Εφαρμογή Κερσετίνης για Κοινό Κυπρίνο (Cyprinus Carpio): I. Επιδράσεις στην Αυξητική Απόδοση, την Χυμική Ανοσία, την Αντιοξειδωτική Κατάσταση, τα Γονίδια που σχετίζονται με το Ανοσοποιητικό και την Αντίσταση στο Θερμικό Στρες

Αυτή η μελέτη έγινε για να αξιολογήσει την επίδραση των διαφορετικών επιπέδων κερκετίνης στην απόδοση ανάπτυξης, τις ανοσολογικές αποκρίσεις, την αντιοξειδωτική κατάσταση, τους βιοχημικούς παράγοντες ορού και τις αποκρίσεις στρες σε υψηλή θερμοκρασία στον κοινό κυπρίνο (Cyprinus carpio). Ένας συνολικός αριθμός 216 κοινών κυπρίνων με μέσο βάρος 27:21 ± 53 g χωρίστηκαν σε 12 δεξαμενές (τέσσερις θεραπείες × τρεις επαναλήψεις) και τροφοδοτήθηκαν με 0 mg/kg κερσετίνη (Τ0), 200 mg/kg κερκετίνης (T1), 400 mg/kg κερκετίνης (T2) και 600 mg/kg κερκετίνης (T3) για 60 ημέρες. Υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην απόδοση ανάπτυξης και το υψηλότερο τελικό σωματικό βάρος (FBW), αύξηση βάρους (WG), ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (SGR) και πρόσληψη τροφής (FI) παρατηρήθηκαν σε T2 και T3 (P <0:05) .

Υπάρχει στενή σχέση μεταξύ βιοχημικών παραγόντων ορού και ανοσίας. Οι βιοχημικοί παράγοντες ορού είναι οι κύριοι μεταβολίτες στο ανθρώπινο σώμα και η αύξηση ή η μείωση των επιπέδων τους θα επηρεάσει την ανοσία του ανθρώπινου σώματος.

Οι βιοχημικοί παράγοντες του ορού περιλαμβάνουν πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, λίπη και άλλες ουσίες, οι οποίες σχηματίζουν ένα πολύπλοκο μεταβολικό δίκτυο στο ανθρώπινο σώμα. Όταν το ανθρώπινο σώμα είναι σε υγιή κατάσταση, τα επίπεδα των βιοχημικών παραγόντων στον ορό θα είναι σε ισορροπημένη κατάσταση, γεγονός που βοηθά στη διατήρηση της υγιούς κατάστασης του ανθρώπινου σώματος.

Όταν το ανθρώπινο σώμα υποφέρει από ασθένεια ή στρες, τα επίπεδα των βιοχημικών παραγόντων στον ορό θα αλλάξουν, γεγονός που θα μειώσει την ανοσία. Για παράδειγμα, όταν τα επίπεδα πρωτεΐνης και αμυλάσης στον ορό μειώνονται, η ανοσία του σώματος θα εξασθενήσει σημαντικά, με αποτέλεσμα την αυξημένη ευαισθησία σε ασθένειες.

Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να διατηρηθεί η ισορροπία των βιοχημικών παραγόντων του ορού, η οποία μπορεί να επιτευχθεί με αλλαγές στον τρόπο ζωής. Για παράδειγμα, η περισσότερη άσκηση, η κατανάλωση λιγότερων τροφών με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, αλάτι και υψηλή περιεκτικότητα σε ζάχαρη και η κατανάλωση περισσότερων φρέσκων φρούτων και λαχανικών μπορεί να βοηθήσει το σώμα να διατηρήσει υγιή επίπεδα βιοχημικών παραγόντων στον ορό, βελτιώνοντας έτσι την ανοσία.

