Ποσοτική αξιολόγηση των φλεγμονωδών διηθήσεων σε βιοψίες μεταμόσχευσης νεφρού με χρήση πολλαπλής ενίσχυσης σήματος τυραμιδίου και βαθιάς μάθησης

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Αφηρημένη

Η καθυστερημένη λειτουργία μοσχεύματος (DGF) είναι ένας ισχυρός παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη διάμεσης ίνωσης και σωληναριακής ατροφίας (IFTA) σε μεταμοσχεύσεις νεφρού. Η ποσοτική αξιολόγηση των φλεγμονωδών διηθήσεων σε βιοψίες νεφρού ασθενών με DGF μπορεί να αποκαλύψει προγνωστικούς δείκτες για την ανάπτυξη IFTA. Σε αυτή τη μελέτη, συνδυάσαμε πολλαπλή ενίσχυση σήματος τυραμιδίου (mTSA) και συνελικτικά νευρωνικά δίκτυα (CNNs) για να αξιολογήσουμε το φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον σε βιοψίες νεφρού ασθενών με DGF (n=22) που ελήφθησαν 6 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση. Οι ασθενείς στρωματοποιήθηκαν για ανάπτυξη IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Το Cistanche deserticola αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Εισαγωγή

Η καθυστερημένη λειτουργία μοσχεύματος (DGF) μετά τη μεταμόσχευση νεφρού είναι πολυπαραγοντική και σχετίζεται κυρίως με τα χαρακτηριστικά του δότη και τον χρόνο ισχαιμίας. Ο DGF γενικά περιγράφεται ως η ανάγκη για αιμοκάθαρση εντός 7 ημερών μετά τη μεταμόσχευση και είναι ένας ισχυρός παράγοντας κινδύνου για χρόνια βλάβη του νεφρικού μοσχεύματος [1-3]. Ένα κλασικό συστατικό της χρόνιας νεφρικής βλάβης είναι η παρουσία διάμεσης ίνωσης και σωληναριακής ατροφίας (IFTA). Ωστόσο, δεν προχωρούν όλοι οι ασθενείς με DGF στην ανάπτυξη IFTA και η πολύπλοκη σχέση μεταξύ DGF και IFTA εξακολουθεί να είναι ελάχιστα κατανοητή. Αυτό οφείλεται πρώτα στον χρόνο καθυστέρησης μεταξύ των πιθανώς αιτιολογικών συμβάντων και της λειτουργικής έκπτωσης και δεύτερον λόγω των μεταβλητών και πολύπλοκων επιδράσεων των πιθανών επαγωγέων, όπως η απόρριψη και οι παρενέργειες της φαρμακευτικής αγωγής [1, 4]. Η γενική παρουσία φλεγμονής και συγκεκριμένων μακροφάγων έχει περιγραφεί σε πολυάριθμες μελέτες ως προγνωστικός παράγοντας για την απώλεια μοσχεύματος [5-8]. Ωστόσο, οι υποκείμενες παθολογικές διεργασίες δεν είναι πλήρως κατανοητές και τα υψηλά επίπεδα φλεγμονής δεν οδηγούν πάντα σε μακροπρόθεσμη απώλεια μοσχεύματος. Ως αποτέλεσμα περιβαλλοντικών ερεθισμάτων, τα μακροφάγα αποκτούν εξειδικευμένες λειτουργίες και πολώνονται σε διαφορετικούς φαινότυπους. Πολυάριθμες μελέτες υποδεικνύουν ότι συγκεκριμένοι υποτύποι μακροφάγων (εναλλακτικά ενεργοποιημένοι μακροφάγοι) εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση των ιστών προκαλώντας επισκευή ή ίνωση των ιστών. Η πόλωση προς έναν φαινότυπο αναδιαμόρφωσης ιστού (μερικές φορές προ-ινωτικό) είναι γνωστό ότι εξαρτάται από ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών ερεθισμάτων, μεταξύ άλλων που παρέχονται από υποτύπους Τ-βοηθών λεμφοκυττάρων [9-11]. Η αξιολόγηση των πληθυσμών Τ-βοηθών κυττάρων στο μόσχευμα κατά τη στιγμή του DGF αποκάλυψε έναν επικρατέστερο υποτύπο Τ-βοηθού 1, αλλά οι συσχετίσεις με την έκβαση του μοσχεύματος ή την εξέλιξη σε IFTA δεν έχουν διερευνηθεί μέχρι στιγμής [12]. Μια ολοκληρωμένη αξιολόγηση του φλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος που επικεντρώνεται ειδικά σε μακροφάγα και υποσύνολα Τ-βοηθών κυττάρων σε προσεκτικά επιλεγμένες κοόρτες ασθενών μπορεί να παρέχει πληροφορίες για το γιατί ορισμένοι, αλλά όχι όλοι οι ασθενείς με DGF προχωρούν στην ανάπτυξη της IFTA.

Ωστόσο, μια ολοκληρωμένη διερεύνηση των φλεγμονωδών διηθήσεων παρεμποδίζεται από αρκετούς (τεχνικούς) περιορισμούς. Οι τεχνικές παραδοσιακής ανοσοϊστοχημείας (IHC) και ανοσοφθορισμού υποστηρίζουν την απεικόνιση μόνο ενός περιορισμένου αριθμού κυτταρικών δεικτών σε ένα τμήμα ιστού. Η σειριακή τομή μικρών, πολύτιμων θραυσμάτων ιστού, όπως βιοψίες νεφρού, δεν είναι επιθυμητή και η ερμηνεία των σχέσεων μεταξύ των κυττάρων σε διαφορετικές τομές είναι δύσκολη. Επιπλέον, η ποσοτική αξιολόγηση των φλεγμονωδών διηθήσεων με οπτική εκτίμηση συνοδεύεται από ένα σημαντικό επίπεδο μεταβλητότητας μεταξύ των παρατηρητών [13]. Οι παραδοσιακές τεχνικές επεξεργασίας εικόνας όπως το κατώφλι εικονοστοιχείων, η λεκάνη απορροής και η κατάτμηση με βάση τη μορφολογία βασίζονται στην προηγούμενη γνώση όλων των αναπαραστάσεων των μορφολογικών κυττάρων και της έντασης λεκέδων ιστού σε ένα σύνολο δεδομένων [14-16]. Επομένως, αυτές οι μέθοδοι συχνά στερούνται στιβαρότητας για βιολογικές και τεχνικές παραλλαγές εικόνας και μεταφράζονται ελάχιστα σε νέα ή εξωτερικά σύνολα δεδομένων. Η άνοδος της ψηφιακής παθολογίας έχει επιταχύνει την ανάπτυξη εναλλακτικών μεθόδων για την αξιολόγηση εικόνων ολόκληρων διαφανειών (WSI) [17, 18]. Τα μοντέλα βαθιάς μάθησης, συγκεκριμένα, τα συνελικτικά νευρωνικά δίκτυα (CNN) έχουν αποδειχθεί ικανά να τμηματοποιούν και να ανιχνεύουν σχετικές βιολογικές δομές σε ιστοπαθολογικές διαφάνειες [19-23]. Αυτές οι τεχνικές έχουν τη δυνατότητα να μετακινηθούν από την υποκειμενική οπτική εκτίμηση και την παραδοσιακή επεξεργασία εικόνας στην ακριβή, αντικειμενική και αναπαραγώγιμη ανίχνευση κυττάρων.

Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να αναπτύξει μια μέθοδο για την αντικειμενική, ποσοτική αξιολόγηση πολλαπλών φλεγμονωδών κυτταρικών δεικτών, παρακάμπτοντας την ανάγκη για εκτεταμένη σειριακή τομή πλακιδίων. Για να γίνει αυτό, συνδυάζουμε πολυπλεξία IHC, πολυφασματική απεικόνιση και μοντέλα βαθιάς μάθησης. Για να δείξουμε τη δυνατότητα εφαρμογής αυτών των τεχνικών, μελετάμε τις συσχετίσεις του φλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος, που προσδιορίζεται ποσοτικά από μοντέλα βαθιάς μάθησης, με την ανάπτυξη του IFTA σε βιοψίες μοσχεύματος επιτήρησης ασθενών με DGF.

