Η ραπαμυκίνη τροποποιεί εναλλακτικά τη μιτοχονδριακή δυναμική στα δενδριτικά κύτταρα για να μειώσει τον τραυματισμό ισχαιμικής επαναιμάτωσης των νεφρών
Feb 22, 2022
Αφηρημένη:Τα δενδριτικά κύτταρα (DC) είναι μοναδικά ανοσοκύτταρα που μπορούν να συνδέσουν έμφυτες και προσαρμοστικές ανοσοαποκρίσεις και ο ανοσομεταβολισμός επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τον φαινότυπο τους. Η ραπαμυκίνη είναι μια μακρολιδική ένωση που έχει ανοσοκατασταλτικές λειτουργίες και χρησιμοποιείται για την πρόληψη της απώλειας μοσχεύματος στη μεταμόσχευση νεφρού. Η τρέχουσα μελέτη αξιολόγησε το θεραπευτικό δυναμικό των DC που έλαβαν ex-vivo ραπαμυκίνη για προστασίανεφράσε ένα μοντέλο ποντικιού της οξείαςνεφρική βλάβη (ΑΚΙ). Για την μονή θεραπεία με ραπαμυκίνη (S) (Rapa-S-DC), τα Veh-DC υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη (10 ng/mL) για 1 ώρα πριν από το LPS. Αντίθετα, η πολλαπλή θεραπεία με ραπαμυκίνη (Μ) (Rapa-M-DC) εκτέθηκε σε 3 θεραπείες για 7 ημέρες. Μόνο πολλαπλές ex-vivo θεραπείες ραπαμυκίνης DCs προκάλεσαν έναν επίμονο επαναπρογραμματισμό του μιτοχονδριακού μεταβολισμού. Αυτά τα DC είχαν 18-πλάσια περισσότερα μιτοχόνδρια, είχαν σχεδόν 4-πλάσια ποσοστά κατανάλωσης οξυγόνου και παρήγαγαν περισσότερο ATP σε σύγκριση με τα Veh-DCs (DCs ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με Veh). Η ανάλυση οδού έδειξε ότι η σηματοδότηση της IL10 είναι η κύρια οδός που συμβάλλει στον αλλοιωμένο ανοσοφαινότυπο μετά τη θεραπεία με Rapamycin σε σύγκριση με φορέα με σημαντικά χαμηλότερες κυτοκίνες Tnfa, Il1b και Il6, ενώ οι ρυθμιστές του μιτοχονδριακού περιεχομένου Pgc1a, Tfam και Ho1 παρέμειναν αυξημένοι. Ουσιαστικά, η θετική μεταφορά DC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη σε λήπτες WT 24 ώρες πριν από διμερείςνεφρόη ισχαιμία προστάτευε σημαντικά τηννεφράαπό τραυματισμό με σημαντική 3-πλάσια βελτίωσηνεφρική λειτουργία. Τέλος, η έγχυση DCs που περιείχαν υψηλότερους αριθμούς μιτοχονδρίων (που υποβλήθηκαν σε θεραπεία ex-vivo με υγιή απομονωμένα μιτοχόνδρια (10 μg/mL) μία ημέρα πριν) προστάτευε επίσης εν μέρει τονεφράαπό το IRI. Αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν ότι η προληπτική έγχυση ex-vivo επαναπρογραμματισμένων DC που έχουν υψηλότερη περιεκτικότητα σε μιτοχόνδρια έχει θεραπευτική ικανότητα να επάγει έναν αντιφλεγμονώδη ρυθμιστικό φαινότυπο για προστασίανεφράαπό τραυματισμό.
Λέξεις-κλειδιά:δενδριτικό κύτταρο; ραπαμυκίνη; μιτοχόνδρια; οξεία νεφρική βλάβη? κάκωση ισχαιμικής επαναιμάτωσης
ΕισαγωγήΗ παθοβιολογία της οξείαςνεφρική βλάβηείναι πολυπαραγοντικό και περιλαμβάνει περίπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύνεφρώνπαρεγχυματικά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού [1,2]. Στονεφρό,Τα συμβατικά δενδριτικά κύτταρα (DCs) είναι το κύριο υποσύνολο ανοσοκυττάρων και βρίσκονται στενά στον διάμεσο χώρο σε όλο τονεφρό[3–5]. Τα DCs είναι ένας από τους κύριους τύπους κυττάρων που εμπλέκονται στην έμφυτη ανοσία και είναι απαραίτητα για την παροχή προστασίας έναντι των παθογόνων. Η προηγουμένως δημοσιευμένη εργασία μας χρησιμοποιώντας DC που προέρχονται από μυελό των οστών έχει δείξει ότι η θεραπεία με DCs μπορεί να ρυθμίσει διάφορες έμφυτες και προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις που σχετίζονται με το AKI [6,7].
Τα DCs εντοπίζονται εκτενώς σε όλους τους ιστούς, με ένα υποσύνολο DCs (CD11c συν DCs) που κατοικούν στονεφρώνπαρέγχυμα. Ωστόσο, αυτά τα CD11c συν DC παίζουν επίσης παθογόνο ρόλο στην επιδείνωσηνεφρική βλάβημετά από τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (IRI) [8]. Το IRI ορίζεται ως τραυματισμός που προκύπτει από την επανεισαγωγή οξυγονωμένου αίματος σε ένα όργανο μετά από μια περίοδο ισχαιμίας και εμφανίζεται συχνά σε έμφραγμα του μυοκαρδίου, εγκεφαλικό επεισόδιο και μεταμόσχευση συμπαγών οργάνων. Σε απόκριση στο IRI, τα CD11c συν DCs αποτελούν ένα σημαντικό μέρος της διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων σενεφρώνιστός.
Τα DCs είναι ικανά να αναγνωρίζουν μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με παθογόνα (PAMPs) μέσω διαφόρων υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων που βρίσκονται στην επιφάνεια των DCs, όπως οι υποδοχείς τύπου toll (TLRs) και οι υποδοχείς τύπου NOD. Η δέσμευση των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (PRRs) με τα ειδικά τους PAMP έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση πολλών οδών, οι οποίες περιλαμβάνουν προφλεγμονώδεις αποκρίσεις, σύνθεση αντιμικροβιακών πεπτιδίων και επαγωγή προσαρμοστικής ανοσίας που προκαλείται από λεμφοκύτταρα [9]. Σημαντική έρευνα έχει αφιερωθεί στη μελέτη των αλλαγών στην κυτταρική βιοενέργεια των DCs κατά την ενεργοποίηση από τα PAMP. Έχει διαπιστωθεί ότι η ενεργοποίηση των DCs με λιποπολυσακχαρίτη (LPS, ένα PAMP διακριτό από τα gramαρνητικά βακτήρια), μέσω της δέσμευσης στον ειδικό του υποδοχέα TLR4 οδηγεί σε μεταβολική αλλαγή από εξαιρετικά αποτελεσματική οξειδωτική φωσφορυλίωση σε μια διαδικασία πολύ παρόμοια με τον μεταβολισμό Warburg ή αερόβια γλυκόζη . Ο μεταβολισμός του Warburg χαρακτηρίζεται από την εκτροπή του πυροσταφυλικού που παράγεται από τη γλυκόλυση προς τη μετατροπή σε γαλακτικό για παραγωγή ενέργειας και μακριά από τη μεταφορά στα μιτοχόνδρια για να υποστεί καταβολισμό μέσω του κύκλου TCA, παρά την επαρκή διαθεσιμότητα οξυγόνου. Μια εξήγηση για αυτό το φαινόμενο περιλαμβάνει μια από τις πολλές κατάντη επιδράσεις της ενεργοποίησης του TLR4, που είναι η αυξημένη δραστηριότητα της κινάσης σερίνης/θρεονίνης, ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR). Η αναστολή του mTOR από τη ραπαμυκίνη διατηρεί τη μιτοχονδριακή λειτουργία σε ενεργοποιημένα DCs με μείωση του iNOS, με τα DC που έχουν υποστεί αγωγή με ραπαμυκίνη που διεγείρονται παρουσία LPS που παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα αερόβιας γλυκόλυσης [10]. Οι αναστολείς mTORC1 όπως η ραπαμυκίνη χρησιμοποιούνται επί του παρόντος στη μεταμόσχευση στερεών οργάνων ως πιθανή εναλλακτική λύση για τους αναστολείς καλσινευρίνης για την αποφυγή χρόνιαςνεφρώνβλάβη αλλομοσχεύματος καθώς έχει επίσης τη δυνατότητα να επεκταθεί CD4 συν CD25 συν ρυθμιστικά Τ-κύτταρα [11,12]. Ωστόσο, η χρήση ραπαμυκίνης στη μεταμόσχευση μπορεί να οδηγήσει σε φλεγμονώδεις επιπλοκές που περιλαμβάνουν περιφερικό οίδημα, αύξηση κρεατινίνης και θρομβοπενία. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ανεπιθύμητες ενέργειες των υποξικών ερεθισμάτων ενισχύονται από την έκθεση στο LPS και εξασθενούν από τη ραπαμυκίνη [8,13].
