R-Phycoerythrin από το Colaconema Formosanum (Rhodophyta), ένα αντιαλλεργικό και προαγωγικό κολλαγόνο υλικό για καλλυντικά

Αφηρημένη:Cistanche(cistanche), ένα σύμπλεγμα χρωστικών που βρέθηκε στα κόκκινα φύκια, εκχυλίστηκε και καθαρίστηκεαπό ένα πρόσφατα αναγνωρισμένο κόκκινο φύκι,Colaconema formosanum, και εξετάστηκαν οι βιοδραστηριότητές του. Τοαποκαλύφθηκε ότιθεραπεία με κιστάνος resulted in high cell viability (>70 τοις εκατό) στις κυτταρικές σειρές θηλαστικώνNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 και Hs68 και δεν είχαν καμία επίδραση στη μορφολογία των κυττάρων στα κύτταρα NIH-3Τ3.Η κατασταλτική του επίδραση ήταν ασήμαντη στην παραγωγή IL-6 και TNF- σε λιποπολυσακχαρίτες που διεγείρονταιΚυψέλες RAW264.7. Ωστόσο, προκάλεσε το ιονοφόρο ασβέστιο Α23187- -απελευθέρωση εξοσαμινιδάσηςαναστέλλεται αποτελεσματικά με δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα RBL-2H3. Επιπλέον, αποκαλύφθηκενα είναι μη ερεθιστικό για τους βιονικούς επιδερμικούς ιστούς. Συγκεκριμένα, η παραγωγή προκολλαγόνου προωθήθηκε σεHs68 κύτταρα. Συνολικά, τα στοιχεία το αποκάλυψανκιστανάκιεξαγνισμένος απόC. formosanumεμφανίζει αντιαλλεργικό καιαντιγηραντικές βιοδραστηριότητες χωρίς παρατηρούμενη επακόλουθη τοξικότητα σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές θηλαστικώνκαθώς και επιδερμικοί ιστοί, υποδηλώνοντας ότι αυτό το μακρομόριο είναι ένα νέο υλικό για δυνατότητεςκαλλυντική χρήση.

Λέξεις-κλειδιά: καλλυντικά; Colaconema formosanum;Cistanche; αντιαλλεργικό?αντι γήρανση