Εν ολίγοις, οι βιοχημικοί παράγοντες του ορού σχετίζονται στενά με την ανθρώπινη ανοσία και μαζί αποτελούν το μεταβολικό δίκτυο του οργανισμού. Θα πρέπει να διατηρήσουμε έναν υγιεινό τρόπο ζωής και να διατηρήσουμε τους βιοχημικούς παράγοντες του ορού σε ισορροπία για να προστατεύσουμε την υγεία μας. Από αυτή την άποψη, πρέπει να βελτιώσουμε το ανοσοποιητικό μας. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την ανοσία επειδή το Cistanche έχει επίσης αντι-ιικές και αντικαρκινικές επιδράσεις, οι οποίες μπορούν να ενισχύσουν την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να καταπολεμά και να βελτιώσει την ανοσία του σώματος.

Κάντε κλικ στα οφέλη για την υγεία του κιστανάκι

Τα διαφορετικά επίπεδα κερσετίνης αύξησαν σημαντικά τη δραστηριότητα της οδού του συμπληρώματος (ACH50) και τη δραστηριότητα της λυσοζύμης τόσο πριν όσο και μετά τη θερμική καταπόνηση (P < 0:05). Η καταλάση (CAT), η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) και η μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) αυξήθηκαν σημαντικά σε ψάρια που εκτέθηκαν σε θερμικό στρες, αλλά τα ψάρια που τρέφονταν με συμπληρωματική διατροφή με κερκετίνη εμφάνισαν τα χαμηλότερα επίπεδα τόσο πριν όσο και μετά το θερμικό στρες (P < {{ 7}}:05). Τα επίπεδα υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) αυξήθηκαν σημαντικά σε δίαιτες που τρέφονταν με ψάρια και συμπληρωμένες με κερκετίνη και στις δύο φάσεις (P < 0:05). Τα διαφορετικά επίπεδα κερσετίνης οδήγησαν σε σημαντική μείωση της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT) και της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST) πριν και μετά τη δοκιμασία πρόκλησης (P <0:05).

Τα επίπεδα γλυκόζης και κορτιζόλης ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα ελέγχου σε σύγκριση με τις άλλες θεραπείες και στις δύο φάσεις (P < {0}}:05). Η έκφραση της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPx) και της λυσοζύμης αυξήθηκε σημαντικά σε ψάρια που τρέφονταν με δίαιτες συμπληρωμένες με κερσετίνη (P <0:05). Δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτα αποτελέσματα για την αυξητική ορμόνη (GR) και την ιντερλευκίνη-8 (IL8) (P > 0:05). Συμπερασματικά, τα διαιτητικά συμπληρώματα κερκετίνης (400- 600 mg/kg κερσετίνης) βελτίωσαν την απόδοση ανάπτυξης, την ανοσία και την αντιοξειδωτική κατάσταση και αύξησαν την ανοχή στο θερμικό στρες.

1. Εισαγωγή

Η υδατοκαλλιέργεια αναπτύσσεται σταδιακά παράλληλα με την αύξηση του παγκόσμιου πληθυσμού. Ωστόσο, οι εντατικές δραστηριότητες παραγωγής, οι ξαφνικές αλλαγές θερμοκρασίας, το ανώμαλο κλίμα και άλλες περιβαλλοντικές συνθήκες προκαλούν άγχος στα ψάρια και παρεμποδίζουν την ποιότητα και την απόδοση της παραγωγής, πυροδοτώντας ανοσοκαταστολή και αυξημένες μολυσματικές επιδημίες. Ένα από τα πιο σημαντικά περιβαλλοντικά στοιχεία στη βιομηχανία υδατοκαλλιέργειας είναι η θερμοκρασία επειδή μπορεί να επηρεάσει τον μεταβολισμό, τη συμπεριφορά διατροφής, την απόδοση ανάπτυξης, την επιβίωση και την αντοχή των υδρόβιων ζώων [1-3]. Οι αλλαγές θερμοκρασίας μείωσαν την ανάπτυξη, την αποτελεσματικότητα της τροφής, τη φυσιολογική λειτουργία, την ανοσοαπόκριση και την οξειδωτική κατάσταση στα όργανα των υδρόβιων ζώων ([3-5].

