Η λιποκαλίνη που σχετίζεται με την εκκρινόμενη ουδετεροφιλική ζελατινάση δείχνει ισχυρότερη ικανότητα να αναστέλλει τη διεύρυνση της κύστης των κυττάρων ADPKD σε σύγκριση με τη μη εκκρινόμενη μορφή Ⅳ

4. Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η προσθήκη και/ή η υπερέκφραση του εκκρινόμενου mNGALπρωτεΐνη μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 2L3καιανέστειλε την ανάπτυξη της κύστης in vitro ρυθμίζοντας προς τα πάνω την απόπτωσηκαι αυτοφαγία καιμείωση της ρύθμισης των οδών σηματοδότησης που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό. Για να προσδιοριστεί εάν τα κύτταρα M-1, που έχουν δημιουργηθεί από παρόμοιους τόπους νεφρικών σωληναρίων ποντικού με τα κύτταρα 2L3, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως κύτταρα ελέγχου άγριου τύπου για κύτταρα 2L3, χρώση με λεκτίνη των κυττάρων M-1 και 2L3 με LTL και πραγματοποιήθηκε DBA (Εικόνα 1D). Τα LTL και DBA χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό των διαφοροποιημένων εγγύς σωληναρίων και των αγωγών συλλογής των νεφρών του ποντικού, αντίστοιχα [45,46]. Τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα Μ-1 έχουν παρόμοια μορφολογία (Εικόνα 1C) και προέλευση νεφρικών σωληναρίων (Εικόνα 1D) με κύτταρα 2L3. Ως εκ τούτου, η κυτταρική γραμμή M-1 επιλέχθηκε ως έλεγχος άγριου τύπου για κελιά 2L3.

ΝΕΑ ΒΟΤΑΝΑ ΓΙΑADPKD(ΠΟΛΥΚΥΣΤΙΚΕΣ ΝΕΦΡΕΣ)

Στις περισσότερες κλινικές περιπτώσεις, οι ασθενείς με ADPKD εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα NGAL στα ούρα τους από τους φυσιολογικούς ανθρώπους [19,47-49]. Το μοντέλο ποντικιού ADPKD που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη έχει επίσης υψηλότερα επίπεδα έκφρασης NGAL και NGAL-R [31]. Τόσο τα αποτελέσματα RT-qPCR όσο και western blot έδειξαν ότι τα κύτταρα 2L3 εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα NGAL από την κυτταρική σειρά άγριου τύπου M-1 (Εικόνα 1F, H), ενώ δεν εντοπίστηκε σημαντική διαφορά στο επίπεδο έκφρασης NGAL-R μεταξύ τις δύο κυτταρικές σειρές (Εικόνα 1G, H), κάτι που δεν συνάδει με τα in vivo αποτελέσματα [31]. Αυτή η διαφορά μπορεί να οφείλεται στη σύνθετη αλληλεπίδραση εντός των ιστών του ποντικιού, η οποία δεν συμβαίνει στο πολύ απλούστερο κυτταρικό σύστημα.

