Επικοινωνία:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian‐feng Zhang|Τσουάν Τσιν

Το Cistanche έχει αντιγηραντική δράση

Αφηρημένη

Ιστορικό: Η σχετιζόμενη με το χρόνο μείωση της αναγεννητικής ικανότητας και της ομοιόστασης των οργάνων είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό τουγηράσκων. Τα Rehmannia glutinosa και Astragalus membranaceus έχουν χρησιμοποιηθεί ως παραδοσιακά κινέζικα φυτικά φάρμακα για ενισχυμένη ανοσία και παρατεταμένη ζωή. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο αυτό το φυτικό φάρμακο επιβραδύνει τη γήρανση είναι άγνωστος. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον μηχανισμό του βοτάνουαντιγηραντική δράση.

Μέθοδοι: Τα ποντίκια τράφηκαν με δίαιτες συμπληρωμένες με R. glutinosa ή A. membranaceus για 10 μήνες. η ομάδα ελέγχου τράφηκε με τυπική δίαιτα. Οι φαινότυποι αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα βαθμολογίας βαθμολόγησης και ανάλυση επιβίωσης. Τα ποσοστά των φαινοτύπων γήρανσης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) προσδιορίστηκαν με ανάλυση ταξινόμησης κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό. Η λειτουργία και ο μηχανισμός των HSCs αναλύθηκαν με κλωνογονικό προσδιορισμό και την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο.

Αποτελέσματα: Τοαντιγηραντική δράσητου R. glutinosa οφείλεται στην ενισχυμένη λειτουργία των HSCs. Τα ποντίκια που τράφηκαν με R. glutinosa εμφάνισαν χαρακτηριστικά επιβράδυνσηςγηράσκωνδιαδικασία, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης γήρανσης και του αυξημένου ποσοστού επιβίωσης. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε μειωμένους αριθμούς κυττάρων Lin–Sca1 συν c‐kit– (LSK), μακροχρόνιων HSCs (LT‐ HSCs) και βραχυπρόθεσμων HSCs (ST‐ HSCs) στην ομάδα R. glutinosa. In vitro, οι κλωνογονικές αναλύσεις έδειξαν αυξημένη ικανότητα αυτοανανέωσης των LT-HSCs από την ομάδα R. glutinosa καθώς και διατήρηση της ηρεμίας του LSK μέσω της προς τα πάνω ρυθμισμένης έκφρασης της p18. Η ομάδα R. glutinosa έδειξε επίσης μειωμένα επίπεδα αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και το ποσοστό των κυττάρων ‐gal plus μέσω της μείωσης της ρύθμισης της πρωτεΐνης p53 και p16 που σχετίζεται με την κυτταρική γήρανση.

Συμπέρασμα: Η Rehmannia glutinosa ασκείαντι γήρανσηεπιδράσεις διατηρώντας την ηρεμία και μειώνοντας τη γήρανση των HSC.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: αντιγήρανση, αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα, ηρεμία, Rehmannia glutinosa

1|ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η γήρανση ορίζεται ως η εξαρτώμενη από το χρόνο λειτουργική έκπτωση που επηρεάζει τους περισσότερους ζωντανούς οργανισμούς.1 Η μακροζωία των οργανισμών διατηρείται κυρίως από βλαστοκύτταρα.2 Τα ειδικά για τον ιστό βλαστοκύτταρα έχουν την ικανότητα αυτοανανέωσης και διαφοροποιούνται σε μια ποικιλία τελεστικών κυττάρων. 3 Ωστόσο, κατά τη διαδικασία της γήρανσης, αυτή η ικανότητα αυτο-ανανέωσης μειώνεται, οδηγώντας τελικά στη συσσώρευση μη επισκευασμένων, κατεστραμμένων ιστών σε ηλικιωμένους οργανισμούς.4 Απώλεια της ικανότητας διατήρησης ισορροπίας μεταξύ ηρεμίας και διαφοροποίησης στο βλαστοκύτταρο/προγονικό κύτταρο. Το διαμέρισμα μπορεί να οδηγήσει σε θάνατο ή ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία.2 Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι η αναζωογόνηση των βλαστοκυττάρων μπορεί να αντιστρέψει τον φαινότυπο της γήρανσης.5,6 Στο αιμοποιητικό σύστημα, τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs) είναι υπεύθυνα για την παραγωγή αιμοσφαιρίων. Σε ηλικιωμένα ποντίκια, το αιμοποιητικό σύστημα εμφανίζει βλάβη των Τ- και Β- λεμφικών κυττάρων και ο αριθμός των μυελοειδών κυττάρων είναι αυξημένος. Τα ηλικιωμένα HSC έδειξαν μειωμένη δραστηριότητα αυτοανανέωσης και μειωμένη ικανότητα αναδόμησης της αιμοποίησης. Συγκεκριμένα, οι αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία στο διαμέρισμα HSC εκδηλώνονται στον γηρασμένο ξενιστή ως αναιμία, αυξημένη τάση για μυελοπολλαπλασιαστικά νεοπλάσματα, μειωμένη ανοσοποιητική λειτουργία και αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου.{11}} Ωστόσο, ο μηχανισμός της γήρανσης του HSC και του HSC. οι επιδράσεις των φυτικών φαρμάκων στη γήρανση του HSC είναι άγνωστες.10