Για την καταπολέμηση τέτοιων προκλήσεων, η συμμετοχή λειτουργικών προσθέτων ζωοτροφών στη διατροφή των ψαριών είναι φιλική προς το περιβάλλον και αποτελεσματική. Αυτά τα πρόσθετα μπορούν δυνητικά να αυξήσουν την ανάπτυξη και την αναπαραγωγική απόδοση των ψαριών, την ποιότητα του φιλέτου και την αντοχή σε ασθένειες και περιβαλλοντικές συνθήκες.

Πολυφαινόλες και πρόσθετα πλούσια σε πολυφαινόλες προστίθενται στις ζωοτροφές υδρόβιων ζώων για να αυξήσουν την απόδοση ανάπτυξης, την ανοσοαπόκριση, την αντιοξειδωτική κατάσταση και την αντίσταση στις ασθένειες [6, 7]. Θεωρούμενη ως η κύρια κατηγορία φλαβονοειδών (φλαβονόλες), μια οικογένεια πολυφαινολικών ενώσεων, η κερκετίνη είναι άφθονη σε πολλά φρούτα και λαχανικά, όπως τσάι, κρεμμύδια, μήλα, φράουλες, λάχανο, ξηρούς καρπούς και κουνουπίδι.

Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η κερσετίνη αναστέλλει την παραγωγή βιοφίλμ πολλών παθογόνων βακτηριδίων όπως ο Enterococcus faecalis, ο Staphylococcus aureus, ο Streptococcus mutants, το Escherichia coli και το Pseudomonas aeruginosa με τα χαρακτηριστικά του όπως η καταστολή της απαρτίας, η διακοπή της απαρτίας. της πλασματικής μεμβράνης και αναστέλλοντας τη σύνθεση νουκλεϊκών οξέων [8]. Επιπλέον, η κερσετίνη έχει πολλές ευεργετικές ιδιότητες όπως είναι αντικαρκινικό [9], αντιοξειδωτικό και αντιφλεγμονώδες [10].

Προηγούμενα ευρήματα έδειξαν ότι η διατροφική κερσετίνη είχε θετική επίδραση στην αντιοξειδωτική κατάσταση [11, 12], στην απόδοση ανάπτυξης [13, 14], στην ποιότητα της σάρκας [15], στις αιματολογικές και ανοσολογικές παραμέτρους [16], στην αντίσταση στη νόσο [17, 18], και αμυντικές ιδιότητες ιριδοϊού σφυρίδας [19-21]. Κάποιες έρευνες έδειξαν ότι η διατροφική κερσετίνη ενίσχυσε την απόδοση ανάπτυξης του κοτόπουλου [22] και ενίσχυσε τις αισθητηριακές βαθμολογίες όπως το χρώμα, την υφή και τη συνολική αποδοχή της οσφυϊκής κατσίκας [23]. Σε υδρόβια ζώα, η κερσετίνη πάνω από 400 mg/kg βελτίωσε την απόδοση ανάπτυξης της τιλάπιας (Oreochromis spp.) [24].

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα διαιτητικά φυτικά συμπληρώματα μειώνουν τους δείκτες στρες σε ορισμένα είδη ψαριών και/ή οστρακοειδών όπως το Macrobrachium rosenbergii [25], το Megalobrama amblycephala [26] και το Oncorhynchus mykiss [27] που υποβάλλονται σε υψηλή θερμοκρασία. Ωστόσο, δεν υπάρχουν διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με την επίδραση της διαιτητικής κερκετίνης σε υδρόβια ζώα που εκτίθενται σε στρες υψηλής θερμοκρασίας. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη διεξήχθη για να συγκριθεί η επίδραση των διατροφικών συμπληρωμάτων κερσετίνης στην απόδοση ανάπτυξης, ορισμένες ανοσολογικές παραμέτρους, αντιοξειδωτική κατάσταση, ορισμένες βιοχημικές μεταβλητές ορού και αντιδράσεις στρες σε υψηλή θερμοκρασία στα ψάρια.