εκχύλισμα κιστάνι για τη θεραπεία παθήσεων των νεφρών

Υλικά και μέθοδοι

Για να αξιολογήσουμε το φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον στις βιοψίες νεφρού ασθενών με DGF, πραγματοποιήσαμε πολλαπλή IHC σε βιοψίες επιτήρησης που ελήφθησαν 6 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση. Οι ασθενείς στρωματοποιήθηκαν για ανάπτυξη IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Δείγματα ιστών

Χρησιμοποιήσαμε βιοψίες επιτήρησης από λήπτες μοσχευμάτων νεφρού στην Ιατρική Σχολή του Ανόβερου (Ανόβερο, Γερμανία), που αποκτήθηκαν στο πλαίσιο ενός προοπτικού προγράμματος βιοψίας επιτήρησης. Τα κριτήρια συμπερίληψης ήταν: εμφάνιση DGF (ορίζεται ως<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

Αξιολόγηση IFTA

Η έκταση της διάμεσης ίνωσης (ci) και της σωληναριακής ατροφίας (ct) (IFTA) στις 6 εβδομάδες και 6 μήνες, που εκφράζεται χρησιμοποιώντας το σύστημα ταξινόμησης αλλοιώσεων Banff [24] λήφθηκε από την αναφορά παθολογίας. Για να αξιολογηθεί λεπτομερέστερα η σχέση μεταξύ των πρώιμων φλεγμονωδών διηθήσεων και της ανάπτυξης IFTA, όλες οι διαφάνειες που χρωματίστηκαν με PAS ψηφιοποιήθηκαν για επανεξέταση χρησιμοποιώντας έναν ψηφιακό σαρωτή διαφανειών Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, Ουγγαρία) με 20 × αντικειμενικός σε ανάλυση 0,24 μm/pixel. Το PAS WSI και των δύο χρονικών σημείων (6 εβδομάδες και 6 μήνες) βαθμολογήθηκε για την έκταση του IFTA (ποσοστό επιφάνειας, με διαστήματα 10 τοις εκατό) από τρεις παθολόγους νεφρών. Οι μέσες βαθμολογίες IFTA των παθολόγων χρησιμοποιήθηκαν ως τελική βαθμολογία για τον υπολογισμό της αλλαγής στο IFTA μεταξύ 6 εβδομάδων και 6 μηνών μετά τη μεταμόσχευση. Οι ασθενείς στρωματοποιήθηκαν με απόλυτη αύξηση της βαθμολογίας IFTA 10 τοις εκατό ή περισσότερο (n=13) και καμία ή<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Επιπλέον, οι βαθμολογίες της βλάβης Banff συγκρίθηκαν μεταξύ χρονικών σημείων χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία υπογεγραμμένων βαθμίδων Wilcoxon. Αυτό αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ βιοψιών 6 εβδομάδων και 6 μηνών για τις κατηγορίες Banff ti (ρ=0.017), ci (ρ=0.004) και ct (ρ=0.011) .

Multiplex TSA χρώση

Πραγματοποιήσαμε multiplex IHC χρησιμοποιώντας mTSA για να απεικονίσουμε πολλαπλούς δείκτες κυττάρων στις βιοψίες 6 εβδομάδων. Μετά την επώαση με ένα πρωτογενές και δευτερεύον αντίσωμα, ο ιστός υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σημασμένο με φθορισμό τυραμίδιο. Η υπεροξειδάση ραπανιού από το δευτερεύον αντίσωμα καταλύει το σχηματισμό ενεργών ριζών τυραμιδίου. Οι ρίζες τυραμιδίου συνδέονται ομοιοπολικά με τα υπολείμματα τυροσίνης στο αντιγόνο. Αυτή η μόνιμη δέσμευση επέτρεψε την επαγόμενη από τη θερμότητα απομάκρυνση του πρωτεύοντος-δευτερογενούς συμπλέγματος αντισωμάτων διατηρώντας παράλληλα την εναπόθεση φθορίζοντος τυραμιδίου [25]. Αυτό επέτρεψε την επακόλουθη διαδοχική επώαση με περαιτέρω αντισώματα από το ίδιο είδος έναντι των αντιγόνων-στόχων.

Το mTSA πραγματοποιήθηκε σε δύο διαδοχικές διαφάνειες από τις βιοψίες επιτήρησης 6 εβδομάδων. Αναπτύξαμε δύο πάνελ mTSA για να αξιολογήσουμε τη φλεγμονώδη διήθηση και την περισωληνιακή τριχοειδική έκταση στις ομάδες ασθενών μας. Το πλαίσιο Ι υπήρχε από αντισώματα αντι-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 και CD34. Το πλαίσιο II χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της πόλωσης των Τ-βοηθών κυττάρων και των μακροφάγων χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-CD4, Tbet, GATA3, CD68 και CD163. Οι προδιαγραφές αντισωμάτων, οι αραιώσεις και οι εντολές χρώσης παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1. Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες αποπαραφινώθηκαν σε ξυλόλιο, αφυδατώθηκαν σε 95 τοις εκατό αιθανόλη, πλύθηκαν σε νερό βρύσης και έβρασαν για ανάκτηση επιτόπου σε 10x αραιωμένο βορικό τριπλό οξύ-ΒΕΧ0 , 0658, VWR Life Sciences, US) buffer. Μετά την ψύξη, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν σε διάλυμα υπεροξειδάσης υδρογόνου 3 τοις εκατό για αποκλεισμό ενδογενούς υπεροξειδάσης και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αλατούχου τρις-ρυθμισμένου διαλύματος με 0,05 τοις εκατό Tween 20 (822184, Merck KGaA, Γερμανία) (TBS-T). Ο αποκλεισμός πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας TBS-T με 1 τοις εκατό λευκωματίνη ορού βοοειδών (BSA) (στάδιο 1 mTSA). Τα πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύχτα στους τέσσερις βαθμούς Κελσίου (στάδιο mTSA 2). Μετά από πλύση σε TBS-T, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με HRP δευτερεύον αντίσωμα (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, The Netherlands) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (mTSA στάδιο 3). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε TSA χρησιμοποιώντας τα φθοροφόρα Opal TSA από ένα κιτ Εγχειριδίου IHC χρώματος Opal (NEL811001KT, Akoya Biosciences, US) (βήμα 4 mTSA) (τα φθοροφόρα και τα αντίστοιχα αντισώματά τους παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1). Το σύμπλοκο αντισώματος-TSA απομακρύνθηκε με έναν κύκλο βρασμού σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ (στάδιο mTSA 5). Τα βήματα 1-5 του mTSA επαναλήφθηκαν έως ότου οι αντικειμενοφόρες πλάκες χρωματίστηκαν με όλα τα αντισώματα από το σχετικό πάνελ. Οι διαφάνειες καλύφθηκαν με fluoromount-G με DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, ΗΠΑ).

βότανο cistanche

Multiplex TSA επικύρωση

Οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι βρασμού μπορούν να επηρεάσουν τη συγγένεια του επιτόπου στόχου. Ορισμένα αντισώματα παρουσιάζουν ασθενέστερο μοτίβο χρώσης μετά το βρασμό του ιστού πολλές φορές, άλλα αντισώματα χρειάζονται περισσότερους κύκλους βρασμού για να φτάσουν στη βέλτιστη ένταση χρώσης και άλλα δεν επηρεάζονται καθόλου. Αξιολογήσαμε αυτό το αποτέλεσμα για όλα τα αντισώματα χρησιμοποιώντας χρωμογόνο IHC σε ιστό αμυγδαλών ελέγχου FFPE. Για κάθε δοκιμασμένο αντίσωμα (n=9), κόπηκαν έξι τομές (πάχους 4 μm). Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες αποπαραφινώθηκαν σε ξυλόλιο, αφυδατώθηκαν σε 95 τοις εκατό αιθανόλη, πλύθηκαν σε νερό βρύσης και έβρασαν για ανάκτηση επιτόπου σε 10x αραιωμένο TBE (κύκλος βρασμού πρώτος). Μετά την ψύξη, μία αντικειμενοφόρος πλάκα ανά ελεγμένο αντίσωμα αποθηκεύτηκε σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Οι υπόλοιπες τσουλήθρες ξαναβράστηκαν. Αυτός ο κύκλος επαναλήφθηκε πέντε φορές. Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν σε διάλυμα υπεροξειδάσης υδρογόνου 3 τοις εκατό και ακολουθήθηκαν από έκπλυση σε PBS. Τα πρωτογενή αντισώματα (Συμπληρωματικός Πίνακας 1) επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν σε PBS. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες που χρωματίστηκαν με αντισώματα αντι-CD68, Θιβέτ και GATA3 απαιτούσαν μια πρόσθετη επώαση με αποκλεισμό μετά από αντισώματα (PAB) για 15 λεπτά (αναστολέας VWRKDPVB, Immunologic, Ολλανδία). Μετά την επώαση, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με HRP δευτερεύον αντίσωμα (ακολουθώντας το PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, The Netherlands, για άλλα, βλέπε δευτερεύον αντίσωμα Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Η οπτικοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 3,3'-διαμινοβενζιδίνη (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, The Netherlands). Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, προσδιορίσαμε τη βέλτιστη σειρά αντισωμάτων για τα πειράματα mTSA, όπως αναφέρεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.

