Η λιποκαλίνη που σχετίζεται με την εκκρινόμενη ουδετεροφιλική ζελατινάση δείχνει ισχυρότερη ικανότητα να αναστέλλει τη διεύρυνση της κύστης των κυττάρων ADPKD σε σύγκριση με τη μη εκκρινόμενη μορφή Ⅲ
Jun 25, 2024
3.4. Επιδράσεις του mNGAL στον σχηματισμό κύστεων κυττάρων 2L3 σε 3D καλλιέργεια
Πολλαπλασιασμός κυττάρωνείναι ασυνήθιστα αυξημένο σε ποντίκια 2L3 και οδηγεί σε σχηματισμό κύστης και μεγέθυνση [17]. Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα που ανέστειλε το mNGALΠολλαπλασιασμός κυττάρων 2L3 σε 2D καλλιέργεια(Εικόνα 3), υποθέσαμε ότι το mNGAL μπορεί να αναστείλει περαιτέρω τον σχηματισμό κύστεων σε κύτταρα 2L3. Για να διερευνήσουμε εάν το mNGAL θα μπορούσε να αναστείλει τον σχηματισμό κύστεων σε κύτταρα 2L3, δημιουργήσαμε μια τρισδιάστατη πλατφόρμα καλλιέργειας που παρείχε ένα κατάλληλο περιβάλλον με το Matrigel για το σχηματισμό κύστεων (Εικόνα 6). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων (1000 κύτταρα/φρεάτιο) πάνω από το προσχηματισμένο Matrigel όλη τη νύχτα. Αφού τα κύτταρα προσαρτήθηκαν στο πήκτωμα, προστέθηκε περισσότερο Matrigel στα κύτταρα για να σχηματιστεί ένα σχέδιο που μοιάζει με σάντουιτς (Εικόνα 6Α). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τρισδιάστατη καλλιέργεια στους 37 ◦C και 5% CO2 για τουλάχιστον 5 ημέρες για να σχηματιστούν κύστεις. Οι κύστεις σε τρισδιάστατη καλλιέργεια μεγάλωσαν με παρατεταμένο χρόνο καλλιέργειας (Εικόνα 6Β). Για να επιβεβαιώσουμε ότι οι σφαιρικές κατασκευές που παρατηρήθηκαν στην τρισδιάστατη καλλιέργεια ήταν κύστεις με αυλό, τις στερεώσαμε και τις χρωματίσαμε με αντισώματα DAPI και Ε-καντερίνης και ακτίνης για να ταυτοποιήσουμε κυτταρικούς πυρήνες, adh κυττάρου, esion και κορυφαία μεμβράνη, αντίστοιχα. Διαφορετικές οπτικές τομές z μιας κύστης 2L3 σε τρισδιάστατη καλλιέργεια από την κορυφή (στρώμα 1) έως τη μέση (στρώμα 5) παρατηρήθηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία και ο αυλός επιβεβαιώθηκε εντός της σφαιρικής κύστης (Εικόνα 6C, Συμπληρωματικό υλικό
ΝΕΑ ΒΟΤΑΝΑ ΓΙΑ ADPKD(ΠΟΛΥΚΥΣΤΙΚΕΣ ΝΕΦΡΕΣ)
Για τη διερεύνηση των επιδράσεων του mNGAL στον σχηματισμό κύστεων κυττάρων 2L3 σε 3D καλλιέργεια, τα κύτταρα σε 3D καλλιέργεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορσκολίνη από τις Ημέρες 1 έως 3 για να προκληθεί σχηματισμός κύστης. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς mNGAL από τις Ημέρες 4 έως 8 και οι διάμετροι των κύστεων μετρήθηκαν κάθε μέρα (Εικόνα 6D). Οι κύστεις στην τρισδιάστατη καλλιέργεια αυξήθηκαν αναλογικά με τον αριθμό των ημερών καλλιέργειας, με διαμέτρους που κυμαίνονταν από 40 έως 120 μm (Εικόνα 6E–G), ενώ το mNGAL κατέστειλε σημαντικά τις διαμέτρους της κύστης (Εικόνα 6F) και την περιοχή (Εικόνα 6G) μέχρι την Ημέρα 8. Ωστόσο , δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στην αύξηση του αριθμού κύστεων μεταξύ της ομάδας ελέγχου και των ομάδων που έλαβαν mNGAL από τις Ημέρες 4 έως 8 (Εικόνα 6Η). Αναλύσαμε περαιτέρω τον αριθμό των μεγάλων κύστεων (διάμετρος > 100 μm) μεταξύ των δύο ομάδων και βρήκαμε ότι το mNGAL μείωσε σημαντικά το ποσοστό των μεγάλων κύστεων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου την Ημέρα 8 (Εικόνα 6I).