Οι άνθρωποι ασχολούνταν με την καθυστέρηση της διαδικασίας γήρανσης και την παραμονή νέων από την αρχαιότητα καιαντι γήρανσηαποτελεί επίκαιρο επίκεντρο της έρευνας. Η παραδοσιακή κινεζική ιατρική έχει λάβει αυξανόμενη προσοχή για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών που σχετίζονται με τη γήρανση. Πολλά βότανα που χρησιμοποιούνται στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική είναι γνωστό ότι παρέχουν θετικά αποτελέσματα κατά της γήρανσης μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Τα Rehmannia glutinosa και Astragalus membranaceus χρησιμοποιούνται ευρέως με αυτόν τον τρόπο εδώ και χιλιάδες χρόνια.

Το Rehmannia glutinosa χρησιμοποιείται για τη θεραπεία διαφόρων διαβητικών διαταραχών, την ενίσχυση του μεταβολισμού των οστών στην οστεοπόρωση και την αναστολή της φλεγμονής και της ίνωσης του ήπατος. Επιπλέον, αυτό το βότανο έχει και άλλα αποτελέσματα όπωςκατά της κούρασης, αντικαταθλιπτικές και νευροπροστατευτικές ιδιότητες. Τα τελευταία χρόνια, οι φαρμακολογικές μελέτες για το R. glutinosa και τα ενεργά συστατικά του επικεντρώθηκαν κυρίως στις ευρείες δράσεις του στο αίμα, το ενδοκρινικό, το καρδιαγγειακό και το νευρικό σύστημα.11-14 Έτσι, το R. glutinosa αποδείχθηκε ότι διαθέτει ισχυρό ανοσοποιητικό σύστημα. ‐ενισχυτική δραστηριότητα, η οποία παρείχε τη θεωρητική βάση για περαιτέρω μελέτες.

Το Astragalus membranaceus έχει τονωτικές, ηπατοπροστατευτικές, διουρητικές και αποχρεμπτικές ιδιότητες15 και έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζει ανοσοτροποποιητικές,16αντιφλεγμονώδη,καιαντιοξειδωτικόεπιδράσεις.17 Η αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τις επιδράσεις των παραδοσιακών κινεζικών φαρμάκων στην κλινική πράξη είναι ένα βασικό βήμα προς την παγκόσμια εφαρμογή τους και αυτό το θέμα αποτελεί επί του παρόντος αντικείμενο έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος.

Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, ταΐσαμε ποντίκια με δίαιτες συμπληρωμένες με R. glutinosa και A. membranaceus για 10 μήνες για να διερευνήσουμε τον μηχανισμό στον οποίο βασίζεται η ικανότητα του R. glutinosa να αυξάνει τη μακροζωία.

2|ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1|Ομαδοποίηση και θεραπεία ζώων

Τα θηλυκά ποντίκια C57BL/6J διατηρήθηκαν σε περιβάλλον απαλλαγμένο από παθογόνα και τρέφονταν με μια τυπική δίαιτα. Η χρήση ζώων σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από τις Επιτροπές Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Ινστιτούτου Εργαστηριακής Επιστήμης των Ζώων του Ιατρικού Κολλεγίου της Ένωσης Πεκίνου. Τα ποντίκια (ηλικίας 10 μηνών) χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (n=20/ομάδα). Η ομάδα ελέγχου τράφηκε με μια τυπική δίαιτα (Beijing HFK Biosicence, Πεκίνο, Κίνα). Οι δίαιτες των άλλων δύο ομάδων συμπληρώθηκαν με αλεσμένο R. glutinosa και A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Beijing, Κίνα), αντίστοιχα, σε δόση 200 mg/ημέρα για 10 μήνες. Αυτή η δόση επιλέχθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κανονικοποίησης της επιφάνειας σώματος για να επιβεβαιωθούν οι δόσεις του φαρμάκου από μελέτες σε ανθρώπους έως μελέτες σε ποντίκια. Το σωματικό βάρος προσδιοριζόταν κάθε 2 μήνες και η επιβίωση καταγραφόταν καθημερινά.

2.2|Αξιολόγηση του βαθμού γήρανσης

Ένα σύστημα βαθμολογίας βαθμολόγησης υιοθετήθηκε για την αξιολόγηση του βαθμού γήρανσης σύμφωνα με κριτήρια που ορίζονται από τους Takeda et al.18 Κάθε κατηγορία που αναφέρεται στο πρωτόκολλο επιλέχθηκε από τα κλινικά σημεία που σχετίζονται με τη διαδικασία γήρανσης. Κάθε ποντίκι βαθμολογήθηκε σε ηλικία 18 μηνών και η βαθμολογία σε κάθε κατηγορία αθροίστηκε για να καθοριστεί η συνολική βαθμολογία βαθμολόγησης.

