Περίληψη

Η κατάθλιψη αντιπροσωπεύει μια ιδιαίτερα διαδεδομένη και αναπηρική ψυχιατρική διαταραχή παγκοσμίως. Τα αυξανόμενα στοιχεία δείχνουν ότι η υπερβολική νευροφλεγμονώδης ενεργοποίηση εντός του ιππόκαμπου συμβάλλει ουσιαστικά στην εμφάνιση και την εξέλιξη των καταθλιπτικών συμπτωμάτων. Γλυκοζίτες φαινυλαιθανόλης (CPhGs), κύρια βιοδραστικά συστατικά που εξάγονται από παραδοσιακό βρώσιμο-φαρμακευτικό βότανοCistanche deserticolaκαιCistanche tubulosa, έχουν επιδείξει πολλαπλές νευροπροστατευτικές φαρμακολογικές ιδιότητες σε προηγούμενες μελέτες. Αυτή η παρούσα έρευνα είχε στόχο να διερευνήσει τις θεραπευτικές επιπτώσεις και τους μοριακούς μηχανισμούς που ασκούνται από τα CPhG σε φαινοτύπους συμπεριφοράς που μοιάζουν με κατάθλιψη που προκαλούνται από χρόνιο απρόβλεπτο ήπιο στρες (CUMS) σε ποντίκια C57BL/6.

Εξήντα ποντίκια C57BL/6 βαθμού SPF διαχωρίστηκαν τυχαία σε έξι πειραματικές κοόρτες: ομάδα ελέγχου, ομάδα μοντέλου CUMS, ομάδα CPhGs υψηλής δόσης (700 mg/kg), ομάδα μεσαίας δόσης CPhGs (350 mg/kg), ομάδα χαμηλής δόσης CPh5 mg/kg και 7 mg/kg ομάδα θετικού ελέγχου φλουοξετίνης (15 mg/kg). Μετά από παρέμβαση τεσσάρων εβδομάδων με καθετήρα φαρμάκου μετά από μοντελοποίηση CUMS, εφαρμόστηκαν ολοκληρωμένες νευροσυμπεριφορικές αξιολογήσεις, συμπεριλαμβανομένης της δοκιμής προτίμησης σακχαρόζης (SPT), της δοκιμής ανοιχτού πεδίου (OFT), της δοκιμής ανάρτησης ουράς (TST) και της δοκιμής αναγκαστικής κολύμβησης (FST). Τα κιτ ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας (ELISA) ποσοτικοποίησαν τις συγκεντρώσεις των νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης στον ορό, παράλληλα με τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες του ιππόκαμπου και τους φλεγμονώδεις μεσολαβητές. Η χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (HE) και η χρώση Nissl οραματίστηκαν νευρωνικές παθολογικές βλάβες εντός των περιοχών της οδοντωτής έλικας του ιππόκαμπου. Η ανοσοϊστοχημεία ανίχνευσε την ένταση έκφρασης της γλοιακής ινιδιακής όξινης πρωτεΐνης (GFAP), του ιονισμένου μορίου προσαρμογέα που δεσμεύει το ασβέστιο-1 (Iba-1), του NLRP3 και των πρωτεϊνών Κασπάσης-1. Η χρώση ανοσοφθορισμού αξιολόγησε περαιτέρω την κατάσταση ενεργοποίησης του ανοδικού καταρράκτη σηματοδότησης TLR4/NF‑κB.

Τα πειραματικά μας αποτελέσματα έδειξαν ότι η από του στόματος χορήγηση CPhGs μετριάζει σημαντικά τις ανωμαλίες συμπεριφοράς που σχετίζονται με την κατάθλιψη. Τα CPhG αύξησαν το ποσοστό προτίμησης σακχαρόζης και μείωσαν τη διάρκεια της ακινησίας σε παραδείγματα συμπεριφοράς που βασίζονται στην απόγνωση. Επιπλέον, η θεραπεία με CPhGs αποκατέστησε τα μειωμένα επίπεδα σεροτονίνης ορού και ιππόκαμπου (5-HT) καθώς και ντοπαμίνης (DA). Η βιοχημική ανίχνευση αποκάλυψε σημαντική καταστολή των προφλεγμονωδών μεσολαβητών του ιππόκαμπου και της υπερπαραγωγής κυτοκίνης. Οι ιστοπαθολογικές παρατηρήσεις κατέδειξαν δοσοεξαρτώμενη ανακούφιση της νευρωνικής βλάβης του ιππόκαμπου που προκαλείται από CUMS. Τα ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματα έδειξαν ότι τα CPhG αύξησαν την πυκνότητα των αστροκυττάρων που χαρακτηρίζεται από GFAP, ανέστειλε την παθολογική υπερενεργοποίηση της Iba-1-θετικής μικρογλοίας και μειωμένη ρύθμιση της αφθονίας πρωτεΐνης που σχετίζεται με το φλεγμονώδες NLRP3. Οι δοκιμές ανοσοφθορισμού επικύρωσαν ότι τα CPhG περιόρισαν την υπερβολική ενεργοποίηση του TLR4 και φωσφορυλιωμένης NF-κB p65 εντός του ιστού του ιππόκαμπου.

Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνουν ότι τα CPhGs ασκούν εξέχουσα αποτελεσματικότητα παρόμοια με αντικαταθλιπτικά έναντι εκδηλώσεων που μοιάζουν με CUMS σε ποντίκια. Ο φαρμακολογικός μηχανισμός του διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω διπλών ρυθμιστικών λειτουργιών: αποκατάσταση της ομοιόστασης των νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης και περιορισμός των νευροφλεγμονωδών αποκρίσεων που διαμεσολαβούνται από τον άξονα σηματοδότησης TLR4/NF‑κB/NLRP3. Αυτή η μελέτη σε ζώα παρέχει προκλινικά πειραματικά θεμέλια που υποστηρίζουν την περαιτέρω εκμετάλλευση των CPhG ως πολλά υποσχόμενοι φυσικοί υποψήφιοι παράγοντες ή λειτουργικά συστατικά τροφίμων για επικουρική παρέμβαση κατά της κατάθλιψης.

