ανθρώπινων ασθενειών.

Η ακτεοσίδη, που ονομάζεται επίσης χρήση ή βερμπασκοσίδη [20], είναι ένας φαινυλαιθανοειδής γλυκοσίδης που απομονώνεται από πολλά δικοτυλήδονα. Σύμφωνα με αναφορές, η ακτεοσίδη ασκεί μερικές ενδιαφέρουσες βιολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων των αντιοξειδωτικών, αντιφλεγμονωδών και ρυθμιστικών ιδιοτήτων της κυτταρικής απόπτωσης [21,22]. Ωστόσο, η πιθανή αντικαρκινική του δράση δεν έχει αντιμετωπιστεί. Αναφέρουμε εδώ ότι η ακτεοσίδη έδειξε αυξημένη κυτταροτοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων θηλαστικών χωρίς εμφανή τοξικά αποτελέσματα σε φυσιολογικά κυτταρικά πλαίσια. Επιπλέον, η ακτεοσίδη κατέστειλε την ανάπτυξη όγκου μελανώματος στο μοντέλο ποντικού Vivo, ενεργοποιώντας (μεταξύ άλλων) ανοσολογικές αντιδράσεις κατά του όγκου.

αποτελέσματα τουακτεοσίδη κιστάνχης

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Φυτικό υλικό και εκχύλιση

αποξηραμένα φύλλα Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) αγοράστηκαν από την τοπική αγορά στην Αθήνα, Ελλάδα. Τα φύλλα κονιοποιήθηκαν και εκχυλίστηκαν με μηχανική ανάδευση για 12 ώρες με μεθανόλη (2 χ 20 L). Το μεθανολικό εκχύλισμα εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και πλύθηκε με ένα μίγμα CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L). Το αδιάλυτο υπόλειμμα διαχωρίστηκε και ξηράνθηκε, παράγοντας μια πρασινοκίτρινη σκόνη (450 g).

2.2. Καθαρισμός ακτεοσίδης και ανάλυση UPLC-HRMS

Ένα μέρος (1{3}} g) του προαναφερθέντος υπολείμματος υποβλήθηκε σε χρωματογραφία αντίθετης ροής χρησιμοποιώντας μια συσκευή ταχείας φυγοκεντρικής χρωματογραφίας κατανομής (FCPC) (Kromaton, Γαλλία). Ένα μίγμα EtOAc/EtOH/H2O σε αναλογία 5/0,5/4,5 χρησιμοποιήθηκε ως διφασικό σύστημα διαλυτών. Τα συλλεχθέντα κλάσματα υποβλήθηκαν σε χρωματογραφία λεπτής στιβάδας. Στη συνέχεια τα χρωματογραφήματα παρατηρήθηκαν κάτω από λυχνία UV (254 και 365 nm) και έγιναν ορατά με ψεκασμό με θειική βανιλίνη μεθανόλη και ακολούθησε θέρμανση για δύο λεπτά. Συνολικά 2,1 g ακτεοζίτη (καθαρότητα μεγαλύτερη από ή ίση με 90 τοις εκατό) απομονώθηκαν με την προαναφερθείσα διεργασία. Η ταυτοποίηση του ακτεοσιδίου πραγματοποιήθηκε με φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και φασματομετρίας μάζας (MS), ενώ η καθαρότητά του καθορίστηκε με ανάλυση UPLC-MS και NMR. για λεπτομέρειες, ανατρέξτε στο Suppl. Υλικά και μέθοδοι.