Ο στόχος είναι να αναπτυχθούν μέθοδοι για τη χρήση εγκεκριμένων από τον FDA φαρμάκων κλινικής ποιότητας, όπως η ραπαμυκίνη, για την πρόκληση ρυθμιστικών DCs που μπορούν να ελέγξουν τις ανεπιθύμητες εγγενείς και προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί ο δυνητικός προστατευτικός μηχανισμός(οι) των διεγερμένων με ραπαμυκίνη BMDCs σε ένα προκλινικό μοντέλο ποντικούνεφρόIRI. Η θεραπεία των BMDCs ex-vivo με ραπαμυκίνη αποφεύγει τυχόν ανεπιθύμητες ενέργειες εκτός στόχου και φλεγμονώδεις επιπλοκές που σχετίζονται με συστηματικές ενέσεις φαρμάκων. Η βέλτιστη δόση και ο χρόνος των περισσότερων φαρμακολογικών ενώσεων ή φαρμάκων εξαρτώνται από διάφορες παραμέτρους. Στα καρκινικά κύτταρα, η χαμηλή δόση ραπαμυκίνης σε σύγκριση με την υψηλή δόση αναστέλλει διαφορικά τα mTORC1 και mTORC2 με αποτέλεσμα είτε μερική είτε πλήρη αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου [14]. Για όλες τις ex-vivo μελέτες προετοιμασίας των BMDCs στο τρέχον χειρόγραφο, επιλέξαμε τη χαμηλή δόση των 10 ng/mL ραπαμυκίνης με βάση προηγούμενες μελέτες με ανεκτικά BMDCs [15,16]. Ο χρονισμός του πόσες δόσεις (τρεις ή μία) βασίστηκε στην προηγουμένως δημοσιευμένη εργασία μας με πολλαπλασιαστικά BMDC ποντικών και προστέθηκε με GMCSF [17,18]. Τα τρέχοντα δεδομένα μας καταδεικνύουν ότι τόσο η απλή όσο και η πολλαπλή θεραπεία(εις) των DCs με ραπαμυκίνη επάγουν λιγότερο ισχυρές ανοσογονικές αποκρίσεις (χαμηλότερες κυτοκίνες και συν-διεγερτικά μόρια) μετά από διέγερση LPS. Η μεταφορά είτε μεμονωμένων είτε πολλαπλών DC που έχουν υποστεί αγωγή με ραπαμυκίνη προστατεύει εξίσουνεφράαπό IRI σε συγγενικά (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 ποντίκια) ή αλλογενή (BALB/c BMDC→C57BL/6 ποντίκια) μοντέλα IRI. Ωστόσο, η πολλαπλή ex-vivo θεραπεία με ραπαμυκίνη (3 θεραπείες σε 7 ημέρες), εκτός από τη μείωση των ανοσογονικών αποκρίσεων, αύξησε επίσης τον αριθμό και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων (Seahorse Analyzer) σε σύγκριση με τα DC που έλαβαν θεραπεία με όχημα. Αυτές οι πειραματικές παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι τα DC με υψηλότερο αριθμό μιτοχονδρίων έχουν τη δυνατότητα να γίνουν ρυθμιστικά και η μεταφορά αυτών των DCs μπορεί να προστατεύσεινεφράαπό ισχαιμικό τραυματισμό. Όπως έδειξε η πρόσφατη μελέτη μας που χρησιμοποιεί DCs που έχουν υποστεί αγωγή με FTY720 [18], φαρμακολογικές ή μιτοχονδριακές μεταμοσχεύσεις που επάγουν υψηλότερο αριθμό μιτοχονδρίων σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (DCs ή μακροφάγα) προκαλούν επίσης σε αυτά τα κύτταρα έναν αντιφλεγμονώδη φαινότυπο, μια επίδραση που πιθανώς οφείλεται στη διατήρηση των μιτοχονδρίων οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS) και με μειωμένη μετάβαση σε γλυκόλυση για ενέργεια μετά τη διέγερση. Για αυτά τα αποτελέσματα, αυξήσαμε εξωγενώς τους αριθμούς μιτοχονδρίων στα DC για να ελέγξουμε εάν υψηλότεροι αριθμοί μιτοχονδρίων μπορούν να επάγουν έναν ρυθμιστικό φαινότυπο χρησιμοποιώντας μιτοχονδριακά μοσχεύματα. Η μεταφορά αυτών των Mito-DC προστατεύεταινεφράαπό το IRI? Ωστόσο, σε αντίθεση με τα Rapa-DC, αυτά τα Mito-DC δεν έχουν μειωμένες ανοσογονικές αποκρίσεις (MHCII, συν-διεγερτικά μόρια και κυτοκίνες) μετά από διέγερση LPS, πιθανώς υποδηλώνοντας ότι η αύξηση του αριθμού αντιγράφων των μιτοχονδρίων μπορεί να παρακάμψει τις λειτουργικές αλλαγές που προκαλούνται από εξωγενή διέγερση LPS. Σε αυτή τη μελέτη και όπως αποδείχθηκε προηγουμένως [6,7,18], τα συστηματικά εγχυόμενα DCs (με αγωγή με όχημα, ραπαμυκίνη ή μιτοχόνδρια) σε δόση μισού εκατομμυρίου βρίσκονται κυρίως μόνο στον σπλήνα και ανευρίσκεται ελάχιστο έως καθόλου σήμα στονεφρά. Σε σπλήνα όπως τα FTY720-DCs, τα πλούσια σε ραπαμυκίνη και μιτοχόνδρια DCs μπορεί να προκαλέσουν μια αντιφλεγμονώδη απόκριση με αποτέλεσμα την προστασία απόνεφρόIRI. Αυτά τα σπερματικά ευρήματα παρέχουν νέα στοιχεία που υποδηλώνουν ότι η αύξηση του αριθμού των μιτοχονδρίων (εξωγενώς μέσω μιτοχονδριακών μοσχευμάτων ή μέσω φαρμακολογικής παρέμβασης (FTY720 ή ραπαμυκίνη) στα ανοσοκύτταρα μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική μέθοδος για να ρυθμίσει τελικά τις ανοσολογικές τους αποκρίσεις για την πρόληψη και/ή την έγκαιρη θεραπείατραυματισμό των νεφρών.
Υλικά και μέθοδοι
ΠοντίκιαΌλες οι διαδικασίες και ο χειρισμός των ζώων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον Οδηγό Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου και ο αριθμός πρωτοκόλλου Bajwa UTHSC, 18-080, ημερομηνία έγκρισης 28/09/2018 εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο Επιτροπές Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Tennessee Health Science Center (UTHSC). Οι πολιτικές για τη φροντίδα των εργαστηριακών ζώων ακολουθούν την Πολιτική της Δημόσιας Υπηρεσίας Υγείας για την Ανθρωπιστική Φροντίδα και τη Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Όλα τα αποτελέσματα αναφέρονται με τρόπο που συνάδει με τις οδηγίες του ARRIVE [19]. Για όλες τις μελέτες μεταφοράς ποντίκια C57BL/6J και BALB/c αγοράστηκαν από το The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ΜΕ, ΗΠΑ). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε τυπικό περίβλημα vivarium με κύκλο φωτός/σκότους 12- ωρών σε δίαιτα τροφής και το νερό ήταν ελεύθερα διαθέσιμο.
Νεφρική Ισχαιμία-Επαναιμάτωση Όλες οι λεπτομερείς χειρουργικές επεμβάσεις ακολουθήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18]. Αρσενικά ποντίκια C57BL/6 (ηλικίας 8-12 εβδομάδων) υποβλήθηκαν σε 26-λεπτά αμφοτερόπλευρη ισχαιμία ακολουθούμενη από επαναιμάτωση 20-24 ωρών. Εν συντομία, όλα τα αρσενικά ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή (IP) ένεση μείγματος κεταμίνης και ξυλαζίνης, με υποδόρια ένεση βουπρενορφίνης και τοποθετήθηκαν σε ένα ζεστό επίθεμα για να διατηρηθεί η θερμοκρασία του σώματος στους 34,5-36 ◦C. Τα ποντίκια στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν στην κατάσταση εικονικής επέμβασης ή IRI. Πραγματοποιήθηκε αμφοτερόπλευρη πλαγιοκοπτική τομή. Η θερμοκρασία του σώματος ελέγχθηκε και διατηρήθηκε σε όλη την ισχαιμική περίοδο. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε σαμπουάν υποβλήθηκαν στην ίδια διαδικασία εκτός από τη σύσφιξη των αγγείων και το κλείσιμο των χειρουργικών πληγών. Ποντίκια που είχαν ένανεφρόχωρίς επαναιμάτωση 24 ώρες μετά την ισχαιμία αποκλείστηκαν από όλες τις αναλύσεις.
Αξιολόγηση Λειτουργίας Νεφρού και ΙστολογίαΤο αίμα συλλέχθηκε υπό αναισθησία από τον οπισθοκογχικό κόλπο και η κρεατινίνη του πλάσματος (mg/dL) προσδιορίστηκε με χρήση ενζυματικής μεθόδου με μικρές τροποποιήσεις από το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Diazyme Laboratories, Poway, CA, ΗΠΑ) και άζωτο ούρων αίματος (BUN ) και η μέτρηση κρεατινίνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18,20]. Για την ιστολογία,νεφράσταθεροποιήθηκαν όλη τη νύχτα σε 4 τοις εκατό PLP ή 10 τοις εκατό φορμαλίνη και ενσωματώθηκαν σε παραφιφίνη.Νεφράπροετοιμάστηκαν για χρώση H&E όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] και ελήφθησαν φωτογραφίες με ρύθμιση φωτεινότητας/αντίθεσης που έγινε με το μικροσκόπιο EVOS (Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βαθμολογίας σωληναριακής βλάβης, οι τομές αξιολογήθηκαν μετρώντας το ποσοστό των σωληναρίων που εμφάνιζαν κυτταρική νέκρωση, απώλεια περιγράμματος βούρτσας, σχηματισμό γύψου και διαστολή σωληναρίων ως εξής: 0=φυσιολογικό. 1=Λιγότερο ή ίσο με 10 τοις εκατό ; 2=10 έως 25 τοις εκατό ; 3=26 έως 50 τοις εκατό ; 4=51 έως 75 τοις εκατό ; 5=Μεγαλύτερο ή ίσο με 75 τοις εκατό . Πέντε έως 10 πεδία από κάθε εξωτερικό μυελό αξιολογήθηκαν και βαθμολογήθηκαν με τυφλό τρόπο. Η ιστολογική αλλαγή εκφράστηκε ως οξεία σωληναριακή νέκρωση (ATN), που βαθμολογήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7,21]. Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με ανάλυση TUNEL (In Situ Cell Death Detection kit, TMR Red; Roche, Basel, Switzerland) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Καλλιέργεια μυελού των οστών (BM)-Προερχόμενα από δενδριτικά κύτταρα (DC) και υιοθεσίαΑρσενικά ποντίκια C57BL/6J ή BALB/c WT ηλικίας 8–1{12}} εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία DCs από ολόκληρες πρόδρομες ουσίες BM [22]. Πλούσιο σε GMCSF υπερκείμενο προήλθε από κύτταρα J558L σταθερά επιμολυνθέντα με GMCSF ποντικού. Η κυτταρική σειρά ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Δρ. Ira Mellman (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Yale, New Haven, CT, ΗΠΑ). Εν συντομία, πρόσφατα απομονωμένο BM καλλιεργήθηκε με 6 ng/mL ανασυνδυασμένου GMCSF ποντικού (σύνολο 3 θεραπειών) για 8 ημέρες σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Η βέλτιστη δόση των 10 ng/mL ραπαμυκίνης αποφασίστηκε μετά από δοκιμή διαφόρων δόσεων (0,1–10 ng/mL). Τα BMDC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 ng/mL ραπαμυκίνης (Sigma, St. Louis, MO, ΗΠΑ) για συνολικά τρεις θεραπείες ή 1-ολονύκτια θεραπεία). Τα BMDC υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον λιποπολυσακχαρίτη αγωνιστή TLR4 (LPS, ορότυπος Escherichia coli 0111:B4: 100 ng/mL, Sigma-Aldrich). ή φορέα (1 × PBS) για 24 ώρες σε μέσο καλλιέργειας για συγγενείς μελέτες (ποντίκια C57BL/6J BMDCs→ C57BL/6J) και αφέθηκαν χωρίς θεραπεία για αλλογονικές μελέτες (ποντίκια BALB/c BMDCs→ C57BL/6J). Τα κύτταρα πλύθηκαν και 0,5 × 106 κύτταρα ανά ποντικό εγχύθηκαν ενδοφλεβίως (iv) σε αφελείς ποντικούς 1 ημέρα πριν από αμφίπλευρηνεφρόIRI. Τα BMDC επισημάνθηκαν με MitoTracker CMXRos Red ή MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 λεπτά @ 37◦C, Invitrogen) ή Mitosox (5 μΜ, 10 λεπτά @ 37◦C, Invitrogen).
Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνοΤο σχετικό επίπεδο έκφρασης του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, απομονώθηκε το συνολικό γονιδιωματικό DNA και χρησιμοποιήθηκαν ίσες ποσότητες (5 ng) για RTPCR χρησιμοποιώντας ND1 ως υποκατάστατους εκκινητές για mtDNA και HK2 εκκινητές για πυρηνικό DNA (nDNA) για ποντίκι και ND6 για ανθρώπινο mtDNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23,24]. Το ολικό RNA απομονώθηκε και αντιστράφηκε μεταγράφηκε σε cDNA και πραγματοποιήθηκε RT-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7,25,26].
Απομόνωση και ποσοτικοποίηση μιτοχονδρίωνΤα μιτοχόνδρια απομονώθηκαν από κύτταρα HEK293 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, πλάκες 60 cm κυττάρων HEK293 συλλέχθηκαν με προσθήκη 5 mL ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης (300 mmol/L σακχαρόζη, 10 mmol/L HEPES-KOH, 1 mmol/L EGTA-KOH, ρΗ 7,4) με 1 mg πρωτεάσης σουμπτιλισίνης Α από Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Ένα λεπτομερές πρωτόκολλο για την απομόνωση των μιτοχονδρίων μπορεί να βρεθεί στο προηγούμενο δημοσιευμένο χειρόγραφό μας [18].
2 Βιοαναλυτής Seahorse FluxΤα BMDC ηλικίας επτά ημερών μεταφέρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού 24-πηγαδιού Seahorse και μετρήθηκε ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) και οι παράμετροι υπολογίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] με την ακόλουθη τροποποίηση. Μετά τη μέτρηση του βασικού αναπνευστικού ρυθμού, αναστολείς ολιγομυκίνης (Sigma, 2 μΜ), FCCP (Sigma, 1,5 μΜ, καρβονυλοκυανιδίου 4- (τριφθορομεθοξυ)-φαινυλυδραζόνη (FCCP)) και αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων (σύμπλεγμα I και III), ροτενόνη (Sigma; 0.5 μΜ) και αντιμυκίνη Α (Sigma; 0.5 μΜ)) εγχύθηκαν διαδοχικά κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας. Η βασική μιτοχονδριακή αναπνοή, η συνδεδεμένη με ATP αναπνοή, η διαρροή υπέρ τόνου (κατανάλωση οξυγόνου που δεν συνδέεται με ATP), η μέγιστη αναπνοή, η μη μιτοχονδριακή αναπνοή, η εφεδρική αναπνευστική ικανότητα, ο λόγος αναπνευστικού ελέγχου και η αποτελεσματικότητα σύζευξης προσδιορίστηκαν σε ολόκληρα κύτταρα σύμφωνα με τους Brand et al. . [27]; N=4–5 φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε πειραματική ομάδα και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.
Κυτταρομετρική Ανάλυση ροής, Western Blot και ELISAΗ απόκτηση δεδομένων κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) με Cytek {0}}αναβάθμιση κυτταρομετρίας ροής χρώματος (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό FlowJo 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, USA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6,7,28]. Για ELISA μέσα συλλέχθηκαν από BMDC 24 ώρες μετά την επεξεργασία με 100 ng/mL LPS. Τα επίπεδα TNF, IL6 ή IL10 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA ποντικιού (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Το Veh- ή Mito-DC που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με και χωρίς LPS για 6 ή 24 ώρες χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση ολικής πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό λύσης RIPA συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης (Thermo Fisher Scientifific, Vernon Hills, IL, USA). Για το προϊόν λύσης GAPDH τα υπερκείμενα είτε βράστηκαν (10 λεπτά στους 100 ◦C) και τα λύματα αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά για κοκτέιλ OXPHOS τρωκτικών (Abcam, Cambridge, MA, ΗΠΑ) [18]. Οι πιο λεπτομερείς μέθοδοι έχουν περιγραφεί προηγουμένως [18].
Δεδομένα και Στατιστική ΑνάλυσηΤο GraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση και την παρουσίαση των δεδομένων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν, μετά από μετασχηματισμό, εάν χρειαζόταν για τη δημιουργία μιας κανονικής κατανομής, με 2-τεστ ουράς t ή 1-way ANOVA με εκ των υστέρων ανάλυση ανάλογα με την περίπτωση. Χρησιμοποιήθηκε μη ζευγαρωμένο t τεστ δύο ουρών για ανάλυση δύο ομάδων. p Λιγότερο ή ίσο με 0.05 χρησιμοποιήθηκε για να υποδείξει τη σημασία.
Αποτελέσματα
Οι πολλαπλές θεραπείες με ραπαμυκίνη (Rapa-M) προκαλούν υψηλότερους αριθμούς μιτοχονδρίων και λιγότερα ανοσογόνα DCsC57BL/6 WT DC απομονώθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν για 8 ημέρες παρουσία GMCSF και φορέα (1Χ PBS) ή ραπαμυκίνης (10 ng/mL), συνολικά τρεις αγωγές. Τα DC υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 ng/mL LPS όλη τη νύχτα. Τα κατεργασμένα με LPS DCs χρησιμοποιήθηκαν για το RNASeq ή επισημάνθηκαν με διάφορες μιτοχονδριακές βαφές. Τα δεδομένα RNASeq επιβεβαίωσαν προηγούμενα δεδομένα ότι η θεραπεία με ραπαμυκίνη επάγει λιγότερα ανοσογόνα DCs με χαμηλότερες προφλεγμονώδεις κυτοκίνες που ρυθμίζουν τις εγγενείς και προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις με την IL10 ως την κύρια μεταβαλλόμενη οδό (Συμπληρωματικό Υλικό Εικόνα S1A,B και Πίνακας S1). Σε σύγκριση με τη θεραπεία με όχημα, η θεραπεία με ραπαμυκίνη αύξησε το μιτοχονδριακό περιεχόμενο σε BMDC (Εικόνα 1Α) όπως ελέγχθηκε με το MitoTracker CMXRos Red (50 nM) με και χωρίς LPS. Ομοίως, υπήρξε σημαντικά υψηλότερη επισήμανση με MitoTracker Deep Red (100 nM) και σημαντικά χαμηλότερη επισήμανση με MitoSox (5 μΜ) και μετά από ολονύκτια διέγερση LPS στο Rapa-M-DC σε σύγκριση με το Veh-DC (Εικόνα 1B,C). Ημι-ποσοτικός προσδιορισμός ιστογραμμάτων MFI για όλες τις μιτοχονδριακές βαφές (Εικόνα 1D). Επιπλέον, τα Veh- και Rapa-M-DCs χρωματίζονταν χρησιμοποιώντας JC{-1 για να ελέγξουν εάν η θεραπεία με Rapamycin άλλαξε το δυναμικό της μεμβράνης των μιτοχονδρίων. Η πολλαπλή θεραπεία με ραπαμυκίνη δεν αλλάζει το δυναμικό της μεμβράνης των μιτοχονδρίων βάσης σε σύγκριση με τα BMDCs ελέγχου που έχουν υποστεί αγωγή με όχημα, όπως φαίνεται από τον ανοσοφθορισμό (Σχήμα Συμπληρωματικού Υλικού Σχήμα S2A) και την κυτταρομετρία ροής (Συμπληρωματικό Υλικό Εικόνα S2B,C).
(Veh) και φέρει ετικέτα (A) MitoTracker CMXRos (50 nM) ή (B) MitoSox (5 μM) ή (C) MitoTracker Deep Red (100 nM) . (D) Ημι-ποσοτικοποιημένη ανάλυση MFI χρωστικών μιτοχονδρίων με επισήμανση δεδομένων κυτταρομετρίας ροής. (Ε) Τα DC σπάρθηκαν σε αναλυτή Seahorse XF-24e, διεγέρθηκαν με και χωρίς LPS για 24 ώρες και προσδιορίστηκε ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) κατά τη διάρκεια διαδοχικών αγωγών με ολιγομυκίνη (1), FCCP (2) και αντιμυκίνη Α/ροτενόνη (3). (ΣΤ) Ποσοτικοποίηση της βασικής παραγωγής OCR και ATP. (Ζ) επίπεδα mRNA των Pgc1a και Tfam σε Veh-DC και Rapa-M-DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng/mL LPS ή αφέθηκαν χωρίς διέγερση για 24 ώρες. (Η) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του MHC II, των συν-διεγερτικών μορίων (CD40/80/86) και της έκφρασης PDL1 προσδιορίστηκε με και χωρίς διέγερση LPS. (Ι) ELISA των IL10, IL6 και TNF από τα Veh-DC και Rapa-M-DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng/mL LPS για 24 ώρες. Επίπεδα (J–L) mRNA των Il10, Tnfa και Il6 σε Veh-DC και Rapa-M-DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng/mL LPS ή αφέθηκαν χωρίς διέγερση για 24 ώρες. * p Μικρότερο ή ίσο με 0,05, ** p Μικρότερο ή ίσο με 0,01 και *** p Μικρότερο ή ίσο με 0,001, μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη μετα-δοκιμή του Tukey. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM τριπλών.