Τα αποτελέσματα western blot έδειξαν ότι η άμεση χορήγηση και/ή η γενετική υπερέκφραση του mNGAL σε 2L3 ανέστειλε την οδό ERK. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Α και 8Α, το σήμα του p-ERK1 (44 kDa) ήταν ασθενέστερο από το p-ERK2 (42 kDa), ενώ το ERK1 (44 kDa) ήταν πιο έντονο από το ERK2 (42 kDa), προκαλώντας αξιοσημείωτη αύξηση σε p-ERK2/ERK2 σε σύγκριση με p-ERK1/ERK1 σε όλες τις πειραματικές ομάδες. Το ERK1 και το ERK2 είναι δύο ισομορφές των ERK που έχουν προταθεί ότι έχουν διαφορετικές επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [50]. Το ERK1 έχει αναγνωριστεί ότι προκαλεί επιβίωση και ανάπτυξη κυττάρων. Ωστόσο, το ERK2 προάγει τη διαφοροποίηση των κυττάρων και εμποδίζει την κυτταρική ανάπτυξη [51]. Στη μελέτη μας, η αναλογία του p-ERK2/ERK2 ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή του p-ERK1/ERK1 σε όλες τις ομάδες, γεγονός που έδειξε ότι τα κύτταρα έτειναν να διαφοροποιούνται και να μειώνουν την ανάπτυξη. Ωστόσο, τόσο η προσθήκη όσο και η υπερέκφραση του mNGAL μείωσαν δραματικά την αναλογία και των δύο p-ERK1/ERK1 και p-ERK2/ERK2 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και οδήγησαν σε σημαντικά χαμηλότερη αναλογία p-ERK/ERK, που έδειξε το φαινόμενο mNGAL στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Για τη δημιουργία μιας τρισδιάστατης πλατφόρμας καλλιέργειας για τον χαρακτηρισμό και την αξιολόγηση της θεραπείας του σχηματισμού κύστεων σε κύτταρα 2L3, επιχειρήθηκαν διάφορες συνθήκες. Έχει αποδειχθεί ότι η συγκέντρωση του Matrigel για τρισδιάστατη καλλιέργεια επηρεάζει το ποσοστό των δομικών κύστεων και σωληναρίων που σχηματίζονται in vitro [25,52,53]. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι το 40% Matrigel ήταν η καλύτερη φόρμουλα για να δείξει τον βέλτιστο σχηματισμό δομής κύστης των κυττάρων 2L3. Υπήρχαν αρκετές συνθήκες, συμπεριλαμβανομένων των ενσωματωμένων μοτίβων και των μοτίβων στην κορυφή για τρισδιάστατες καλλιέργειες [54]. Επιλέξαμε τη μέθοδο on-top (μοτίβο σαν σάντουιτς) για έναν καλύτερο και ευκολότερο τρόπο ανάλυσης των κύστεων (Εικόνα 6). Ωστόσο, η εμπειρία μας έδειξε ότι οι κύστεις των κυττάρων 2L3 δεν ήταν αρκετά μεγάλες όταν καλλιεργήθηκαν χωρίς κανένα επαγωγέα σε τρισδιάστατη καλλιέργεια μέχρι την Ημέρα 14. Η φορσκολίνη χρησιμοποιείται συνήθως για την πρόκληση σχηματισμού κύστεων ενεργοποιώντας την αδενυλυλοκυκλάση (AC) για την αύξηση της κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (cAMP). [11,55]. Επομένως, στη μελέτη μας, χρησιμοποιήσαμε φορσκολίνη (20 μΜ) για να προκαλέσουμε σχηματισμό κύστης σε κύτταρα 2L3 πριν από τη διανοητική θεραπεία.

Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η υπερέκφραση της ειδικής για τα νεφρά NGAL σε ποντίκια 2L3 θα μπορούσε να επιβραδύνει την εξέλιξη της ADPKD μειώνοντας το μέγεθος της κύστης αλλά όχι τον αριθμό της κύστης σε ποντίκια 2L3 [31]. Στην παρούσα μελέτη, η προσθήκη διανοητικής κύστης ανέστειλε σημαντικά τη μεγέθυνση της κύστης των κυττάρων 2L3 καταστέλλοντας τη διάμετρο της κύστης, την περιοχή και το ποσοστό των μεγάλων κύστεων (Εικόνα 6F, G, I), ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον αυξανόμενο ρυθμό του συνόλου. αριθμός κύστης (Εικόνα 6Η). Τα αποτελέσματα της προόδου της κύστης 2L3 σε τρισδιάστατη καλλιέργεια ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα in vivo. Ωστόσο, η θεραπεία με mNGAL ανέστειλε την ανάπτυξη κύστεων κυττάρων 2L3 σε τρισδιάστατη καλλιέργεια, ενώ χρησιμοποιήσαμε υψηλότερη συγκέντρωση mNGAL (2 mg/mL) (Εικόνα 6) από ό,τι στα προηγούμενα πειράματα 2D (600 μg/mL) για τον προσδιορισμό MTT για εξέταση την επίδραση του mNGAL στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικόνα 3). Υποθέσαμε ότι το ανασυνδυασμένο mNGAL που καθαρίστηκε από το E. coli δεν είχε μεταμεταφραστική τροποποίηση [56,57] και είχε ως αποτέλεσμα χαμηλή βιοδραστικότητα του ανασυνδυασμένου mNGAL. Η υπερέκφραση του NGAL σε κύτταρα 2L3 με επιμόλυνση των κατασκευών pN + LS και pN - LS θα μπορούσε να βοηθήσει να διευκρινιστεί αυτό το ερώτημα.