Λέξεις-κλειδιά: Γλυκοζίτες φαινυλαιθανόλης Cistanche (CPhGs); κατάθλιψη; χρόνιο απρόβλεπτο ήπιο στρες. νευροφλεγμονή? αστροκύτταρα; μικρογλοία? Φλεγμονώδης οδός TLR4/NF‑κB/NLRP3

1. Εισαγωγή

Η κατάθλιψη είναι μια πολύπλευρη συναισθηματική ψυχιατρική ασθένεια που χαρακτηρίζεται από βασικές κλινικές εκδηλώσεις που περιλαμβάνουν επίμονη χαμηλή διάθεση, ανηδονία, ψυχοκινητική καθυστέρηση, διαταραχή ύπνου-εγρήγορσης και σωματική δυσλειτουργία. Τα σοβαρά καταθλιπτικά επεισόδια δυνητικά οδηγούν σε αυτοτραυματισμό και αυτοκτονικό ιδεασμό, επιβάλλοντας τεράστια βάρη για τη δημόσια υγεία παγκοσμίως. Τα δεδομένα επιδημιολογικής έρευνας από την Κίνα ανέφεραν ότι ο εθνικός επιπολασμός της κατάθλιψης έφτασε το 2,1 %, και ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας έχει ταξινομήσει τη μείζονα καταθλιπτική διαταραχή μεταξύ των κορυφαίων ασθενειών που συμβάλλουν στην παγκόσμια απώλεια ετών ζωής λόγω αναπηρίας.

Παρόλα αυτά, η πλήρης μοριακή αιτιολογία της παθογένεσης της κατάθλιψης παραμένει ατελώς διευκρινισμένη, εμποδίζοντας τέλειες κλινικές θεραπευτικές λύσεις. Οι σύγχρονες παθοφυσιολογικές υποθέσεις έχουν μετατοπίσει την εστίαση προς τους νευροάνοσους μηχανισμούς διασταύρωσης. Η συσσώρευση προκλινικής και κλινικής έρευνας υπογραμμίζει την επίμονη νευροφλεγμονή ως ζωτικής σημασίας παθογόνο παράγοντα για τις καταθλιπτικές διαταραχές. Υπό χρόνιες προκλήσεις ψυχολογικού ή φυσιολογικού στρες, οι πληθυσμοί των νευρογλοιακών κυττάρων του ιππόκαμπου υφίστανται ανώμαλη ενεργοποίηση. Η υπερενεργοποιημένη μικρογλοία και τα δυσλειτουργικά αστροκύτταρα προκαλούν ισχυρή απελευθέρωση πολλαπλών προφλεγμονωδών μεσολαβητών, δημιουργώντας προφλεγμονώδη αποτελέσματα καταρράκτη κυτοκίνης. Τέτοιες νευροφλεγμονώδεις προσβολές προκαλούν περαιτέρω νευρωνική μορφολογική επιδείνωση, μεταβολική διαταραχή των νευροδιαβιβαστών και εξασθένηση της συναπτικής πλαστικότητας, διευκολύνοντας τελικά την παθολογική εξέλιξη που μοιάζει με κατάθλιψη.

Οι τρέχουσες κλινικές αντικαταθλιπτικές παρεμβάσεις βασίζονται κυρίως σε συνθετικά χημικά αντικαταθλιπτικά που αντιπροσωπεύονται από τη φλουοξετίνη, έναν εκλεκτικό αναστολέα επαναπρόσληψης σεροτονίνης (SSRI). Παρά τη μερική ανακούφιση των συμπτωμάτων για ορισμένους ασθενείς, τα συνθετικά αντικαταθλιπτικά έχουν καλά αναγνωρισμένα μειονεκτήματα: μη ικανοποιητικές αναλογίες πλήρους ύφεσης, συχνά υπολειπόμενα καταθλιπτικά συμπτώματα, υψηλή πιθανότητα υποτροπής μετά τη διακοπή της φαρμακευτικής αγωγής, καθώς και ανεπιθύμητες γαστρεντερικές, ηπατικές και μεταβολικές παρενέργειες κατά τη μακροχρόνια χορήγηση. Αντίθετα, τα παραδοσιακά φυτικά φάρμακα διαθέτουν ρυθμιστικά χαρακτηριστικά πολλαπλών στόχων και σχετικά ήπια προφίλ ασφάλειας, προσελκύοντας έτσι αυξανόμενο ερευνητικό ενδιαφέρον για την επικουρική θεραπεία διαταραχής της διάθεσης.

Cistanche deserticolaκαιCistanche tubulosa, που ονομάζεται κοινώς «τζίνσενγκ της ερήμου», ανήκει στην οικογένεια Orobanchaceae. Οι σαρκώδεις μίσχοι τους χρησιμεύουν ως κλασικές ομόλογες πρώτες ύλες φαρμακευτικής-διατροφής στην παραδοσιακή ασιατική φυτική πρακτική. Οι σύγχρονες φαρμακολογικές έρευνες τεκμηριώνουν πολλαπλές νευροπροστατευτικές βιοδραστηριότητες γιαCistancheεκχυλίσματα, συμπεριλαμβανομένων των επιδράσεων κατά του νευροεκφυλισμού κατά της νόσου του Αλτσχάιμερ και της νόσου του Πάρκινσον. Οι γλυκοσίδες της φαινυλαιθανόλης αποτελούν τα κύρια βιοενεργά κλάσματα στο εσωτερικόCistancheεκχυλίσματα, που περιέχουν κυρίως εχινακοσίδη και βερμπασκοσίδη. Οι γλυκοσίδες φαινυλαιθανόλης (CPhGs) της Cistanche παρουσιάζουν αντικαρκινικές, αντιοξειδωτικές, ανοσοτροποποιητικές και νευροπροστατευτικές βιοδραστηριότητες σε πολλαπλές πειραματικές πλατφόρμες.

Προηγούμενη προκαταρκτική εργαστηριακή εργασία έχει δείξει ότι τα CPhGs θα μπορούσαν να αυξήσουν τη συγκέντρωση ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα και να ανακουφίσουν τους καταθλιπτικούς φαινότυπους που σχετίζονται με την εμμηνόπαυση σε μοντέλα ζώων τρωκτικών. Ωστόσο, εάν τα CPhG παράγουν προστατευτικές επιδράσεις στην κατάθλιψη που προκαλείται από χρόνιο στρες και οι λεπτομερείς καταρράκτες μεταγωγής σήματος που διαμεσολαβούν τέτοιες βιοδραστηριότητες εξακολουθούν να στερούνται συστηματικής εξερεύνησης. Το ζωικό παράδειγμα χρόνιου απρόβλεπτου ήπιου στρες (CUMS) αποτελεί ένα καλά εδραιωμένο μοντέλο προκλινικής κατάθλιψης. Εκθέτοντας εργαστηριακά τρωκτικά σε διαφοροποιημένους τυχαίους ήπιους στρεσογόνους παράγοντες για διαδοχικές εβδομάδες, το CUMS ανακεφαλαιώνει αξιόπιστα τα βασικά καταθλιπτικά χαρακτηριστικά όπως η ανηδονία, η συμπεριφορική απόγνωση και η νευροπαθολογική βλάβη του ιππόκαμπου.

