Η λιποκαλίνη που σχετίζεται με την εκκρινόμενη ουδετεροφιλική ζελατινάση δείχνει ισχυρότερη ικανότητα να αναστέλλει τη διεύρυνση της κύστης των κυττάρων ADPKD σε σύγκριση με τη μη εκκρινόμενη μορφή Ⅱ
Jun 24, 2024
3. Αποτελέσματα
3.1. Σύγκριση της έκφρασης NGAL και του πολλαπλασιασμού κυττάρου μεταξύ M-1 Wild Type και 2L3 ADPKD Cells
Η κυτταρική σειρά 2L3 ιδρύθηκε με μεταγωγή του ιού SV40 πρωτογενών νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων από ποντίκια Pkd1L3/L3 [17]. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκαν Μ-1 κύτταρα (νεφρική επιθηλιακή κυτταρική σειρά άγριου τύπου ποντικού) που αγοράστηκαν από BCRC (Hsinchu, Ταϊβάν). Ο γονότυπος PCR των μεταγραφών Pkd1 των κυττάρων 2L3 και Μ-1 διεξήχθη για να ελεγχθούν οι γονότυποι χρησιμοποιώντας εκκινητές πριν και μετά την πρώτη θέση loxP στο εσώνιο 30 του στοχευόμενου αλληλόμορφου (Εικόνα 1Α). Ιστοί ποντικού Pkd1+/+, Pkd1L3/+ και Pkd1L3/L3 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι γονότυπου. Τα προϊόντα PCR από κύτταρα M-1 έδειξαν μια ζώνη άγριου τύπου (WT) Pkd1+/+ (473 bp), ενώ τα προϊόντα PCR από κύτταρα 2L3 έδειξαν μια μοναδική ζώνη Pkd1L3/L3 (507 bp) λόγω ενός επιπλέον τμήματος loxP (34 bp) (Εικόνα 1Β).
Για να χαρακτηρίσετε εάν τα κελιά M-1 και 2L3 ήταν απόνεφρικά σωληνάρια παρόμοιας προέλευσης, πρώτα συγκρίναμε τη μορφολογία μεταξύ των 2 κυτταρικών σειρών. Τα κύτταρα M-1 και τα κύτταρα 2L3 έδειξαν πολύ παρόμοια μορφολογία (Εικόνα 1C). Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε χρώση λεκτίνης με λεκτίνη Lotus tetragonolobus (LTL, δείκτης διαφοροποιημένων εγγύς σωληναρίων, επισημασμένων με φλουορεσκεΐνη) και Dolichos biflorus agglutinin (DBA, δείκτης διαφοροποιημένων περιφερικών σωληναρίων και αγωγών συλλογής, επισημασμένοι με ροδαμίνη) για τον έλεγχο της προέλευσής τους) από νεφρικά σωληνάρια (Εικόνα 1D). Τα αποτελέσματα της χρώσης έδειξαν ότι τα κύτταρα M-1 και 2L3 ήταν και τα δύο LTL- (κυρίως εντοπισμένα με DAPI) και θετικά σε DBA (εντοπισμένα στο κυτταρόπλασμα) (Εικόνα 1D). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι τα κύτταρα M-1 και 2L3 προέρχονται απόνεφρικά σωληνάριαπαρόμοιας προέλευσης και ενδέχεται να έχουν παρόμοια χαρακτηριστικά. Τα αποτελέσματα PCR σε πραγματικό χρόνο έδειξαν ότι τα κύτταρα 2L3 είχαν εξαιρετικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης Pkd1 mRNA σε σύγκριση με τα κύτταρα Μ-1 (Εικόνα 1Ε), το οποίο ήταν σύμφωνο με τα δεδομένα από τα ποντίκια 2L3 με επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Pkd1 μόνο 25% αυτά των ποντικών άγριου τύπου [17]. Τα ποντίκια 2L3 έχουν αποδειχθεί ότι έχουν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης NGAL και υποδοχέα NGAL (NGAL-R) στους νεφρούς τους από ποντίκια άγριου τύπου [31]. Τα αποτελέσματα PCR σε πραγματικό χρόνο έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης του mRNA Lcn2 ήταν 15.96-φορές μεγαλύτερο σε κύτταρα 2L3 από ό,τι σε M-1 (Εικόνα 1ΣΤ), σύμφωνα με τα δεδομένα που αναφέρθηκαν για ποντίκια 2L3 [31], ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκφραση mRNA Slc22a17 μεταξύ των δύο ομάδων (Εικόνα 1G). Τα αποτελέσματα στυπώματος Western έδειξαν επίσης ότι τα κύτταρα 2L3 είχαν υψηλότερο επίπεδο έκφρασης NGAL από τα κύτταρα Μ-1, ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο επίπεδο έκφρασης του NGAL-R μεταξύ των δύο ομάδων (Εικόνα 1Η). Τα κύτταρα και τα υπερκείμενα των κυττάρων M-1 και 2L3 συλλέχθηκαν και τα δύο μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες για να ποσοτικοποιηθεί η NGAL στα κυτταρολύματα και στα υπερκείμενα (που αντιπροσωπεύουν την εκκρινόμενη NGAL) με ELISA. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα western blot, η ELISA έδειξε ότι το 2L3 είχε σημαντικά υψηλότερη ενδοκυτταρική NGAL και έκκριση NGAL στο υπερκείμενο από το M-1 (Εικόνα 1I).