Για να προσδιοριστεί εάν μια υψηλότερη συγκέντρωση mNGAL (2 mg/mL) που χρησιμοποιήθηκε σε τρισδιάστατη καλλιέργεια για την καταστολή της διεύρυνσης της κύστης των κυττάρων 2L3 (Εικόνα 6) προέκυψε από την έλλειψη μεταμεταφραστικής τροποποίησης του mNGAL και για να ελεγχθεί εάν το NGAL έπρεπε να εκκριθεί και να αλληλεπιδράσει με Το NGAL-R για να προκαλέσει απόπτωση και περαιτέρω αναστολή της εξέλιξης της κύστης, οι κατασκευές pN + LS και pN - LS διαμολύνθηκαν σε κύτταρα 2L3 για να υπερεκφραστούν οι εκκρινόμενες και μη εκκρινόμενες πρωτεΐνες NGAL (Εικόνα 7). Συγκεντρωμένα διαμολυνθέντα κύτταρα συλλέχθηκαν μία εβδομάδα μετά την επιλογή blasticidin και η επιμόλυνση pN + LS και pN - LS αύξησε πολύ τα επίπεδα έκφρασης mRNA του Lcn2 (συνολικά, συμπεριλαμβανομένων τόσο του ενδογενούς όσο και του εξωγενούς NGAL) και του Lcn2-c-myc (εξωγενές NGAL) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 7F, G) και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα Lcn2 και Lcn2-c-myc μεταξύ των ομάδων pN + LS και pN - LS (Εικόνα 7F, G). Η έκφραση του Lcn{{20}}myc στις ομάδες pN + LS και pN − LS ήταν περίπου 8500- φορές μεγαλύτερη από αυτή στα κύτταρα 2L3 (Εικόνα 7G). Ωστόσο, η έκφραση του Lcn2 σε pN + LS και pN - LS ήταν περίπου 1.5- φορές μεγαλύτερη από αυτή στα κύτταρα 2L3 (Εικόνα 7F). Θεωρητικά, το Lcn2-myc δεν υπήρχε στα κύτταρα 2L3, οδηγώντας σε χαμηλά επίπεδα έκφρασης (φόντο) με RT-QPCR. Ως αποτέλεσμα, η σχετική αναλογία Lcn2-myc στα κύτταρα pN + LS και pN − LS ήταν σημαντικά υψηλότερη (περίπου 8500 φορές) από αυτήν στην ομάδα ελέγχου 2L3, με αποτέλεσμα τη μεγάλη διαφορά μεταξύ της σχετικής αναλογίας Lcn2 και Lcn2-myc. Επιπλέον, η αναλογία έκφρασης του Lcn2 στα κύτταρα pN + LS και pN - LS (το pN + LS ήταν 0.91-πλάσιο από αυτό του pN - LS) ήταν παρόμοια με αυτή του Lcn2-c-myc (Το pN + LS ήταν 1.01-πλάσιο εκείνο του pN - LS) (Εικόνα 7F, G). Η έκφραση της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης NGAL στα κύτταρα pN + LS και pN - LS αυξήθηκε σε σύγκριση με εκείνη στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 7I) και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων pN + LS και pN - LS. Τα αποτελέσματα western blot για την έκφραση ολικής πρωτεΐνης NGAL στις ομάδες pN + LS και pN - LS (το pN + LS ήταν 0.{60}}πλάσιο από αυτό του pN - LS) (Εικόνα 7I) ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα RT-qPCR (Το pN + LS ήταν 0.91-πλάσιο εκείνο του pN - LS) (Εικόνα 7F). Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, τα επίπεδα των πρωτεϊνών NGAL (τόσο ολικών όσο και εξωγενών) στα κύτταρα pN + LS και pN - LS ήταν παρόμοια, γεγονός που έδειξε ότι οι δύο ομάδες πρέπει να συγκριθούν σε περαιτέρω πειράματα.