Κατά συνέπεια, αυτή η έρευνα κατασκεύασε καταθλιπτικό μοντέλο ποντικιού επαγόμενο από το CUMS για να αξιολογήσει συστηματικά την in-vivo αντικαταθλιπτική δράση τριών βαθμίδων δόσεων CPhGs. Εστιάσαμε ιδιαίτερα στην ανάκτηση νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης, τον φαινοτυπικό μετασχηματισμό των νευρογλοιακών κυττάρων του ιππόκαμπου και τη νευροφλεγμονώδη οδό φλεγμονώδους NLRP3 που διέπεται από το TLR4/NF-κB. Αυτή η μελέτη σκοπεύει να παράσχει αντικειμενικά πειραματικά στοιχεία για να υποστηρίξει τη μελλοντική φαρμακευτική ανάπτυξη και την εφαρμογή λειτουργικών τροφίμων των CPhG με στόχο τη βελτίωση των συμπτωμάτων της κατάθλιψης.

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Πειραματικά Υλικά, Αντιδραστήρια και Όργανα

Το τυποποιημένο ακατέργαστο εκχύλισμα CPhG αποκτήθηκε από την Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (αριθ. παρτίδας. 20231221, Xinjiang, Κίνα). Ολική περιεκτικότητα σε γλυκοσίδη σε φαινυλαιθανόλη μεγαλύτερη από ή ίση με 85 %, που περιέχει εχινακοσίδη μεγαλύτερη από ή ίση με 40 % και βερμπασκοσίδη μεγαλύτερη ή ίση με 16 %. Κάψουλες υδροχλωρικής φλουοξετίνης ελήφθησαν από την Patheon France. Τα εμπορικά κιτ ανάλυσης ELISA για 5-HT, DA, iNOS, COX-2, PGE2, TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN- προέρχονται από πιστοποιημένους προμηθευτές βιολογικών αντιδραστηρίων. Τα κύρια αντισώματα που εφαρμόστηκαν για την ανοσοϊστοχημεία και τον ανοσοφθορισμό περιελάμβαναν αντι-GFAP, αντι-Iba-1, αντι-NLRP3, αντι-κασπάση-1, αντι-TLR4 και αντιφωσφο-NF-κΒ αντισώματα p65. Τα κιτ ιστολογικής χρώσης για τη χρώση HE και Nissl παρασκευάστηκαν για επεξεργασία τομής εγκεφάλου παραφίνης.

Τα βασικά εργαστηριακά όργανα ανάλυσης κάλυπταν ηλεκτρονική αναλυτική ζυγαριά υψηλής ακρίβειας, σταθμό εργασίας καθαρισμού εξαιρετικά καθαρού νερού Milli‑Q, συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών SpectraMax, όρθιο μικροσκόπιο φθορισμού Leica, καθώς και πλήρες υλικό ανάλυσης συμπεριφοράς τρωκτικών και λογισμικό σύστημα rack SMART30.

Εξήντα αρσενικά ποντίκια C57BL/6 βαθμού SPF, ηλικίας επτά εβδομάδων με αρχικό εύρος σωματικού βάρους 18-22 g, αγοράστηκαν από την Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Όλοι οι πειραματικοί χειρισμοί σε ποντίκια έλαβαν επίσημη έγκριση από την επιτροπή ιατρικής και ηθικής της ιατρικής από την Anim ID: SUCMDL20231015003). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε εγκαταστάσεις φιλοξενίας ζώων χωρίς συγκεκριμένα παθογόνα. Οι περιβαλλοντικές παράμετροι διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (21 ± 2) βαθμοί, σχετική υγρασία 60 % ± 10 %, εφαρμόζοντας τυπικούς κύκλους φωτισμού 12 ωρών φωτός-σκότους. Η τροφή τρωκτικών και το πόσιμο νερό ήταν προσβάσιμα ad libitum. Πραγματοποιήθηκε περίοδος προσαρμοστικού εγκλιματισμού μίας εβδομάδας πριν από την έναρξη επίσημων πειραματικών ροών εργασίας.

2.2 Ομαδοποίηση ζώων, Μοντελοποίηση CUMS και Χορήγηση Φαρμάκων

Μετά από προσαρμοστική αύξηση μιας εβδομάδας, ο προκαταρκτικός έλεγχος προτίμησης σακχαρόζης απέκλεισε μεμονωμένα ποντίκια με εγγενή χαμηλή προτίμηση στην κατανάλωση ζάχαρης. Τα πιστοποιημένα πειραματικά ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε έξι ομάδες μελέτης (n = 10 ζώα σε κάθε ομάδα):

Ομάδα ελέγχου (Con): χωρίς στρες CUMS, ενδογαστρική χορήγηση ισοογκομετρικού απιονισμένου νερού.

Ομάδα μοντέλων CUMS (Mod): λήψη πλήρους διέγερσης CUMS, καθετήρας με ίσου όγκου απιονισμένο νερό.

Ομάδα CPhGs υψηλής δόσης (CPhGs-H): Έκθεση CUMS, CPhGs 700 mg/kg σωματικού βάρους με ημερήσιο καθετήρα.

Ομάδα CPhGs μεσαίας δόσης (CPhGs-M): Έκθεση CUMS, CPhGs 350 mg/kg με ημερήσιο καθετήρα.

Ομάδα χαμηλών δόσεων CPhGs (CPhGs-L): έκθεση CUMS, CPhGs 175 mg/kg με καθετηριασμό καθημερινά.

Ομάδα θετικού ελέγχου στη φλουοξετίνη (FLX): Έκθεση CUMS, φλουοξετίνη 15 mg/kg καθετήρα μία φορά την ημέρα.