Εάν τα επίτοπα ενδιαφέροντος συνεντοπίζονται, τα κοιτάσματα τυραμιδίου μπορεί να παρεμβαίνουν μεταξύ τους. Για να ελέγξουμε αυτή τη στερική αναστολή, χρησιμοποιήσαμε αντικειμενοφόρους ιστούς ελέγχου αμυγδαλών και τις βάφαμε με τα πάνελ mTSA. Η έκφραση αντισωμάτων στο mTSA συγκρίθηκε με εκείνη σε πλάκες με μονή βαφή, οι οποίες πέρασαν από τον ίδιο αριθμό κύκλων βρασμού. Δεν παρατηρήσαμε διαφορές στα μοτίβα χρώσης μεταξύ των πλακών με μονή και πολλαπλή χρώση (παραδείγματα περιλαμβάνονται από τον πίνακα Ι, Συμπληρωματικά Σχήματα 2 και 3). Όλα τα πρωτογενή αντισώματα στο mTSA χρησιμοποιήθηκαν στην ίδια αραίωση που χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο IHC. Η ένταση του σήματος φθορισμού βελτιστοποιήθηκε ρυθμίζοντας τις αραιώσεις του διαλύματος TSA.

Multiplex απεικόνιση TSA

Η πολυφασματική απεικόνιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης Vectra Polaris (CLS143455, Akoya Biosciences, ΗΠΑ) με αντικειμενικό στόχο 20x, σε ανάλυση 0,49 μm ανά εικονοστοιχείο και χρησιμοποιώντας DAPI, FITC, CY3, Texas Red και Φασματικοί κύβοι Cy5. Το σύστημα Vectra επιτρέπει τη χειροκίνητη επιλογή περιοχών για πολυφασματική απόκτηση, οι οποίες στη συνέχεια χωρίζονται από το σύστημα σε πλακίδια (Εικ. 1.1). Τα φάσματα του αυτοφθορισμού και όλα τα φθοροφόρα Opal TSA προκαταγράφηκαν σε μια φασματική "βιβλιοθήκη" χρησιμοποιώντας το Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, ΗΠΑ). Η φασματική βιβλιοθήκη επέτρεψε την αποσύνθεση του πλακιδίου πολυπλεξίας σε πολλαπλά μεμονωμένα πλακίδια που αντιπροσωπεύουν τη συμβολή κάθε φθοροφόρου ("απομίξη"). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα μονόχρωμα πλακίδια πολλαπλών καναλιών, με κάθε κανάλι να αντιστοιχεί σε ένα μόνο φθοροφόρο και επομένως αντίσωμα (Εικ. 1.2).

Μετατροπή σε τεχνητό IHC φωτεινού πεδίου

Με βάση τις αποθηκευμένες συντεταγμένες, τα πλακίδια συρράπτονταν για να δημιουργηθεί ένα πολυκαναλικό WSI χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο σενάριο python (Εικ. 1.3). Τα κανάλια που αντιπροσωπεύουν το σήμα DAPI (IDAPI) και τα κανάλια που αντιπροσωπεύουν ένα από τα αντισώματα (IIHC) μετατράπηκαν σε τεχνητή χρώση αιματοξυλίνης και DAB, αντίστοιχα (Εικ. 1.4 και 1.5). Με βάση τη γνωστή χρωματική αιματοξυλίνη και τις συντεταγμένες DAB Cx, Cy μετά από μετασχηματισμό χρωματικής πυκνότητας κορεσμού (HSD), φορείς κηλίδωσης αποκτήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες [26, 27]. Αυτά τα διανύσματα λεκέδων χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό των τιμών κόκκινου-πράσινου-μπλε για το IHC τεχνητού φωτεινού πεδίου (Εικ. 1.5), όπως:

με CR, st την απορρόφηση φωτός της χρωστικής st στο κόκκινο τμήμα του φάσματος. Οι τιμές για τα B και G υπολογίστηκαν με παρόμοιο τρόπο.

Ανάλυση εικόνας

Περιοχές ενδιαφέροντος (ROI)

Οι περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) σχολιάστηκαν για κάθε περίπτωση στην κοόρτη χρησιμοποιώντας το λογισμικό αυτόματης πλατφόρμας ανάλυσης διαφανειών (ASAP, έκδοση 1.9, διαθέσιμο ως λογισμικό ανοιχτού κώδικα στο GitHub). Αυτά τα ROI αποτελούνται από φλοιώδες σωληναριστήριο, αποκλείοντας έτσι την κάψουλα, τα σπειράματα και τις αρτηρίες. Εφόσον η φλεγμονή στις νεφρικές υποκαψικές περιοχές θεωρείται μη ειδική στην παθολογία του μοσχεύματος, οι βιοψίες σε αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν κυρίως εξαιρουμένης της υποκαψικής περιοχής (που ορίζεται ως 400 μm κάτω από την κάψουλα). Δευτερευόντως, επαναλάβαμε τις αναλύσεις συμπεριλαμβανομένης της υποκαψικής περιοχής. Οπτικά παραδείγματα των ROI περιλαμβάνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 4.

Ανίχνευση λεμφοκυττάρων CNN I

Οι τεχνητές εικόνες IHC φωτεινού πεδίου που αντιπροσωπεύουν χρώση CD3, CD4, CD8 και CD20 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα υπάρχον CNN με αρχιτεκτονική U-Net [22, 28]. Αυτό το δίκτυο σχεδιάστηκε ειδικά για την ανίχνευση κυτταροπλασματικών λεμφοκυτταρικών δεικτών σε IHC. Η απόδοση του CNN μπορεί να εκφραστεί με ακρίβεια, ανάκληση και βαθμολογία F1-, όπου:

Το CNN πέτυχε ακρίβεια {{0}},76, ανάκληση 0,79 και F{4}}βαθμολογία 0},78 στο σετ δοκιμής που χρησιμοποιήθηκε στο αρχικό χαρτί, που αποτελείται από παραδοσιακό IHC WSI. Η ανίχνευση μεμονωμένων θετικών κυττάρων απαιτεί περιορισμό του κατωφλίου της εξόδου CNN, ακολουθούμενη από μεταεπεξεργασία. Επειδή η χρώση CD3 στο πλαίσιο mTSA ήταν ισχυρότερη σε σύγκριση με τα CD4, CD8 και CD20, χρησιμοποιήθηκε χαμηλότερο όριο ανίχνευσης αντικειμένων για τα τελευταία τρία (0,4) και το αρχικό όριο ανίχνευσης αντικειμένου για CD3 (0,7). Για την αξιολόγηση της απόδοσης του CNN στα IHC WSI τεχνητού φωτεινού πεδίου σε αυτήν τη μελέτη, τέσσερα τεχνητά φωτεινά πεδίου IHC WSI (CD8 και CD20 από δύο ασθενείς) χρησιμοποιήθηκαν ως σύνολο δοκιμών σε αυτή τη μελέτη. Οι σχολιασμοί κουκκίδων (n=1115) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ASAP. Μετά την εφαρμογή του δικτύου, η ακρίβεια, η ανάκληση και η βαθμολογία F{19}} υπολογίστηκαν για την αξιολόγηση της απόδοσης του CNN. Οι ανιχνεύσεις θεωρήθηκαν αληθώς θετικές εάν βρέθηκαν εντός 4 μm (μέση διάμετρος λεμφοκυττάρων) από έναν σχολιασμό αληθείας βάσης. Όταν βρέθηκαν δύο ανιχνεύσεις εντός εύρους 4 μm, μόνο η ανίχνευση που ήταν πιο κοντά στον σχολιασμό θεωρήθηκε αληθινή θετική. Στη συνέχεια, η ανίχνευση λεμφοκυττάρων CNN I χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση όλων των τεχνητών φωτεινών πεδίων IHC WSI που αντιπροσωπεύουν δείκτες κυτταροπλασματικών λεμφοκυττάρων (CD3, CD4, CD8 και CD20).