2.3. Κυτταρικές γραμμές

Οι εμβρυονικοί ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα (κύτταρα IMR90) μαζί με τις κυτταρικές σειρές ποντικών B16.F1, B16.F10, YAC{-1 και WEHI-164 ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection (ATCC). Οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος U2 OS και Sa OS δόθηκαν ευγενικά από τον Καθ. Β. Γοργούλη (Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ελλάδα), ενώ τα κύτταρα οστεοσαρκώματος KH OS και οι κυτταρικές σειρές χημειοανθεκτικών οστεοσαρκώματος [23] ήταν δωρεά του Δρ. Ε. Γκόνου (Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Ελλάδα). Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου ποντικού C5N και A5 ανήκουν σε ένα μοντέλο καρκινογένεσης δέρματος ποντικού πολλαπλών σταδίων [24,25] και δωρήθηκαν από τον καθηγητή A. Balmain (Περιεκτικό Κέντρο Καρκίνου, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Οι συνθήκες καλλιέργειας των χρησιμοποιούμενων κυτταρικών σειρών αναφέρονται στο Suppl. Υλικά και μέθοδοι.

όφελος απόακτεοσίδη κιστάνχης

2.4. Αρσενικό μοντέλο ποντικιού μελανώματος

Ποντίκια C57BL/6 (25-30 γρ. βάρους, ηλικίας 6-8 εβδομάδων) ελήφθησαν από το Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ και στεγάστηκαν σε ελεγχόμενη θερμοκρασία (22 βαθμοί ) και φωτοπερίοδο (12 ώρες φως: 12 ώρες σκοτάδι ) με δωρεάν πρόσβαση σε νερό και φαγητό. Τα ποντίκια εμβολιάστηκαν υποδορίως με 105 κύτταρα μελανώματος B16.F1 (σε 100 μL PBS) και χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες (n=5/ομάδα). Όταν οι όγκοι έγιναν ψηλαφητές (ημέρα 11), τα ποντίκια έλαβαν ακτεοσίδη μέσω δύο οδών. είτε ενδοπεριτοναϊκά (IP) (1 mg/ποντικό αραιωμένο σε 200 μL PBS, συνολικά 6 δόσεις χορηγούμενες κάθε δεύτερη μέρα) είτε από το στόμα με πόσιμο νερό (OR) (2,5 mg/ποντικό, συνολικά 13 δόσεις για 13 συνεχόμενες ημέρες). Σε ποντίκια ελέγχου χορηγήθηκε PBS. Η ανάπτυξη του όγκου καταγραφόταν κάθε 2 ημέρες μετρώντας τον κύριο και τον ελάσσονα άξονα των σχηματισμένων όγκων με ψηφιακό παχύμετρο. Οι μετρήσεις μετασχηματίστηκαν σε όγκο όγκου χρησιμοποιώντας τον τύπο: όγκος όγκου (cm3)=κύριος άξονας × δευτερεύων άξονας 2 × 0,5. Την ημέρα 28, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας, και οι σπλήνες αφαιρέθηκαν υπό άσηπτο τρόπο. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια ευρήματα.

Τα σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από μεμονωμένα ομογενοποιημένους σπλήνες και δοκιμάστηκαν αμέσως για την κυτταροτοξικότητά τους έναντι των κυτταρικών στόχων B16.F1, YAC-1 και WEHI-164. Η κυτταροτοξικότητα αξιολογήθηκε με βάση την ανίχνευση έκθεσης CD107 στην κυτταρική επιφάνεια, ως αποτέλεσμα της αποκοκκίωσης των τελεστών κυττάρων. Τα σπληνοκύτταρα (105 κύτταρα/φρεάτιο) συγκαλλιεργήθηκαν με στόχους σε μικροπλάκες πυθμένα 96-φρεάτιου U σε αναλογία τελεστή προς στόχο (Ε: Τ) 100:1, στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2. Σε κάθε φρεάτιο προστέθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα αντι-CD107a και αντι-CD107b συζευγμένα με FITC (25 μL/mL) και μονενσίνη (6 μL/mL, όλα από την BD Biosciences). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 6 ώρες αργότερα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCanto II. Παράλληλα, οι όγκοι αποκόπηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για κατάντη αναλύσεις όπως περιγράφεται στο Suppl. Υλικά και μέθοδοι.

ακτεοσίδη κιστάνχης