Για την κατασκευή του μοντέλου CUMS, υιοθετήθηκαν δέκα διαφορετικά είδη ήπιων στρεσογόνων παραγόντων: φυσική συγκράτηση (60 λεπτά), οριζόντια ανακίνηση (60 λεπτά), ανάρτηση ουράς (60 λεπτά), γωνία κλίσης 45 μοιρών (24 ώρες), υγρό περιβάλλον κλινοσκεπασμάτων (24 ώρες), απομόνωση άδειου κλουβιού (1 ώρα), φωτισμός σε άδειο κλουβί (24 ώρες). κολύμβηση με ζεστό νερό στους 41 βαθμούς για 5 λεπτά, κολύμβηση σε κρύο νερό στους 4 βαθμούς για 5 λεπτά και διέγερση με κλιπ ουράς διάρκειας 2 λεπτών. Δύο διαφορετικοί παράγοντες άγχους εφαρμόστηκαν τυχαία κάθε μέρα. ταυτόσημος στρεσογόνος παράγοντας δεν θα εμφανιζόταν διαδοχικά σε δύο παρακείμενες ημέρες. Η διαδικασία μοντελοποίησης CUMS συνεχίστηκε για τέσσερις εβδομάδες.

Μετά την ολοκλήρωση της μοντελοποίησης στρες τεσσάρων εβδομάδων, οι αντίστοιχες ουσίες δοκιμής ή ο φορέας διαλύτη χορηγήθηκαν ενδογαστρικά μία φορά την ημέρα για άλλες συνεχόμενες τέσσερις εβδομάδες. Την όγδοη πειραματική εβδομάδα, όλα τα έργα ανίχνευσης νευροσυμπεριφορικής υλοποιήθηκαν διαδοχικά.

2.3 Μπαταρία δοκιμής νευροσυμπεριφοράς

2.3.1 Δοκιμή προτίμησης σακχαρόζης (SPT)

Η δοκιμή προτίμησης σακχαρόζης αξιολογεί τον πυρηνικό καταθλιπτικό φαινότυπο που μοιάζει με ανηδονία σε τρωκτικά. Πριν από την επίσημη μέτρηση, κάθε ποντίκι στεγαζόταν ξεχωριστά. Εκτελέστηκε τριήμερη φάση προσαρμογής ροφήματος σακχαρόζης. Ημέρα πρώτη: δύο φιάλες διαλύματος σακχαρόζης 1 % τοποθετημένες σε κάθε κλωβό για 24 ώρες. Ημέρα δεύτερη: ένα μπουκάλι διαλύματος σακχαρόζης σε συνδυασμό με ένα μπουκάλι καθαρού νερού. Τρίτη ημέρα: αλλάξτε τη θέση των δοχείων ζάχαρης-νερού και καθαρού νερού για να εξαλείψετε την επιρροή της μεροληψίας τοποθεσίας. Μετά τον κύκλο προσαρμογής, τα ποντίκια νήστευαν από τροφή και νερό για 24 ώρες. Στη συνέχεια, παρασχέθηκαν προζυγισμένη φιάλη νερού σακχαρόζης 1 % και φιάλη καθαρού νερού. Οι θέσεις των φιαλών εναλλάχθηκαν μετά από 12 ώρες. Μετά από συνολική διάρκεια δοκιμής 24 ωρών, το υπόλοιπο υγρό βάρος και των δύο φιαλών καταγράφηκε με ακρίβεια. Ποσοστό προτίμησης σακχαρόζης (%)=(κατανάλωση διαλύματος σακχαρόζης)/(κατανάλωση διαλύματος σακχαρόζης + κατανάλωση καθαρού νερού) × 100 %.

2.3.2 Δοκιμή ανοιχτού πεδίου (OFT)

Η συσκευή ανοιχτού πεδίου σχημάτισε ένα κυβικό κουτί ανοιχτής οροφής 50 cm × 50 cm × 50 cm. Η κεντρική τετράγωνη περιοχή ορίστηκε ως μια κεντρική ζώνη 25 cm × 25 cm με κέντρο μέσα στην αρένα. Κάθε ποντίκι τοποθετήθηκε απαλά στην κεντρική επιφάνεια του κουτιού ανοιχτού πεδίου. Επιτρεπόταν ο ελεύθερος χρόνος προσαρμογής πέντε λεπτών. Η καταγραφή συμπεριφοράς και η ανάλυση δεδομένων επικεντρώθηκαν στην επόμενη περίοδο παρατήρησης πέντε λεπτών. Οι κύριοι δείκτες ανάγνωσης περιείχαν τη συνολική απόσταση κίνησης, τον χρόνο που δαπανήθηκε εντός της κεντρικής ζώνης και τη συχνότητα των καταχωρήσεων στην κεντρική ζώνη. Αυτές οι παράμετροι αντικατοπτρίζουν την αυθόρμητη κινητική δραστηριότητα και την εξερευνητική προθυμία υπό άγνωστες περιβαλλοντικές συνθήκες.

2.3.3 Δοκιμή ανάρτησης ουράς (TST)

Το τμήμα της ουράς του ποντικιού στερεώθηκε με ασφάλεια επιτρέποντας στο ζώο να κρέμεται ανάποδα πάνω από την επιφάνεια του εδάφους. Ο συνολικός χρόνος εγγραφής ήταν έξι λεπτά. Τεκμηριώθηκε η διάρκεια του χρόνου ακινησίας κατά τη διάρκεια του τελευταίου τμήματος των τεσσάρων λεπτών. Ο αυξημένος χρόνος ακινησίας αντιπροσωπεύει ενισχυμένη συμπεριφορά-απόγνωση καταθλιπτική κατάσταση.

2.3.4 Δοκιμή αναγκαστικής κολύμβησης (FST)

Διαφανές κυλινδρικό βαρέλι κολύμβησης (διάμετρος 15 cm, ύψος 50 cm) γεμίστηκε με νερό διατηρημένο στους (25 ± 2) βαθμούς. το βάθος του νερού έφτασε τα 20 cm. Κάθε ποντίκι τοποθετήθηκε απαλά σε δοχείο κολύμβησης για συνολικό διάστημα εγγραφής έξι λεπτών. Ο χρόνος αιωρούμενης ακινησίας των τελευταίων τεσσάρων λεπτών ποσοτικοποιήθηκε στατιστικά. Η μεγαλύτερη περίοδος ακινησίας υποδηλώνει έντονη συμπεριφορά συμπεριφοράς που σχετίζεται με την απόγνωση.