Η αλλαγμένη μιτοχονδριακή λειτουργία, η βιοενεργειακή ανάλυση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το Seahorse Bioanalyzer. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18], το LPS αμβλύνει την κατανάλωση οξυγόνου σε σύγκριση με τους ελέγχους Veh στα Veh-DCs όπως αναμενόταν (Εικόνα 1Ε, μπλε προς μαύρη γραμμή). Είναι ενδιαφέρον ότι τα rapa-M DC με ή χωρίς LPS έχουν υψηλότερη βασική OCR (Εικόνα 1Ε, πράσινη προς μπλε γραμμή τη στιγμή μηδέν). Το Rapa-M-DC έδειξε αποτυχία να αυξήσει τη μέγιστη αναπνευστική ικανότητα μετά την ένεση FCCP σε μη διεγερμένα κύτταρα που διατηρήθηκε με διέγερση LPS, αποδεικνύοντας ότι η ραπαμυκίνη καταργεί την πλεονάζουσα αναπνευστική ικανότητα, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως η εργασία μας με το FTY-DC [18]. Τα DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LPS είχαν μειωμένη παραγωγή ATP όπως μετρήθηκε με OCR (μπλε προς μαύρο) σε σύγκριση με τα Veh-DC. Το Rapa-M-DC έδειξε σημαντικά μεγαλύτερη παραγωγή ATP σε σύγκριση με το Veh-DC τόσο σε μη διεγερμένα όσο και σε διεγερμένα από LPS DCs (Εικόνα 1ΣΤ). Τα Rapa-M-DCs εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα mRNA για τον ενεργοποιημένο από πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος υποδοχέα γάμμα συν-ενεργοποιητή 1-άλφα (Pgc1a) σε σύγκριση με τα Veh-DCs (Εικόνα 1G) και γονιδιακή έκφραση για το Pgc1a και τον μιτοχονδριακό μεταγραφικό παράγοντα Α (Tfam ) διατηρήθηκαν σε Rapa-M-DC μετά από διέγερση LPS. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο πολλαπλασιασμός των BMDC παρουσία ραπαμυκίνης αύξησε το μιτοχονδριακό περιεχόμενο, τη βασική OCR και την παραγωγή ATP.
Για να ελεγχθεί εάν η ραπαμυκίνη εκτός από την αύξηση του αριθμού και της λειτουργίας των μιτοχονδρίων προκάλεσε επίσης μια αλλαγή στα συν-διεγερτικά μόρια DC μετά τον έλεγχο του LPS. Είναι ενδιαφέρον ότι μετά τη θεραπεία με LPS, το Rapa-M-DC έχει σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης των μορίων παρουσίασης συνδιεγερτικού αντιγόνου (CD80, CD86 και CD40), MHCII και PDL1 σε σύγκριση με το Veh-DC (Εικόνα 1Η, μπλε έναντι κόκκινου). Είναι ενδιαφέρον ότι τα Rapa-M-DCs είχαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης για το PDL1 σε σύγκριση με τα Veh-DCs, αλλά είχαν σημαντική αύξηση στην αναλογία PDL1/CD86 μετά από διέγερση LPS σε σύγκριση με τα Veh-DC που έλαβαν θεραπεία με LPS όπου το PDL1/CD{{ 18}} μειώθηκε (Veh/Veh 0.59 ± 0.03 έναντι Veh/LPS 0.43 ± 0.{{33 }}02, p < 0.001="" και="" rapa/veh="" 0,56="" ±="" 0,001="" έναντι="" rapa/lps="" 0,73="" ±="" 0,02,="" p=""><0,05). δεν="" παρατηρήθηκαν="" σημαντικές="" αλλαγές="" στην="" έκφραση="" του="" cd11c="" μεταξύ="" των="" veh-="" και="" rapa-m-dc,="" αν="" και="" το="" rapa-m-dc="" είχε="" χαμηλότερο="" πλευρικό="" σήμα="" διασποράς="" που="" υποδεικνύει="" το="" μικρότερο="" μέγεθος="" των="" κυττάρων="" μετά="" από="" διέγερση="" lps="" (τα="" δεδομένα="" δεν="" παρουσιάζονται).="" τα="" rapa="" m-dcs="" είχαν="" υψηλότερα="" σχετικά="" επίπεδα="" mtdna/ndna="" σε="" σύγκριση="" με="" τα="" veh-dcs="" (105,7="" ±="" 8,7="" έναντι="" 196,8,9="" ±="" 49,3),="" αποδεικνύοντας="" ότι="" η="" θεραπεία="" με="" ραπαμυκίνη="" αυξάνει="" τους="" αριθμούς="" των="" μιτοχονδρίων="" dc.="" η="" ραπαμυκίνη="" μείωσε="" σημαντικά="" τη="" γονιδιακή="" έκφραση="" των="" συγκεντρώσεων="" il6,="" il10="" και="" tnfa="" και="" πρωτεΐνης="" των="" tnf="" και="" il6="" που="" επάγεται="" από="" lps,="" αλλά="" διατήρησε="" υψηλότερα="" επίπεδα="" il10="" σε="" σύγκριση="" με="" το="" veh-dc="" που="" έλαβε="" θεραπεία="" με="" lps="" (εικόνα="" 1i–l).="" άλλα="" γονίδια="" που="" είναι="" γνωστό="" ότι="" ρυθμίζονται="" από="" τη="" ραπαμυκίνη="" (αυτοφαγία="" ή="" φλεγμονή)="" παρατίθενται="" στον="" συμπληρωματικό="" πίνακα="" υλικού="" s2.="" τα="" γονίδια="" μετά="" το="" lps="" που="" υποδεικνύονται="" με="" πράσινο="" ρυθμίστηκαν="" προς="" τα="" κάτω="" και="" με="" κόκκινο="" ρυθμίστηκαν="" προς="" τα="" πάνω="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" αντίστοιχη="" θεραπεία="">
Η μεταφορά Rapa-M-DC προστατεύει τα νεφρά από ισχαιμική βλάβηΌλα τα DC ενεργοποιήθηκαν με 100 ng/mL LPS πριν από τη μεταφορά σε όλες τις συγγενικές μελέτες (ποντίκια C57BL/6 BMDC→ C57BL/6). Μισό εκατομμύριο DCs εγχύθηκαν 1 ημέρα πριν από 26-λεπτό αμφίπλευρανεφρόIRI. Σχηματικό σχέδιο μελέτης (Εικόνα 2Α). Ως έλεγχος, τα ποντίκια ενέθηκαν με 1 χ PBS ως μάρτυρες χωρίς κύτταρα (NC). Σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με NC και Veh-DC, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Rapa-M-DC προστάτευσαν σημαντικά τηννεφράαπό τραυματισμό, κρεατινίνη πλάσματος (Εικόνα 2Β). Παρόμοιες αλλαγές στο BUN παρατηρήθηκαν σε αυτά τα ποντίκια [Sham 41,30 ± 3,4 έναντι NC 159,75 ± 3,2 έναντι Veh-DC 151,82 ± 1,5 έναντι Rapa-M-DC 114,68 ± 16,3; p < 0,05="" nc="" ή="" veh-dc="" έναντι="" rapa-m-dc].="" μορφολογικές="" αλλαγές="" (εικόνα="" 2γ,δ)="" παράλληλες="" λειτουργικές="" μελέτες.="" τα="" ποντίκια="" που="" έλαβαν="" θεραπεία="" με="" rapa-m-dcs="" έχουν="">νεφρόΕπίπεδα mRNA του Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 έναντι Rapa-M-DC {{2{{{23} }}}.001 ± 0,002], Ngal [Veh-DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-M-DC 0,12 ± 0,09] και Tnfa [Veh-DC 0,19 ± 0,15 έναντι Rapa-M-DC 0,0005 ± 0,0002] σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν Veh-DC. Σε αυτές τις μελέτες, και όπως αποδείχθηκε προηγουμένως [6,7,17,18], τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC σε δόση μισού εκατομμυρίου έχουν συγκρίσιμες αλλαγές στονεφρική λειτουργίακαινεφρόπροφίλ κυτοκίνης. Σε μελέτες συγγενούς μεταφοράς, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Rapa-M-DCs παρουσίασαν μειωμένη απόπτωση (επισήμανση με τη μεσολάβηση της τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης διγοξιγενίνης δεοξυουριδίνης [TUNEL]) σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC (Veh-DC 3,8 ± 1,4 vs M-DC 1.1 ± 0.6· p < 0.05);="" αντιπροσωπευτικές="" εικόνες="" από="" την="" ανάλυση="" tunel="" φαίνονται="" στο="" σχήμα="" s3="" του="" συμπληρωματικού="" υλικού.="" είναι="" ενδιαφέρον="" ότι="" δεν="" υπήρξαν="" σημαντικές="" αλλαγές="" στον="" αριθμό="" των="" διεισδυτικών="" ουδετερόφιλων="" σε="" ποντίκια="" που="" έλαβαν="" θεραπεία="" με="" rapa-m-dc="" σε="" σύγκριση="" με="" το="" veh-dc="" (δεδομένα="" δεν="" παρουσιάζονται),="" γεγονός="" που="" υποδηλώνει="" ότι="" τα="" ποντίκια="" που="" έλαβαν="" θεραπεία="" με="" rapa-m-dc="" μπορεί="" να="" μην="" έχουν="" αλλαγές="" στις="" χημειοκίνες,="" αν="" και="" η="" λειτουργία="" αυτών="" των="" διεισδυτικών="" έμφυτων="" ανοσοκυττάρων="" μπορεί="" να="">