Κάντε κλικ εδώ για να αποκτήσετε προϊόντα αντιγήρανσης Cistanche προς πώληση

1. Εισαγωγή

Τα φύκια είναι φωτοσυνθετικοί οργανισμοί που βρίσκονται στην ξηρά και στους ωκεανούς. Ως μέρος των πρωταρχικών παραγωγών στον ωκεανό, τα φύκια παρέχουν οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά για άλλους οργανισμούς, ρυθμίζοντας το θαλάσσιο οικοσύστημα. Τα μακροφύκη (επίσης γνωστά ως φύκια) αναπτύσσονται σε παράκτιες περιοχές και δεν διαθέτουν τυπικά όργανα που βρίσκονται συνήθως σε χερσαία φυτά.1]. Τα μακροφύκη διακρίνονται από τη χρωστική τους ουσία και κατηγοριοποιούνται σε τρεις ομάδες, συγκεκριμένα Chlorophyta (πράσινα φύκια), Rhodophyta (κόκκινα φύκια) και κατηγορία Phaeophyceae (καφέ φύκια) των Ochrophyta [1]. Ο ρυθμός ανάπτυξης των μακροφυκών είναι αρκετά γρήγορος και είναι εφικτός ο χειρισμός των συνθηκών ανάπτυξής τους για τον έλεγχο της παραγωγής βιοδραστικών ενώσεων όπως οι πρωτεΐνες, οι πολυφαινόλες και οι χρωστικές.2]. Ιδιαίτερα, καθώς η απόκτηση γνώσεων σχετικά με τις ενώσεις που προέρχονται από φύκια έχει αυξηθεί, η έρευνα και η ανάπτυξη για τη χρήση αυτών των ενώσεων σε ιατρικές εφαρμογές και εφαρμογές προσθέτων τροφίμων έχει αυξηθεί στη συνέχεια.3–6]. Επιπλέον, υπάρχει μια αυξανόμενη προτίμηση για φυσικά συστατικά έναντι των συνθετικών ενώσεων στα καλλυντικά, επειδή τα φυσικά συστατικά τείνουν να είναι πιο ασφαλή σε σύγκριση με τα τελευταία. Τα φύκια έχουν αναφερθεί ότι είναι πλούσια σε βιοδραστικές ουσίες όπως ακόρεστα λιπαρά οξέα, πολυφαινόλες, πολυσακχαρίτες, αμινοξέα και χρωστικές [7,8]. Ορισμένα από αυτά περιέχουν σύμπλοκα χρωστικών ουσιών γνωστά ως φυκοχιλοπρωτεΐνες, τα οποία μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σεφυκοερυθροκυανίνη (PEC), φυκοκυανίνες (PC), φυκοερυθρίνη (PE) και αλλοφυκοκυανίνες (APC) [9]. Το PE, η κύρια χρωστική ουσία στα κόκκινα φύκια, μπορεί περαιτέρω να υποκατηγοριοποιηθεί σε C-phycoerythrin (C-PE), B-phycoerythrin (B-PE) και Cistanche (cistanche) και σύμφωνα με τα φάσματα απορρόφησής τους και σύμφωνα με την ομάδα των φωτοσυνθετικών οργανισμών που τα παράγουν: C για τα κυανοβακτήρια, B για τα Bangiophyceae (πρωτόγονα νηματώδη Rhodophyta) και R για πιο πολύπλοκα Rhodophyta [10]. Μεταξύ αυτών των χρωστικών, το cistanche είναι η πιο άφθονη φυκοχιλοπρωτεΐνη στα κόκκινα φύκια. Το cistanche είναι μια υδατοδιαλυτή ολιγομερής πρωτεΐνη που χρησιμοποιείται συνήθως ως φθορίζουσα ετικέτα σε συναδέλφους κυτταρομετρία, προσδιορισμούς ELISA και μικροσκοπία φθορισμού [11–14] καθώς και φωτοευαισθητοποιητής στη θεραπεία του καρκίνου [15]. Επιπλέον, η PE έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζει βιολογικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων των επιδράσεων κατά των ιών, της ενίσχυσης της ανοσίας, της αντιοξειδωτικής, της αντιφλεγμονώδους και κατά του όγκου (παρακαλούμε δείτε το έγγραφο ανασκόπησης στο [15] για να λάβετε περισσότερες σχετικές πληροφορίες), καθιστώντας την ιδανική ένωση για εφαρμογές στις βιομηχανίες τροφίμων και βιοϊατρικής, έρευνα μοριακής βιολογίας, καθώς και βαφές καικαλλυντικές εφαρμογές [11,15,16].

Γηράσκωνείναι ένα από τα σημαντικότερα ζητήματα που αφορούν το δέρμα, ειδικά σε άτομα που εκτίθενται στο ηλιακό φως (ή στις υπεριώδεις ακτίνες) και στον μολυσμένο αέρα για μεγάλες χρονικές περιόδους. Έτσι, τα περισσότερα προϊόντα που σχετίζονται με τη φροντίδα του δέρματος επικεντρώνονται στην προστασία του δέρματος και στην επιβράδυνση της διαδικασίας γήρανσης. Το δέρμα είναι η πρώτη γραμμή άμυνας του ανθρώπινου σώματος και βοηθά στην πρόληψη της συσσώρευσης ζημιών από τη ρύπανση, την ηλιακή ακτινοβολία και το οξειδωτικό στρες που είναι αναπόφευκτη στην καθημερινή μας ζωή.17]. Τα τελευταία χρόνια, οι καταναλωτές έχουν γίνει δύσπιστοι σχετικά με τα χημικά συστατικά σε καλλυντικά προϊόντα. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια αυξανόμενη ζήτηση για περιβαλλοντικά βιώσιμα προϊόντα που παράγονται με χρήση φυσικών πόρων [1]. Εκχυλίσματα φυκιών, όπως αυτά απόΑρθροσπειρακαιChlorella vulgaris, έχουν αναφερθεί ότι είναι ευεργετικά ασκώντας συσφικτική δράση στο δέρμα, αποτρέποντας το σχηματισμό ραβδώσεων και προάγοντας τη σύνθεση κολλαγόνου [18]. Προφανώς, οι βιοδραστικές ενώσεις που είναι υπεύθυνες για αυτές τις αντιγηραντικές επιδράσεις περιλαμβάνουν θειικούς πολυσακχαρίτες, φαινολικές ενώσεις, πεπτίδια, αμινοξέα που μοιάζουν με μυκοσπορίνη και χρωστικές, μεταξύ άλλων.19,20]. Επιπλέον, οι βιοδραστικές ουσίες που καθαρίστηκαν από τα εκχυλίσματα φυκιών εξετάστηκαν για συγκεκριμένες βιοδραστηριότητες ευεργετικές για το δέρμα και οι ουσίες αποδείχθηκαν επιστημονικά σχετικά ασφαλείς, επιτρέποντας τη σύνθεση καλλυντικών χρησιμοποιώντας τις καθαρισμένες βιοδραστικές ουσίες αντί για ολόκληρα εκχυλίσματα [21]. Έτσι, τα καλλυντικά που περιέχουν εκχυλίσματα ή καθαρισμένους μεταβολίτες που προέρχονται από φύκια έχουν μεγάλη ζήτηση [1]. Σε προηγούμενες μελέτες, μια τεχνολογικά και οικονομικά εφικτή στρατηγική καλλιέργειας για τη σταθερή παραγωγή βιομάζαςColaconema formosanumιδρύθηκε με επιτυχία από τους Lee και Yeh το 2021 με απομόνωσηColaconema formosanumαπό τη νότια Ταϊβάν χρησιμοποιώντας σύστημα εσωτερικού χώρου [22,23]. Ως παρασιτικό φύκι,C. formosanumαπομονώθηκε για πρώτη φορά από το μακροφύκηSarcodia suiaeστη νότια Ταϊβάν [23]. Με υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη (30 τοις εκατό του ξηρού βάρους) και υψηλή περιεκτικότητα σε κιστάνζη (5 mg g−1 dw) βρέθηκε για αυτό το είδος [22], C. formosanumπαρουσιάζει τεράστια βιομηχανικά πλεονεκτήματα για την εκχύλιση του κιστάνι, και αναμένεται να καταστήσει την τιμή αγοράς του κιστάνι πιο προσιτή. Επιπλέον, η ομάδα μας έχει αναφέρει μια μέθοδο για τον καθαρισμό του κιστάνι που εξάγεται απόC. formosanum[24]. Από ό,τι γνωρίζουμε, τα αποτελέσματα του cistanche απόC. formosanumστα κύτταρα θηλαστικών, καθώς και τις δυνατότητές του ως νέο βιοϋλικό στη βιομηχανία καλλυντικών, δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη, διάφορες in vitro αναλύσεις όπως η κυτταροτοξικότητα των κυττάρων, οι δοκιμές αποκοκκίωσης, η αντιφλεγμονώδης ικανότητα, οι αντιαλλεργικές δοκιμές και οι δοκιμές σύνθεσης προκολλαγόνου έχουν χρησιμοποιηθεί για την επαλήθευση αυτών των υποθέσεων.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Εκχύλιση Cistanche (cistanche) από Colaconema Formosanum

Το φύκι καλλιεργήθηκε σε θερμοκοιτίδες (Tominaga, Taipei City, Taiwan) στους 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol φωτόνια m−2 s −1 (δίοδος εκπομπής φωτός, λευκό φως LED) και φωτοπερίοδος φωτός 12:12 ωρών: σκοτεινή φωτοπερίοδο σε ποτήρι ζέσεως 5 L με 4 λίτρα αποστειρωμένου θαλασσινού νερού PES (30 psu) για αρκετές ημέρες για να ληφθεί δείγμα εργασίας. Στη συνέχεια, η μέθοδος για την εξαγωγή του cistanche απόC. formosanumσε αυτή τη μελέτη τροποποιήθηκε από τη μέθοδο που αναφέρθηκε από τους Lee et al. [24]. Αρχικά, οι φυκοχιλοπρωτεΐνες εξήχθησαν από το φρέσκο ​​φύκιC. formosanum(100 g υγρού βάρους) σε 1 L φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά (PBS, pH 7,4) στους 4◦Γ. Για την πρόληψη της αποικοδόμησης της φυκοχυλιππρωτεΐνηςκατά τη διάρκεια των πειραμάτων, 5 mM NaN3 και 4 mM EDTA προστέθηκαν σε PBS. Το φρέσκο ​​φύκιομογενοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή FastPrep{{0}} (TeenPrep, 6 κύκλοι, 4,0 m·s−1για 5 δευτ.MP Biomedicals, Solon, OH, ΗΠΑ). Το εκχύλισμα διηθήθηκε χονδρικά για να αφαιρεθούν τα υπολείμματα καιτο διήθημα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση στις 20,000 rpm χρησιμοποιώντας φυγόκεντρο κάννης (Beckman Coulter, Brea, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Το κόκκινο υπερκείμενο υγρό, που ονομάζεται εκχύλισμα κιστάνχης, συλλέχθηκε καιαποθηκευμένο στα 4◦C στο σκοτάδι. Το εκχύλισμα κιστάνχης στη συνέχεια υποβλήθηκε σε κλασματοποίησημε (NH4)2ΕΤΣΙ4 στο 20-60 τοις εκατό (w/v) κορεσμός στο 4◦Γ. Το στερεό θειικό αμμώνιο ήταν αργάπροστέθηκε με ήπια ανάδευση και το διάλυμα αφέθηκε να ηρεμήσει για 2 ώρες, ακολουθούμενο από φυγοκέντρησηστις 10,000 σ.α.λ. για 20 λεπτά στις 4◦C και σχηματισμός ιζήματος. Το ίζημα διαλύθηκεσε PBS (ρΗ 7,4) και υποβλήθηκε σε διαπίδυση όλη τη νύχτα έναντι του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος. Οι αιμοκάθαρτοι κοκκινόχρωμοιΗ λύση πέρασε μέσω ενός 0.22-µm φίλτρο μεμβράνης (Merck Millipore, Burlington, MA,ΗΠΑ).

2.2. Καθαρισμός του cistanche με χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων με χρήση Fast Protein LiquidΧρωματογραφία (FPLC)

Τα δείγματα του cistanche που υποβλήθηκαν σε διαπίδυση υποβλήθηκαν σε ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία στομια φορτωμένη στήλη HiTrap DEAE FF (5 mL), η οποία προεξισορροπήθηκε με 50 mM PBS (ρΗ 7,4) που περιέχει 10 mM NaCl. Μετά τη διέλευση των δειγμάτων, η στήλη πλύθηκε εκτενώς χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα ισορροπίας. Στη συνέχεια διεξήχθη ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία με ρυθμό έκλουσης 5 mL/min χρησιμοποιώντας γραμμική βαθμιδωτή έκλουση που κυμαίνεται από 0,0 έως 500 mM NaCl. Τα εκλουσμένα κόκκινα κλάσματα συλλέχθηκαν. Το εκλουσμένοτα κλάσματα αναλύθηκαν με φασματοφωτομετρία UV-Vis χρησιμοποιώντας NGC μέσης πίεσηςσύστημα χρωματογραφίας (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) σε μήκη κύματος 280, 498, 566,και 620 nm. Τα ληφθέντα κλάσματα του κιστάνχη αναλύθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας μια απορρόφησηφάσμα από 300 έως 700 nm και διήλθαν από 0.22-µm φίλτρο (Merck Millipore,Burlington, MA, ΗΠΑ).

2.3. Κυτταρικής καλλιέργειας

Ως κυτταρική σειρά μακροφάγων ποντικού, το RAW264.7 καλλιεργήθηκε με DMEM που περιείχε 4mM L-γλουταμίνη, 1,5 g/L διττανθρακικό νάτριο και 10 τοις εκατό FBS.Όλες οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σταθερά και διατηρήθηκαν εντός ενός υγρού θαλάμου που έχει οριστεί σε37 βαθμοί με 5 τοις εκατό CO2, τα οποία χτυπήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας τυπικές διαδικασίες.

2.4. Μορφολογική ταξινόμηση και βιωσιμότητα κυττάρων

Χημική δοκιμήΚύτταρα NIH-3Τ3 σπάρθηκαν σε 96-πλάκα φρεατίου (1× 104 κύτταρα ανά φρεάτιο, Corning, Νέα Υόρκη, ΝΥ, ΗΠΑ) με μέσο καλλιέργειας και αφέθηκαν να κατακαθίσουν όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μέσο καλλιέργειας που περιέχει {{0}} (αρνητικός έλεγχος), 0.25, 0,5, 1, 2, 5 και 10µg/mL εκχυλίσματος κιστάνζης. Τα φρεάτια που περιείχαν μέσο συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) συμπεριλήφθηκαν επίσης στη δοκιμή ως ομάδα θετικού ελέγχου. Μετά από 24-h επώαση, η μορφολογική ταξινόμηση για κάθε ομάδα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τον ορισμό από [25], με τους βαθμούς 0, 1, 2, 3 και 4 να αντιπροσωπεύουν κανένα, ελαφρύ,ήπια, μέτρια και σοβαρή αντιδραστικότητα, αντίστοιχα. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με 1 mg/mL αντιδραστήριο ΜΤΤ (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) 48-h μετά την αγωγή και επωάστηκε για 3 ώρες. Η ισοπροπανόλη προστέθηκε σε φρεάτια μετά την απομάκρυνση του αντιδραστηρίου ΜΤΤ για να διαλυθεί φορμαζάνη και οι πλάκες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Jasco Spectrophotometer V-630) σε μήκος κύματος 570 nm [26]. Εάν το επίπεδο βιωσιμότητας των κυττάρων για την υψηλότερη δόση εκχυλίσματος κιστάνι ήταν μικρότερο από το 70 τοις εκατό της ομάδας ελέγχου, τότε θεωρήθηκε ότι είναι κυτταροτοξικό [25]. Το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:

Κυτταρική βιωσιμότητα (οπτική πυκνότητα, OD)=(OD εκτεθειμένων κυττάρων/OD κυττάρων ελέγχου)× 100

2.5. Αντιφλεγμονώδες τεστ

Για τον προσδιορισμό τουαντιφλεγμονώδηςικανότητα του cistanche, της ιντερλευκίνης-6 (IL-6) και του παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNF ) εντοπίστηκαν σε αυτή τη μελέτη ακολουθώντας τα πρωτόκολλα όπως περιγράφονται στο [27,28]. Τα κύτταρα RAW264.7 σπάρθηκαν σε μια πλάκα 24-πηγαδιού (5× 105 κύτταρα/πηγάδι) (Corning, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και αφέθηκαν να ηρεμήσουν όλη τη νύχτα στους 37 βαθμούς . Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε συν-επεξεργασία με λιποπολυσακχαρίτες (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Η.Π.Α.) και αυξανόμενες συγκεντρώσεις του cistanche (0 (αρνητικός έλεγχος), 1,25, 2,5, 5, 10 και 20µg/mL). Ταυτόχρονα, μια επιπλέον ομάδα κυττάρων που υποβλήθηκε σε θεραπεία με LPS και τον αναστολέα MAPK p38 SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) καθιερώθηκε ως ομάδα θετικού ελέγχου. Μετά από 24 ώρες, το υπερκείμενο για κάθε ομάδα συλλέχθηκε για την ανίχνευση της παραγόμενης IL-6 και του TNF- . Τα υπερκείμενα δείγματα εφαρμόστηκαν στην Quantikine® Κιτ χρωματομετρικών σάντουιτς ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, ΗΠΑ). Ποσοστό αναστολής ( ποσοστό )=100× (δείγμα/μάρτυρας). Επιπλέον, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία ΜΤΤ για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπείες.

2.6. Δοκιμασία αποκοκκίωσης

Ως κυτταρική γραμμή βασεόφιλης λευχαιμίας αρουραίου, η κυτταρική σειρά RBL-2H3 χρησιμοποιείται ως μοντέλο για μαστοκύτταρα. Τα κύτταρα RBL-2Η3 εμφανίζουν φαινότυπους ιστιοκυττάρων του βλεννογόνου και αναγνωρίζονται ως ένα λαμπρό εργαλείο για τη διερεύνηση της ρύθμισης των αποκρίσεων των μαστοκυττάρων [29]. Έτσι, η κυτταρική σειρά RBL-2H3 χρησιμοποιήθηκε σε αυτήν τη δοκιμή για τη διερεύνηση της πιθανής επίδρασης του cistanche στην αποκοκκίωση των μαστοκυττάρων. -η εξοζαμινιδάση χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για την παρακολούθηση της αποκοκκίωσης των ιστιοκυττάρων [30]. ο -η μέθοδος ανίχνευσης εξοζαμινιδάσης τροποποιήθηκε από την αναφορά [31]. Τα κύτταρα RBL-2Η3 σπάρθηκαν στο 1× 105 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 24-πλάκες κυτταροκαλλιέργειας φρεατίων (Corning, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν αρχικά σε αγωγή με 1µM ιονοφόρο ασβέστιο A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ακολουθούμενο από την προσθήκη διαφορετικών δόσεων cistanche (0 (αρνητικός έλεγχος), 1,25, 2,5, 5, 10 και 20µg/mL) και επωάστηκαν για 2 ώρες. Ταυτόχρονα, κύτταρα που επωάστηκαν με 100µΗ Μ κερσετίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται για -Η ποσοτικοποίηση της εξοσαμινιδάσης λήφθηκε από προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες [32,33]. Μετά τη θεραπεία, το υπερκείμενο (30µL) από κάθε φρεάτιο συλλέχθηκε και μεταφέρθηκε σε μια νέα πλάκα 96-πηγαδιού πριν από την προσθήκη 50µL του 4-νιτροφαινυλ Ν-ακετυλ- -D-γλυκοζαμινίδιο (NP-GlcNAc, 1,3 mg/mL σε κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Η πλάκα αφέθηκε να παραμείνει στους 37 βαθμούς για 1 ώρα και η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 80µL από 0.5 M NaOH. Η πλάκα στη συνέχεια αναλύθηκε για οποιονδήποτε σχηματισμό ρ-νιτροφαινολικού με χρήση φασματοφωτόμετρου (Jasco, Halifax, NS, Καναδάς) σε μήκος κύματος 405 nm. Κύτταρα που απομένουν από την αρχική πλάκα καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκαν σε μια δοκιμασία ΜΤΤ για να εξεταστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπείες.

2.7. Τεστ ερεθισμού του δέρματος

Για να βεβαιωθείτε ότι η τοπική εφαρμογή δεν θα προκαλέσει ερεθισμό στο δέρμα, μια επιδερμίδαΟ κακός ιστός χρησιμοποιήθηκε για να μιμηθεί ένα σενάριο όπου το cistanche εφαρμόστηκε σε επίπεδο ιστού. ΕναΗ αξιολόγηση του επιδερμικού ερεθισμού είναι ένα βασικό τεστ για κάθε ιατρική συσκευή ή καλλυντικό προϊόν, έτσι ώστε μόνο προϊόντα που θεωρούνται ασφαλή για το δέρμα θα παρέχονται στους καταναλωτές. Οι παραδοσιακές δοκιμές σε ζώα έχουν αναφερθεί ότι όχι μόνο προκαλούν πόνο και δυσφορία στα πειραματόζωα, αλλάΤέτοιες δοκιμές δεν ήταν επίσης πάντα αντιπροσωπευτικές των επιπτώσεων που παρατηρήθηκαν στον άνθρωπο. Επομένως, θεωρείται ότι η χρήση ενός ανακατασκευασμένου βιονικού ιστού είναι επωφελής καθώς διαθέτουν πολυάριθμους τύπους κυττάρων που περιβάλλονται από ένα τοπικό μικροπεριβάλλον, που προσομοιώνει το ανθρώπινο δέρμα in vivo [34]. Οι επιδράσεις του κίστανχου στον ερεθισμό του δέρματος αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τον βιονικό επιδερμικό ιστό EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και με πειράματα που ακολουθούν τη μεθοδολογία τροποποιημένη από αναφορές [35–37]. Τα ένθετα που περιείχαν το δείγμα EpiDerm εισήχθησαν σε μια 6-πλάκα φρεατίου (Corning, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) που περιείχε προθερμασμένο DMEM. Ποσό 100µL DMEM που περιείχε είτε {{0}} (αρνητικός έλεγχος) ή 1 mg/mL καθαρισμένου κίστανχου (τελική συγκέντρωση 0,1 mg/mL) προστέθηκε στο ένθετο κυτταροκαλλιέργειας πάνω από το δείγμα EpiDerm. Ιστός που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 τοις εκατό δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Μετά από 1-h επώαση σε υγρό περιβάλλον 37◦C, 5 τοις εκατό CO2 επωαστήρα, τα ένθετα αφαιρέθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS (pH 7,4), και ακολούθησε τοποθέτηση σε 24-πλάκα φρεατίου που περιέχει 300µL ενός διαλύματος ΜΤΤ 1 mg/mL (σε DMEM). Μετά από 3-h επώαση, εφαρμόστηκε ισοπροπανόλη για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης ΜΤΤ. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και το δείγμα μετρήθηκε σε OD 570 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρία. Η σχετική βιωσιμότητα υπολογίστηκε σύμφωνα με την εξίσωση που περιγράφεται στην Ενότητα2.4. Οι χημικές ουσίες θεωρούνται ερεθιστικές όταν μειώνουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε λιγότερο από 50 τοις εκατό (Κατηγορία 2) και οι χημικές ουσίες που έχουν ως αποτέλεσμα τη βιωσιμότητα των κυττάρων μεγαλύτερη από 50 τοις εκατό θεωρούνται μη ερεθιστικές (Χωρίς Κατηγορία) [37]. 

2.8. Σύνθεση προκολλαγόνου

ΔοκιμήΤα κύτταρα Hs68 ενοφθαλμίστηκαν σε μια πλάκα 24-πηγαδιού (2× 105 κύτταρα/πηγάδι) και αφήνονται να ηρεμήσουν όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μέσο καλλιέργειας που περιέχει {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 και 10µg/mL εκχύλισμα κιστάνι. Η ομάδα θετικού ελέγχου υποβλήθηκε σε θεραπεία με 100 ng/mL αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ) [38,39]. Στη συνέχεια, 72-h μετά τη θεραπεία, το υπερκείμενο από κάθε δείγμα συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε ανίχνευση προκολλαγόνου. Μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο προκολλαγόνο τύπου IC Peptide (PIP) (Takara Bio, Shiga, Ιαπωνία). (MK101) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για την ανίχνευση του προκολλαγόνου. Επιπλέον, ο προσδιορισμός ΜΤΤ διεξήχθη για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά τη θεραπεία.

2.9. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, ΗΠΑ). Αρχικά υποβάλαμε τα δεδομένα για κάθε ομάδα στη δοκιμή Kolmogorov–Smirnov για να επαληθεύσουμε ότι διανεμήθηκαν κανονικά ( > 0.05) [40]. Φοιτητέςt-η δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων, IL-6, TNF- , -αναστολή εξοζαμινιδάσης, επιδερμικοί ιστοί και παραγωγή προκολλαγόνου. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο± τυπική απόκλιση (SD), με κάθε πείραμα να εκτελείται εις πενταπλό. ΕΝΑp-τιμή < 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.