Ανίχνευση λεμφοκυττάρων CNN II

Η ανάλυση του τεχνητού φωτεινού πεδίου IHC WSI με μοτίβα πυρηνικής χρώσης (όπως παρουσιάζονται από τα T-bet και GATA3) κανάλια που αντιπροσωπεύουν DAPI και CD4 επιλέχθηκαν να συνδυαστούν σε ένα WSI (4). Οι φορείς λεκέδων που αποκτήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες χρησιμοποιήθηκαν για να χρωματίσουν τεχνητά το σήμα DAPI μπλε (αιματοξυλίνη) και το σήμα CD4 καφέ (DAB), με αποτέλεσμα ένα τεχνητό φωτεινό πεδίο IHC WSI (5).

απαιτείται εκπαίδευση, επικύρωση και δοκιμή ενός νέου CNN. Για το σκοπό αυτό, κόπηκαν εννέα πλακίδια από ιστό ελέγχου FFPE νεφρού, αμυγδαλών και παραρτήματος. Αυτές οι διαφάνειες χρωματίστηκαν με IHC με anti-Tibet (κλώνος 4B1{{1{0}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientic, US) και anti-GATA3 (κλώνος L50-823, CM -405B, Biocare Medical, The Netherlands) αντισώματα. Οι διαφάνειες ψηφιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν ψηφιακό σαρωτή διαφανειών Pannoramic 250 Flash II σε ανάλυση 0,12 μm/pixel. Δύο παρατηρητές παρήγαγαν σχολιασμούς 5726 κουκκίδων σε διαφορετικές περιοχές χρησιμοποιώντας το λογισμικό ASAP. Οι σχολιασμοί από πέντε διαφάνειες χρησιμοποιήθηκαν για την εκπαίδευση μιας αρχιτεκτονικής U-Net CNN χρησιμοποιώντας patches των 256 × 256 pixel με μέγεθος pixel 0,49 μm/pixel. Δύο WSI χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση του CNN και για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης αντικειμένων (0,4). Η απόδοση του CNN στο παραδοσιακό IHC WSI αξιολογήθηκε σε ένα σετ δοκιμών απόκρυψης δύο IHC WSI. Η απόδοση του CNN σε τεχνητό φωτεινό πεδίο IHC WSI αξιολογήθηκε σε ένα δευτερεύον σετ δοκιμών που αποτελείται από τέσσερα τεχνητά φωτεινά πεδία IHC WSI (Θιβέτ και GATA3 από δύο ασθενείς) με σχολιασμούς 1082 κουκκίδων. Η ακρίβεια, η ανάκληση και η βαθμολογία F{22}}υπολογίστηκαν για την αξιολόγηση της απόδοσης και στα δύο σετ δοκιμών. Οι ανιχνεύσεις θεωρήθηκαν αληθώς θετικές εάν βρέθηκαν σε απόσταση 4 μm από έναν σχολιασμό αληθείας βάσης. Όταν βρέθηκαν δύο ανιχνεύσεις εντός εύρους 4 μm, μόνο η ανίχνευση που ήταν πιο κοντά στον σχολιασμό θεωρήθηκε αληθινή θετική. Στη συνέχεια, η ανίχνευση λεμφοκυττάρων CNN II χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση όλων των τεχνητών φωτεινών πεδίων IHC WSI που αντιπροσωπεύουν πυρηνικούς (λεμφοκυττάρους) δείκτες (Θιβέτ και GATA3).

Ανίχνευση μακροφάγων CNN

Σε αντίθεση με την ανίχνευση λεμφοκυττάρων, η ταυτοποίηση μεμονωμένων μακροφάγων δεν είναι σαφής. Ειδικά σε συγκεντρωμένες σκηνές, μπορεί να αναμένεται ένα σημαντικό επίπεδο μεταβλητότητας παρατηρητή. Ως εκ τούτου, ένας πολύ μεγαλύτερος αριθμός περιπτώσεων και ανθρώπινων σχολιασμών χρησιμοποιήθηκε για την εκπαίδευση ενός αποκλειστικού, τρίτου CNN για την ανίχνευση μακροφάγων CD68 plus και CD163 plus. Συλλέχθηκαν βαμμένες με IHC πλακίδια (n=111) από εγγενή και μεταμοσχευμένο νεφρικό ιστό. Οι χρωματισμοί IHC πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας anti-CD68 (κλώνος PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Δανία ή κλώνος KP1, M0876, Dako, Δανία) ή αντι-CD163 (κλώνος MRQ -26 ή 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) αντίσωμα. Οι διαφάνειες IHC ψηφιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν πανοραμικό σαρωτή διαφανειών 250 Flash II ή έναν σαρωτή διαφανειών Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, Γερμανία) σε ανάλυση 0.24 ή 0 .25 μm/pixel, αντίστοιχα. Τέσσερις παρατηρητές παρήγαγαν σχολιασμούς 37.709 κουκκίδων σε πολλαπλά ROI στα WSI, χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο για σχολιασμό μακροφάγων, το οποίο συμφωνήθηκε μετά από αρχικά πιλοτικά πειράματα. Οι σχολιασμοί από 101 διαφάνειες χρησιμοποιήθηκαν για την εκπαίδευση μιας αρχιτεκτονικής YoloV2 CNN [29]. Το Yolo είναι ειδικά κατάλληλο για εργασίες που στοχεύουν σε εργασίες ανίχνευσης. Το δίκτυο, που αποτελείται από επτά συνελικτικά στρώματα, εκπαιδεύτηκε σε μπαλώματα 256×256 εικονοστοιχείων που εξήχθησαν σε ανάλυση 0,98 μm/pixel με οριοθετημένα κουτιά 21 μm (με βάση το μέσο μέγεθος μακροφάγων). Δέκα WSI χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση του CNN και για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης αντικειμένων (0,45) και των παραμέτρων μη μέγιστης καταστολής (0,05). Η απόδοση του CNN στο παραδοσιακό IHC WSI αξιολογήθηκε σε ένα σετ δοκιμών απόκρυψης δέκα IHC WSI. Η απόδοση του CNN σε τεχνητό φωτεινό πεδίο IHC WSI αξιολογήθηκε σε ένα δευτερεύον σετ δοκιμών που αποτελείται από τέσσερα τεχνητά φωτεινά πεδίου IHC WSI (CD68 και CD163 από δύο ασθενείς) με σχολιασμούς 1033 κουκκίδων. Οι βαθμολογίες ακρίβειας, ανάκλησης και F1 υπολογίστηκαν για την αξιολόγηση της απόδοσης και στα δύο σετ δοκιμών. Οι ανιχνεύσεις θεωρήθηκαν αληθώς θετικές εάν βρέθηκαν εντός 21 μm (μέση διάμετρος μακροφάγου) από έναν σχολιασμό αληθείας βάσης. Όταν βρέθηκαν περισσότερες ανιχνεύσεις εντός εύρους 21 μm, μόνο η ανίχνευση που ήταν πιο κοντά στον σχολιασμό θεωρήθηκε αληθινή θετική. Στη συνέχεια, το CNN ανίχνευσης μακροφάγων χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση όλων των τεχνητών φωτεινών πεδίων IHC WSI που αντιπροσωπεύουν δείκτες μακροφάγων (CD68 και CD163).

cistanche tubolosa τεστοστερόνη

Διπλή θετικότητα

Η θετικότητα των κυττάρων για δύο δείκτες (διπλή θετικότητα) αξιολογήθηκε με τον προσδιορισμό του αριθμού των εικονοστοιχείων μεταξύ των ανιχνεύσεων κυττάρων στα διαφορετικά κανάλια. Εάν η απόσταση μεταξύ δύο ανιχνεύσεων λεμφοκυττάρων ήταν<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Οι αριθμοί κελιών υπολογίστηκαν εντός των ROI και οι πυκνότητες κελιών βασίστηκαν στον αριθμό των κυττάρων και στην περιοχή της σχολιασμένης απόδοσης επένδυσης.