2.4 Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία ιστού

Στο πειραματικό τελικό σημείο της εβδομάδας 8, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ενδοπεριτοναϊκή ένεση 3 % πεντοβαρβιτάλης νατρίου (10 mL/kg) για βαθιά αναισθησία. Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν μέσω της τεχνικής αιμορραγίας αφαίρεσης του βολβού του ματιού. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ευθανασία με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας. Η ψυχρή καρδιακή αιμάτωση με φυσιολογικό-αλατόνερο καθάρισε το κυκλοφορούν αίμα μέσα στους εγκεφαλικούς ιστούς. Ολόκληρα δείγματα ολόκληρου του εγκεφάλου ανατέμθηκαν γρήγορα. Οι μισοί εγκεφαλικοί ιστοί βυθίστηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4 % για στερέωση ιστού για 72 ώρες για επακόλουθη ιστολογία. Οι περιοχές του εγκεφάλου του ιππόκαμπου απομονώθηκαν γρήγορα από τα εναπομείναντα δείγματα εγκεφάλου σε προψυχθείσα πλατφόρμα πάγου και διατηρήθηκαν σε περιβάλλον αποθήκευσης υγρού αζώτου. Για βιοχημική μέτρηση, δείγμα ιστού ιππόκαμπου 10 mg αναμίχθηκαν με προψυγμένο φυσιολογικό ορό με αναλογία μάζας-όγκου 1:9, υποβάλλοντας σε μηχανική ομογενοποίηση σε λουτρό πάγου. Το ομογενοποίημα ιστού φυγοκεντρήθηκε υπό 4000 r/min για 15 λεπτά και τα υπερκείμενα κλάσματα συλλέχθηκαν για ποσοτικοποίηση βιοδείκτη ELISA.

2.5 Μέτρηση βιοχημικού δείκτη

Σύμφωνα με τα εγχειρίδια λειτουργίας κατασκευαστών των εμπορικών κιτ ELISA, δείγματα υπερκειμένου ορού και ομογενοποιήματος ιππόκαμπου μετρήθηκαν για να ληφθούν τιμές συγκέντρωσης νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης, συμπεριλαμβανομένων των 5-HT και DA. Το υπερκείμενο ομογενοποιημένο ιππόκαμπο εξετάστηκε περαιτέρω για δείκτες φλεγμονώδους μεσολαβητή iNOS, COX-2, PGE2, παράλληλα με τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 και IFN-. Οι μετρήσεις απορρόφησης οπτικής πυκνότητας καταγράφηκαν μέσω φασματοφωτόμετρου μικροπλακών. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης του δείγματος βαθμονομήθηκε εφαρμόζοντας κιτ ποσοτικοποίησης πρωτεΐνης BCA πριν από την ανίχνευση κυτοκίνης.

2.6 Ιστοπαθολογική χρώση ιππόκαμπου

Σταθεροποιημένα δείγματα εγκεφαλικού ιστού ενσωματώθηκαν σε κερί παραφίνης και κόπηκαν σε ιστολογικές τομές πάχους 4 μm. Για τη χρώση HE: οι τομές παραφίνης πέρασαν από αποκήρωση ξυλολίου, ενυδάτωση με αιθανόλη βαθμίδας, πυρηνική χρώση αιματοξυλίνης, αντιχρώση κυτταροπλασματικής ηωσίνης, διαφοροποίηση υδροχλωρικής-αλκοόλης, αφυδάτωση διαβάθμισης αιθανόλης, επεξεργασία διαφάνειας ξυλίνης και ουδέτερο κόμμι. Η μικροσκοπική παρατήρηση επικεντρώθηκε στην κυτταρική μορφολογία, την πυρηνική κατάσταση και την κυτταροπλασματική δομική ακεραιότητα στην περιοχή της οδοντωτής έλικας του ιππόκαμπου.

Η χρώση Nissl απεικονίζει τα νευρωνικά σωμάτια Nissl που αντανακλούν τη νευρωνική βιοσυνθετική δραστηριότητα και τη ζωτικότητα των κυττάρων. Οι αποκηρωμένες φέτες παραφίνης επωάστηκαν σε διάλυμα εργασίας χρώσης Nissl. Μετά τα βήματα πλύσης με απεσταγμένο νερό, τα τμήματα έλαβαν αφυδάτωση, διαδικασία διαφάνειας και σφράγιση. Στο οπτικό μικροσκόπιο παρατηρήθηκαν ιστομορφολογικές παραλλαγές των νευρώνων του ιππόκαμπου.

2.7 Ανοσοϊστοχημεία

Τα τμήματα του ιστού του ιππόκαμπου που είναι ενσωματωμένα σε παραφίνη αποκηρώθηκαν και ενυδατώθηκαν. Εφαρμόστηκαν διαδοχικά βήματα ανάκτησης αντιγόνου, αποκλεισμού ενδογενούς υπεροξειδάσης και αποκλεισμού μη ειδικής δέσμευσης πρωτεΐνης. Οι φέτες ιστού επωάστηκαν όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία 4 βαθμών με αραιωμένα πρωτογενή αντισώματα: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), αντι-Κασπάση-1 (1:400). Μετά από δευτερογενή επώαση αντισωμάτων, πραγματοποιήθηκε χρωμογόνος αντίδραση DAB. Ολοκληρώθηκαν οι διαδικασίες αντι-χρώσης πυρήνων, αφυδάτωσης και τοποθέτησης. Μικροσκόπιο φωτός απαθανάτισε ψηφιακές εικόνες οπτικού πεδίου. Το λογισμικό επεξεργασίας εικόνας Image-J υπολόγισε τις μέσες τιμές οπτικής πυκνότητας για να αξιολογήσει ημιποσοτικά την ένταση έκφρασης της πρωτεΐνης στόχου.

2.8 Χρώση ανοσοφθορισμού

Οι προετοιμασμένες τομές ιππόκαμπου παραφίνης παρουσίασαν επέμβαση αποκήρωσης, ανάκτησης αντιγόνου και αποκλεισμού. Τα πρωτογενή αντισώματα anti-TLR4 (1:400) και anti-phospho-NF-kB p65 (1:200) εφαρμόστηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύχτα σε συνθήκες τεσσάρων βαθμών Κελσίου. Δευτερεύοντα αντισώματα επισημασμένα με φθορισμό προστέθηκαν για επώαση μίας ώρας σε κατάσταση προστασίας από το φως. Η πυρηνική αντικηλίδα DAPI συμπεριλήφθηκε στο μέσο στερέωσης. Μικροσκόπιο φθορισμού λέιζερ φωτογράφισε σήματα φθορισμού. Το λογισμικό Image-J υπολόγισε τη μέση ένταση φθορισμού που αντιπροσωπεύει το μέγεθος ενεργοποίησης της πρωτεΐνης TLR4 και p‑NF‑κB p65.