2. Υλικό και Μέθοδοι

2.1. Experimental Diets. Four experimental diets with different quercetin (>Διαμορφώθηκαν επίπεδα καθαρότητας 95 τοις εκατό, Sigma Chemical Co., USA (Πίνακας 1). Εν συντομία, τα ξηρά συστατικά αναμίχθηκαν επιμελώς. Μετά τη διάχυση των υγρών συστατικών στο μίγμα, προστέθηκε απιονισμένο νερό (250 ml ανά kg δίαιτας). Το παρασκευασμένο μίγμα εξωθήθηκε σε ηλεκτρικό μύλο κρέατος (MG1400R, Pars Khazar, Τεχεράνη, Ιράν) και οι τροφές διαβιβάστηκαν με βάση το μέγεθος του στόματος του ψαριού (διάμετρος 1 mm). Τέλος, παρασκευάστηκαν τέσσερις πειραματικές δίαιτες συμπεριλαμβανομένων 0 mg/kg κερκετίνης (Τ0), 200 mg/kg κερκετίνης (Τ1), 400 mg/kg κερκετίνης (Τ2) και 600 mg/kg κερκετίνης (Τ3). Τα σφαιρίδια ξηράνθηκαν σε θάλαμο ξήρανσης και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στους 4 βαθμούς C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Η χημική σύνθεση, η υγρασία, η περιεκτικότητα σε ακατέργαστες πρωτεΐνες, λιπίδια και τέφρα επιβεβαιώθηκαν με τις ακόλουθες τυπικές μεθόδους [28].

2.2. Ψάρια και Πειραματική Κατάσταση. Ένας συνολικός αριθμός 216 κοινών κυπρίνων με μέσο βάρος 27:21 ± 53 g ελήφθησαν από ένα ιδιωτικό ιχθυοτροφείο και μεταφέρθηκαν στην αίθουσα έρευνας του Πανεπιστημίου του Gonbad (Gonbad, Ιράν). Αποθηκεύτηκαν σε 12 δεξαμενές με πυκνότητα 18 ψάρια ανά δεξαμενή και εγκλιματίστηκαν σε πειραματικές συνθήκες για 10 ημέρες. Κατά τη διάρκεια της περιόδου εγκλιματισμού, ο κοινός κυπρίνος τρέφονταν με βασική διατροφή δύο φορές την ημέρα. Στο τέλος του χρόνου προσαρμογής, αυτές οι δεξαμενές ορίστηκαν τυχαία σε 4 θεραπείες με 3 επαναλήψεις και τα ψάρια τρέφονταν με ρυθμό 2,5 τοις εκατό του σωματικού βάρους δύο φορές την ημέρα για 60 ημέρες. Τα απορρίμματα ψαριών και το μισό νερό του ενυδρείου σιφώνιζαν καθημερινά και αντικαθίστανται με καλά αεριζόμενο νερό. Οι παράμετροι ποιότητας του νερού όπως η θερμοκρασία, το διαλυμένο οξυγόνο και το pH μετρήθηκαν τακτικά και διατηρήθηκαν σε τυπικά επίπεδα για τον κοινό κυπρίνο (θερμοκρασία 24:1±0:5C, διαλυμένο οξυγόνο 6:8±0:2mg/l, pH7 :36 ± 0:1 και φωτοπερίοδος 12D: 12L) [29].

2.3. Συλλογή Βιομετρίας και Αίματος. Μετά από μια περίοδο νηστείας 24 ωρών, όλα τα ψάρια σε κάθε δεξαμενή αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 200 mg l-1 σκόνης γαρύφαλλου και καταγράφηκε το βάρος κάθε ψαριού [30]. Η απόδοση ανάπτυξης και ο ρυθμός επιβίωσης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν κοινό τύπο [7]. Τρία ψάρια ανά δεξαμενή (9 ψάρια ανά θεραπεία) επιλέχθηκαν τυχαία για τη συλλογή του δείγματος αίματος. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος μέσω της ουραίας φλέβας κάθε ψαριού χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη σύριγγα και εισήχθησαν σε σωλήνες. Οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν (5000 rpm για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς C) [29], και στη συνέχεια, το υπερκείμενο διαχωρίστηκε και αποθηκεύτηκε σε -20 βαθμό C.