Χωρικές σχέσεις

Η αυτοματοποιημένη ανίχνευση κυττάρων στο WSI επιτρέπει τη διερεύνηση των χωρικών σχέσεων μεταξύ των κυττάρων. Η μέση μικρότερη απόσταση προσδιορίστηκε (σε περιοχές εξαιρουμένης της υποκαψικής περιοχής) για κύτταρα CD68 plus και CD3 plus, CD3 plus CD8 plus και CD20 plus κύτταρα στο WSI του πάνελ Ι και για τις δύο ομάδες ασθενών, και μεταξύ των κυττάρων CD163 plus και CD4 plus , CD4 plus Tbet plus και CD4 plus GATA3 plus στο WSI και για τις δύο ομάδες ασθενών.

Περισωληνοειδής τριχοειδική έκταση

Προκειμένου να εκτιμηθεί η περισωληνοειδής τριχοειδική έκταση, αναλύθηκαν μη μικτά WSI που αντιπροσωπεύουν το κανάλι CD34 στα Φίτζι (έκδοση ImageJ 2.0.0, ΗΠΑ, μακροεντολές και προσθήκες: "Open and Duplicate", "ASAP ASAP" ROI Reader») [30]. Τα θετικά εικονοστοιχεία προσδιορίστηκαν μέσω του αυτόματου κατωφλίου και στη συνέχεια εκφράστηκαν ως το ποσοστό του συνολικού αριθμού εικονοστοιχείων εντός του ROI.

Στατιστική ανάλυση

Οι πυκνότητες των ακόλουθων πληθυσμών κυττάρων υπολογίστηκαν στις βιοψίες 6 εβδομάδων: Τ-λεμφοκύτταρα (CD3 plus), κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα (CD3 συν CD8 plus), Β-λεμφοκύτταρα (CD20 plus), μακροφάγα (CD68 plus, πάνελ I και II), πολωμένα μακροφάγα (CD68 συν CD163 συν, CD163 συν), Τ-βοηθητικά λεμφοκύτταρα (CD4 συν Tbet συν) και Τ-βοηθητικά 2 λεμφοκύτταρα (CD4 συν GATA3 συν). Οι συντελεστές συσχέτισης του Spearman υπολογίστηκαν για να εκτιμηθεί εάν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της πυκνότητας των λεμφοκυττάρων T-helper 1 και T-helper 2 (CD4 συν Tbet συν, CD4 συν GATA3 συν) και της πυκνότητας των πολωμένων μακροφάγων (είτε CD68 συν CD163 συν ή CD6). Παρατηρήσαμε σήμα CD68 (φθοροφόρο 540 nm) στα τεχνητά CD4 (φθοροφόρο 520 nm) IHC ενός πάνελ Ι. Επομένως, αναφέρουμε επιπλέον τις κυτταρικές πυκνότητες για τα CD3 συν CD8− κύτταρα. Για να αξιολογήσουμε τις διαφορές μεταξύ ομάδων ασθενών με διαφορετικά αποτελέσματα IFTA, αναφέρουμε τις μέσες τιμές, την ελάχιστη και τη μέγιστη κυτταρική πυκνότητα ανά ομάδα. Σημαντικές διαφορές στην κυτταρική πυκνότητα και στην έκταση των περισωληναριακών τριχοειδών (που ορίζεται ως το ποσοστό του θετικού εικονοστοιχείου CD) μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή U Mann-Whitney για ανεξάρτητα δείγματα. Το εάν οι ασθενείς με διαφορετικά αποτελέσματα IFTA εμφανίζουν σημαντικά διαφορετικές αναλογίες CD3 συν CD8−/CD3 συν CD8 συν κύτταρα, αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ t για ανεξάρτητα δείγματα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ασθενών στις χωρικές σχέσεις των κυττάρων CD68 plus και CD163 plus με άλλα ανοσοκύτταρα αξιολογήθηκαν ως προς τη σημασία τους χρησιμοποιώντας τη δοκιμή U Mann-Whitney για ανεξάρτητα δείγματα.

Αποτελέσματα

Ανίχνευση θετικών IHC κυττάρων με βάση το CNN

Προκειμένου να εφαρμοστούν τα υπάρχοντα CNN, τα οποία αναπτύχθηκαν αρχικά για μικροσκοπία φωτεινού πεδίου, οι εικόνες φθορισμού mTSA μετατράπηκαν σε τεχνητές εικόνες φωτεινού πεδίου. Παραδείγματα περιοχών χρωματισμένων με mTSA με τις αντίστοιχες εικόνες IHC τεχνητού φωτεινού πεδίου περιλαμβάνονται στην Εικ. 2. Ένα παράδειγμα ενός τεχνητού φωτεινού πεδίου IHC WSI παρουσιάζεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 4. Τα WSI πολλαπλής ανάλυσης μπορούν να ανοίξουν και να προβληθούν σε ψηφιακή διαφάνεια λογισμικό όπως το ASAP και το Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 2, το τεχνητό φωτεινό πεδίο IHC WSI ήταν κατάλληλο για αυτοματοποιημένη ανάλυση από CNN που αναπτύχθηκαν αρχικά για το παραδοσιακό IHC WSI.

Χρησιμοποιήθηκαν τρία CNN για την ποσοτική αξιολόγηση των φλεγμονωδών κυττάρων στις βιοψίες μοσχεύματος 6 εβδομάδων που χρωματίστηκαν με mTSA: για ανίχνευση λεμφοκυττάρων με κυτταροπλασματική (CNN I) και πυρηνική (CNN II) χρώση IHC και για ανίχνευση μακροφάγων. Ο Πίνακας 2 δείχνει την απόδοση του CNN (ακρίβεια, ανάκληση και F{3}}βαθμολογίες) για σετ συγκράτησης τόσο των IHC WSI που έχουν χρωματιστεί με DAB όσο και των IHC WSI τεχνητών φωτεινού πεδίου. Η απόδοση του CNN ήταν συνήθως τόσο καλή όσο ή καλύτερη από τη βασική γραμμή του CNN που περιγράφηκε προηγουμένως (με βαθμολογία F1-0,78), η οποία αποδείχθηκε ότι είχε απόδοση συγκρίσιμη με έμπειρους χειροκίνητους παρατηρητές [22] . Ενώ η ανίχνευση λεμφοκυττάρων CNN II έδειξε κάπως μειωμένη απόδοση σε εικόνες εικονικού φωτεινού πεδίου σε σύγκριση με τις πραγματικές εικόνες DAB (στις οποίες εκπαιδεύτηκε το CNN), το αντίθετο παρατηρήθηκε για το CNN για την ανίχνευση μακροφάγων.

Ένα παράδειγμα επιτυχημένης αυτόματης αξιολόγησης διπλής θετικότητας περιλαμβάνεται στο Σχ. 3.

Συσχέτιση διαφορετικών τύπων κυττάρων

Η ισχυρότερη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ CD4 συν GATA3 συν κυτταρική πυκνότητα και CD163 συν κυτταρική πυκνότητα (συντελεστής Spearman 0.75, p < 0.001)="" στο="" βιοψία="" 6="" εβδομάδων="" (συμπληρωματικό="" σχ.="" 5α).="" αυτή="" η="" συσχέτιση="" ήταν="" ασθενέστερη="" μεταξύ="" cd4="" συν="" tbet="" συν="" πυκνότητα="" κυττάρων="" και="" cd163="" συν="" κυτταρική="" πυκνότητα="" (συντελεστής="" spearman="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (συμπληρωματικό="" σχ.="" 5β)="" .="" κατά="" τον="" περιορισμό="" του="" κυτταρικού="" πληθυσμού="" σε="" διπλά="" θετικά="" μακροφάγα="" (cd68="" συν="" cd163="" συν),="" ο="" συντελεστής="" συσχέτισης="" του="" spearman="" ήταν="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" με="" κύτταρα="" cd4="" συν="" gata3="" συν="" και="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" με="" cd4="" συν="" κύτταρα="" tbet="" plus="" (συμπληρωματικό="" σχ.="" 5γ,="" δ).="" η="" συμπερίληψη="" της="" υποκαψικής="" περιοχής="" στις="" αναλύσεις="" δεν="" άλλαξε="" τα="">

Σύγκριση φλεγμονωδών διηθήσεων μεταξύασθενείς που εξελίσσονται σε IFTA έναντι μη IFTA

Οι ασθενείς που εξελίσσονταν σε IFTA στους 6 μήνες εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερες πυκνότητες CD163 συν κυτταρική στις βιοψίες που ελήφθησαν 6 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση (μέσος όρος 505 κύτταρα/mm2) σε σύγκριση με ασθενείς που δεν προχώρησαν σε IFTA (διάμεση τιμή 370 κύτταρα/mm2, p=0 .043) (Πίνακας 3). Η συμπερίληψη της υποκαψικής περιοχής είχε ως αποτέλεσμα μια ελαφρά μείωση αυτού του φαινομένου (ρ=0.051). Τα CD68 και CD4 χρησιμοποιήθηκαν και στα δύο πάνελ. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες που χρωματίστηκαν με το πάνελ mTSA I έδειξαν μεγαλύτερη θετικότητα σε CD68 από τις πλάκες που βάφτηκαν με το πάνελ mTSA II. Η πυκνότητα των κυττάρων CD4 είναι υψηλότερη στο mTSA panel II σε σύγκριση με το mTSA panel I (Πίνακας 3).