Η εφάπαξ θεραπεία με ραπαμυκίνη (Rapa-S) προκαλεί λιγότερα ανοσογόνα DCs χωρίς αλλαγή της μιτοχονδριακής δυναμικήςΣτη συνέχεια εξετάσαμε εάν μια μεμονωμένη θεραπεία με ραπαμυκίνη ήταν επαρκής για την επαγωγή ενός ρυθμιστικού φαινοτύπου, καθιστώντας έτσι τη σκοπιμότητα πρόκλησης ρυθμιστικού φαινοτύπου DCs πιο κλινικά σχετική. Τα WT DCs απομονώθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν για 8 ημέρες παρουσία GMCSF, συνολικά τρεις θεραπείες. Τα DC ηλικίας επτά ημερών υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ραπαμυκίνη (10 ng/mL) πριν από τη θεραπεία με 100 ng/mL LPS για ολονύκτια επώαση και επισημάνθηκαν την επόμενη ημέρα με MitoTracker CMXRos Κόκκινο (50 nM). Σε σύγκριση με τη θεραπεία με όχημα, η θεραπεία Rapa-S δεν αλλάζει το μιτοχονδριακό περιεχόμενο σε BMDC (Εικόνα 3Α) με και χωρίς LPS. Ομοίως, δεν υπήρξε αλλαγή στην επισήμανση με MitoTracker Deep Red (100 nM) και MitoSox (5 μM) και μετά από ολονύκτια διέγερση LPS στο Rapa-S-DC σε σύγκριση με το Veh-DC (Εικόνα 3Β, Γ). Ημι-ποσοτικοποίηση ιστογραμμάτων MFI για όλες τις μιτοχονδριακές βαφές (Εικόνα 3D). Ομοίως, σε πολλαπλές αναλύσεις θεραπείας, τα Veh- και Rapa-S-DCs χρωματίζονταν χρησιμοποιώντας JC{{2{{{0}} για να ελεγχθεί εάν η μονή θεραπεία με ραπαμυκίνη αλλάζει το δυναμικό της μεμβράνης των μιτοχονδρίων. Η εφάπαξ θεραπεία με ραπαμυκίνη δεν αλλάζει το δυναμικό της μεμβράνης των μιτοχονδρίων βάσης σε σύγκριση με τα BMDCs ελέγχου που έχουν υποστεί αγωγή με όχημα, όπως φαίνεται από τον ανοσοφθορισμό (Σχήμα Συμπληρωματικού Υλικού Σχήμα S2A) και την κυτταρομετρία ροής (Συμπληρωματικό Υλικό Εικόνα S2B,C). Το LPS μείωσε την κατανάλωση οξυγόνου σε σύγκριση με τους ελέγχους Veh στα Veh-DCs όπως αναμενόταν (Εικόνα 3Ε, μπλε προς μαύρη γραμμή). Τα Rapa-S-DCs δεν είχαν καμία αλλαγή στη βασική OCR (Εικόνα 3Ε, πράσινη προς μπλε γραμμή τη στιγμή μηδέν). Όταν ποσοτικοποιήθηκε η παραγωγή ATP, το LPS μείωσε την παραγωγή ATP όπως μετρήθηκε με OCR (μπλε προς μαύρο) σε Veh-DC και Rapa-S-DC (Εικόνα 3F). Ωστόσο, τα Rapa-S-DC εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα mRNA για το Pgc1a σε σύγκριση με τους ελέγχους Veh και αυτά τα επίπεδα διατηρήθηκαν στα Rapa-S-DC μετά από LPS (Εικόνα 3G), μικρή έως καμία αλλαγή παρατηρήθηκε στα επίπεδα μεταγραφής του Tfam. Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν η μονή θεραπεία με ραπαμυκίνη προκάλεσε μια αλλαγή στα συν-διεγερτικά μόρια DC μετά από LPS. Είναι ενδιαφέρον ότι μετά τη θεραπεία με LPS, τα Rapa-S-DC έχουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης των μορίων παρουσίασης συνδιεγερτικού αντιγόνου (CD80, CD86 και CD40), MHCII, και PDL1 σε σύγκριση με το Veh-DC (Εικόνα 3Η). Τα Rapa-S-DCs είχαν παρόμοιο επίπεδο έκφρασης για το PDL1 σε σύγκριση με τα Veh-DC και είχαν παρόμοιες σημαντικές μειώσεις στην αναλογία PDL1/CD86 μετά από διέγερση LPS σε σύγκριση με τα Veh-DC (Veh/Veh 0). 59 ± 0,03 έναντι Veh/LPS 0,43 ± 0,002, p < 0,001="" και="" rapa-s/veh="" 0,69="" ±="" 0,02="" έναντι="" rapa-s/lps="" 0,56="" ±="" 0,008,="" p="">< 0,05).="" η="" απλή="" θεραπεία="" με="" ραπαμυκίνη="" μείωσε="" σημαντικά="" την="" γονιδιακή="" έκφραση="" των="" επαγόμενων="" από="" lps="" il6,="" il10="" και="" tnfa="" μαζί="" με="" χαμηλότερες="" συγκεντρώσεις="" πρωτεΐνης="" της="" il10="" με="" μικρή="" ή="" καθόλου="" αλλαγή="" στον="" tnf="" και="" μετά="" από="" θεραπεία="" με="" lps="" (εικόνα="" 3i–l).="" άλλα="" γνωστά="" γονίδια="" που="" ρυθμίζονται="" από="" τη="" ραπαμυκίνη="" (αυτοφαγία="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" και="" lamp2]="" ή="" φλεγμονή="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" και="" ho1])="" ρυθμίστηκαν="" μόνο="" εν="" μέρει="" σε="" σύγκριση="" με="" τη="" διέγερση="" dcs="" μετά="" από="" lps="" πίνακας="" υλικών="">
Η μεταφορά Rapa-S-DC προστατεύει τα νεφρά από ισχαιμική βλάβηΌλα τα DC ενεργοποιήθηκαν με 100 ng/mL LPS ή υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη (10 ng/mL) πριν από τη μεταφορά σε όλες τις συγγενικές μελέτες (ποντίκια C57BL/6 BMDC→ C57BL/6). Μισό εκατομμύριο DCs εγχύθηκαν 1 ημέρα πριν από αμφοτερόπλευρηνεφρόIRI. Σχηματικό σχέδιο μελέτης (Εικόνα 4Α). Ως έλεγχος, τα ποντίκια ενέθηκαν με 1 χ PBS ως μάρτυρες χωρίς κύτταρα (NC). Σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Rapa-S-DC προστάτευσαν σημαντικά τηννεφράαπό τραυματισμό κρεατινίνης πλάσματος (Εικόνα 4Β). Παρόμοιες αλλαγές στο BUN παρατηρήθηκαν σε αυτά τα ποντίκια [Veh-DC 151,82 ± 1,5 έναντι Rapa-S-DC 139,53 ± 3,8]. Μορφολογικές αλλαγές (Εικόνα 4Γ,Δ) παράλληλες λειτουργικές μελέτες. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Rapa-S-DCs έχουν χαμηλότερανεφρόΕπίπεδα mRNA του Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{2{0}}9 εναντίον Rapa. -S-DC 0.004 ± 0,002], Ngal [Veh DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-S-DC 0,14 ± 0,008] και Tnfa [Veh-DC 0,196 ± 0,15 έναντι Rapa-S-DC 0,0017 ± 0,001] σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC.
Η αλλογενής μεταφορά BMDC του Rapa-M-DC ή του Rapa-S-DC προστατεύει εξίσου τα νεφρά από ισχαιμική βλάβηΜισό εκατομμύριο DCs εγχύθηκαν 1 ημέρα πριν από αμφοτερόπλευρεςνεφρόIRI για αλλογενείς μελέτες μεταφοράς (BALB/C BMDC→C57BL/6 ποντίκια). Σχηματικό σχέδιο μελέτης (Εικόνα 5Α). Ως έλεγχος, τα ποντίκια ενέθηκαν με 1x PBS ως μάρτυρες χωρίς κύτταρα (NC). Σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Rapa-M-DC ή Rapa-S-DC, προστάτευσαν σημαντικά τηννεφράαπό τραυματισμό (Εικόνα 5Β). Μορφολογικές αλλαγές (Εικόνα 5Γ,Δ) παράλληλες λειτουργικές μελέτες. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με DCs ραπαμυκίνης έχουν χαμηλότερανεφρόΕπίπεδα mRNA του Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 έναντι Rapa-M-DC 0. 005 ± 0.0{{30}}2 εναντίον Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 vs RapaM-DC 0,19 ± 0,11 vs Rapa- S-DC 0,05 ± 0,01] και Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 έναντι Rapa-M-DC 0,007 ± 0,003 έναντι Rapa-S-DC 0,008 ± 0,005] σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC. Σε μελέτες αλλογενούς μεταφοράς, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Rapa-M-DC ή Rapa-S-DC είχαν μειωμένο TUNEL απόπτωσης σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 έναντι Rapa-M-DC 7,2 ± 2,5 έναντι Rapa- S-DC 9,1 ± 0,1).