2.3|Κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από τον θύμο, τον σπλήνα, το περιφερικό αίμα (PB) και τον μυελό των οστών (BM). Η σπλήνα και ο θύμος αδένας αφαιρέθηκαν αμέσως, πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό και ζυγίστηκαν. Οι σπλήνες και οι θύμοι ομογενοποιήθηκαν ήπια σε γυάλινο ομογενοποιητή και τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε στείρο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Τα κύτταρα από το ΡΒ εφαρμόστηκαν σε λύση ερυθρών αιμοσφαιρίων (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Τα κύτταρα από το BM απομονώθηκαν με έκπλυση τόσο της κνήμης όσο και των μηριαίων οστών με στείρο PBS. Όλα τα κύτταρα απομονώθηκαν με διήθηση σε ένα αποστειρωμένο νάιλον πλέγμα και χρωματίστηκαν για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς με τα ακόλουθα συζευγμένα με φθοροφόρο αντισώματα: συζευγμένο με φυκοερυθρίνη (PE) - αντι-CD3 (G4.18), αντισυζευγμένο με αλλοφυκοκυανίνη (APC) ‐ CD4 (OX35) και PE‐Cy7‐συζευγμένο αντι‐CD8a (OX8). Για τα ΒΜ κύτταρα, οι δείκτες γενεαλογίας χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένο με βιοτίνη αντι-ποντικού CD4 (RM4-5), CD5 (53-7.3), CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), Τα TER119 (TER- 119) και Gr1 (RB6-8C5), ακολουθούμενα από χρώση με το αντίσωμα APC-eFluor 780-συζευγμένη στρεπταβιδίνη ελήφθη επίσης από την eBioscience (San Diego, CA, USA). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για επιφανειακή χρώση: APC ανοσοσφαιρίνη (Ig)M (II/41), ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) IgD (11‐26), PE‐Cy7 Sca‐ 1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) και PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). Όλα τα αντισώματα ελήφθησαν από την eBiosciences (San Diego, CA, USA). Τα δεδομένα ελήφθησαν από FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (Three Star, Ashland, OR, USA).

2.4|Ανάλυση κυτταρικού κύκλου

Για ανάλυση κυτταρικού κύκλου, τα συνολικά κύτταρα ΒΜ χρωματίστηκαν για δείκτες επιφανείας βλαστοκυττάρων (Lin–Sca‐ 1 plus c‐ KitHigh, LSTKs), στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και διαπερατήθηκαν (00-5123‐43· Becton Dickinson ) πριν από τη χρώση με FITC Ki‐

67 αντίσωμα και 7-αμινοακτινομυκίνη D (7-AAD). Η απόκτηση δεδομένων πραγματοποιήθηκε στο FACS Aria II (Becton Dickinson). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo.

2,5|Χρώση γαλακτώματος που σχετίζεται με τη γήρανση

Η δραστηριότητα σχετιζόμενη με τη γήρανση (SA) - gal προσδιορίστηκε επίσης με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας C12FDG όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Εν συντομία, τα βλαστοκύτταρα χρωματίστηκαν αρχικά για δείκτες κυτταρικής επιφάνειας και στη συνέχεια επωάστηκαν με 100 nmol L− 1 μπαφιλομυκίνη Α1 για 1 ώρα στους 37 βαθμούς για να προκληθεί αλκαλοποίηση λυσοσωμάτων. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 mmol L− 1 C12FDG για 1-2 ώρες στους 37 βαθμούς και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Προσδιορισμός της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS).

Τα κύτταρα επωάστηκαν με διχλωρο-διϋδρο-φθοροσκεΐνη διοξική (DCFH- DA; Beyotime, Σαγκάη, Κίνα) στους 37 βαθμούς για 20 λεπτά. Το DCFH-DA διαχέεται παθητικά στα κύτταρα, όπου αποακετυλιώνεται από εστεράσες για να σχηματίσει μη φθορίζουσα 2',7'-διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH). Η ποσότητα του φθορισμού που εκπέμπεται συσχετίζεται με την ποσότητα του ROS στο κύτταρο. Τα δεδομένα ελήφθησαν σε FACS Aria I (Becton Dickinson) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo.

2.7|Ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (PCR).