Η περισωληνοειδής τριχοειδική έκταση ήταν παρόμοια σε βιοψίες 6 εβδομάδων ασθενών με DGF με διαφορετικά αποτελέσματα IFTA (Πίνακας 3), τόσο κατά την εξαίρεση (p=0.74) όσο και κατά την εξαίρεση (p=0.90) της υποκαψικής περιοχής από/στην ανάλυση.

Η αξιολόγηση των αναλογιών CD3 συν CD8-/CD3 συν CD8 συν κύτταρα έδειξε σημαντικά υψηλότερη αναλογία σε ασθενείς με<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Η μέση μικρότερη απόσταση από κύτταρα CD68 plus έως κύτταρα CD3 plus , CD3 συν CD8 plus και CD20 plus (πλαίσιο Ι) και από κύτταρα CD163 plus έως κύτταρα CD4 plus , CD4 plus Tbet plus και CD4 συν GATA3 plus (πλαίσιο II) ήταν δεν διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των ομάδων ασθενών. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο Σχ. 4.

εκχύλισμα κιστάνι: βελτιώνει τη λειτουργία των νεφρών και τη σωματική δύναμη

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε μια μέθοδο για τον ακριβή και αντικειμενικό ποσοτικό προσδιορισμό των διηθήσεων φλεγμονωδών κυττάρων σε βιοψίες μοσχεύματος ασθενών με μεταμόσχευση νεφρού με DGF που παρακάμπτει την εκτεταμένη σειριακή κοπή υλικού βιοψίας νεφρού. Για το σκοπό αυτό, συνδυάσαμε το multiplex IHC, την ενίσχυση του σήματος τυραμιδίου, την πολυφασματική απεικόνιση και τον ποσοτικό προσδιορισμό από CNN. Ήμασταν οι πρώτοι που μετατρέψαμε πολυφασματικά δεδομένα με πλακίδια σε μία ενιαία τεχνητή χρωμογόνο εικόνα ανά δείκτη κυψέλης, διευκολύνοντας την ανάλυση WSI και την εφαρμογή CNN σχεδιασμένων για IHC φωτεινού πεδίου. Σχεδιάσαμε δύο νέα CNN για την ανίχνευση πυρηνικών λεμφοκυττάρων και μακροφάγων και δείξαμε τη δυνατότητα γενίκευσης των CNN που αναπτύχθηκαν στο παραδοσιακό IHC WSI σε τεχνητό φωτεινό πεδίο IHC WSI. Η εφαρμοσιμότητα της μεθόδου μας αποδείχθηκε χρησιμοποιώντας τα ποσοτικά αποτελέσματα που ελήφθησαν από τα CNN για τη μελέτη συσχετίσεων του φλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος σε βιοψίες 6 εβδομάδων ασθενών με DGF με την ανάπτυξη IFTA 6 μήνες μετά τη μεταμόσχευση.

Χρησιμοποιήσαμε ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ χειροκίνητης χρώσης για multiplex IHC για να απεικονίσουμε τα ανοσοκύτταρα και τα περισωληνάρια τριχοειδή αγγεία σε βιοψίες επιτήρησης που ελήφθησαν 6 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση. Η διαδικασία πολλαπλής χρώσης συνίστατο σε πολλαπλά στάδια πλύσης, επώασης και βρασμού ιστού και περιλαμβάνει διάφορα διαλύματα αντιδραστηρίων. Επομένως, οι εκτενείς επικυρώσεις μεθόδων και οι ποιοτικοί έλεγχοι έχουν μεγάλη σημασία και συνιστάται η χρήση ειδικών αντισωμάτων που αποδίδουν σταθερή ένταση χρώσης. Παρά τα βήματα επικύρωσης που εκτελέστηκαν, μοτίβα χρώσης που μοιάζουν με μακροφάγους παρατηρήθηκαν στα κανάλια CD4 των πλακών από τα πάνελ mTSA I και II. Οι κύκλοι χρώσης CD4 και CD68 δεν πραγματοποιήθηκαν διαδοχικά, επομένως αυτό το φαινόμενο δεν μπορούσε να προκληθεί από ατελή απογύμνωση του αντισώματος CD68 (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Αν και έχουν περιγραφεί σπάνιες περιπτώσεις διπλής θετικότητας μακροφάγων με CD4 [31], μια πιο εύλογη εξήγηση βρίσκεται στην εγγύτητα των φασμάτων εκπομπής των φθοροφόρων που χρησιμοποιήθηκαν για την οπτικοποίηση CD4 (520 nm) και CD68 (540 nm), και τα δύο καλύπτονται από τον κύβο φίλτρου FITC του μικροσκοπίου φθορισμού. Αυτό μπορεί να προκαλέσει "αιμορραγία" του ισχυρού σήματος CD68 στο κανάλι CD4. Μεγάλο μέρος αυτού του σήματος εξαιρέθηκε από την ανάλυση στον πίνακα Ι επειδή μόνο τα κύτταρα CD4 plus που ήταν διπλά θετικά με το CD3 χρησιμοποιήθηκαν για γενική ανάλυση Τ-βοηθών κυττάρων. Ωστόσο, αποφασίσαμε να αξιολογήσουμε έμμεσα και τα γενικά Τ-βοηθητικά κύτταρα, χρησιμοποιώντας CD3 συν CD8− ως αντικατάσταση. Στο πλαίσιο II, το CD4 χρησιμοποιήθηκε αποκλειστικά σε συνδυασμό με το Θιβέτ και το GATA3, περιορίζοντας τον κίνδυνο για τη χρήση ψευδώς θετικών ανιχνεύσεων.

Χαμηλότερη θετικότητα CD68 παρατηρήθηκε στον πίνακα II σε σύγκριση με τον πίνακα I. Υποθέτουμε ότι αυτό είναι το αποτέλεσμα της στερικής αναστολής από την εναπόθεση τυραμιδίου που ανήκει στο CD163 («φαινόμενο ομπρέλας») [32]. Παρατηρήσαμε σημαντικά περισσότερα CD163-θετικά κύτταρα στη μελετημένη κοόρτη παρά στον ιστό αμυγδαλών που χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της στερικής αναστολής, εξηγώντας πιθανώς γιατί αυτό το αποτέλεσμα δεν ανακαλύφθηκε κατά την επικύρωση.