2.9 Στατιστική Ανάλυση

Τα αρχικά πειραματικά δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό στατιστικής SPSS 26.0 και το πρόγραμμα γραφημάτων GraphPad Prism 9.0. Όλα τα ποσοτικά δεδομένα έκβασης εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Διενεργήθηκαν στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ ομάδων με κατάλληλες στατιστικές δοκιμές. Η τιμή P μικρότερη από 0,05 κρίθηκε ως στατιστικά σημαντική διαφορά. Π< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Πειραματικά Αποτελέσματα

3.1 CPhGs Βελτιωμένο σύμπτωμα ανηδονίας και αποκατεστημένα επίπεδα νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης

Πριν από την έναρξη της μοντελοποίησης CUMS, τα βασικά ποσοστά προτίμησης σακχαρόζης δεν εμφάνιζαν εμφανή στατιστική διακύμανση σε όλες τις κοόρτες πειραματόζωων. Μετά από στρες CUMS τεσσάρων εβδομάδων συν κύκλους παρέμβασης τεσσάρων εβδομάδων, η ομάδα του μοντέλου CUMS εμφάνισε σαφώς μειωμένη αναλογία προτίμησης σακχαρόζης σε σχέση με ζώα ελέγχου χωρίς στρες (Ρ< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

Σε σύγκριση με την κοόρτη του μοντέλου Mod, οι ομάδες θεραπείας με CPhGs υψηλής, μεσαίας και χαμηλής δόσης καθώς και η ομάδα θετικής φλουοξετίνης δημιούργησαν σημαντική αύξηση στο ποσοστό προτίμησης σακχαρόζης, 5-HT ορού, DA ορού, 5-HT ιππόκαμπου και περιεχόμενο ιππόκαμπου< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 Ενισχυμένη διερευνητική δραστηριότητα CPhG σε δοκιμή ανοιχτού πεδίου

Στην αξιολόγηση συμπεριφοράς ανοιχτού πεδίου, τα ποντίκια του μοντέλου CUMS παρουσίασαν αξιοσημείωτη μείωση στη συνολική απόσταση κίνησης, τον χρόνο παραμονής στην κεντρική ζώνη και τη συχνότητα εισόδου στην κεντρική περιοχή έναντι των ποντικών ελέγχου (Ρ< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 Συντομευμένος χρόνος ακινησίας CPhG σε πρότυπα συμπεριφοράς που βασίζονται στην απελπισία

Το τεστ ανάρτησης ουράς και το τεστ αναγκαστικής κολύμβησης ανιχνεύουν συμπεριφορική απόγνωση, που αντιπροσωπεύει βασικές καταθλιπτικές συμπεριφορικές αναγνώσεις. Η ομάδα Mod εμφάνισε δραστικά παρατεταμένο χρόνο ακινησίας τόσο στο TST όσο και στο FST (Σελ< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 Τα CPhG μειώνουν τις υπερεκφρασμένες προφλεγμονώδεις κυτοκίνες του ιππόκαμπου

Οι συγκεντρώσεις της προφλεγμονώδους κυτοκίνης του ιππόκαμπου (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) σε ζώα του μοντέλου CUMS ήταν δραστικά αυξημένες σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μάρτυρες (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3,5 CPhGs Down-Regulated Hippocampal Inflammatory-Inmediator Biomarkers

Οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές του ιππόκαμπου iNOS, COX-2 και PGE2 σε ποντικούς μοντέλου CUMS αυξήθηκαν σημαντικά (Ρ< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 CPhGs Εξασθενημένη CUMS-Προκληθείσα παθολογική παθολογική βλάβη του ιπποκάμπου

Αποτελέσματα χρώσης HE: νευρώνες οδοντωτής έλικας του ιππόκαμπου από την ομάδα Mod παρουσίασαν σοβαρές παθολογικές βλάβες: διαταραγμένη κυτταρική διάταξη, πύκνωση του πυρήνα, κυτταροπλασματική κενοτοπιοεκφύλιση, που εμφανίζει εμφανή νευρωνική βλάβη. Η ομάδα CPhGs-L έδειξε μόνο ασήμαντο αποτέλεσμα βελτίωσης. Οι CPhG μεσαίας και υψηλής δόσης προφανώς ανέστρεψαν τέτοιες παθολογικές αλλοιώσεις. Η ομάδα υψηλής δόσης CPhGs-H εμφάνισε ανώτερη δράση νευρωνικής προστασίας σε σύγκριση με την ομάδα φλουοξετίνης σε μερικά οπτικά πεδία.

Αποτελέσματα χρώσης Nissl: Οι νευρώνες του ιππόκαμπου της ομάδας Mod εμφάνισαν αποδιοργανωμένη διάταξη, εμφανή μείωση της ποσότητας σωματιδίων Nissl, η οποία αντανακλούσε μειωμένη νευρωνική συνθετική λειτουργία και χαμηλή κυτταρική ζωτικότητα. Η χορήγηση CPhGs αποκατέστησε την αφθονία του σώματος Nissl, ανάλογα με τη δόση. Η νευρωνική μορφολογία και η πυκνότητα των σωματιδίων Nissl εντός της ομάδας CPhGs-H πλησίασαν το φυσιολογικό επίπεδο της ομάδας ελέγχου. Τα ιστοπαθολογικά ευρήματα επιβεβαίωσαν τα CPhGs προστάτευαν την ακεραιότητα του νευρώνα του ιππόκαμπου έναντι της καταστροφής που προκαλείται από χρόνιο στρες.