Εξωγενή DC φορτωμένα με μιτοχόνδρια (Mito-DC) με υψηλότερη μιτοχονδριακή δυναμική και περισσότερο ανοσογονικό φαινότυπο μετά από διέγερση LPSΤα WT DCs απομονώθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν για 8 ημέρες παρουσία GMCSF, συνολικά 3 θεραπείες. Τα DC ηλικίας επτά ημερών υποβλήθηκαν σε αγωγή κατά τη διάρκεια της νύχτας με ανθρώπινα εξωγενή μιτοχόνδρια (10 μg/mL). Σε σύγκριση με τη θεραπεία με όχημα, τα DC Mito-DC που έλαβαν μιτοχόνδρια έχουν υψηλότερα μιτοχόνδρια. Τα μιτοχόνδρια απομονώθηκαν από ανθρώπινη κυτταρική σειρά HEK293. Τα BMDC αναλύθηκαν για την παρουσία ανθρώπινων μιτοχονδρίων σε ποντικού WT DCs χρησιμοποιώντας ανθρώπινους εκκινητές mtDNA για NADH αφυδρογονάση (ND). Το σχετικό ανθρώπινο περιεχόμενο [mtDNA] στο Veh-DC ήταν {{10}}.26 ± 0.10 έναντι 16.8 ± 0.59. p < 0,001,="" αύξηση="" 63-="" φορές="" στο="" γονιδιωματικό="" dna="" που="" απομονώθηκε="" από="" bmdc.="" ένας="" περιορισμός="" της="" τρέχουσας="" ανάλυσης="" είναι="" ότι="" μετρά="" το="" mtdna="" ανθρώπου="" ή="" ποντικού="" σε="" σχέση="" με="" το="" πυρηνικό="" dna="" και="" η="" μικρή="" ποσότητα="" ανθρώπινου="" mtdna="" που="" ανιχνεύεται="" στο="" veh-dc="" θα="" μπορούσε="" να="" οφείλεται="" σε="" ελάχιστη="" επικάλυψη="" στην="" αλληλουχία="" του="" nd="" στον="" προσδιορισμό="" pcr="" ή="" σε="" πιθανότητα,="" καθώς="" είμαστε="" που="" δείχνει="" σχετική="" έκφραση="" σε="" πυρηνικό="" dna="" ποντικού.="" για="" να="" προσδιοριστεί="" εάν="" το="" υψηλότερο="" μιτοχονδριακό="" περιεχόμενο="" άλλαξε="" επίσης="" τη="" λειτουργία="" των="" μιτοχονδρίων,="" πραγματοποιήθηκε="" βιοενεργειακή="" ανάλυση="" χρησιμοποιώντας="" το="" seahorse="" bioanalyzer.="" το="" lps="" αμβλύνει="" την="" κατανάλωση="" οξυγόνου="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" ελέγχους="" veh="" σε="" veh-dcs="" όπως="" αναμενόταν="" (εικόνα="" 6α,="" μπλε="" προς="" μαύρη="" γραμμή).="" τα="" mito-dcs="" έχουν="" υψηλότερη="" βασική="" ocr="" (εικόνα="" 6α,="" πράσινη="" προς="" μπλε="" γραμμή="" τη="" στιγμή="" μηδέν).="" κατά="" τη="" θεραπεία="" με="" αποζεύκτη="" fccp,="" το="" mito-dc="" έδειξε="" αποτυχία="" να="" αυξήσει="" τη="" μέγιστη="" αναπνευστική="" ικανότητα="" σε="" μη="" διεγερμένα="" κύτταρα="" που="" διατηρήθηκε="" με="" διέγερση="" lps,="" αποδεικνύοντας="" ότι="" η="" θεραπεία="" με="" απομονωμένα="" μιτοχόνδρια="" αφαιρεί="" την="" πλεονάζουσα="" αναπνευστική="" ικανότητα="" (πιθανότατα="" επειδή="" ήδη="" στη="" μέγιστη="" ocr="" στη="" βασική="" κατάσταση).="" όταν="" προσδιορίστηκε="" ποσοτικά="" η="" παραγωγή="" atp,="" το="" lps="" μείωσε="" την="" παραγωγή="" atp="" όπως="" μετρήθηκε="" με="" ocr="" (μπλε="" προς="" μαύρο)="" σε="" veh-dcs.="" το="" mito-dc="" έδειξε="" σημαντικά="" μεγαλύτερη="" βασική="" παραγωγή="" ocr="" και="" atp="" σε="" σύγκριση="" με="" το="" veh-dc="" σε="" dcs="" που="" διεγείρονται="" από="" lps="" (εικόνα="" 6β).="" τα="" mito-dcs="" εμφάνισαν="" αυξημένα="" επίπεδα="" mrna="" για="" το="" pgc1a="" και="" ενδιαφέροντα="" σημαντικά="" χαμηλότερο="" tfam="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" ελέγχους="" veh="" (εικόνα="" 6c).="" οι="" διαφορές="" στο="" pgc1a="" και="" στο="" tfam="" σε="" αυτό="" το="" σύνολο="" πειραμάτων="" μετά="" από="" διεγέρσεις="" lps="" σε="" σύγκριση="" με="" τα="" δεδομένα="" στα="" σχήματα="" 1="" και="" 3="" πιθανώς="" οφείλονται="" στη="" χρήση="" balb/c="" bmdcs.="" σε="" σύγκριση="" με="" τα="" c57bl/6="" bmdcs,="" τα="" dcs="" από="" το="" balb/c="" έχουν="" σημαντικές="" αλλαγές="" στα="" μιτοχόνδρια="" και="" την="" παραγωγή="" κυτοκίνης="" μετά="" από="" διέγερση="" [29,30].="" πιθανότητα="" λόγω="" αυτών="" των="" αλλαγών="" στα="" dcs,="" ιστορικά="" χρησιμοποιήσαμε="" υψηλότερο="" ισχαιμικό="" χρόνο="" σε="" ποντίκια="" balb/c="" σε="" σύγκριση="" με="" το="" c57bl/6="" για="" να="" έχουμε="">νεφρότραυματισμός [6,18]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η μεταφορά εξωγενών υγιών μιτοχονδρίων έχει ως αποτέλεσμα αυξημένο μιτοχονδριακό περιεχόμενο, βασική OCR και παραγωγή ATP. Αυτό υποδηλώνει τη δυνατότητα για έναν αντιφλεγμονώδη φαινότυπο σε DCs μετά από θεραπεία με εξωγενή μιτοχόνδρια, όπως φαίνεται στην προηγούμενη μελέτη μας [18]. Στη συνέχεια, δοκιμάζουμε εάν τα DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εξωγενή μιτοχόνδρια που έχουν ως αποτέλεσμα αυξημένους αριθμούς και λειτουργία των μιτοχονδρίων προκάλεσαν επίσης μια αλλαγή στα συν-διεγερτικά μόρια DC μετά το LPS. Αξιοσημείωτα, με και χωρίς διέγερση LPS, το Mito-DC έχει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης μορίων παρουσίασης συνδιεγερτικού αντιγόνου (CD80, CD{8}} και CD40), MHCII και PDL1 σε σύγκριση με το Veh-DC (Εικόνα 6D). Επιπλέον, τα Mito-DCs είχαν υψηλότερο επίπεδο έκφρασης για το PDL1 σε σύγκριση με τα Veh-DCs. Ωστόσο, είχαν επίσης μια αύξηση στην αναλογία PDL1/CD86 μετά από διέγερση LPS σε σύγκριση με τα Veh-DC που έλαβαν θεραπεία με LPS (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Το Mito-DC είχε σημαντικά αμβλυνόμενη γονιδιακή έκφραση του επαγόμενου από LPS Tnfa, αλλά υψηλότερη γονιδιακή έκφραση των Il6 και Il10 σε σύγκριση με το Veh-DC και χαμηλότερες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης TNF και IL10, αλλά διατήρησε υψηλότερα επίπεδα IL6 σε σύγκριση με το Veh-DC που υποβλήθηκε σε θεραπεία με LPS (Εικόνα 6Ε –Η). Άλλα γονίδια που είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από μιτοχόνδρια (αυτοφαγία [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b και Lamp2] ή φλεγμονή [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a και Ho1]) ρυθμίστηκαν εν μέρει μετά από διέγερση με LPS (Supple Sup3). Τα Veh-DC και Mito-DC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS για 6 και 24 ώρες. Μετρήθηκαν οι σχετικές αλλαγές στο μιτοχονδριακό σύμπλεγμα. Το Mito-DC που υποβλήθηκε σε αγωγή με και χωρίς LPS έχει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης των μιτοχονδριακών συμπλεγμάτων IV, II και I και σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα Συμπλοκών V και III σε σύγκριση με τα Veh-DCs (Εικόνα 6I). Ημι-ποσοτική ανάλυση της σχετικής πρωτεϊνικής έκφρασης μιτοχονδριακών συμπλεγμάτων σε GAPDH (Εικόνα 6J). Οι κηλίδες πλήρους μήκους παρέχονται ως συμπληρωματικές εικόνες (Συμπληρωματικό υλικό Σχήματα S4–S7).
Εικόνα 6. Τα φορτωμένα με μιτοχόνδρια DCs (Mito-DC) έχουν υψηλότερη μιτοχονδριακή λειτουργία και ανοσογονικότητα μετά από διέγερση LPS σε σύγκριση με τα Veh-DCs. Veh-DC ηλικίας επτά ημερών και επωάστηκαν με 10 μg/mL μιτοχόνδρια HEK293 μία ημέρα πριν από τη θεραπεία με 100 ng/mL LPS για επιπλέον 24 ώρες ή αφέθηκαν χωρίς διέγερση ( Veh). (Α) 24 ώρες μετά την προσθήκη μιτοχονδρίων, τα DC σπάρθηκαν σε έναν αναλυτή Seahorse XF-24e, διεγέρθηκαν με και χωρίς LPS για 24 ώρες και προσδιορίστηκε ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) κατά τη διάρκεια διαδοχικών αγωγών με ολιγομυκίνη (1 ), FCCP (2) και αντιμυκίνη Α/ροτενόνη (3). (Β) Ποσοτικοποίηση της βασικής παραγωγής OCR και ATP. (Γ) επίπεδα mRNA των Pgc1a και Tfam σε Veh-DC και Mito-DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng/mL LPS ή αφέθηκαν χωρίς διέγερση για 24 ώρες. (Δ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του MHCII, των συν-διεγερτικών μορίων (CD40/80/86) και της έκφρασης PDL1 προσδιορίστηκε με και χωρίς διέγερση LPS. (Ε) ELISA των IL10, IL6 και TNF από τα Veh-DC και Mito-DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng/mL LPS για 24 ώρες. Επίπεδα mRNA (F-H) των Tnfa, Il6 και Il10 σε Veh-DC και Mito-DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng/mL LPS ή αφέθηκαν χωρίς διέγερση για 24 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM, * p Μικρότερο ή ίσο με 0,05, ** p Μικρότερο ή ίσο με 0,01 και *** p Μικρότερο ή ίσο με 0,001, μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη μετα-δοκιμή του Tukey. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM τριπλών.
Allogeneic BMDC Transfer of Mito-DC ProtectΝεφράαπό ισχαιμικό τραυματισμό Μισό εκατομμύριο DCs εγχύθηκαν 1 ημέρα πριν από αμφοτερόπλευρηνεφρόIRI για γονιδιακές μελέτες μεταφοράς Mito-DC allo (ποντίκια BALB/C BMDC→C57BL/6). Σχηματικό σχέδιο μελέτης (Εικόνα 7Α). Ως έλεγχος, τα ποντίκια ενέθηκαν με 1x PBS ως μάρτυρες χωρίς κύτταρα (NC). Σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Mito-DC προστάτευσαν σημαντικά τηννεφράαπό τραυματισμό (Εικόνα 7Β). Μορφολογικές αλλαγές (Εικόνα 7C,D) παράλληλες λειτουργικές μελέτες. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Mito-DCs έχουν χαμηλότερανεφρόΕπίπεδα mRNA του Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 έναντι Mito-DC 0.02 ± 0.01], Ngal [Veh-DC 0.57 ± {0.3 vs Mito-DC 0.39 ± {{29} },20] και Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs Mito-DC 0,0028 ± 0,0013] σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν Veh-DC. Σε μελέτες αλλογενούς μεταφοράς, τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Mito-DC είχαν μειωμένο TUNEL απόπτωσης σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 έναντι Mito-DC 3,0 ± 1,2).