Το Multiplex IHC έχει συνδυαστεί με πολυφασματική απεικόνιση για την εξέταση του μικροπεριβάλλοντος του όγκου σε αρκετές ογκολογικές μελέτες, και πρόσφατα επίσης για την ανάλυση της απόρριψης αλλομοσχεύματος νεφρού [33-35]. Για να εξαχθεί η συμβολή όλων των δεικτών στις διαφάνειες mTSA, οι τομές απεικονίζονται με σύστημα Vectra ή παρόμοιο μικροσκόπιο φθορισμού με πολυφασματική ρύθμιση. Μετά την εγγραφή μιας επισκόπησης εικόνας χαμηλής μεγέθυνσης, το σύστημα Vectra διαιρεί τον ιστό σε πλακίδια και σαρώνει αυτόματα τα πλακίδια πολυφασματικά. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα πλακίδια εικόνας με πολλαπλά συνεισφέροντα φάσματα. Επειδή τα φάσματα των μεμονωμένων φθοροφόρων είναι γνωστά από την προηχογραφημένη φασματική «βιβλιοθήκη», είναι δυνατή η αποσύνθεση των πλακιδίων πολυπλεξίας σε πολλαπλά μεμονωμένα πλακίδια που αντιπροσωπεύουν τη συμβολή κάθε φθοροφόρου («απομίξη»). Στις περισσότερες μελέτες, οι μη αναμεμειγμένες εικόνες αναλύονται στη συνέχεια με εμπορικό λογισμικό. Σε πολλές περιπτώσεις, αυτά τα προγράμματα δεν υποστηρίζουν ανάλυση WSI, δυσκολεύονται να αναλύσουν ομαδοποιημένα κύτταρα και συχνά δεν είναι ανθεκτικά σε τεχνουργήματα και παραλλαγές χρώσης. Η μετατροπή των μη αναμεμειγμένων πλακιδίων σε IHC WSI τεχνητού φωτεινού πεδίου, μας επέτρεψε να εφαρμόσουμε ένα υπάρχον CNN ειδικά σχεδιασμένο για ανίχνευση λεμφοκυττάρων σε IHC [22] (αναφέρεται ως ανίχνευση λεμφοκυττάρων CNN I). Αυτό το δίκτυο μπορεί να ανιχνεύσει μεμονωμένα και συγκεντρωμένα λεμφοκύτταρα με υψηλή ακρίβεια ενώ είναι ανθεκτικό στη χρώση του υποβάθρου (Εικ. 2, CD3). Επιπλέον, εκπαιδεύσαμε δύο νέα CNN για την ανίχνευση κυττάρων με μοτίβα πυρηνικής χρώσης (Θιβέτ, GATA3) (ανίχνευση λεμφοκυττάρων CNN II) και για την ανίχνευση μακροφάγων. Τα μακροφάγα είναι εμφανώς δύσκολο να ανιχνευθούν λόγω του διάσπαρτου μοτίβου χρώσης τους. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση μακροφάγων CNN εκπαιδεύτηκε χρησιμοποιώντας τους σχολιασμούς τεσσάρων διαφορετικών ειδικών. Πριν από την πραγματοποίηση των σχολιασμών, προγραμματίστηκαν πολλαπλές συναντήσεις όπου συζητήθηκαν και αξιολογήθηκαν τα κριτήρια για τον σχολιασμό των μακροφάγων. Αυτό οδήγησε σε ένα δίκτυο που μπορεί να ανιχνεύσει μακροφάγα με αναπαραγώγιμο τρόπο ενώ είναι ανθεκτικό για μη ειδική χρώση (Πίνακας 2, Εικ. 2, και Συμπληρωματικό Σχήμα 6). Από όσο γνωρίζουμε, αυτός είναι ο πρώτος αλγόριθμος για την ανίχνευση μακροφάγων σε σαρωμένες ιστοπαθολογικές τομές. Δοκιμάσαμε την απόδοση και των τριών δικτύων σε ένα δοκιμαστικό σύνολο που αποτελείται από παραδοσιακά IHC WSI (παρόμοια με αυτά που χρησιμοποιούνται κατά την προπόνηση) και σε ένα δευτερεύον σύνολο δοκιμών που αποτελούνταν από τεχνητό φωτεινό πεδίο IHC WSI, που δημιουργήθηκε από τις πολυφασματικά καταγεγραμμένες εικόνες. Όλα τα CNN εμφανίζουν πολύ καλή απόδοση στα πρωτεύοντα σετ δοκιμών και παρόμοια αποτελέσματα F{11}} στα δευτερεύοντα σετ δοκιμών. Οι μετρήσεις απόδοσης της ανίχνευσης λεμφοκυττάρων CNN I υπολογίστηκαν σε φυσιολογικό ιστό, τεχνουργήματα και συστάδες κυττάρων. Το τεχνητό IHC φωτεινού πεδίου του δεύτερου σετ δοκιμής δεν περιείχε τεχνουργήματα ιστού και λιγότερες ομάδες κυττάρων. Αυτό μπορεί να εξηγήσει τη συνολική καλύτερη απόδοση αυτού του δικτύου στο δεύτερο σετ δοκιμών. Η ανίχνευση μακροφάγων CNN εκπαιδεύτηκε και δοκιμάστηκε σε σχολιασμούς από τέσσερις διαφορετικούς σχολιαστές. Ενώ συζητήθηκαν ιδιαίτερα τα κριτήρια σχολιασμού, ωστόσο παρατηρήθηκαν παραλλαγές στο στυλ σχολιασμού. Επομένως, η ευαισθησία του CNN είναι μάλλον κάπου στη μέση των ακραίων στυλ σχολιασμού. Οι σχολιασμοί για το δεύτερο σετ δοκιμών δημιουργήθηκαν από έναν σχολιαστή, που φαινομενικά ταιριάζουν με την ευαισθησία του CNN.

Η χρήση των περιγραφόμενων CNN μας επέτρεψε να διερευνήσουμε τη φλεγμονώδη διήθηση με πρωτοφανή ακρίβεια σε μια μοναδική σειρά αυστηρά επιλεγμένων βιοψιών πρώιμης επιτήρησης μεταμοσχευμένων ασθενών με DGF.

Δυστυχώς, πολλά δείγματα έπρεπε να αποκλειστούν από την ανάλυση, κυρίως λόγω ανεπαρκούς υπολειμματικού ιστού μετά από διαγνωστική εξέταση. Ακόμη και με το περιορισμένο μέγεθος του συνόλου δεδομένων, βρήκαμε σημαντικά υψηλότερες πυκνότητες CD163 συν κυτταρική σε βιοψίες ασθενών με DGF που προχώρησαν στην ανάπτυξη του IFTA, το οποίο είναι σύμφωνο με τον δυνητικά προϊντικό ρόλο αυτών των κυττάρων [11]. Ενώ η παρατηρούμενη τάση ήταν συνεπής με τα δημοσιευμένα δεδομένα, δεν μπορέσαμε να επιβεβαιώσουμε την επιζήμια επίδραση της πρώιμης παρουσίας CD68 συν μακροφάγων που έχουν αναφερθεί προηγουμένως για άλλες ομάδες ασθενών με μεταμόσχευση νεφρού [7, 36, 37]. Βρήκαμε μια θετική συσχέτιση μεταξύ των πυκνοτήτων των κυττάρων CD4 συν GATA3 συν και κυττάρων CD163 συν, η οποία θα μπορούσε να επιβεβαιώσει τη συμβολή των λεμφοκυττάρων Τ-βοηθός 2 σε ένα προ-ινωτικό μικροπεριβάλλον. Αν και δεν ανακαλύφθηκαν νέοι προγνωστικοί βιοδείκτες για την ανάπτυξη IFTA σε ασθενείς με DGF, αναπτύξαμε με επιτυχία μεθόδους για την ακριβή, αναπαραγώγιμη και κλιμακούμενη αξιολόγηση της φλεγμονώδους διήθησης σε αραιό ιστό, όπως οι βιοψίες μοσχεύματος. Αυτές οι μέθοδοι είναι πολύτιμες για μελλοντικές ποσοτικές μελέτες σχετικά με τη φλεγμονή στον ιστοπαθολογικό ιστό.

Για να ανακουφίσετε την κόπωση των επινεφριδίων με το cistanche, κάντε κλικ εδώ για περισσότερες λεπτομέρειες

Διαθεσιμότητα δεδομένων

Τα αιτήματα συνεργασίας που περιλαμβάνουν τη χρήση δεδομένων που παρουσιάζονται σε αυτήν τη μελέτη μπορούν να απευθύνονται στον αντίστοιχο συγγραφέα (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) ή στον FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τους Mark Gorris και Kiek Verrijp για τις συμβουλές τους σχετικά με τη χρώση και την απεικόνιση mTSA, τον Merijn van Erp για την ανάπτυξη προσαρμοσμένης λειτουργικότητας ImageJ και τους Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg και Martijn Otten για τη δημιουργία βασικής αλήθειας για το δίκτυο ανίχνευσης μακροφάγων. Επιπλέον, ευχαριστούμε την Irina Scheffner για τη βοήθειά της στη συλλογή κλινικών δεδομένων.