2.4. Πρόκληση θερμότητας. Μετά από 60 ημέρες σίτισης, χορηγήθηκε πρόκληση θερμικού στρες σύμφωνα με τους Dawood et al. [30] μελέτη εις τριπλούν. Πρώτον, η σίτιση σταμάτησε κατά τη διάρκεια της δοκιμής και επτά ψάρια που λιμοκτονούσαν ανά δεξαμενή (21 ψάρια ανά θεραπεία) διατηρήθηκαν σε παρόμοια κατάσταση με υψηλή θερμοκρασία (32 βαθμούς C) για 48 ώρες λόγω θερμικής καταπόνησης. Οι θερμαντήρες ενυδρείου χρησιμοποιήθηκαν για την αύξηση της θερμοκρασίας έως και 32 βαθμούς C και η θερμοκρασία του νερού ελέγχονταν συχνά από φορητούς πολυπαραμέτρους (YSI, Κίνα).

2.5. Δειγματοληψία αίματος και ιστών. Μετά το δύσκολο τεστ, όλα τα ψάρια σε κάθε δεξαμενή αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 200 mg l-1 σκόνης γαρύφαλλου και επιλέχθηκαν τρία ψάρια ανά δεξαμενή (9 ψάρια ανά θεραπεία) για τη συλλογή δειγμάτων αίματος. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος μέσω της ουραίας φλέβας κάθε ψαριού χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη σύριγγα και εισήχθησαν σε σωλήνες. Οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν (5000 rpm για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς C) [29], και στη συνέχεια, το υπερκείμενο διαχωρίστηκε και αποθηκεύτηκε σε -20 βαθμό C.

2.6. Δοκιμασία Βιοχημείας. Πριν και μετά από δύσκολες δοκιμές, η γλυκόζη, η αμινοτρανσφεράση αλανίνης (ALT), η ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST), η καταλάση (CAT), η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx), η μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) και η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ (Pars Azmoon , Ιράν). Η δραστηριότητα της λυσοζύμης ορού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των Saurabh και Sahoo [31] με θολερότητα. Αρχικά, παρασκευάστηκε ένα εναιώρημα Micrococcus lysodeikticus με διάλυση 0,2 mg ml-1 σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 5 Μ (ρΗ 6,2). Στη συνέχεια, 50 μΙ ορού προστέθηκαν σε ένα εναιώρημα 2 ml Micrococcus lysodeikticus και το μίγμα της αντίδρασης χωρίστηκε σε ένα τρυβλίο μικροτιτλοδότησης 96- φρεατίου (Hyperion, Γερμανία) και η αρχική OD μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 450 nm αμέσως. Η τελική OD μετρήθηκε μετά από επώαση του μίγματος της αντίδρασης στους 24 βαθμούς C για 1 ώρα. Ως μονάδα δραστικότητας λυσοζύμης ορίστηκε η ποσότητα δείγματος που προκαλεί μείωση στην απορρόφηση 0,001/λεπτό λυσοζύμης του δείγματος που βαθμονομήθηκε χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη που προσδιορίστηκε με λυσοζύμη ασπράδι αυγού κότας (Sigma) σε PBS. Η ενεργότητα εναλλακτικού συμπληρώματος ορού (ACH50) μετρήθηκε με βάση τους Yano et al. [32], όπου τα ερυθρά αιμοσφαίρια (RBCs) κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν ως στόχος. Τα επίπεδα κορτιζόλης στον ορό μετρήθηκαν με την ανταγωνιστική μέθοδο ELISA χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (IBL Co., Gesellschaft für Immunchemie und Immunbiologie).