Συζήτηση Στην παρούσα μελέτη επιδείξαμε προστασία απόνεφρόΤο IRI που προκαλείται από την εγκριτική μεταφορά DC που έχουν υποστεί αγωγή με ραπαμυκίνη (είτε μεμονωμένα είτε πολλαπλά) ρυθμίζει εναλλακτικά τη λειτουργία DC που εξαρτάται από σχετικές αλλαγές στη δυναμική των μιτοχονδρίων. Τόσο η απλή όσο και η πολλαπλή(ες) θεραπεία(εις) με ραπαμυκίνη επάγουν μειωμένα ανοσογόνα (κατώτερες κυτοκίνες και συν-διεγερτικά μόρια) DCs. Η μεταφορά είτε των Rapa-M-DCs είτε των Rapa-S-DCs προστατεύει τονεφράαπό τραυματισμό ισχαιμικής επαναιμάτωσης, υποδεικνύοντας ότι η μειωμένη ανοσογονική κατάσταση των τροποποιημένων με ραπαμυκίνη DCs επάγει την προστασία. Επιπλέον, η μεταφορά του Veh-DC που είχε παροδικές αυξήσεις στους αριθμούς των μιτοχονδρίων προστατεύει επίσηςνεφράαπό το IRI (Εικόνα 8A–D)). Από αυτές τις μελέτες μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η έγχυση λιγότερο ανοσογόνων DCs είναι κεντρική για την πρόκληση προστασίας από IRI, μια διαδικασία που μπορεί να επιτευχθεί με φαρμακολογική θεραπεία (ραπαμυκίνη) ή μέσω μεταφοράς υγιών εξωγενών μιτοχονδρίων. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [31] και επιβεβαιώθηκε στις μελέτες μας για το RNAseq, συνολικά, δεν υπάρχει σαφής ανεκτογόνος υπογραφή που να σχετίζεται με ρυθμιζόμενα από τη ραπαμυκίνη DCs. Αν και τα DC της ραπαμυκίνης εμφανίζουν ορισμένες σημαντικές αλλαγές στα γονίδια μετά από διέγερση LPS σε σύγκριση με τα DCs φορέα, αυτές περιορίστηκαν σε RapaM-DC που έχουν χαμηλότερη σηματοδότηση με τη μεσολάβηση κυτοκίνης και παραγωγή κυτοκίνης (σηματοδότηση TNF μέσω παραγωγής NF-kB και IFN) όλα κρίσιμα και στα δύο έμφυτες και προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως και επιβεβαιώθηκε στη μελέτη μας, η σηματοδότηση IL-10 αναγνωρίστηκε ως η κύρια οδός που ήταν διαφορετική σε DC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη με FDR 5,87 × 10 4 (Συμπληρωματικό υλικό Εικόνα S1), μια κυτοκίνη χαρακτηριστική της ανεκτικής υπογραφής σε DC.
Ιστορικά, τα ανεκτικά DCs (Tol-DC) αναγνωρίζονται ως διαταραγμένα λόγω ωρίμανσης ή ημι-ανώριμα με χαμηλή έκφραση συνδιεγερτικού (CD80, CD{5}}, CD40) με αυξημένη παραγωγή IL10 που συνοδεύεται από χαμηλή έκκριση IL12 και IFN. , χαμηλότερη ικανότητα εκκίνησης Τ κυττάρων και δυνατότητα επαγωγής Treg μετά από προφλεγμονώδη διέγερση [32,33]. Τα ρυθμιστικά ή ανεκτικά DCs μπορούν να διαφοροποιηθούν in vitro με τη χρήση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων ή ενώσεων όπως το FTY720 [18] ή η ραπαμυκίνη (η τρέχουσα μελέτη) ή αντιφλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως η IL10 [34] ή μέσω γενετικής τροποποίησης.
Ο ρόλος των δενδριτικών κυττάρων στην οξεία νεφρική βλάβη (ΑΚΙ)Παρόλο που έχουν γίνει σημαντικές φαρμακολογικές πρόοδοι για την πρόληψη ή τη θεραπεία διάφορων τραυματισμών, κανένας δεν είναι διαθέσιμος για το AKI, επομένως παραμένει ως σημαντικό βάρος για την υγεία [35]. Επιπλέον, για την πρόληψη ή τη μείωση προσαρμοστικών ανοσολογικών αποκρίσεων, η μεσολάβηση απόρριψης αλλομοσχεύματος ή αυτοάνοσης νόσου, η χρήση μη ειδικών ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων σχετίζεται με ανεπιθύμητες παρενέργειες. Έτσι, η χρήση ενός τύπου ανοσοκυττάρου όπως τα DC που μπορούν να στοχεύουν έμφυτες και προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις είναι πλεονεκτήματα. Επιπλέον, τα DCs είναι σημαντικά κύτταρα στην ανοσία ή την ανοχή και η ιδέα της χρήσης ex-vivo ρυθμιστικών ή ανεκτικών DCs σε κυτταρικές θεραπείες για καρκίνο, αυτοάνοσες διαταραχές και μεταμόσχευση έχει διερευνηθεί [36]. Φαρμακολογικές (FTY720 [18]) ή βιολογικές στρατηγικές (γενετικά τροποποιημένες) επάγουν ρυθμιστικά ή ανεκτικά DCs (Tol-DC) [37], τα οποία είτε είναι ανθεκτικά στην ωρίμανση είτε έχουν χαμηλότερα επίπεδα ωρίμανσης ή ενεργοποιούνται εναλλακτικά που εκφράζουν τελικά χαμηλά επίπεδα MHC I ή MHC II και συν-διεγερτικά μόρια όπως CD40, CD80 και CD86. Χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά ποντίκια CD11c-DTR, έχουμε δημοσιεύσει προηγουμένως μελέτες που έδειξαν ότι η εξάντληση των DCs με τοξίνη διφθερίτιδας προστάτευσε σημαντικά τον ποντικόνεφράαπό τραυματισμό επαναιμάτωσης ισχαιμίας (IRI) [7,38], και αντιστρόφως επιδεινώθηκε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στους αριθμούς DCνεφρική βλάβη[7], υποδηλώνοντας ότι τα DCs θα μπορούσαν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του AKI. Αξίζει να αναφερθεί ότι στην ΑΚΙ, το μοντέλο της ΑΚΙ που χρησιμοποιείται (χημειοθεραπεία με σισπλατίνη ή ισχαιμία) υπαγορεύει τον ρόλο που παίζουν τα DC στην αλλαγή των ανοσολογικών αποκρίσεων. Σε επαγόμενη από σισπλατίνη AKI, η κατάλυση DC είτε με χρήση διαγονιδιακών ποντικών είτε μέσω λιποσωμικής έγχυσης χλωρονικού έχει ως αποτέλεσμα περισσότερο τραυματισμό καθώς η IL-10 που παράγεται από DCs σε αυτό το μοντέλο είναι τελικά απαραίτητη για την άμβλυνση της νεφροτοξικής βλάβης [39,40].
Ραπαμυκίνη: φλεγμονή, ανοσοκύτταρα, τραυματισμός επαναιμάτωσης ισχαιμίας (IRI)Προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες έχουν δείξει έναν προστατευτικό ρόλο της ραπαμυκίνης σε μοντέλα AKI χρησιμοποιώντας μελέτες IRI που περιλάμβαναν τη ρύθμιση της διήθησης των κυττάρων ΝΚΤ και τη βελτίωση της λειτουργίαςνεφρική βλάβη[41], σε αυτή τη μελέτη ποντίκια έλαβαν από του στόματος θεραπεία με ραπαμυκίνη τρεις φορές 24 ώρες, 1 ώρα πριν από την ισχαιμία και 12 ώρες μετά την ισχαιμία. Χρόνια χορήγηση από το στόμα σε ποντίκια μία ημέρα πριννεφρόIRI και κάθε μέρα μετά (έως 7 ημέρες) οδήγησαν σε υψηλότερανεφρική βλάβηλόγω αναστολής τουνεφρώνπολλαπλασιασμός σωληναριακών κυττάρων 1 και 3 ημέρες μετά την ισχαιμία [42]. Αυτό ήταν εμφανές όπως σε ένα μοντέλο ποντικού μονόπλευρης απόφραξης ουρητήρα (UUO), όπου η θεραπεία με ραπαμυκίνη βελτιώθηκενεφρόίνωση με άμεση αναστολή της σηματοδότησης mTOR σε μυοϊνοβλάστες και διάμεσους μακροφάγους [43]. Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι η ραπαμυκίνη μπορεί να έχει αντίθετα αποτελέσματα σε διάφορες οξείες έναντι χρόνιεςνεφρόμοντέλα. Ωστόσο, διάφορες μελέτες έχουν αναφέρει επιζήμιο ρόλο της ραπαμυκίνης σε ζωικά μοντέλα IRI. Η από του στόματος δόση ραπαμυκίνης (4 mg/ημέρα) για 7 ημέρες σε χοίρους του Yorkshire μείωσε την εξαρτώμενη από το ενδοθηλιακό αγγειοχαλάρωση και αύξησε τη νέκρωση του μυοκαρδίου σε ένα μοντέλο απόφραξης στεφανιαίας αρτηρίας [44]. Ωστόσο, σε ποντίκια, η οξεία θεραπεία με ραπαμυκίνη (μία ώρα πριν από την ισχαιμία, την ενδοπεριτοναϊκή ένεση) προκάλεσε καρδιοπροστασία ρυθμίζοντας τη σηματοδότηση JAK2-STAT3 για προστασία από έμφραγμα του μυοκαρδίου [45]. Ανάλογα με την οδό (gavage ή υποδόρια ή ενδοπεριτοναϊκή), τη δόση (0.1–6 mg/kg/ημέρα), το χρόνο (πρώιμο ή καθυστερημένο) [46] και τον τύπο του μοντέλου που χρησιμοποιείται (καρδιά [47] , συκώτι [48] ήνεφρό[41,49]), η ραπαμυκίνη έχει αποδειχθεί ότι είναι προστατευτική [47] ή όχι [50].