Τα ποντίκια 2L3 έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν υψηλότερο κυτταρικό πολλαπλασιασμό από τα ποντίκια άγριου τύπου [17]. Οι αναλύσεις ενσωμάτωσης MTT και BrdU διεξήχθησαν για να διερευνηθεί εάν η κυτταρική σειρά 2L3 έδειξε επίσης καλύτερη βιωσιμότητα και πολλαπλασιασμό από τα κύτταρα άγριου τύπου (Εικόνα 2A-C). Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες αποκάλυψαν μεγαλύτερη συρροή κυττάρων 2L3 από τα κύτταρα Μ{10}} μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες με τους ίδιους αρχικούς αριθμούς σποράς (Εικόνα 2Α). Οι αναλύσεις MTT έδειξαν ότι τα κύτταρα 2L3 είχαν σημαντικά καλύτερη βιωσιμότητα από τα κύτταρα Μ-1 που καλλιεργήθηκαν για 24 και 48 ώρες (Εικόνα 2Β). Για να συγκριθεί η ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων M-1 και 2L3, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες μετά την ανάλυση ενσωμάτωσης BrdU, η οποία έδειξε ότι τα κύτταρα 2L3 είχαν σημαντικά καλύτερο πολλαπλασιασμό από τα κύτταρα M-1 (Εικόνα 2C) .
ΝΕΑ ΒΟΤΑΝΑ ΓΙΑ ΝΕΦΡΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ
3.2. Επιδράσεις της προσθήκης mNGAL στη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 2L3
Η χορήγηση εξωγενούς NGAL έχει αποδειχθεί ότι μειώνει την ανάπτυξη της κύστης in vitro [25]. Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η υπερέκφραση του NGAL σε ένα μοντέλο ποντικού ADPKD (ποντίκια Pkd1L3/L3, NGALTg/Tg ποντίκια) μείωσε την εξέλιξη της κύστης συνοδευόμενη από αλλαγές σε μια σειρά μοριακών οδών που εμπλέκονται σεπολλαπλασιασμός κυττάρων, απόπτωση, καιίνωση[31]. Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε τα αποτελέσματα του ανασυνδυασμένου mNGAL στη βιωσιμότητα των κυττάρων 2L3 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTT (Εικόνα 3). Η καθαρότητα του ανασυνδυασμένου mNGAL (χωρίς το πεπτίδιο σήμα) που καθαρίστηκε από E. coli προσδιορίστηκε αρχικά με SDS-PAGE και χρώση με μπλε Coomassie, το οποίο αποκάλυψε μια μονή ζώνη 20-kD και μια πολύ ελαφριά ζώνη διμερούς σε υψηλές συγκεντρώσεις ( Εικόνα 3Α). Επιπλέον, η σταθερότητα του mNGAL στο μέσο κυτταροκαλλιέργειας αναλύθηκε με στύπωμα western, το οποίο έδειξε τη σταθερότητα του mNGAL στο μέσο για τουλάχιστον 48 ώρες (Εικόνα 3Β). Παρατηρήσαμε ότι το mNGAL μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων 2L3 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου μετά από θεραπεία για 8 ώρες (Εικόνα 3C). Η ραπαμυκίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος σε αυτό το πείραμα, η οποία αναγνωρίζεται ως αναστολέας του mTOR και είναι γνωστό ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων και την ανάπτυξη κύστεων σε ένα μοντέλο ποντικού PKD [32]. Επιπλέον, ο προσδιορισμός ενσωμάτωσης BrdU έδειξε επίσης ότι η αγωγή με mNGAL για 24 ώρες ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 2L3 (Εικόνα 3D). Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό της ADPKD και το εύρημα ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων 2L3 θα μπορούσε να μειωθεί κατά mNGAL υποδηλώνει ότι το mNGAL μπορεί να αναστείλει περαιτέρω τον σχηματισμό κύστεων στα κύτταρα 2L3.