Προβλέψαμε ότι η υπερέκφραση του NGAL χωρίς πεπτίδιο σήμα δεν θα αύξανε την έκκριση NGAL παρά το υψηλό επίπεδο ενδοκυτταρικής έκφρασης NGAL. Ωστόσο, τα αποτελέσματα ELISA χρησιμοποιώντας το υπερκείμενο από την καλλιέργεια έδειξαν ότι και τα δύο κύτταρα pN + LS και pN - LS είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα εκκρινόμενου NGAL από τα κύτταρα ελέγχου 2L3 (Εικόνα 7J), ενώ η ποσότητα NGAL που εκκρίνεται από τα κύτταρα pN - LS ήταν σημαντικά χαμηλότερο από αυτό των κυττάρων pN + LS (Εικόνα 7J). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η υπερέκφραση του NGAL χωρίς πεπτίδιο σήματος (pN - LS) περιόρισε την έκκριση του NGAL, αν και εντοπίστηκαν υψηλά επίπεδα ενδοκυτταρικού mRNA και πρωτεΐνης NGAL εντός των κυττάρων (Εικόνα 7F, I). Τα αποτελέσματα της ενσωμάτωσης BrdU έδειξαν σημαντικά υψηλότερο πολλαπλασιασμό των κυττάρων pN - LS από τα κύτταρα pN + LS (Εικόνα 7K).

Οι ενδοκυτταρικές ποσότητες και οι ποσότητες έκκρισης του NGAL ήταν περίπου 1.6- φορές και 2.2- φορές υψηλότερες στα κύτταρα pN + LS από ότι στα κύτταρα 2L3, αντίστοιχα (Εικόνα 7I, J), γεγονός που θα μπορούσε να οδηγήσει στην αναστολή του pN + LS σε σύγκριση με τον πολλαπλασιασμό κυττάρων 2L3 (Εικόνα 7Κ). Ωστόσο, οι ενδοκυτταρικές και οι εκκρινόμενες ποσότητες NGAL στα κύτταρα 2L3 ήταν περίπου 4-φορές και 5.3-φορές υψηλότερες από αυτές στα κύτταρα Μ-1, αντίστοιχα (Εικόνα 1Η, Ι), ενώ υψηλότερες ήταν κυτταρικός πολλαπλασιασμός παρατηρήθηκε σε 2L3 από ότι σε κύτταρα Μ-1 (Εικόνα 2C). Υποψιαζόμαστε ότι η αυξημένη έκφραση και έκκριση NGAL, που παίζουν προστατευτικό ρόλο στα κύτταρα 2L3, είναι ανεπαρκής για την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που προκύπτει από το νοκ-άουτ Pkd1, αλλά η αυξημένη έκφραση και έκκριση NGAL στο pN + LS παρέχει συμπληρωματική NGAL για την επίτευξη καταστολής του πολλαπλασιασμού. Στην προηγούμενη μελέτη μας, τα ποντίκια Pkd1L3/L3 είχαν σημαντικά μεγαλύτερα νεφρικά επίπεδα πρωτεΐνης NGAL και πολλαπλασιαζόμενου πυρηνικού αντιγόνου κυττάρων (PCNA) από τα ποντίκια Pkd1+/+ [31]. Ωστόσο, το νεφρικό επίπεδο της πρωτεΐνης NGAL σε ποντίκια Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg ήταν περίπου 2-πλάσιο από αυτό στα ποντίκια Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ και η υπερέκφραση του NGAL οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα PCNA στο Pkd1L3 /L3 × NGALTg/Tg σε σχέση με τα ποντίκια Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ και περαιτέρω ανέστειλε την ανάπτυξη κύστεων και παρατεταμένες ημέρες επιβίωσης [31]. Το NGAL φαίνεται να παίζει προστατευτικό ρόλο στην αναστολή του αυξημένου πολλαπλασιασμού στα μοντέλα ADPKD, ενώ η ενδογενής έκφραση NGAL είναι ανεπαρκής και το συμπληρωματικό εξωγενές NGAL μπορεί να βοηθήσει.