2.7. Γονιδιακή έκφραση. Το συνολικό RNA των συκωτιών ψαριών που συλλέχτηκε μετά από μια απαιτητική δοκιμή απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ GeneAll (GeneAll Biotechnology, Σεούλ, Κορέα). Μετά την αξιολόγηση της ποιότητας του RNA με ηλεκτροφόρηση πηκτές αγαρόζης, 2 ug ολικού RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase I και χρησιμοποιήθηκαν για σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου χρησιμοποιώντας εκκινητές ολίγο (dT), 10 mM dNTPs και ανάστροφη μεταγραφάση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή οδηγίες (Thermo Scientific, Γερμανία). Ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές αναφέρθηκαν για ανάλυση RT-PCR στον Πίνακα 2. Το γονίδιο βήτα-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η qPCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση RealQ Plus Master Mix Green (AMPLIQONIII) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αντίδραση που αποτελείται από 10 μΙ πράσινου μίγματος SYBR, 1 μΙ αραιωμένου cDNA, 0,5 μΙ από κάθε εκκινητή και νερό Millipore προστέθηκε σε τελικό όγκο 20 μΙ. Για την αντίδραση χρησιμοποιήθηκε το ακόλουθο πρόγραμμα: 10 λεπτά στους 95 βαθμούς C, μετουσίωση στους 95 βαθμούς C για 10 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 60 βαθμούς C για 40 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 βαθμούς C για 35 δευτερόλεπτα για 40 κύκλους. Το επίπεδο RNA υπολογίστηκε με βάση τη μέθοδο 2-ΔΔCT [33]. Έγιναν τρεις βιολογικές επαναλήψεις για κάθε πείραμα.

2.8. Στατιστική ανάλυση. Τα δεδομένα (μέση τιμή ± SD) αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από δοκιμή πολλαπλών εύρους Duncan για σύγκριση των μέσων τιμών μεταξύ των ομάδων. Πριν από τις αναλύσεις, τα δεδομένα αξιολογήθηκαν ως προς την κανονικότητα και την ομοιογένεια της διακύμανσης με τη δοκιμή Shapiro-Wilk και τη δοκιμή Levene, αντίστοιχα. Η αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε επίσης για τον έλεγχο των επιπτώσεων της δίαιτας, του θερμικού στρες και των αλληλεπιδράσεων τους. Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS έκδοση 23 και το P < 0:05 ήταν το αποδεκτό επίπεδο σημαντικότητας.

3. Αποτελέσματα

3.1. Επιδόσεις Ανάπτυξης. Υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην απόδοση ανάπτυξης και τα υψηλότερα FBW, WG, SGR και FI παρατηρήθηκαν σε T2 και T3 (Πίνακας 3, P < 0:05). Η FCR μειώθηκε σημαντικά στην κερκετίνη που τρέφεται με ψάρια (Πίνακας 3, Σελ< 0:05).

3.2. Ανοσολογική απόκριση ορού. Η δραστηριότητα της λυσοζύμης και της ACH50 μειώθηκε σημαντικά όταν οι κοινοί κυπρίνοι εκτέθηκαν σε θερμικό στρες και η χαμηλότερη δραστηριότητα παρατηρήθηκε σε ψάρια που τρέφονταν με δίαιτα ελέγχου και ψάρια που τρέφονταν με συμπληρωμένες δίαιτες, αντιπροσωπεύοντας τα υψηλότερα επίπεδα (Πίνακας 4, P < 0:05). Πριν και μετά τη θερμική καταπόνηση, τα διαφορετικά επίπεδα κερκετίνης αύξησαν σημαντικά την ACH50 και τη δραστηριότητα της λυσοζύμης και οι υψηλότερες δραστηριότητες παρατηρήθηκαν σε ψάρια που τρέφονταν με 400 (Τ2) και 600 (Τ3) mg/kg κερκετίνης (Πίνακας 4, P <0:05).

3.3. Αντιοξειδωτικά Ένζυμα. Η καταλάση, η MDA και η GPx αυξήθηκαν σημαντικά σε ψάρια που εκτέθηκαν σε θερμικό στρες, με τα υψηλότερα επίπεδα στα ψάρια που τρέφονταν με δίαιτα ελέγχου και στα ψάρια που τρέφονταν με συμπληρωματική δίαιτα με κερκετίνη να παρουσιάζουν τα χαμηλότερα επίπεδα (Πίνακας 4, P < {{3} }:05). Τα επίπεδα SOD μειώθηκαν σημαντικά σε ψάρια που εκτέθηκαν σε θερμικό στρες (όταν όλες οι θεραπείες συνδυάστηκαν). Επίσης, υπήρξε σημαντική διαφορά στα επίπεδα SOD μεταξύ των θεραπειών πριν και μετά τη θερμική πρόκληση και το υψηλότερο επίπεδο καταγράφηκε στο Τ2 και στις δύο φάσεις (Πίνακας 5, P < 0:05).

3.4. Παράμετροι στρες. Πριν και μετά το θερμικό στρες, τα επίπεδα γλυκόζης και κορτιζόλης ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα ελέγχου σε σύγκριση με τις θεραπείες συμπληρωμάτων κερκετίνης (Πίνακας 6, P < 0:05). Η έκθεση του κοινού κυπρίνου σε υψηλές θερμοκρασίες οδήγησε σε σημαντική αύξηση των AST και ALT σε όλες τις θεραπείες, αλλά τα ψάρια που τρέφονταν με 600 mg/kg κερκετίνης είχαν τα χαμηλότερα επίπεδα (Πίνακας 6, P <0:05). Επιπλέον, πριν και μετά την πρόκληση, η υψηλότερη και η χαμηλότερη δραστηριότητα ALT και AST παρατηρήθηκαν στην ομάδα ελέγχου και στην T3, αντίστοιχα (Πίνακας 6, P < 0:05).

3.5. Γονιδιακή έκφραση. Μετά από έκθεση σε θερμικό στρες, η έκφραση του GPx (Εικόνα 1(α)) ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω και τα υψηλότερα επίπεδα RNA παρατηρήθηκαν σε ψάρια που τρέφονταν με 400 mg/kg κερκετίνης (P <0: 05). Δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτα αποτελέσματα για το GR (Εικόνα 1(β)) και το IL8 (Εικόνα 1(γ)), ​​αλλά ήταν υψηλότερα σε ψάρια που τρέφονταν με τροφές συμπληρωμένες με κερκετίνη (P > 0:05).

Η έκφραση του γονιδίου της λυσοζύμης ήταν αξιοσημείωτα υψηλότερη στον κοινό κυπρίνο που τροφοδοτήθηκε με τροφές συμπληρωμένες με κερκετίνη από ό,τι στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 1(δ)).

4. Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, η διατροφική ενσωμάτωση κερκετίνης βελτίωσε σημαντικά την ανάπτυξη και την αποτελεσματικότητα της τροφής στον κοινό κυπρίνο. Αντίστοιχα, τα καλύτερα WG, SGR, FI και FCR λήφθηκαν στα ψάρια που τρέφονταν με δίαιτες συμπληρωμένες με κερσετίνη 400 και 600 mg/kg. Προηγούμενα ευρήματα έδειξαν ότι η διατροφική κερκετίνη είχε θετική επίδραση στο WG, SGR και FCR στην τιλάπια του Νείλου (Oreochromis niloticus) [34], στον κυπρίνο (Ctenopharyngodon idella) () και στον κοινό κυπρίνο [13]. Η προαγωγική επίδραση της κερσετίνης στην απόδοση ανάπτυξης των ψαριών μπορεί να σχετίζεται με την καλύτερη αποτελεσματικότητά τους στην τόνωση της έκκρισης πεπτικών ενζύμων όπως η πρωτεάση, η αμυλάση και η λιπάση [13, 34], μειώνοντας την αφθονία επιβλαβών βακτηρίων του εντέρου και προάγοντας τους πληθυσμούς των ωφέλιμα βακτήρια [35], βελτιώνοντας τη λειτουργία του εντερικού φραγμού και βελτιώνοντας την επιφάνεια των εντερικών λαχνών και των κύλικων κυττάρων [36].