3.3. Μονοπάτια σηματοδότησης που επηρεάζονται από την προσθήκη mNGAL σε κύτταρα 2L3
Η σύζευξη NGAL και NGAL-R έχει αποδειχθεί ότι απομονώνει τον ενδοκυτταρικό σίδηρο και προκαλεί περαιτέρω απόπτωση [29]. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι το NGAL μπορεί να προκαλέσει απόπτωση σε ένα μοντέλο ADPKD in vitro και in vivo [25,31]. Για να διερευνήσουμε εάν το mNGAL θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση των κυττάρων 2L3, αναλύσαμε την απόπτωση των κυττάρων 2L3 με κυτταρομετρία ροής. Με βάση το εύρημα ότι το mNGAL ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 2L3 μετά από θεραπεία με mNGAL για 8 ώρες (Εικόνα 3D), αναλύσαμε τις επιδράσεις του mNGAL στα κύτταρα 2L3 τόσο σε προηγούμενα (4 ώρες) όσο και σε μεταγενέστερα (12 ώρες) χρονικά σημεία.
Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, απαιτήθηκαν πολύ υψηλότεροι αριθμοί κυττάρων και μικρότερη διάρκεια καλλιέργειας από εκείνες των αναλύσεων ΜΤΤ που πραγματοποιήθηκαν προηγουμένως. Ως εκ τούτου, 2L3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίου και μια υψηλότερη συγκέντρωση mNGAL (600-1200 μg/mL) εφαρμόστηκε στα κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 1200 μg/mL mNGAL ανέστειλε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 4 και 12 ώρες θεραπείας, ενώ 600 μg/mL mNGAL ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων μόνο μετά από 4 ώρες θεραπείας (Εικόνα 3Ε). Δοκιμασίες απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την ανίχνευση κυττάρων χρωματισμένων με αννεξίνη V-FITC και ΡΙ. Η αννεξίνη V έχει υψηλή συγγένεια με τη φωσφατιδυλοσερίνη (PS) και χρησιμοποιείται για την αναγνώριση αποπτωτικών κυττάρων με εκτεθειμένο PS [33]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της χρώσης, τα κύτταρα μπορούν να ταξινομηθούν ως φυσιολογικά (AV-/PI-), πρώιμη απόπτωση (AV+/PI-), όψιμη απόπτωση (AV+/PI+) και νέκρωση (AV-/PI+) και φαίνονται σε τεταρτοταγή διαγράμματα (Εικόνα 3ΣΤ). Τα κύτταρα στο πρώιμο αποπτωτικό στάδιο διατηρούν άθικτες μεμβράνες, οι οποίες διαφέρουν από τα κύτταρα στο όψιμο αποπτωτικό στάδιο με αποσαθρωμένες μεμβράνες [34]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ρυθμός απόπτωσης των κυττάρων 2L3 (συμπεριλαμβανομένης της πρώιμης απόπτωσης AV+/PI- και της όψιμης απόπτωσης AV+/PI+) ήταν σημαντικά αυξημένος σε σύγκριση με εκείνον της ομάδας ελέγχου μετά από 12 ώρες θεραπείας με mNGAL (1200 μg/mL· Εικόνα 3F, G ).