3.5. Επιδράσεις της επιμόλυνσης με pN + LS και pN - LS στην έκφραση NGAL και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε κύτταρα 2L3
Για να μελετήσουμε εάν η ανάγκη για υψηλότερη συγκέντρωση mNGAL (2 mg/mL) σε τρισδιάστατη καλλιέργεια για την αναστολή της ανάπτυξης κύστης των κυττάρων 2L3 (Εικόνα 6) οφειλόταν στην έλλειψη μεταμεταφραστικής τροποποίησης του mNGAL, σχεδιάσαμε ένα κατασκεύασμα για την υπερέκφραση του mNGAL σε κύτταρα 2L3. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι το NGAL μπορεί να αλληλεπιδράσει με το NGAL-R και να προκαλέσει περαιτέρω απόπτωση [29]. Επομένως, για να κατανοήσουμε εάν το NGAL αλληλεπιδρά με το NGAL-R για να προκαλέσει απόπτωση και περαιτέρωαναστέλλουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων(Εικόνα 3) και ανάπτυξη κύστης (Εικόνα 6), ένα κατασκεύασμα για την υπερέκφραση της μη εκκρινόμενης NGAL (χωρίς την αλληλουχία οδηγό) επίσης επιμολύνθηκε σε κύτταρα 2L3.
Το NGAL ποντικιού (NP_032517.1) και το ανθρώπινο NGAL (NP_005555.2) είναι πρωτεΐνες 200-aa και 198-aa, αντίστοιχα, και και τα δύο έχουν {{6 }}aa πεπτίδιο σήματος για έκκριση που βρίσκεται στο Ν-άκρο της πρωτεΐνης NGAL (Εικόνα 7Α). Η σύγκριση αλληλουχίας έδειξε 62% ταυτότητα και 80% θετικότητα μεταξύ NGAL ποντικού και ανθρώπινης NGAL. Το NGAL ποντικού είχε δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης με Ν στην ασπαραγίνη (Asn, Ν) στα aa 81 και 85, ενώ το ανθρώπινο NGAL είχε μία θέση στο aa 85 (Εικόνα 7Α), αποκαλύπτοντας τη διαφορά μεταξύ τους στη μετα-μεταφραστική τροποποίηση.
Εικόνα 7. Επιδράσεις της επιμόλυνσης με pN + LS και pN - LS στην έκφραση NGAL και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε κύτταρα 2L3. (Α) Ευθυγράμμιση πρωτεϊνών NGAL ποντικού (NP_032517.1) και ανθρώπινου NGAL (NP_005555.2). Τα πεπτίδια σήματος 20-aa εμφανίζονται με μπλε χρώμα. Οι δύο αναφερόμενες θέσεις Ν-συνδεδεμένης γλυκοζυλίωσης στο Asn (Ν) στα aa 81 και 85 του NGAL ποντικού και μία στο aa 85 του ανθρώπινου NGAL σημειώνονται με έναν αστερίσκο (*). Ταυτότητες: συμπαγής γραμμή; θετικά: ζευγαρωμένες κουκκίδες. Οι παραπάνω πληροφορίες ακολουθίας προέρχονται από το πρόγραμμα BLASTP στον ιστότοπο του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI). (Β) Κατασκευάστε ένα διάγραμμα mNGAL με (pN + LS) ή χωρίς (pN − LS) την εκκρινόμενη ακολουθία οδηγών Igκ στο φορέα pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd. (Γ) Το αποτέλεσμα της ηλεκτροφόρησης γέλης επιβεβαίωσε την κατασκευή των pN + LS (647 bp) και pN - LS (587 bp) που χωνεύτηκαν από NheI και NotI. (Δ) Χρονοδιάγραμμα μόλυνσης και επιλογή κυττάρων 2L3 με pN + LSκαι pN − LS, αντίστοιχα. Τα κύτταρα 2L3 μολύνθηκαν με pN + LS ή pN - LS στην πλάκα των 6α φρεατίων την ημέρα 1. Η