Κυτταρική θεραπεία και ραπαμυκίνηΟ πολλαπλασιασμός των BMDC ποντικών ή των ανθρώπινων CD14 συν μονοκυττάρων που θεωρούμε χρόνια επήγαγε έναν εναλλακτικό προστατευτικό ή ρυθμιστικό φαινότυπο στα DC που ρύθμιζε τόσο τις εγγενείς όσο και τις προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Στη θανατηφόρα νόσο μοσχεύματος έναντι ξενιστή, τα DCs που δημιουργήθηκαν με ραπαμυκίνη είχαν μειωμένα μόρια MHC II και συν-διεγερτικά, αλλά είχαν υψηλότερο πληθυσμό IL12 που παρήγαγε μετά από διέγερση LPS. Αυτά τα Rapa-M-DC που παράγουν IL12 ενίσχυσαν την αλλοαντιδραστική απόπτωση των Τ κυττάρων, έναν μηχανισμό που εμπλέκει την IFN [51]. Ομοίως, τα μονοκύτταρα CD14 συν που πολλαπλασιάστηκαν παρουσία ραπαμυκίνης παρήγαγαν επίσης υψηλότερα επίπεδα IL12p70 μαζί με επίπεδα IL27 που ρύθμιζαν τη λειτουργία των ΝΚ κυττάρων, αλλάζοντας έτσι τις αλλογενείς αποκρίσεις των Τ κυττάρων μέσω της IFN [52]. Σενεφρό,η μεταφορά των Tregs που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη είχε καταστείλει σημαντικά τις αποκρίσεις των Τ κυττάρων, των μυελοειδών κυττάρων και των μυοϊνοβλαστών, με αποτέλεσμα βελτιωμένες οξείες και χρόνιεςΝεφρική Νόσοςσε σύγκριση με την άμεση θεραπεία ποντικών με ραπαμυκίνη [53]. Ομοίως, βελτιώθηκε η μεταβιβάση των κατασταλτικών κυττάρων που προέρχονται από μυελοειδή (MDSCs) που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ραπαμυκίνη σε ποντικούςνεφρική λειτουργίαμε μειωμένες ιστολογικές βλάβες και διήθηση κυττάρων του ανοσοποιητικού [54]. Αυτές οι μελέτες παρέχουν στοιχεία ότι η κυτταρική θεραπεία που περιλαμβάνει θεραπεία κυττάρων με ραπαμυκίνη πριν από την ένεση αποφεύγει τις ανεπιθύμητες παρενέργειες που μπορεί να σχετίζονται με τη συστηματική θεραπεία με ραπαμυκίνη. Επιπλέον, έχουμε δοκιμάσει τη χρήση μετφορμίνης ή ενώσεων όπως η ριβοφουρανοσίδη 5-αμινοϊμιδαζόλη-4-καρβοξαμίδη-1- -4- (AICAR) για την επαγωγή ενός ρυθμιστικού φαινοτύπου σε DC ποντικών για να ελεγχθεί ο ρόλος τους στην αλλαγήνεφρόIRI. Όπως η στρατηγική δοσολογίας που χρησιμοποιήθηκε με τη ραπαμυκίνη (Rapa-S-DC), αντιμετωπίσαμε τα BMDC με χαμηλές δόσεις μετφορμίνης (1 mM) ή AICAR (1 mM) την ημέρα 7 μαζί με LPS. Κάναμε συστηματική ένεση 0.5 x 106 είτε μετφορμίνης-DCs είτε AICAR-DCs μία ημέρα πριννεφρόIRI. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία είτε με μετφορμίνη-DCs είτε με AICAR-DCs προστατεύτηκαν σημαντικά σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία είτε με NC είτε με Veh-DC (μη δημοσιευμένες παρατηρήσεις, εργαστήριο Bajwa). Έτσι, πολλά φάρμακα ή ενώσεις που προκαλούν μεταβολικές αλλαγές ή ενεργοποιούν την οδό AMPK μπορεί να αξίζει να δοκιμαστούν είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Αξίζει να σημειωθεί ότι η χρήση πολλαπλών συνδυασμών φαρμάκων ή ενώσεων (μετφορμίνη ή AICAR) που θα μπορούσαν ενδεχομένως να συμπληρώσουν τις προστατευτικές επιδράσεις της ραπαμυκίνης δεν έχει ακόμη διερευνηθεί κατά την αξιολόγηση της χρήσης τους σε BMDC. Στα καρκινικά κύτταρα, ο συνδυασμός AICAR με ραπαμυκίνη ενισχύει την αποτελεσματικότητα της ραπαμυκίνης στην περαιτέρω καταστολή του mTORC2 για την πρόκληση απόπτωσης [55]. Στα Τ κύτταρα, η συνδυασμένη χρήση μετφορμίνης και ραπαμυκίνης έχει επίσης δοκιμαστεί ως πιθανός ρυθμιστής του μεταβολικού σημείου ελέγχου για να επηρεάσει τη λειτουργία των Τ κυττάρων [56]. Επομένως, αυτές οι συνδυαστικές θεραπευτικές μέθοδοι θα πρέπει να δοκιμαστούν στο μέλλον με ανεκτικά ή ρυθμιστικά BMDC ως πιθανούς άμεσους ή έμμεσους ρυθμιστές των μεταβολικών σημείων ελέγχου.
Ραπαμυκίνη: Ο ρόλος των μιτοχονδρίων σε δενδριτικά κύτταρα και μακροφάγουςΟι λειτουργίες του DC και των μακροφάγων ρυθμίζονται από τον μεταβολισμό των μιτοχονδρίων. Τα μακροφάγα τύπου 1 [57,58] και τα ανοσογόνα DCs (ενεργοποίηση μέσω TLR) έχουν μεταβολική μετάβαση στην οποία η μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση αναστέλλεται από ενδογενώς συντιθέμενο μονοξείδιο του αζώτου (NO) και δέσμευση σε υψηλούς αερόβιους γλυκολυτικούς ρυθμούς [59]. Η ενεργοποίηση των DC ή των μακροφάγων από αρκετούς αγωνιστές TLR (LPS ή CpG) οδηγεί σε ταχεία αύξηση της γλυκόλυσης, ακολουθούμενη από μείωση του OXPHOS και του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης [59-61]. Κάποιος ρόλος για τα μιτοχόνδρια έχει αποδειχθεί με DC που έλαβαν in vitro θεραπεία με βιταμίνη D. αυτά τα DC έχουν αυξήσει την παραγωγή OXPHOS, μιτοχονδριακή μάζα και mROS [62], η πρόσφατη μελέτη μας με χρήση FTY720 [18] έδειξε παρόμοιες αλλαγές στο DC (υψηλότερο OXPHOS και λιγότερη ανοσογονικότητα), η οξεία θεραπεία με ραπαμυκίνη έχει αποδειχθεί ότι παρατείνει την κυτταρική διάρκεια ζωής του DCs που εξαρτιόταν από τη διατήρηση της μιτοχονδριακής λειτουργίας [10] μέσω της αναστολής του ΝΟ. Σε αντίθεση με την αύξηση της διάρκειας ζωής των DCs, οι ίδιες ομάδες ανέφεραν επίσης ότι η οξεία ή σύντομη έκθεση στη ραπαμυκίνη στα DCs τα καθιστά επίσης ισχυρούς ενεργοποιητές των ειδικών για αντιγόνο CD8 + Τ κυττάρων, ενισχύοντας έτσι τον έλεγχο του μελανώματος Β16 ως εμβολιασμό σε ποντίκια [63]. Η οξεία θεραπεία (90 λεπτά) των DC που προέρχονται από ανθρώπινα μονοκύτταρα με ραπαμυκίνη καταστέλλει τα επαγόμενα από LPS ανοσοδιεγερτικά μόρια και αλλοδιεγερτικό δυναμικό που περιλάμβανε την αδυναμία του επεξεργασμένου DCS να αυξήσει τη σηματοδότηση NF-kB [64]. Στα μακροφάγα, η ραπαμυκίνη καταστέλλει την παραγωγή IL1 και IL-18μετά από διέγερση LPS, μια διαδικασία που περιλαμβάνει επίσης τη μείωση των μιτοχονδριακών ROS (mtROS) με την άμεση αναστολή των οδών NLRP3 inflammasome-p38 MAPK-NF-kB [65]. Το ρυθμισμένο με ραπαμυκίνη DC (Rapa-DC) από ποντίκια και ανθρώπους συμπεριφέρεται διαφορετικά, σε σύγκριση με το Rapa-DC ποντικού, το ανθρώπινο Rapa-DC έχει αποδειχθεί ότι είναι μερικώς ανθεκτικό στην ωρίμανση μετά από προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και εμφανίζει ετερογένεια στη ρύθμιση της επέκτασης των τελεστών Τ-κυττάρων και λειτουργία [66]. Πολλές από τις ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των ρυθμιζόμενων από ραπαμυκίνη προερχόμενων από μονοκύτταρα DCs και ο ρόλος τους στη μεταμόσχευση έχουν αναθεωρηθεί κομψά από τους Macedo et al. [67].
Τα τρέχοντα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τα DC που έχουν υποστεί αγωγή με απλή ή πολλαπλή ραπαμυκίνη έχουν μειωμένο ανοσογονικό και ανοσοδιεγερτικό φαινότυπο μετά από διέγερση LPS. Η μεταφορά αυτών των DC προστατεύεινεφράαπό το IRI. Η ραπαμυκίνη εναλλακτικά ρυθμίζει τη δυναμική των μιτοχονδρίων. Μόνο η πολλαπλή θεραπεία προκαλεί υψηλότερο αριθμό μιτοχονδρίων. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η DC μιτοχονδριακή δυναμική (υψηλότερη περιεκτικότητα σε μιτοχόνδρια), μαζί με λιγότερο ανοσογονικό φαινότυπο που προκαλείται από τη ραπαμυκίνη, προστατεύουν από κοινούνεφράαπό είναι χημική βλάβη. Αν και είναι πιο ενδιαφέρον, τα δεδομένα μας με DC που έχουν υποστεί αγωγή με εξωγενή μιτοχόνδρια υποδεικνύουν ότι υψηλότεροι αριθμοί μιτοχονδρίων μπορούν να ξεπεράσουν την πιο ανοσογονική κατάσταση των DCs μετά από διέγερση LPS για επίσης προστασίανεφράαπό το IRI. Θα είναι ενδιαφέρον να επιβεβαιωθεί εάν οι υψηλότεροι αριθμοί μιτοχονδρίων στα DCs αλλάζουν τις αποκρίσεις των Τ κυττάρων, τα DCs έχουν την ικανότητα να αλλάζουν την ανοσοαπόκριση όπως έδειξε η προηγούμενη μελέτη μας. Τα προκαταρκτικά μας δεδομένα υποδεικνύουν, σε μελέτες πολλαπλασιασμού αλλογενών Τ κυττάρων, τα DC με υψηλότερο αριθμό μιτοχονδρίων καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των CD4 Τ κυττάρων σε μικτές αντιδράσεις λεμφοκυττάρων (MLR, δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν είναι επί του παρόντος ασαφές εάν τα DC με υψηλότερους μιτοχονδριακούς αριθμούς μπορούν να προκαλέσουν μια απόκριση Treg που θα μπορούσε να συμβάλει θετικά στην προστασίανεφράαπό το IRI. Αυτά θα είναι το επίκεντρο των επόμενων μελετών μας.
συμπεράσματα Συνοπτικά, έχουμε αποδείξει ότι τα BMDC μπορούν να ρυθμίσουννεφρική βλάβηαπό έναν μηχανισμό που περιλαμβάνει τη βιογένεση των μιτοχονδρίων είτε με πολλαπλές θεραπείες με ραπαμυκίνη είτε με εξωγενή αύξηση του αριθμού των μιτοχονδρίων χρησιμοποιώντας εξωγενή μιτοχόνδρια. Συμπεραίνουμε ότι τα ρυθμιστικά DC (DCs με υψηλότερους αριθμούς μιτοχονδρίων) μπορεί να είναι χρήσιμα σενεφρόIRI καθώς και σε άλλες φλεγμονώδεις καταστάσεις όπως η μεταμόσχευση και οι αυτοάνοσες διαταραχές για την πρόληψη ή τη θεραπεία τραυματισμών.