σχήμα 1. Σύγκριση της έκφρασης NGAL μεταξύ M-1 άγριου τύπου και 2L3 ADPKD κυττάρων. (Α) Δομή άγριου τύπου και αλληλόμορφα L3 του γονιδίου Pkd1. Ο γονότυπος PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας εκκινητές πριν και μετά το πρώτο loxP εντός του εσωνίου 30 του Pkd1. Γεμισμένα τρίγωνα: loxP; ένα γονίδιο αντίστασης νεομυκίνης που καθοδηγείται από τον υποκινητή mc1 (mc1-neo) που πλαισιώνεται από δύο θέσεις loxP εισήχθη στο εσώνιο 34 του Pkd1. (B) PCR γονότυπος των μεταγραφών Pkd1 των M-1 κυττάρων (473 bp) και 2L3 κύτταρα (507 bp). Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκαν μεταγραφές Pkd1 των ποντικών άγριου τύπου (+/+), ετερόζυγων (L3/+) και ομόζυγων (L3/L3). Η RT–qPCR έδειξε ότι το 2L3 είχε σημαντικά χαμηλότερο Pkd1 (C) M-1 και τα κύτταρα 2L3 έδειξαν παρόμοια μορφολογία. Μπάρα κλίμακας: 100 μm. (D) Τα κύτταρα M-1 και 2L3 χρωματίστηκαν με λεκτίνη Lotus Tetragonolobus (LTL, επισημασμένη με Φλουορεσκεΐνη, πράσινο) και Dolichos biflorus agglutinin (DBA, επισημασμένη με Rhoda mine, κόκκινο) και DAPI (μπλε) και παρατηρήθηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο. Μπάρα κλίμακας: 50 μm. Η RT–qPCR έδειξε ότι το 2L3 είχε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης Pkd1 (E) και υψηλότερα Lcn2 (NGAL) (F) από αυτά των κυττάρων άγριου τύπου M-1. (Ζ) Καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης Slc22a17 (NGAL-R) μεταξύ των κυττάρων M-1 και 2L3. RQ: σχετική ποσοτικοποίηση=2 −ΔΔCt; Το Gapdh χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος κάθε δείγματος. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν σε M{-1. (Η) Τα αποτελέσματα στυπώματος Western έδειξαν ότι 2L3
(AV−/PI−) που φαίνεται στο κάτω δεξιό τεταρτημόριο (Q1). Τα πρώιμα συμβάντα απόπτωσης (AV+/PI−) φαίνονται στο κάτω δεξιό τεταρτημόριο (Q2). Τα συμβάντα όψιμης απόπτωσης (AV+/PI+) εμφανίζονται στο κάτω δεξιό τεταρτημόριο (Q3). Τα συμβάντα νέκρωσης (AV−/PI+) φαίνονται στο κάτω δεξιό τεταρτημόριο (Q4). Τα M-1 και M2 στο ιστόγραμμα αντιπροσωπεύουν κύτταρα που δεν υφίστανται απόπτωση (AV−) και κύτταρα που υφίστανται απόπτωση (AV+), αντίστοιχα. (Ζ) Ποσοτικοποίηση τεταρτοταγούς διαγράμματος και ιστογράμματος 4 και 12 ωρών, αντίστοιχα. (Η) Τα αποτελέσματα Western blot έδειξαν ότι η θεραπεία με mNGAL για 24 ώρες αύξησε τους δείκτες απόπτωσης σε κύτταρα 2L3. Ως εσωτερικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η βινκουλίνη. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στην ομάδα ελέγχου. Διεξήχθη μονόδρομη ANOVA ή Student's t-test για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των ομάδων (n=3). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 έναντι ελέγχου κάθε ομάδας.