3.7 Κατάσταση ενεργοποίησης ιπποκαμπικών γλοιακών κυττάρων ρυθμιζόμενη από CPhGs

Το GFAP είναι ειδικός βιοδείκτης για τον πληθυσμό των αστροκυττάρων. Σε σύγκριση με την ομάδα Con, η ένταση θετικού σήματος του ιππόκαμπου GFAP της ομάδας Mod μειώθηκε σημαντικά (Ρ< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Ο δείκτης πρωτεΐνης Iba-1 αντιπροσωπεύει μικρογλοία. Η ομάδα μοντέλων CUMS εμφάνισε δραματικά αυξημένο σήμα θετικής έκφρασης Iba‑1 (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 Έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζεται με φλεγμονές του ιπποκάμπου NLRP3 από CPhGs

Η ανίχνευση ανοσοϊστοχημείας που εκδηλώθηκε η έκφραση πρωτεΐνης NLRP3 και Caspase-1 εντός του ιππόκαμπου της ομάδας Mod ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (Ρ< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhG καταστέλλεται Υπερενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης TLR4/NF‑κB

Η ανίχνευση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι τα ποντίκια του μοντέλου CUMS εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη ένταση φθορισμού του υποδοχέα TLR4 και της φωσφορυλιωμένης υπομονάδας NF-κB p65 (Ρ< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Συζήτηση

Η μείζονα καταθλιπτική διαταραχή συνιστά σοβαρή νευροψυχιατρική νόσο. Τα τελευταία χρόνια, η νευροφλεγμονώδης θεωρία της κατάθλιψης έχει προσελκύσει ευρεία ερευνητική προσοχή. Το χρόνιο επαναλαμβανόμενο ψυχολογικό στρες μπορεί να πυροδοτήσει την ενεργοποίηση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος μέσα στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Ο ιππόκαμπος, μια περιοχή του εγκεφάλου που είναι ιδιαίτερα ευάλωτη σε προσβολές στρες, συσχετίζεται στενά με τη ρύθμιση της διάθεσης, την επεξεργασία ανταμοιβής και τη λειτουργία της μνήμης. Υπό παρατεταμένη διέγερση στρες, η ομοιόσταση των γλοιακών κυττάρων του ιππόκαμπου καταρρέει. Τα υπερενεργοποιημένα μικρογλοία και τα κατεστραμμένα αστροκύτταρα εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες προφλεγμονωδών κυτοκινών, προκαλώντας νευρωνική δομική βλάβη, μεταβολική διαταραχή μονοαμίνης-νευροδιαβιβαστή, προάγοντας τελικά την εμφάνιση συμπεριφοράς που μοιάζει με κατάθλιψη.

Τα παραδοσιακά ενεργά φυσικά προϊόντα που προέρχονται από φυτικά φάρμακα διαθέτουν φαρμακολογικά πλεονεκτήματα πολλαπλών στόχων, καθιστώντας υποσχόμενους υποψήφιους πόρους για την ανακάλυψη αντικαταθλιπτικών φαρμάκων. Τα CPhG είναι βιοενεργά συστατικά υπογραφής που απομονώνονται απόCistancheφαρμακευτικό βότανο. Αυτή η έρευνα κατασκεύασε μοντέλο ποντικιού με χρόνια κατάθλιψη που προκαλείται από CUMS, επαληθεύοντας διεξοδικά in vivo την αποτελεσματικότητα των CPhGs με βαθμιδωτή δόση παρόμοια με αντικαταθλιπτικά. Συμπεριφορικά πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με CPhGs βελτίωσε σημαντικά το σύμπτωμα της ανηδονίας, βελτίωσε την εξερευνητική δραστηριότητα και μείωσε τον χρόνο ακινησίας που σχετίζεται με την απόγνωση σε ποντίκια με μοντέλο κατάθλιψης, δείχνοντας σαφή συσχέτιση δόσης-αποτελέσματος.

Η υπόθεση του νευροδιαβιβαστή μονοαμίνης είναι η κλασική θεωρία της κατάθλιψης-παθογένεσης. Η σεροτονίνη και η ντοπαμίνη αναλαμβάνουν κρίσιμους ρυθμιστικούς ρόλους που καλύπτουν τη συναισθηματική σταθεροποίηση, την αντίληψη της ανάδρασης ανταμοιβής και τη διαμόρφωση συμπεριφοράς που σχετίζεται με τα κίνητρα. Το στρες CUMS οδήγησε σε εμφανή μείωση των συγκεντρώσεων 5-HT και DA στον ορό και τον ιστό του ιππόκαμπου στα πειραματόζωά μας. Η παρέμβαση των CPhGs αποκατέστησε αποτελεσματικά αυτά τα δύο επίπεδα νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης. Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με προηγούμενες δημοσιευμένες ερευνητικές εκθέσεις σχετικά μεCistancheεκχυλίσματα που ρυθμίζουν τους νευροδιαβιβαστές μονοαμίνης του εγκεφάλου.

Περαιτέρω έλεγχος βιοχημικών βιοδεικτών αποκάλυψε ότι το CUMS προκάλεσε ισχυρή αύξηση πολλαπλών προφλεγμονωδών κυτοκινών (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) καθώς και φλεγμονώδεις μεσολαβητές (iNOS, COXGE-palal ιστό). Η παρέμβαση των CPhGs ανέστρεψε σημαντικά αυτή την κατάσταση υπερέκφρασης φλεγμονώδους. Η ιστοπαθολογική χρώση HE και Nissl απέδειξε διαισθητικά τα CPhGs μετριάζουν τη βλάβη του ιπποκάμπου-νευρώνα που προκαλείται από το στρες και προστατεύουν τη μορφολογική ακεραιότητα των νευρώνων.

Οι πληθυσμοί των νευρογλοιακών κυττάρων χρησιμεύουν ως κεντρικοί συμμετέχοντες που μεσολαβούν στις νευροφλεγμονώδεις αποκρίσεις. Τα αστροκύτταρα διατηρούν την ανακύκλωση των νευροδιαβιβαστών, τη δομική σταθερότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και την παροχή νευρωνικής διατροφής. Τα μικρογλοία λειτουργούν ως μόνιμα έμφυτα ανοσοενεργά κύτταρα μέσα στο παρέγχυμα του εγκεφάλου. Το χρόνιο στρες προκαλεί απώλεια αστροκυττάρων ή λειτουργική ανεπάρκεια, παράλληλα με την παθολογική υπερενεργοποίηση της μικρογλοίας. Τα δεδομένα της ανοσοϊστοχημείας μας έδειξαν ότι η θεραπεία με CPhGs αύξησε την πυκνότητα των αστροκυττάρων θετικών για GFAP, εν τω μεταξύ μείωσε την υπερενεργοποιημένη ποσότητα μικρογλοίας που σημειώθηκε Iba-1 στον ιππόκαμπο. Αυτή η ρυθμιστική ιδιότητα του φαινοτύπου των γλοιακών κυττάρων μπορεί εν μέρει να αποτελεί τη βάση της νευροπροστατευτικής και αντικαταθλιπτικής φαρμακολογικής ισχύος των CPhG.