επιλογή με blasticidin ξεκίνησε την ημέρα 2 και το μέσο άλλαζε κάθε 3 ημέρες. Μετά από επιλογή για μια εβδομάδα, συλλέχθηκαν κύτταρα για να αναλυθούν με RT-QPCR, western blot και ELISA. (Ε) Ανίχνευση έκφρασης του eGFP αναφοράς για να εξεταστεί η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης των pN + LS και pN - LS την Ημέρα 2. Περίπου το 10% των κυττάρων μολύνθηκαν με το κατασκεύασμα GFP. Μπάρα κλίμακας: 50 μm. Τα αποτελέσματα της RT–qPCR έδειξαν ότι τα pN + LS και pN - LS είχαν και τα δύο υψηλότερη έκφραση του Lcn2 (αντιπροσωπευόταν ολικό επίπεδο NGAL) (F) και του c-myc (αντιπροσωπεύτηκε το επιμολυσμένο εξωγενές επίπεδο NGAL) (G) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Η) Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά oinSlc22a17 (NGAL-R) μεταξύ των ομάδων. RQ: σχετική ποσοτικοποίηση=2−∆∆Ct; Το Gapdh χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος κάθε δείγματος. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στην ομάδα ελέγχου. (I) Τα αποτελέσματα Western blot έδειξαν ότι το pN + LS και το pN - LS είχαν υψηλότερη έκφραση NGAL από την ομάδα ελέγχου. (J) Η ELISA έδειξε ότι τα κύτταρα pN + LS και pN - LS και τα δύοεκκρίνει σημαντικά υψηλότερο NGAL από την ομάδα ελέγχου, ενώ η εκκρινόμενη ποσότητα NGAL των κυττάρων pN - LS ήταν σημαντικά μικρότερη από τα κύτταρα pN + LS. (K) Η ενσωμάτωση BrdU έδειξε ότι τα κύτταρα pN + LS και pN - LS είχαν χαμηλότερο λόγο πολλαπλασιασμού κυττάρων από την ομάδα ελέγχου, ενώ τα κύτταρα pN - LS είχαν υψηλότερη από τα κύτταρα pN + LS. Το Student's t-test πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των δύο ομάδων (n=3 σε RT–qPCR και ELISA, n=4 σε western blot και BrdU ενσωμάτωση). *p < 0.05; ** p < {{10}}.01; *** p < 0,001 έναντι 2L3 κάθε ομάδας. # p < 0,05; ### p < 0,001 έναντι ομάδας pN + LS. ns: καμία σημαντική διαφορά.
Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια αλληλουχία οδηγού αλυσίδας Igκ ποντικού (LS) [44] αντί του αρχικού πεπτιδίου σήματος του mNGAL για να εξασφαλίσουμε αυξημένη έκκριση εξωγενούς πρωτεΐνης mNGAL. Για την υπερέκφραση εκκρινόμενου ή μη NGAL, NGAL με ή χωρίς LS στο pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd φορείς, συγκεκριμένα, pN + LS και pN - LS, χρησιμοποιήθηκαν και φαίνονται στο Σχήμα 7Β. Δύο προαγωγείς, ο pCMV και η hPGK, χρησιμοποιήθηκαν για να οδηγήσουν την ανεξάρτητη έκφραση δύο πρωτεϊνών, των NGAL-c-myc-His6 και eGFP. Για να εξασφαλιστεί η εισαγωγή του κατασκευάσματος, χρησιμοποιήθηκαν NheI και NotI για την πέψη των δύο πλασμιδίων και τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης γέλης έδειξαν μια ζώνη 647-bp από pN + LS και μια ζώνη 587-bp από pN - LS (λόγω της έλλειψης ακολουθίας οδηγών 60-bp) (Εικόνα 7Γ).