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της τρισδιάστατης καλλιέργειας (Εικόνα 10), και οι δύο ομάδες pN + LS και pN - LS ανέστειλαν την ανάπτυξη της κύστης μειώνοντας τη διάμετρο (Εικόνα 10C), την περιοχή (Εικόνα 10D) και το ποσοστό μεγάλων κύστεων (διάμετρος > 100 μm) (Εικόνα 10F), αλλά όχι τους αριθμούς (Εικόνα 10Ε). Αυτό το εύρημα δεν συνάδει με την υποψία μας ότι μόνο το pN + LS αλλά όχι το pN - LS αναστέλλει τη διεύρυνση της κύστης επειδή η έκκριση mNGAL από τα κύτταρα 2L3 απαιτείται για την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ωστόσο, η αναστολή της διεύρυνσης της κύστης από pN - LS ήταν φτωχότερη από την pN + LS (Εικόνα 10B-D), γεγονός που αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση του εκκρινόμενου mNGAL είχε ανώτερη ικανότητα να αναστέλλει τη διεύρυνση των κύστεων 2L3 σε τρισδιάστατη καλλιέργεια από εκείνη της μη εκκρινόμενης mNGAL . Αν και βλέπουμε ισχυρότερη καταστολή της διεύρυνσης της κύστης στην ομάδα pN + LS σε σύγκριση με την ομάδα pN - LS στην τρισδιάστατη καλλιέργεια, είναι δύσκολο να δούμε την καλύτερη επίδραση του pN + LS από το pN - LS στο p-AKT/AKT (Εικόνα 8Β ), p-CREB/CREB (Εικόνα 8C) και p62 (Εικόνα 9D). Έχει αποδειχθεί ότι η σύζευξη NGAL και NGAL-R μπορεί να δεσμεύσει τον ενδοκυτταρικό σίδηρο και να προκαλέσει περαιτέρω απόπτωση [29], η οποία σχετίζεται με μια στρατηγική εξάντλησης σιδήρου του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος έναντι βακτηριακής λοίμωξης [30]. Προτείναμε ότι το εκκρινόμενο mNGAL προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα 2L3 μέσω αλληλεπίδρασης με το NGAL-R, ενώ το μη εκκρινόμενο mNGAL δεν μπορούσε να αλληλεπιδράσει με το NGAL-R για να προκαλέσει απόπτωση (Εικόνα 9Α, Β). Έχει αποδειχθεί ότι τα μονοπάτια Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] και AKT/mTOR [38] ρυθμίζονται προς τα πάνω στα κύτταρα ADPKD, γεγονός που οδηγεί σε αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διεύρυνση της κύστης. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το εκκρινόμενο mNGAL ανέστειλε τις οδούς ERK (Εικόνα 8Α) και AKT (Εικόνα 8Β) και το μη εκκρινόμενο mNGAL αδρανοποιημένο μονοπάτι ERK (Εικόνα 8Α). Υποδηλώνει ότι η διανοητική αδρανοποίηση της οδού ERK μπορεί να μην είναι απαραίτητη μέσω του NGAL-R. Θα πραγματοποιηθεί νοκ-άουτ του NGAL-R σε κελιά 2L3 για να διερευνηθεί η ερώτηση

Επιπλέον, η υπερέκφραση του mNGAL σε κύτταρα 2L3 ανέστειλε τη διεύρυνση της κυτταρικής κύστης (Εικόνα 10) και εμφανίστηκε με σχετικά χαμηλότερη έκκριση NGAL (2,27 ng/mL) (Εικόνα 7J) σε σύγκριση με την επίδραση με υψηλή συγκέντρωση mNGAL (2 mg/ mL) που εφαρμόστηκε σε προηγούμενα πειράματα τρισδιάστατης καλλιέργειας (Εικόνα 6). Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να οφείλεται στην έλλειψη μετα-μεταφραστικής τροποποίησης του mNGAL από Ε. coli που χρησιμοποιήθηκε σε προηγούμενα πειράματα, τα οποία απαιτούσαν υψηλή δόση mNGAL για την αναστολή της διεύρυνσης της κύστης (Εικόνα 6). Για να εξεταστεί περαιτέρω εάν μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση του mNGAL είναι ο παράγοντας που είναι υπεύθυνος για την απαίτηση περισσότερο ανασυνδυασμένου mNGAL από Ε. coli, ένα ρυθμισμένο μέσο που περιλαμβάνει mNGAL που εκκρίνεται από μια κυτταρική σειρά ποντικού θα χρησιμοποιηθεί σε περαιτέρω μελέτες.

Στην παρούσα μελέτη, κύτταρα pN + LS και pN - LS που χρησιμοποιήθηκαν για RT-qPCR, western blotting, ELISA, ενσωμάτωση BrdU και 3D καλλιέργεια ελήφθησαν από μια μικτή πολυκλωνική δεξαμενή, η οποία είχε ποικίλα επίπεδα έκφρασης διαγονιδίων στον μικτό πληθυσμό. Η αναγνώριση του μηχανισμού του mNGAL σε κύτταρα ADPKD 2L3 με τις μεθόδους που περιγράφηκαν παραπάνω χρησιμοποιώντας κλωνικά κύτταρα θα πρέπει να βοηθήσει στην εύρεση στρατηγικών για τη μελλοντική κλινική θεραπεία της ADPKD.

5. Συμπεράσματα

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον υποκείμενο μηχανισμό της μειωμένης εξέλιξης της κύστης παρουσία NGAL χρησιμοποιώντας μια απαθανατισμένη κυτταρική σειρά ADPKD. Η προσθήκη ανασυνδυασμένου mNGAL ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε κύτταρα ADPKD. Η παθολογική ανάλυση έδειξε ότι το mNGAL μείωσε τον πολλαπλασιασμό και προκάλεσε οδούς απόπτωσης και αυτοφαγίας στα κύτταρα ADPKD. Επιπλέον, δημιουργήθηκε μια πλατφόρμα τρισδιάστατης κυτταροκαλλιέργειας για την αναγνώριση της εξέλιξης της κύστης και έδειξε ότι η προσθήκη ανασυνδυασμένου mNGAL ανέστειλε τη διεύρυνση της κύστης. Επιπλέον, η υπερέκφραση του εκκρινόμενου mNGAL (pN + LS) είχε ισχυρότερη επίδραση στην αναστολή της μεγέθυνσης της κύστης των κυττάρων ADPKD από εκείνη του μη εκκρινόμενου mNGAL (pN - LS), αν και και οι δύο μορφές μείωσαν τη διάμετρο της κύστης, την περιοχή και το ποσοστό των κύστεων μεγάλου μεγέθους. καθώς και τα αποτελέσματά τους στον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την αυτοφαγία. Συμπεραίνουμε ότι το εκκρινόμενο mNGAL έχει μια πιο έντονη και σταθερή ικανότητα να αναστέλλει τη διεύρυνση της κύστης από εκείνη του μη εκκρινόμενου mNGAL στα κύτταρα ADPKD. Η εργασία μας θα μπορούσε να βοηθήσει στον εντοπισμό στρατηγικών για τη μελλοντική κλινική θεραπεία της ADPKD.