Επιπλέον, δείκτες απόπτωσης, σχισμένες μορφές κασπάσης-3 και πολυ (ADP-ριβόζης) πολυμεράσης (PARP), αναλύθηκαν με στύπωμα western. Η κασπάση-3 διασπάται στην ενεργή μορφή (17- και 19-θραύσματα kD) μέσω των δύο κύριων οδών απόπτωσης, της εξωγενούς και της εγγενούς [35]. Η διασπασμένη κασπάση-3 διασπά διαδοχικά το PARP (θραύσματα 89 και 24 kD), ένα πυρηνικό ένζυμο που εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA, για να απενεργοποιήσει το PARP και να προκαλέσει περαιτέρω απόπτωση [35,36]. Τα αποτελέσματα στυπώματος western (Εικόνα 3Η) ήταν σύμφωνα με τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής (Εικόνα 3F, G). Η επεξεργασία των κυττάρων 2L3 με mNGAL για 24 ώρες προκάλεσε σημαντικά την αναλογία σχισμένης/προ-κασπάσης-3 και διασπασμένης/προ-PARP (Εικόνα 3Η).
Έχει αποδειχθεί ότι τα μονοπάτια Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] και AKT/mTOR [37,38] ρυθμίζονται προς τα πάνω στα κύτταρα ADPKD, γεγονός που οδηγεί σε αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διεύρυνση των κύστεων. Τα μονοπάτια σηματοδότησης MEK/ERK και PI3K/AKT οδηγούν σε αυξημένη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης δέσμευσης στοιχείου απόκρισης cAMP (CREB, S133) [39,40], ενός μεταγραφικού παράγοντα που στοχεύει γονίδια που εμπλέκονται στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [41]. Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο το mNGAL αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, πραγματοποιήθηκε στύπωμα western για να αναλυθεί η επίδραση του mNGAL στα μονοπάτια σηματοδότησης ERK και AKT σε κύτταρα 2L3 (Εικόνα 4). Τα αποτελέσματα western blot έδειξαν ότι η επεξεργασία με mNGAL (1200 μg/mL) κυττάρων 2L3 για 24 ώρες μείωσε σημαντικά την αναλογία p-ERK (T202/Y204)/ERK (Εικόνα 4Α), p-AKT (S473)/AKT (Εικόνα 4Β), και p-CREB (S133)/CREB (Εικόνα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα (Εικόνες 3 και 4) έδειξαν ότι το mNGAL θα μπορούσε να μειώσει την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων 2L3 αναστέλλοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και προκαλώντας απόπτωση. Έχει αποδειχθεί ότι η δυσλειτουργία της αυτοφαγίας εμφανίζεται σε μοντέλα ζέβρα και ποντικού ADPKD, ενώ η θεραπεία με ενεργοποιητές αυτοφαγίας, όπως η ραπαμυκίνη και η καρβαμαζεπίνη, μπορεί να μειώσει σημαντικά τον σχηματισμό κύστεων [12]. Για να διερευνηθεί η επίδραση του mNGAL στην αυτοφαγία σε κύτταρα 2L3, δύο γνωστοί δείκτες αυτοφαγίας, πρωτεΐνες που σχετίζονται με μικροσωληνίσκους 1A/1B ελαφριά αλυσίδα 3 (LC3B) και p62, αναλύθηκαν με στύπωμα western (Εικόνα 5). Η ποσότητα του LC3B II συσχετίζεται με το σχηματισμό αυτοφαγοσώματος και χρησιμοποιείται συνήθως ως δείκτης αυτοφαγίας [42]. Η πρωτεΐνη p62 συνδέει άμεσα υποστρώματα με ετικέτα ουβικιτίνης και το LC3B II και τελικά αποικοδομείται, επομένως η αποικοδόμηση της ρ62 είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος δείκτης αυτοφαγίας [43]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα στυπώματος western, η επεξεργασία με mNGAL κυττάρων 2L3 για 24 ώρες αύξησε σημαντικά την αναλογία LC3B II/LC3B I (Εικόνα 5Α) και μείωσε το επίπεδο της ρ62 (Εικόνα 5Β) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι το mNGAL ενεργοποίησε την αυτοφαγία σε κύτταρα 2L3.
Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:
Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-κατάστημα
ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΝΑ ΠΑΡΕΤΕ ΦΥΣΙΚΟ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 25% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 9% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ ΓΙΑ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ