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZol (Invitrogen, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα γονίδια ενδιαφέροντος ενισχύθηκαν από ολικά RNA που έχουν υποστεί αγωγή με DNase I χρησιμοποιώντας ανάστροφη μεταγραφάση M-MLV (Promega, Madison, WI, ΗΠΑ)

και εκκινητές poly‐dT. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR ήταν οι εξής: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ και 5′‐CGAAGAGACAACGG- CACACT‐3′, Tm=60 βαθμός, 30 κύκλοι), p53 (5′‐CATGAACCGCCGACC- TATC‐ 3′ και 5′‐TCCCGGAACATTCTCGAGGC‐3′, Tm=62 βαθμός , 35 κύκλοι), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ και 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm {{235} μοίρες κύκλοι), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ και 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 βαθμός , 30 κύκλοι), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGCAGGTTCTTGGT′‐ 3GGTCGTCGTGT‐3CCGTCGTGTGTGT‐3CCGTCGTGTGTGTGTGTGT‐3 ′, Tm=61 βαθμός, 35 κύκλοι), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ και 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 βαθμός, 30 κύκλοι), 3‐φωσφορική γλυκεραλδεΰδη αφυδρογονάση (5'‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3' και 5'‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3', Tm=60 βαθμός, 25 κύκλοι). Η PCR πραγματικού χρόνου (RT) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Ιαπωνία) στο σύστημα ανίχνευσης ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2.8|Κλωνογονικές αναλύσεις

Τα μακροχρόνια (LT)- HSC ταξινομήθηκαν με ταξινόμηση κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS) και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε κυτταρικές πλάκες 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας μέσο βάσης μεθυλοκυτταρίνης (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, ΗΠΑ). . Δέκα αντίγραφα φρεάτια παρασκευάστηκαν για κάθε δείγμα. Χρησιμοποιήσαμε πλάκα κυτταροκαλλιέργειας 96 φρεατίων, τρία κύτταρα ανά φρεάτιο. Δύο εβδομάδες μετά την επίστρωση, ο αριθμός και τα μεγέθη των αποικιών μετρήθηκαν σε μικροσκόπιο.

2,9|Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας το λογισμικό Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ΗΠΑ) και GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως η μέση τιμή ± SD. Το P < 0.05="" θεωρήθηκε="" ότι="" υποδηλώνει="" στατιστική="">

3|ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1|Τα R. glutinosa και A. membranaceus άσκησαν αντιγηραντική δράση

Για να επιβεβαιώσετε τοαντιγηραντικές επιδράσειςτων R. glutinosa και A. membranaceus, διερευνήσαμε τα αποτελέσματα της χορήγησης ως συμπλήρωμα διατροφής (200 mg/ημέρα). Στη συνέχεια, καταγράψαμε το σωματικό βάρος, τον βαθμό γήρανσης και το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών. Το σωματικό βάρος των ποντικών που τρέφονταν με R. glutinosa ή A. membranaceus ήταν φυσιολογικό σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας ελέγχου, αν και υπήρξε μείωση στο σωματικό βάρος της ομάδας R. glutinosa και A. membranaceus στους 20 μήνες (Εικόνα 1Α). Η ανάλυση του βαθμού γήρανσης αποκάλυψε μια σταθερή και μη αναστρέψιμη αύξηση στη βαθμολογία βαθμολόγησης με την προχωρημένη ηλικία στις ομάδες R. glutinosa και A. membranaceus σε σύγκριση με αυτήν στην ομάδα ελέγχου, αν και η αύξηση ήταν πιο έντονη στην ομάδα A. membranaceus ομάδα (Εικόνα 1Β). Η υψηλή βαθμολογία οφειλόταν σε πρώιμη έναρξη απώλειας παθητικότητας και αντιδραστικότητας, απώλειας γυαλάδας του δέρματος και αυξημένης τραχύτητας, τριχόπτωσης, περιοφθαλμικές βλάβες, αυξημένη λορδόκυφωση της σπονδυλικής στήλης και πιο έντονη αύξηση της βαρύτητάς τους.18 Ποντίκια στην Α Η ομάδα ποντικών membranaceus παρουσίασε πιο έντονα χαρακτηριστικά φαινοτύπου γήρανσης, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας γυαλάδας του δέρματος και της τριχόπτωσης. Οι καμπύλες επιβίωσης έδειξαν ότι η διάρκεια ζωής των ποντικών στις ομάδες R. glutinosa και A. membranaceus ήταν ελαφρώς μεγαλύτερη από εκείνη στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 1C). Αυτά τα στοιχεία επιβεβαίωσαν τηναντιγηραντικές επιδράσειςτόσο του R. glutinosa όσο και του A. membranaceus, αν και το R. glutinosa βρέθηκε να είναι πιο αποτελεσματικό στην επιβράδυνση της διαδικασίας γήρανσης.

ΕΙΚΟΝΑ 1 Rehmannia glutinosa και Astragalus membranaceusαντιγηραντικές επιδράσεις. Τα ποντίκια τράφηκαν με δίαιτες συμπληρωμένες με αλεσμένο R. glutinosa ή A. membranaceus (200 mg/ημέρα). η ομάδα ελέγχου τράφηκε με τυπική δίαιτα. A, Οι αλλαγές στο σωματικό βάρος των ποντικών μετρώνται κάθε 2 μήνες. Β, Αλλαγές στη βαθμολογία γήρανσης των ποντικών με την ηλικία. Γ, Καμπύλες επιβίωσης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. n=20 ποντίκια/ομάδα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. n=5 ποντίκια/ομάδα.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|Το R. glutinosa μείωσε τον αριθμό των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων

Η εξάντληση των βλαστοκυττάρων θεωρείται ότι είναι η ενσωματωμένη συνέπεια πολλαπλών τύπων βλάβης που σχετίζεται με τη γήρανση και μια από τις κύριες αιτίες γήρανσης των ιστών και των οργανισμών. υπέθεσε ότι τοαντιγηραντικές επιδράσειςτου R. glutinosa διαμεσολαβούνται από την ενίσχυση της λειτουργίας των βλαστοκυττάρων. Επομένως, πραγματοποιήσαμε κυτταρομετρική ανάλυση ροής του αριθμού των αιμοποιητικών βλαστικών/προγονικών κυττάρων που απομονώθηκαν από ποντίκια (ηλικίας 20 μηνών) που τρέφονταν με δίαιτες συμπληρωμένες με R. glutinosa ή A. membranaceus (200 mg/ημέρα) για 10 μήνες (Εικόνα 2Α) . Το ποσοστό των LSK μειώθηκε στις ομάδες R. glutinosa και A. membranaceus (Εικόνα 2Β). Οι αριθμοί των LT- και των βραχυπρόθεσμων (ST)- HSC μειώθηκαν κατά περίπου δύο φορές στην ομάδα R. glutinosa σε σύγκριση με τον αριθμό στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 2C-D). Μεγαλύτεροι αριθμοί κοινών λεμφοειδών προγονικών παραγόντων (CLPs) ανιχνεύθηκαν στην ομάδα R. glutinosa σε σύγκριση με τον αριθμό στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 2I). Δεν υπήρχαν διαφορές στον αριθμό των πολυδύναμων προγόνων (MPPs), των κοινών μυελοειδών προγόνων (CMPs), των προγόνων κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GMPs) και των μεγακαρυοκυττάρων-ερυθροειδών προγόνων (MEPs) στην ομάδα R. glutinosa σε σύγκριση με τον αριθμό στην ομάδα ομάδα ελέγχου. Στην ομάδα A. membranaceus, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στους αριθμούς των LT- και ST- HSC σε σύγκριση με τους αριθμούς στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 2C-D). Επιπλέον, δεν υπήρχε διαφορά στους αριθμούς των κυττάρων MPP, CMP, MEP και CLP σε σύγκριση με τους αριθμούς στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 2Ε, 2F, 2Η και 2I). Ωστόσο, ο αριθμός των GMPs μειώθηκε στην ομάδα A. membranaceus. Έτσι, ποντίκια που τρέφονταν με δίαιτες συμπληρωμένες με R. glutinosa εμφάνισαν μειωμένο αριθμό αιμοποιητικών βλαστικών και προγονικών κυττάρων.

3.3|Το R. glutinosa ενίσχυσε τη λειτουργία και διατήρησε την ηρεμία των HSCs

Για την αξιολόγηση της λειτουργίας των HSCs, το κλωνογονικό δυναμικό των LT‐ HSCs εξετάστηκε in vitro. Ταξινομήσαμε τα κύτταρα LT-HSCs σε ένα μέσο με βάση τη μεθυλοκυτταρίνη χρησιμοποιώντας FACS και μετρήσαμε τον αριθμό και το μέγεθος των αποικιών μετά από 14 ημέρες. Σε σύγκριση με τον αριθμό και το μέγεθος των αποικιών που παράγονται από κύτταρα από ποντίκια στην ομάδα ελέγχου, τα κύτταρα από ποντίκια στην ομάδα R. glutinosa εμφάνισαν αύξηση στον αριθμό των αποικιών, ειδικά για το μικρό μέγεθος (P=0.0241 ) και κλώνου μεγάλου μεγέθους (Ρ=0.0418), ενώ δεν υπήρχε διαφορά στον αριθμό από ποντίκια στην ομάδα A. membranaceus (Εικόνα 3). Το αυξημένο μέγεθος και αριθμός αποικιών στην ομάδα R. glutinosa υποδηλώνει ότι αυτό το βότανο ενισχύει τη δυνατότητα αυτοανανέωσης των LT-HSCs.

Τα περισσότερα HSC σε ενήλικα ποντίκια παραμένουν σε ησυχία· επομένως, η διατήρηση της κυτταρικής ηρεμίας είναι ένας ουσιαστικός μηχανισμός για την αυτοανανέωση των βλαστοκυττάρων.20,21 Οι παρατηρούμενες μειώσεις στα HSC υποδηλώνουν μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων στο R. glutinosa και Α. membranaceus ομάδες; Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την κατάσταση του κυτταρικού κύκλου των HSC μέσω ανάλυσης του πολλαπλασιαστικού κυτταρικού δείκτη Ki-67 σε συνδυασμό με τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε DNA 7‐AAD στον πληθυσμό LSK. Παρατηρήσαμε αυξημένο αριθμό κυττάρων LSK στη φάση G0 στις ομάδες R. glutinosa και A. membranaceus σε σύγκριση με αυτόν στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 4Α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα R. glutinosa και A. membranaceus διατήρησαν την ηρεμία των HSCs.

Η ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα LSK αποκάλυψε ότι τα p18, p19 και p57 έπαιξαν κρίσιμους ρόλους στη διατήρηση της ηρεμίας του HSC.22-24 Δεν παρατηρήθηκαν προφανείς αλλαγές για τα p57 και p19 (Εικόνα 4C‐HSC). D), και η ρ18 ρυθμίστηκε προς τα πάνω στην ομάδα R. glutinosa σε σύγκριση με αυτήν στην ομάδα ελέγχου και ελαφρώς ρυθμίστηκε προς τα πάνω στην ομάδα A. membranaceus (Εικόνα 4Β).

ΣΧΗΜΑ 2 Τα Rehmannia glutinosa και Astragalus membranaceus επηρέασαν τον αριθμό των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων/προγονικών κυττάρων. Ποντίκια (ηλικίας

20 μήνες) τράφηκαν με δίαιτες συμπληρωμένες με R. glutinosa ή A. membranaceus (200 mg/ημέρα) για 10 μήνες (n=5/ομάδα). η ομάδα ελέγχου τράφηκε με τυπική δίαιτα. Πρόσφατα απομονωμένα κύτταρα μυελού των οστών (ΒΜ) χρωματίστηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Α, Αντιπροσωπευτικά προφίλ χρώσης πληθυσμών αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων και προγονικών κυττάρων ΒΜ. Β, Το ποσοστό των κυττάρων Lin–Sca1 συν c‐kit– (LSKs) σε κύτταρα BM. C‐ I, Αριθμοί κυττάρων (C) μακροπρόθεσμα (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus – , Flt3–); D, βραχυπρόθεσμα (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus plus, Flt3–); Ε, πολυδύναμος πρόγονος (MPP; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐Kit plus, Flt3 plus); F, κοινός μυελοειδής πρόγονος (CMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34 plus, CD16/ CD32–); G, πρόγονος κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34 plus, CD16/CD32 plus); Η, μεγακαρυοκύτταρα-ερυθροειδής πρόγονος (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34–, CD16/CD32–); και εγώ, κοινός λεμφοειδής πρόγονος (CLP; Lin–, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 plus). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. n=5 ποντίκια/ομάδα. *P <0,05, **p=""><>

3.4|Το R. glutinosa καθυστέρησε τη γήρανση των HSCs

Η μακροχρόνια συμπλήρωση διατροφής με R. glutinosa μπορεί να παρατείνει τη διάρκεια ζωής των ποντικών. Η κυτταρική γήρανση αυξάνεται με την ηλικία. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε τη γήρανση του HSC στα γηρασμένα ποντίκια με κυτταρομετρική ανάλυση ροής των HSC που έχουν χρωματιστεί με SA‐gal χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον υπόστρωμα ‐gal (C12FDG).25 Το ποσοστό των θετικών SA‐gal‐ κυττάρων μειώθηκε στην Ομάδα R. glutinosa, υποδεικνύοντας ότι το R. glutinosa καθυστερεί τη γήρανση των κυττάρων LSK (Εικόνα 5Α).

Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη γήρανση του HSC και η απώλεια της ηρεμίας του HSC συσχετίζεται συχνά με αυξημένο κυτταρικό ROS.26 Η ανάλυση του ενδοκυτταρικού ROS σε LSK έδειξε ότι τα επίπεδα ήταν μειωμένα στην ομάδα R. glutinosa σε σύγκριση με εκείνα του μάρτυρα ομάδα (Εικόνα 5Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το R. glutinosa μπορεί να διατηρήσει την ηρεμία του HSC και να ενισχύσει τη λειτουργία του HSC μειώνοντας τα επίπεδα ROS.

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε την έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτταρική γήρανση με ανάλυση RT‐PCR των κυττάρων LSK. Σε συγκριση

ΣΧΗΜΑ 3 Λειτουργία αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ενισχυμένη με διατροφικό συμπλήρωμα Rehmannia glutinosa. In vitro κλωνογονικό δυναμικό μακροχρόνιων ηπατικών αστερικών κυττάρων από ποντίκια (n=3)

με την ομάδα ελέγχου, η έκφραση των πρωτεϊνών p53 και p16 που σχετίζονται με την κυτταρική γήρανση μειώθηκε στην ομάδα R. glutinosa (Εικόνα 5D‐E). Αλλά η έκφραση των p53 και p16 δεν ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα κάτω μεταξύ της ομάδας A. membranaceus και της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 5D‐E). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι αρκετά γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και τη γήρανση των κυττάρων ρυθμίζουν τη λειτουργία των HSC σε ποντίκια που τρέφονται με δίαιτες συμπληρωμένες με R. glutinosa.

3,5|Το R. glutinosa ενίσχυσε την ανοσία των Β-κυττάρων

Τα Β και Τ λεμφοκύτταρα είναι και τα δύο σημαντικά για τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Τα Τ λεμφοκύτταρα παίζουν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική ανοσία και τη ρύθμισή της, ενώ τα Β λεμφοκύτταρα συμμετέχουν κυρίως στη χυμική ανοσία. Ο πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων είναι ο πιο άμεσος δείκτης που αντανακλά την οργανική ανοσία. Για να διερευνηθεί ο ρόλος στην ανοσολογική ενίσχυση, εξετάστηκαν οι επιδράσεις των R. glutinosa και A. membranaceus στον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων.

Τα ποντίκια στην ομάδα R. glutinosa εμφάνισαν μειωμένο αριθμό HSCs και αυξημένο αριθμό CLPs. Η κυτταρομετρική ανάλυση ροής έδειξε αυξημένους αριθμούς ώριμων Β κυττάρων (Β220 συν ) στα PB, BM και σπλήνα ποντικών στην ομάδα R. glutinosa σε σύγκριση με τους αριθμούς που ανιχνεύθηκαν στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 6Α). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον αριθμό των Τ κυττάρων (CD4 συν και CD8 συν), των μονοκυττάρων και των κοκκιοκυττάρων (CD11b συν) μεταξύ των δύο ομάδων (Εικόνα 6Β‐Δ). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το διαιτητικό R. glutinosa ενισχύει την ανοσία των Β-κυττάρων.

ΕΙΚΟΝΑ 4 Τα συμπληρώματα διατροφής των Rehmannia glutinosa και Astragalus membranaceus διατήρησαν την ηρεμία των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. Α, Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Κυτταρομετρική ανάλυση ροής 7-αμινοακτινομυκίνης D (7-AAD) και χρώση Ki-67 κυττάρων Lin-Sca1 plus c-kit- (LSKs). Β, Ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο της ταξινόμησης γονιδιακής έκφρασης κυττάρων LSK. Η GAPDH χρησιμοποιήθηκε για κανονικοποίηση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

ΣΧΗΜΑ 5 Το διαιτητικό συμπλήρωμα Rehmannia glutinosa μείωσε τη γήρανση των ηπατικών αστερικών κυττάρων (HSC). Τα ποντίκια (ηλικίας 20 μηνών) τράφηκαν με δίαιτες συμπληρωμένες με Rehmannia glutinosa ή Astragalus membranaceus (200 mg/ημέρα) για 10 μήνες (n {{4 }}/ομάδα); η ομάδα ελέγχου τράφηκε με τυπική δίαιτα. Α, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής SA‐ ‐gal‐ θετικών κυττάρων Lin–Sca1 plus c‐kit– (LSK) χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον υπόστρωμα ‐γαλακτοσιδάσης (C12FDG). Β, Το ποσοστό των θετικών κυττάρων σε δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε LSKs. Κυτταρομετρική ανάλυση ροής θετικών σε ROS LSK. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση (SD). *P < 0,05,="" ***p="">< 0,001.="" γ,="" το="" πρότυπο="" έκφρασης="" των="" γονιδίων="" που="" σχετίζονται="" με="" τη="" γήρανση="" των="" κυττάρων="" σε="" lsks.="" η="" gapdh="" χρησιμοποιήθηκε="" για="" κανονικοποίηση.="" τα="" δεδομένα="" αντιπροσωπεύουν="" τη="" μέση="" τιμή="" ±="" sd="" τριών="" πειραμάτων.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><>

4|ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον μηχανισμό τουαντιγηραντικές επιδράσειςτου R. glutinosa ή του A. membranaceus συμπληρώνοντας τις δίαιτες των ποντικών με τα βότανα σε δόση 200 mg/ημέρα για 10 μήνες. Το R. glutinosa βρέθηκε να παρουσιάζει αντιγηραντικά αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης γήρανσης και της αυξημένης επιβίωσης των HSCs καθώς και

ενισχυμένη ανοσία των Β-κυττάρων. Όσον αφορά τον μηχανισμό τουαντιγηραντικές επιδράσεις, διαπιστώσαμε ότι το R. glutinosa μείωσε τον αριθμό των HSCs, ενώ η ικανότητα πολλαπλασιασμού αυξήθηκε. Επιπλέον, το R. glutinosa διατήρησε την ηρεμία του HSC και μείωσε τον αριθμό των θετικών κυττάρων SA--gal και των επιπέδων ROS μέσω της ρύθμισης των p18, p53 και p16. Σε συνδυασμό, τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν ότι τοαντιγηραντικές επιδράσειςτου R. glutinosa σε ποντίκια χορηγείται φαρμακευτική αγωγή διατηρώντας την ηρεμία και ενισχύοντας τη λειτουργία των HSCs.