Συνεισφορές συγγραφέαMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH και JAWML

σχεδίασε τη μελέτη. Το υλικό των ασθενών και τα κλινικά δεδομένα συλλέχθηκαν και παρασχέθηκαν από τους JS, WG και FF. Η FF συντόνισε τις προσπάθειες που έγιναν στο MHH. Οι JHB, EJS και JK σημείωσαν τη διαφάνεια PAS για το ποσοστό IFTA. Ο MH πραγματοποίησε τις χρώσεις mTSA, τις επικυρώσεις των πινάκων I και II, και την απεικόνιση και την απομίμηση του πίνακα Ι. VV απεικονισμένος και μη αναμεμειγμένος πίνακας II. Η DJG ανέπτυξε τις μεθόδους για τη μετατροπή των πλακιδίων mTSA σε τεχνητό WSI φωτεινού πεδίου. Η MH πραγματοποίησε τις μετατροπές. Ο ZS-C ανέπτυξε τα CNN ανίχνευσης λεμφοκυττάρων και έγραψε τα σενάρια για ποσοτικοποιήσεις λεμφοκυττάρων. Η JL ανέπτυξε τα CNN ανίχνευσης μακροφάγων και έγραψε τα σενάρια για ποσοτικοποιήσεις μακροφάγων. Η MH πραγματοποίησε τον κυτταρικό και τριχοειδικό ποσοτικό προσδιορισμό. Το NSS υπολόγισε τις αποστάσεις των κυττάρων. Οι MH, BS, LBH και JAWML ανέλυσαν τα δεδομένα. Ο MH έκανε τα στοιχεία και συνέταξε το χαρτί. Η τελική έκδοση του χειρογράφου αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από όλους τους συγγραφείς.

ΧρηματοδότησηΑυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από την πρωτοβουλία ERACoSysMed (project SysMIFTA) ως μέρος του προγράμματος πλαισίου της Ευρωπαϊκής Ένωσης Horizon 2020 που προσφέρεται από την ZonMw (αριθ. επιχορήγησης 9003035004), με συγχρηματοδότηση από το γερμανικό Υπουργείο Έρευνας και Παιδείας (BMBF), επιχορήγηση αρ. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) και FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). Το JAWML έλαβε αμοιβές συμβούλων από τη Philips (Ολλανδία) και επιχορηγήσεις από

ContextVision, Philips (Ολλανδία) και Sectra (Σουηδία), εκτός της υποβληθείσας εργασίας. Η JK έλαβε οικονομική υποστήριξη από το Dutch Kidney Foundation (έργο DEEPGRAFT, Grant No. 17OKG23).

Συμμόρφωση με πρότυπα δεοντολογίας

Σύγκρουση συμφερόντωνΟι συγγραφείς δεν δηλώνουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Έγκριση δεοντολογίας και συναίνεση συμμετοχήςΗ συλλογή και η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με ενημερωμένη συγκατάθεση του ασθενούς και με έγκριση του διοικητικού συμβουλίου δεοντολογίας (αρ. 2765) της Ιατρικής Σχολής του Ανόβερου.

Σημείωση εκδότηΤο Springer Nature παραμένει ουδέτερο όσον αφορά τις διεκδικήσεις δικαιοδοσίας σε δημοσιευμένους χάρτες και θεσμικές σχέσεις.

Ανοιχτή πρόσβασηΑυτό το άρθρο αδειοδοτείται με άδεια Creative Commons Attribution 4.0 Διεθνής Άδεια, η οποία επιτρέπει τη χρήση, την κοινή χρήση, την προσαρμογή, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο ή μορφή, αρκεί να αποδίδετε τα κατάλληλα εύσημα στον αρχικό δημιουργό ) και την πηγή, δώστε έναν σύνδεσμο προς την άδεια Creative Commons και υποδείξτε εάν έγιναν αλλαγές. Οι εικόνες ή άλλο υλικό τρίτων σε αυτό το άρθρο περιλαμβάνονται στην άδεια Creative Commons του άρθρου, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά σε ένα πιστωτικό όριο για το υλικό. Εάν το υλικό δεν περιλαμβάνεται στην άδεια Creative Commons του άρθρου και η χρήση για την οποία προορίζεται δεν επιτρέπεται από νομοθετική ρύθμιση ή υπερβαίνει την επιτρεπόμενη χρήση, θα χρειαστεί να λάβετε άδεια απευθείας από τον κάτοχο των πνευματικών δικαιωμάτων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Καθυστερημένη λειτουργία μοσχεύματος στη μεταμόσχευση νεφρού. Am J Transplant. 2011; 11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Παράγοντες κινδύνου μακροχρόνιας απώλειας μοσχεύματος σε λήπτες νεφρικού μοσχεύματος με χρόνια δυσλειτουργία αλλομοσχεύματος. Exp Clin Transplant. 2010; 8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Συσχέτιση μεταξύ καθυστερημένης λειτουργίας μοσχεύματος και αλλομοσχεύματος και επιβίωσης ασθενών: συστηματική ανασκόπηση και μετα-ανάλυση. Μεταμόσχευση Nephrol Dial. 2009; 24:1039-47.

4. Schröppel B, Legendre C. Καθυστερημένη λειτουργία νεφρικού μοσχεύματος: από τον μηχανισμό στη μετάφραση. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel Μ, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis Β, et αϊ. Η βαθμολογία της ολικής φλεγμονής είναι ανώτερη από την τρέχουσα βαθμολογία φλεγμονής Banff στην πρόβλεψη της έκβασης και του βαθμού μοριακής διαταραχής στα νεφρικά αλλομοσχεύματα. Am J Transplant. 2009; 9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Πρόβλεψη επακόλουθης μείωσης στη λειτουργία αλλομοσχεύματος νεφρού από βιοψίες πρώιμης επιτήρησης. Am J Transplant. 2005; 5:2464-72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Ο ρόλος των μακροφάγων στην ανάπτυξη ίνωσης ανθρώπινου νεφρικού αλλομοσχεύματος κατά το πρώτο έτος μετά τη μεταμόσχευση. Am J Transplant. 2014; 14:2126–36.

8. Ikezumi Υ, Suzuki Τ, Yamada Τ, Hasegawa Η, Kaneko U, Hara Μ, et αϊ. Εναλλακτικά ενεργοποιημένα μακροφάγα στην παθογένεση της χρόνιας βλάβης αλλομοσχεύματος νεφρού. Pediatr Nephrol. 2015; 30:1007- 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Μακροφάγος πλαστικότητα και αλληλεπίδραση με υποσύνολα λεμφοκυττάρων: ο καρκίνος ως παράδειγμα. Nat Immunol. 2010; 11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Τα νεφρικά μικροπεριβάλλοντα και οι φαινότυποι των μακροφάγων καθορίζουν την εξέλιξη ή την επίλυση της νεφρικής φλεγμονής και ίνωσης. Kidney Int. 2011; 80:915-25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Μακροφάγοι σε μεταμόσχευση οργάνων. Frontiers Immunol. 2020; 11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini Μ, et al. Υποσύνολα Τ helper 1, 2 και 17 κυττάρων σε ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού με καθυστερημένη λειτουργία μοσχεύματος. Transpl Int. 2011; 24:233-42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder Α, Bockmayr Μ, Hägele Μ, Seegerer Ρ, et αϊ. Βαθμολόγηση λεμφοκυττάρων που διεισδύουν όγκους: από την οπτική εκτίμηση στη μηχανική μάθηση. Σεμινάριο Cancer Biol. 2018; 52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Μια μέθοδος που βασίζεται στην ανάλυση εικόνας για τον ποσοτικό προσδιορισμό των παραμέτρων του δείκτη χρόνιων αλλομοσχευμάτων βλάβης. AMPS. 2006; 114:440-8.

15. Malpica Ν, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba Ι, García-Sagredo JM, et al. Εφαρμογή αλγορίθμων λεκάνης απορροής στην κατάτμηση ομαδοποιημένων πυρήνων. Κυτταρομετρία. 1997; 28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Αποτελεσματικό κυκλικό κατώφλι. IEEE Trans Med Imaging. 2014; 23:992- 1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Μια έρευνα για τη βαθιά μάθηση στην ανάλυση ιατρικής εικόνας. Med Image Anal. 2017; 42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Ανάλυση εικόνας και μηχανική μάθηση στην ψηφιακή παθολογία: προκλήσεις και ευκαιρίες. Med Image Anal. 2016; 33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Διαγνωστική αξιολόγηση αλγορίθμων βαθιάς μάθησης για ανίχνευση λεμφαδένων μεταστάσεων σε γυναίκες με καρκίνο του μαστού. ΤΖΑΜΑ. 2017; 318:2199–210.

20. Hermsen Μ, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et αϊ. Ιστοπαθολογική αξιολόγηση νεφρικού ιστού με βάση τη βαθιά μάθηση. J Am Soc Nephrol. 2019; 30:1968–79.