Συμπληρωματικά υλικά: Συμπληρωματικά βίντεο σε αυτό το άρθρο μπορείτε να βρείτε στο διαδίκτυο (1) Βίντεο S1: Κατασκευή κύστης σε τρισδιάστατη καλλιέργεια: https://reurl.cc/Kjy8rq (πρόσβαση στις 26 Νοεμβρίου 2021). (2) Βίντεο S2: Τομές στοίβας Z μιας κύστης σε τρισδιάστατη καλλιέργεια: https://reurl.cc/VXGY5y (πρόσβαση στις 26 Νοεμβρίου 2021). Συμπληρωματικό γράφημα: αρνητικοί μάρτυρες για το Σχήμα 1D (χωρίς τη χρώση LTL και DBA) βρίσκονται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση https://reurl.cc/LpMmje (πρόσβαση στις 26 Νοεμβρίου 2021). Συνεισφορές συγγραφέα: Conceptualization, W.-YJ, HMH-L. και Y.-YC; επιμέλεια δεδομένων, H.-YC; επίσημη ανάλυση, H.-YC; εξαγορά χρηματοδότησης, HMH-L. και Y.-YC; μεθοδολογία, H.-YC, W.-YJ, EW, C.-MH, HMH-L. και Y.-YC; διαχείριση έργου, H.-YC και HMH-L.; πόροι, W.-YJ, S.-TJ και Y.-YC; εποπτεία, HMH-L.; οπτικοποίηση, H.-YC; εγγραφή-πρωτότυπο προσχέδιο, H.-YC και HMH-L.; συγγραφή-κριτική και επιμέλεια, H.-YC και HMH-L. Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου. Χρηματοδότηση: Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις 107-2622-B-006-005-CC2 και 108-2622-B-006-002- CC2 από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας (MOST) και την έδρα της Πανεπιστημιακής Προώθησης από το Εθνικό Πανεπιστήμιο Cheng Kung, Tainan, Taiwan (Yuan-Yow Chiou). Δήλωση του Συμβουλίου Θεσμικής Αναθεώρησης: Δεν ισχύει. Δήλωση συγκατάθεσης μετά από ενημέρωση: Δεν ισχύει. Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων: Τα δεδομένα που δημιουργήθηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης είναι διαθέσιμα από τον αντίστοιχο συγγραφέα κατόπιν αιτήματος. Ευχαριστίες: Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες για τη βοήθεια του Κέντρου Μοριακής Απεικόνισης του Εθνικού Κανονικού Πανεπιστημίου της Ταϊβάν υπό την αιγίδα του MOST. Ευχαριστούμε το National RNAi Core Facility στην Academia Sinica στην Ταϊβάν για την παροχή σωματιδίων ιών, πλασμιδίων και σχετικών υπηρεσιών. Ευχαριστούμε τον Shu-Wen Lo για τη βοήθεια με την επεξεργασία γραφικών. Σύγκρουση συμφερόντων: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Αναφορές

1. Bergmann, C.; Guay-Woodford, LM; Harris, PC; Horie, S.; Peters, DJ; Torres, VE Πολυκυστική νόσος των νεφρών. Nat. Σεβ. Primers 2018, 4, 50. [CrossRef] [PubMed]

2. Grantham, JJ Clinical πρακτική. Αυτοσωμική επικρατούσα πολυκυστική νόσος των νεφρών. N. Engl. J. Med. 2008, 359, 1477–1485. [CrossRef] [PubMed]

3. Chapman, ΑΒ; Devuyst, Ο.; Eckardt, K.-U.; Gansevoort, RT; Harris, Τ.; Horie, S.; Kasiske, BL; Odland, D.; Pei, Υ.; Perrone, RD; et al. Αυτοσωμική-κυρίαρχη πολυκυστική νόσος των νεφρών (ADPKD): Σύνοψη από μια Νεφρική Νόσος: Βελτίωση παγκόσμιων αποτελεσμάτων (KDIGO) Controversies Conference. Kidney Int. 2015, 88, 17–27. [CrossRef] [PubMed]

4. Grantham, JJ; Mulamalla, S.; Swenson-Fields, KI Γιατί οι νεφροί αποτυγχάνουν στην αυτοσωμική επικρατούσα πολυκυστική νεφρική νόσο. Nat. Αιδ. Nephrol. 2011, 7, 556–566. [CrossRef] [PubMed]

5. Harris, PC; Torres, VE Γενετικοί μηχανισμοί και μονοπάτια σηματοδότησης στην αυτοσωμική επικρατούσα πολυκυστική νόσο των νεφρών. J. Clin. Ερευνήστε. 2014, 124, 2315–2324. [CrossRef] [PubMed]

6. Ong, AC; Harris, PC Μια πολυκυστινοκεντρική άποψη του σχηματισμού κύστεων και της νόσου: Οι πολυκυστίνες επανεξετάστηκαν. Kidney Int. 2015, 88, 699–710. [CrossRef]

7. Weimbs, T. Third-Hit Signaling in Renal Cyst Formation. J. Am. Soc. Nephrol. 2011, 22, 793-795. [CrossRef]

8. Hanaoka, Κ.; Το Guggino, WB cAMP ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό κύστεων σε κύτταρα αυτοσωματικής πολυκυστικής νεφρικής νόσου. J. Am. Soc. Nephrol. 2000, 11, 1179–1187. [CrossRef]

9. Starremans, Ρ.; Li, Χ.; Finnerty, Ρ.; Guo, L.; Takakura, Α.; Neilson, Ε.; Zhou, J. Ένα μοντέλο ποντικού για πολυκυστική νεφρική νόσο μέσω σωματικής διαγραφής εντός πλαισίου στο 5' άκρο του Pkd1. Kidney Int. 2008, 73, 1394–1405. [CrossRef]

10. Yamaguchi, Τ.; Nagao, S.; Wallace, DP; Belibi, FA; Cowley, BD; Pelling, JC; Το Grantham, JJ Cyclic AMP ενεργοποιεί το B-Raf και το ERK σε επιθηλιακά κύτταρα κύστης από αυτοσωμικά επικρατούντα πολυκυστικά νεφρά. Kidney Int. 2003, 63, 1983–1994. [CrossRef]

11. YamaguchiJill, Τ.; Pelling, JC; Ramaswamy, NT; Eppler, JW; Wallace, DP; Nagao, S.; Ρώμη, LA; Sullivan, LP; Το Grantham, JJ cAMP διεγείρει τον in vitro πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων της νεφρικής κύστης ενεργοποιώντας την οδό κινάσης που ρυθμίζεται από το εξωκυτταρικό σήμα. Kidney Int. 2000, 57, 1460–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhu, Ρ.; Sieben, CJ; Xu, Χ.; Harris, PC; Lin, X. Οι ενεργοποιητές αυτοφαγίας καταστέλλουν την κυστογένεση σε ένα μοντέλο αυτοσωματικής επικρατούσας πολυκυστικής νεφρικής νόσου. Βουητό. ΜοΙ. Genet. 2016, 26, 158–172. [CrossRef] [PubMed]

13. Belibi, F.; Zafar, Ι.; Ravichandran, Κ.; Segvic, AB; Jani, Α.; Ljubanovic, ΓΔ; Edelstein, CL υποξία επαγόμενος παράγοντας-1 (HIF-1 ) και αυτοφαγία στην πολυκυστική νόσο των νεφρών (PKD). Π.μ. J. Physiol.-Ren. Physiol. 2011, 300, F1235–F1243. [CrossRef] [PubMed]

14. Chun, Υ.; Kim, J. Autophagy: An Essential Degradation Program for Cellular Homeostasis and Life. Cells 2018, 7, 278. [CrossRef]

15. Rubinsztein, DC; Shpilka, Τ.; Elazar, Z. Mechanisms of Autophagosome Biogenesis. Curr. Biol. 2012, 22, R29–R34. [CrossRef]

16. Mukhopadhyay, S.; Panda, PK; Sinha, Ν.; Das, DN; Bhutia, SK Αυτοφαγία και απόπτωση: Πού συναντιούνται; Apoptosis 2014, 19, 555–566. [CrossRef]