Το Rehmannia glutinosa, το οποίο χρησιμοποιείται ως παραδοσιακό κινέζικο φυτικό φάρμακο για χιλιάδες χρόνια, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της υπογλυκαιμίας σε διάφορες διαβητικές διαταραχές.27,28 Έχει επίσης αναφερθεί ότι το εκχύλισμα R. glutinosa ενισχύει τον μεταβολισμό των οστών.29 Επιπλέον, Το R. glutinosa αναστέλλει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις και τα σύνδρομα,30,31 και προστατεύει από την κυτταρική βλάβη με τον καθαρισμό των ελεύθερων ριζών.14,32 Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τα ποντίκια συμπληρώματα διατροφής με R. glutinosaαντιγηραντικές επιδράσειςκαι ενίσχυσε την ανοσία των Β-κυττάρων αυξάνοντας την πολλαπλασιαστική ικανότητα των LT-HSCs και μειώνοντας τον αριθμό των SA-gal-θετικών κυττάρων και των επιπέδων ROS.

Ο βαθμός της οξειδωτικής βλάβης έχει βρεθεί ότι αυξάνεται με την ηλικία σε μια ποικιλία κυττάρων και ιστών. Το οξειδωτικό στρες είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας της αυτοανανέωσης του HSC. Η απώλεια της ηρεμίας του LT-HSC συσχετίζεται συχνά με αυξημένο κυτταρικό ROS, το οποίο σχετίζεται αρνητικά με την αυτοανανέωση των HSC.26 Το Catalpol είναι ένας ιριδοειδής γλυκοζίτης, ο οποίος έχει βρεθεί στη ρίζα του R. glutinosa. Η Catalpol έδειξε αναστολή του οξειδωτικού στρες, της βλάβης του DNA και της βράχυνσης των τελομερών μέσω της οδού PGC-1 /TERT σε μια προηγούμενη μελέτη.33 Στη μελέτη μας, το επίπεδο του ROS μειώθηκε στα κύτταρα LSK από την ομάδα R. glutinosa σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Έτσι το R. glutinosa παρατείνει την επιβίωση των ποντικών αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες στα HSCs.

ΣΧΗΜΑ 6 Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ποσοστού των ώριμων ανοσοκυττάρων στο περιφερικό αίμα (PB), τον μυελό των οστών (BM), τον σπλήνα και τον θύμο. Τα ποντίκια (ηλικίας 20 μηνών) τράφηκαν με δίαιτες συμπληρωμένες με Rehmannia glutinosa ή Astragalus membranaceus (200 mg/ημέρα) για 10 μήνες (n=5/ομάδα). η ομάδα ελέγχου τράφηκε με τυπική δίαιτα. Α, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ποσοστού των Β κυττάρων (Β220 συν ) σε PB, BM και σπλήνα. Β, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ποσοστού μονοκυττάρων και κοκκιοκυττάρων (CD11b συν ) σε PB και BM. C και D, κυτταρομετρική ανάλυση ροής του ποσοστού των κυττάρων CD4 plus και CD8 plus σε PB, σπλήνα και θύμο αδένα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. *P <>

Το Astragalus membranaceus χρησιμοποιείται επίσης στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική για την προώθηση της ανοσίας, τη μείωση του σακχάρου στο αίμα και την προώθηση της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων.αντιοξείδωσηκαιαντι γήρανσηιδιότητες. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η λήψη συμπληρωμάτων διατροφής με A. memranaceus για 10 μήνες δεν είχε εμφανή αποτελέσματα σε σύγκριση με αυτά που παρατηρήθηκαν στα ποντίκια ελέγχου, ενώ το βάρος των ποντικών μειώθηκε στους 20 μήνες. Επομένως, το A. membranaceus μπορεί να είναι ακατάλληλο για θεραπεία με LT σε ποντίκια που ταΐστηκαν.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το R. glutinosa μπορεί να παρατείνει τη διάρκεια ζωής των ποντικών διατηρώντας την ηρεμία και ενισχύοντας τη λειτουργία των HSCs. Επιπλέον, το R. glutinosa μπορεί να μειώσει τα διακυτταρικά επίπεδα του ROS και τον αριθμό των θετικών κυττάρων SA--gal και να ενισχύσει την ανοσία των Β-κυττάρων.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών για την Κίνα (31672374), το CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016‐ 12M‐ 1‐012) και το Ταμείο Νέων PUMC (2017310018).

ΣΥΓΚΡΟΥΣΕΙΣ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ

Κανένας.

ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΕΣ ΣΥΓΓΡΑΦΕΩΝ

Όλοι οι συγγραφείς που αναφέρονται στη λίστα πληρούν τις προϋποθέσεις για τη συγγραφή. Οι CQ και LFZ συνέλαβαν και σχεδίασαν τα πειράματα. Ο LB πραγματοποίησε τα πειράματα και έγραψε το κύριο χειρόγραφο τεστ. Το GYS πραγματοποίησε και ανέλυσε τα δεδομένα του FACS. Το YJY σχεδίασε το πείραμα σχετικά με την κινεζική παραδοσιακή ιατρική. Το WC διαχειρίστηκε τα ποντίκια. Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και εγκρίνει το χειρόγραφο.