Το φλεγμονώδες NLRP3 αντιπροσωπεύει ζωτικής σημασίας μοριακή πλατφόρμα που μεσολαβεί σε νευρο-φλεγμονώδη καταρράκτη. Η ενεργοποίησή του οδηγεί την ωρίμανση και την έκκριση των κατάντη προφλεγμονωδών κυτοκινών IL-1 και IL-18. Ο άξονας σήματος TLR4/NF‑κB λειτουργεί ως βασικό σήμα εκκίνησης για την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Η διέγερση του υποδοχέα TLR4 προάγει τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας NF-κB και τη μετατόπιση του πυρήνα, περαιτέρω trans-ενεργοποιεί τη μεταγραφή του γονιδίου NLRP3, pro-IL-1. Στην παρούσα μελέτη μας, το στρες CUMS προκάλεσε ταυτόχρονη ενίσχυση της έκφρασης πρωτεΐνης TLR4, φωσφορυλιωμένου NF-κB p65, NLRP3 και Caspase-1. Η παρέμβαση των CPhGs ανέστειλε σαφώς την ενεργοποίηση ολόκληρου του καταρράκτη σήματος. Επομένως, συμπεραίνουμε ότι τα CPhGs ανακουφίζουν μερικώς τη νευροφλεγμονώδη βλάβη περιορίζοντας την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 που προκαλείται από το TLR4/NF-κB.

Συνολικά, τα πειραματικά στοιχεία μας για πειραματικά μοντέλα υποστηρίζουν το μηχανιστικό μοντέλο: Τα CPhG δημιουργούν αντικαταθλιπτικά αποτελέσματα σε καταθλιπτικά ποντίκια που προκαλούνται από CUMS μέσω δύο βασικών διαστάσεων: (1) αποκατάσταση της ομοιόστασης των νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης που σχετίζονται με τη διάθεση (5-HT, DA). (2) ρύθμιση της ομοιόστασης των νευρογλοιακών κυττάρων του ιππόκαμπου και καταστολή του νευρο-φλεγμονώδους παθολογικού καταρράκτη που εξαρτάται από το NLRP3 από το TLR4/NF-κB.

Αρκετοί περιορισμοί αυτής της έρευνας αξίζει να ληφθούν υπόψη. Αυτή η εργασία υλοποίησε αποκλειστικά πειράματα in vivo σε επίπεδο ζώων. Δεν έχουμε πραγματοποιήσει μηχανιστική επικύρωση σε κυτταρικό επίπεδο ούτε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους. Επομένως, το μεταφραστικό συμπέρασμα για τη θεραπεία της ανθρώπινης κατάθλιψης θα πρέπει να παραμείνει συνετό. Επιπλέον, αυτή η έρευνα δεν ανέλυσε τις συνεισφορές μεμονωμένων μονομερών ενώσεων (εχινακοσίδη, βερμπασκοσίδη) σε μικτό εκχύλισμα CPhGs. Η μελλοντική έρευνα μπορεί να επικεντρωθεί στη μηχανιστική επαλήθευση της κυτταροκαλλιέργειας, στη σύγκριση δραστηριότητας μεμονωμένων συστατικών, καθώς και σε προκαταρκτική πιλοτική παρατήρηση από άνθρωπο.

5. Συμπέρασμα

Οι γλυκοσίδες της φαινυλαιθανόλης (CPhGs) παράγουν σημαντικές αντικαταθλιπτικές φαρμακολογικές δράσεις έναντι χρόνιων απρόβλεπτων φαινοτύπων συμπεριφοράς που μοιάζουν με ήπια κατάθλιψη που προκαλούνται από ήπιο στρες σε ποντίκια C57BL/6. Οι μηχανισμοί του που σχετίζονται με τη θεραπεία σχετίζονται με την ανάκτηση των επιπέδων σεροτονίνης και ντοπαμίνης στον ορό και τον ιππόκαμπο, τη διατήρηση της ακεραιότητας της νευρωνικής δομής του ιππόκαμπου, τη ρύθμιση της λειτουργικής ισορροπίας αστροκυττάρων-μικρογλοίας, καθώς και καταστολή του TLR4-NFmasBome νευρο-φλεγμονώδης παθολογικός καταρράκτης. Αυτή η προκλινική μελέτη σε ζώα παρέχει πειραματική αναφορά για περαιτέρω ανάπτυξη CPhG ως φυσική θεραπευτική επικουρική ουσία ή λειτουργικό συστατικό τροφής που στοχεύει στη βελτίωση των συμπτωμάτων της κατάθλιψης.

Αναφορές

Ren L, Shao YT, Qin SH. Μελέτη για την αναγνώριση στόχων και την επίδραση της σαπωνίνης Α στην καταθλιπτική διαταραχή. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44-51.

Fan L, Peng Y, Wang JW, et al. Οι ολικές γλυκοσίδες από τους μίσχους του Cistanche tubulosa ανακουφίζουν από συμπεριφορές που μοιάζουν με κατάθλιψη: αμφίδρομη αλληλεπίδραση των φυτοχημικών και της μικροχλωρίδας του εντέρου. Phytomedicine, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN, et αϊ. Ολοκληρωμένη ανάλυση της φυτοχημικής σύνθεσης, της φαρμακοκινητικής και της φαρμακολογίας του δικτύου για την ανίχνευση διακρίσεων μεταξύ των στελεχών του Cistanche deserticola και του C. tubulosa με βάση την αντικαταθλιπτική δράση. Food & Function, 2022,13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Η κατάθλιψη ως μικρογλοιακή νόσος. Trends in Neurosciences, 2015, 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Μικρογλοία στην κατάθλιψη: τρέχουσες προοπτικές. Science China‑Life Sciences, 2021, 64:911-925.

Wu B, Gan AN, Wang RX, et al. Alpinia oxyphylla Miq. Το πτητικό έλαιο βελτιώνει τις καταθλιπτικές συμπεριφορές και αναστέλλει τη νευροφλεγμονή σε ποντίκια που έχουν εκτεθεί σε CUMS αναστέλλοντας την οδό σηματοδότησης MyD88/NF-κB με τη μεσολάβηση TLR4. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023,130:102270.