Για μόλυνση των pN + LS και pN-SP σε κύτταρα 2L3, πολυβρένιο και φακοϊός προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν στους 37 ◦C για 24 ώρες, ακολουθούμενη από επιλογή με blasticidin (Εικόνα 7D). Η ανίχνευση της έκφρασης GFP πραγματοποιήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού μετά από μόλυνση (Εικόνα 7Ε). Τα μολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν μία εβδομάδα μετά την επιλογή blasticidin για RT-qPCR, western blot και ELISA για να αναλυθεί το επίπεδο έκφρασης NGAL (Εικόνα 7F-J). Τα αποτελέσματα RT–qPCR έδειξαν ότι η μόλυνση των κυττάρων 2L3 με pN + LS και pN - LS οδήγησε σε αυξανόμενη έκφραση του Lcn2 (Εικόνα 7F) και του Lcn2-c-myc (Εικόνα 7G), που αντιπροσώπευε τα επίπεδα της συνολικής και εξωγενές NGAL, αντίστοιχα, ενώ δεν υπήρχαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης Slc22a17 (NGAL-R) (Εικόνα 7Η). Τα αποτελέσματα western blot έδειξαν ότι τα κύτταρα pN + LS και pN - LS είχαν υψηλότερα επίπεδα ενδοκυτταρικής έκφρασης NGAL από τα κύτταρα ελέγχου 2L3 (Εικόνα 7I). Τα αποτελέσματα ELISA για το κυτταρικό υπερκείμενο έδειξαν ότι τα κύτταρα pN + LS και pN - LS είχαν και τα δύο σημαντικά υψηλότερα επίπεδα εκκρινόμενης NGAL από την ομάδα ελέγχου κυττάρων 2L3 (Εικόνα 7J). Επιπλέον, η ποσότητα NGAL που εκκρίνεται από τα κύτταρα pN - LS ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη που εκκρίνεται από τα κύτταρα pN + LS (Εικόνα 7J), ενώ οι δύο ομάδες είχαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης NGAL (Εικόνα 7I). Αυτό το εύρημα υποστήριξε την πρόβλεψή μας ότι η υπερέκφραση του NGAL χωρίς πεπτίδιο σήματος (pN - LS) περιόρισε την έκκριση του NGAL παρά την παρουσία υψηλού επιπέδου ενδοκυτταρικού NGAL. Για να διερευνηθεί εάν το εκκρινόμενο NGAL αντί του μη εκκρινόμενου NGAL ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU, η οποία έδειξε ότι τα κύτταρα pN + LS και pN - LS είχαν σημαντικά χαμηλότερο πολλαπλασιασμό από την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 7Κ). Επιπλέον, τα κύτταρα pN - LS είχαν σημαντικά υψηλότερο πολλαπλασιασμό από τα κύτταρα pN + LS (Εικόνα 7K). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκκριση NGAL από κύτταρα 2L3 χρειαζόταν για την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.
3.6. Επιδράσεις της ψυχικής υπερέκφρασης που οδηγεί σε μονοπάτια σηματοδότησης σε κύτταρα 2L3
Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματά μας που έδειξαν ότι το mNGAL θα μπορούσε να αναστείλει τις οδούς ERK και AKT σε κύτταρα 2L3 (Εικόνα 4) και να μειώσει περαιτέρω τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικόνα 3) και τη διεύρυνση της κύστης (Εικόνα 6), χρησιμοποιήσαμε western blotting για να αναλύσουμε εάν τα ERK και AKT Οι οδοί επηρεάστηκαν στα κύτταρα pN + LS και pN - LS (Εικόνα 8). Τα αποτελέσματα western blot έδειξαν ότι οι ομάδες pN + LS και pN - LS είχαν σημαντικά χαμηλότερη αναλογία p-ERK (T202/Y204)/ERK από την ομάδα ελέγχου και η ομάδα pN - LS είχε υψηλότερη αναλογία p-ERK (T202/Y204)/ERK από την ομάδα pN + LS (Εικόνα 8Α). Η αναλογία p-AKT (S473)/AKT ήταν χαμηλότερη στην ομάδα pN + LS από ό,τι στην ομάδα ελέγχου, ενώ τα κύτταρα pN - LS δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά από εκείνα των ομάδων ελέγχου και pN + LS (Εικόνα 8Β). Η αναλογία p-CREB (S133)/CREB ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα pN - LS από ό, τι στην ομάδα pN + LS, ενώ ούτε pN + LS ούτε pN - LS έδειξαν σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 8C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα pN + LS και pN - LS είχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία p-ERK/ERK (Εικόνα 8Α), ενώ η ομάδα pN + LS δεν παρουσίασε καλύτερη επίδραση στο AKT (Εικόνα 8Β) και στο CREB ( Εικόνα 8Γ) ενεργοποίηση.
Σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα ότι η εφαρμογή mNGAL θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση (Εικόνα 3) και αυτοφαγία σε κύτταρα 2L3 (Εικόνα 5) και να μειώσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικόνα 3) και τη διεύρυνση της κύστης (Εικόνα 6), χρησιμοποιήσαμε western blotting για να διερευνήσουμε την επίδραση στην απόπτωση. και αυτοφαγία σε κύτταρα pN + LS και pN - LS (Εικόνα 9). Τα αποτελέσματα στυπώματος western έδειξαν ότι τα κύτταρα pN + LS είχαν σημαντικά υψηλότερη αναλογία διασπασμένης-/προ-κασπάσης-3 (Εικόνα 9Α) και διασπασμένης/προ-PARP (Εικόνα 9Β) από την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα pN − LS δεν έδειξαν σημαντική διαφορά στην αναλογία διασπασμένης/προ-κασπάσης-3 (Εικόνα 9Α) και διασπασμένης/προ-PARP (Εικόνα 9Β) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, και την αναλογία διασπασμένης- Η /pro-caspase-3 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από αυτή στην ομάδα pN + LS (Εικόνα 9Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση της εκκρινόμενης NGAL αντί της μη εκκρινόμενης NGAL προκάλεσε απόπτωση στα κύτταρα 2L3.
Μια υψηλότερη αναλογία LC3B II/LC3B I (Εικόνα 9C) και μια χαμηλότερη αναλογία p62/GAPDH (Εικόνα 9D) αναγνωρίστηκαν στα κύτταρα pN + LS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα pN − LS δεν είχαν σημαντική διαφορά στην αναλογία LC3B II/LC3B I (Εικόνα 9C) και p62/GAPDH (Εικόνα 9D) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και η αναλογία LC3B II/LC3B I ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό,τι στην ομάδα pN + LS ομάδα (Εικόνα 9C). Αυτό το αποτέλεσμα αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση της εκκρινόμενης NGAL αντί της μη εκκρινόμενης NGAL προκάλεσε αυτοφαγία στα κύτταρα 2L3.
3.7. Επιδράσεις της υπερέκφρασης του mNGAL στον σχηματισμό κύστεων κυττάρων 2L3 σε καλλιέργεια 3D
Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα ότι το mNGAL ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 2L3 και τη μεγέθυνση κύστεων σε 2D και 3D καλλιέργεια, αντίστοιχα (Εικόνες 3 και 6), υποψιαστήκαμε ότι η υπερέκφραση της εκκρινόμενης NGAL θα μπορούσε να αναστείλει περαιτέρω τη διεύρυνση των κύστεων των κυττάρων 2L3 μέσω της αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Εικόνα 7Κ).
Για να διερευνηθούν τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης NGAL σε κύτταρα 2L3 στον σχηματισμό κύστεων, τα κύτταρα ελέγχου 2L3, pN + LS και pN - LS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορσκολίνη τις Ημέρες 1-3 για να προκληθεί σχηματισμός κύστης. Οι διάμετροι, η περιοχή και οι αριθμοί της κύστης μετρήθηκαν καθημερινά μετά την επαγωγή της φορσκολίνης (Εικόνα 10Α). Οι κύστεις των κυττάρων ελέγχου 2L3, pN + LS και pN - LS σε τρισδιάστατη καλλιέργεια αναπτύχθηκαν με τρόπο εξαρτώμενο από τις ημέρες καλλιέργειας (Εικόνα 10Β) και έδειξαν προφανείς διαφορές στο μέγεθος της κύστης από τις Ημέρες 4 έως 8. Η ομάδα pN + LS είχε σημαντικά μικρότερες διαμέτρους κύστης (Εικόνα 10C) και περιοχές (Εικόνα 10D) από την ομάδα ελέγχου από τις Ημέρες 4 έως 8, ενώ η ομάδα pN - LS είχε σημαντικά μικρότερες διαμέτρους κύστης από την ομάδα ελέγχου τις Ημέρες 6 και 8 (Εικόνα 10C). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην περιοχή της κύστης μεταξύ των ομάδων ελέγχου και pN - LS. Επιπλέον, η ομάδα pN - LS είχε σημαντικά μεγαλύτερες διαμέτρους και περιοχές κύστης από την ομάδα pN + LS την Ημέρα 8 (Εικόνα 10C, D). Αν και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον ρυθμό αύξησης του αριθμού κύστεων μεταξύ των κυττάρων ελέγχου, pN + LS και pN - LS (Εικόνα 10Ε), οι ομάδες pN + LS και pN - LS είχαν και οι δύο σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά μεγάλων (διάμετρος > κύστεις 100 μm από την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 10F) από τις Ημέρες 4 έως 8. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα pN + LS και pN - LS ανέστειλαν τη διεύρυνση της κύστης, ενώ η ανασταλτική επίδραση του pN - LS ήταν ασθενέστερη από αυτή του pN + LS . Αυτό το εύρημα αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση του εκκρινόμενου mNGAL είχε ανώτερη ικανότητα να αναστέλλει τη μεγέθυνση της κύστης των κυττάρων 2L3 σε τρισδιάστατη καλλιέργεια από το μη εκκρινόμενο mNGAL.
-Έγινε δοκιμή για τον προσδιορισμό της σημασίας μεταξύ των ομάδων (n=3). * p < 0.05; *** p < 0.001 έναντι ομάδας ελέγχου; # p < 0,05 έναντι της ομάδας pN + LS
κασπάση{{0}} (Α) και διασπάστηκε-/προ-PARP (Β) από την ομάδα ελέγχου, η οποία αντιπροσώπευε την επαγωγή απόπτωσης από εκκρινόμενο mNGAL. Τα κύτταρα pN − LS δεν είχαν σημαντική διαφορά στην αναλογία διασπασμένης/προ-κασπάσης-3 και διασπασμένης/προ-PARP σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα pN + LS είχαν υψηλότερη αναλογία LC3B II/LC3B I (C) και χαμηλότερη αναλογία p62 (D) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα pN -LS δεν είχαν σημαντική διαφορά στην αναλογία LC3B II/LC3B I και p62 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Το Tubulin, Vinculin και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί μάρτυρες κάθε δείγματος. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στην ομάδα ελέγχου. Το Student's t-test πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των ομάδων (n=3). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 έναντι ομάδας ελέγχου. # p < 0,05; ## p < 0,01 vs.pN + ομάδα LS.
Εικόνα 9. Επιδράσεις της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης mNGAL στην απόπτωση και την αυτοφαγία σε κύτταρα 2L3. Τα αποτελέσματα Western blot έδειξαν ότι τα κύτταρα pN + LS είχαν σημαντικά υψηλότερη αναλογία διασπασμένης-/προ-κασπάσης-3(Α) και διασπασμένης-/προ-PARP (Β) από την ομάδα ελέγχου, η οποία αντιπροσώπευε την επαγωγή απόπτωσης από εκκρινόμενη mNGAL. Τα κύτταρα pN -LS δεν είχαν σημαντική διαφορά στην αναλογία διασπασμένης/προ-κασπάσης-3 και διασπασμένης/προ-PARP σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα pN + LS είχαν υψηλότερη αναλογία LC3BII/LC3B I (C) και χαμηλότερη αναλογία p62 (D) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα pN - LS δεν είχαν σημαντική διαφορά στην αναλογία των LC3B II/LC3B I και p62 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Το Tubulin, Vinculin και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί μάρτυρες κάθε δείγματος. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στην ομάδα ελέγχου. Πραγματοποιήθηκε το t-test Student για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των ομάδων
(n {{0}}). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 έναντι ομάδας ελέγχου. # p < 0,05; ## p < 0,01 έναντι ομάδας pN + LS
4–8. Ο αριθμός κύστης την Ημέρα 4 κάθε ομάδας χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τον υπολογισμό της αναλογίας αριθμού κύστης. (ΣΤ) Ποσοστό μεγάλου μεγέθους κύστεων στην τρισδιάστατη καλλιέργεια της ομάδας ελέγχου, κύτταρα pN + LS και pN - LS κατά τις Ημέρες 4-8. Το Student's t-test πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των ομάδων (n=3). * p < {{10}}.05; ** p < 0.01 έναντι ομάδας ελέγχου. # p < 0,05; ## p < 0,01 έναντι ομάδας pN + LS.