Η δραστηριότητα ACH50 είναι μια σημαντική παράμετρος που ωφελήθηκε στην αξιολόγηση της χυμικής μη ειδικής ανοσοαπόκρισης στα ψάρια. Αναφέρεται μείωση των επιπέδων ACH50 στον ορό σε διαφορετικές καταστάσεις στρες στις οποίες εκτίθενται τα ψάρια. Στην παρούσα μελέτη, η δραστηριότητα του ACH50 ορού αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα που συμπληρώθηκε με τις δόσεις των 400 και 600 mg/kg κερκετίνης πριν από το στρες και μετά το στρες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Συμπερασματικά, καθώς το ήπαρ είναι η κύρια πηγή πρωτεϊνών του συμπληρώματος, η αύξηση των επιπέδων ACH50 μπορεί να εξηγηθεί με τη βελτίωση της υγείας και της λειτουργίας του ήπατος. Τα αποτελέσματά μας όσον αφορά την αύξηση της δραστικότητας του ACH50 συμφωνούν πλήρως με τα ευρήματα προηγούμενων μελετών σε κοινές δίαιτες που τρέφονται με κυπρίνο και ενσωματώνονται με 200 ή 800 mg/kg κερκετίνης [16]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα συμβαδίζουν με προηγούμενες μελέτες που έδειξαν ότι τα εξωγενή πρόσθετα ζωοτροφών είναι επιτυχή στην πρόληψη της μείωσης της δραστηριότητας του συμπληρώματος μετά το στρες [37, 38].

Η λυσοζύμη είναι ένα σημαντικό αντιμικροβιακό πεπτίδιο του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος που εισβάλλει παθογόνα. Σημαντική μείωση στη δραστηριότητα της λυσοζύμης ορού βρέθηκε στην ομάδα ελέγχου ψαριών που εκτέθηκαν στους 32 βαθμούς C για 48 ώρες. Παρόμοια μείωση στη δραστηριότητα της λυσοζύμης ορού σε υψηλότερες θερμοκρασίες παρατηρήθηκε στην τιλάπια του Νείλου, Oreochromis niloticus [39]. Στην παρούσα μελέτη, η δραστηριότητα της λυσοζύμης ορού ήταν σημαντικά αυξημένη σε όλες τις ομάδες που έλαβαν συμπλήρωμα κερκετίνης πριν και μετά το στρες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αυτό υποδηλώνει ότι η συμπλήρωση κερκετίνης αναστέλλει την ανοσοκαταστολή του στρες μετά την υψηλή θερμοκρασία.

Παράλληλα με τη μελέτη μας, τα επίπεδα λυσοζύμης έχουν επίσης αυξηθεί σε ορισμένα είδη ψαριών που τρέφονται με τροφές που περιέχουν κερσετίνη. Για παράδειγμα, το C. carpio που τρέφονταν με δίαιτα που περιείχε 200 ή 800 mg kg−1 κερκετίνη έδειξε αύξηση στα επίπεδα της λυσοζύμης στον ορό, το έντερο και τη βλέννα [16]. Οι Wang et al. [18] πρόσθεσε 0,01, 0,1, 1, 10, 100 και 1000 ug/l κερκετίνη στο νερό εκτροφής του ψαριού ζέβρα (Danio rerio) και ανέφερε ότι η δραστηριότητα της λυσοζύμης στον ορό ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα κερκετίνης 1 ug/l από ό,τι στην ομάδα ομάδα ελέγχου.

Είναι ευρέως γνωστό ότι η γλυκόζη του ορού χρησιμοποιείται ως μη ειδικός δείκτης στρες σε μελέτες ψαριών [40, 41]. Σε αυτή τη μελέτη, τα συμπληρώματα κερκετίνης μείωσαν σημαντικά την περιεκτικότητα σε γλυκόζη στον ορό στην ομάδα προέντασης. Υπάρχουν ορισμένες αναφορές σχετικά με τις υπογλυκαιμικές επιδράσεις της κερκετίνης [42, 43]. Αυτό υποστηρίχθηκε σε μια πρόσφατη μελέτη, όπου η κερσετίνη μειώνει τα επίπεδα γλυκόζης στον ορό στον κοινό κυπρίνο [16]. Ωστόσο, σε αντίθεση με τη μελέτη μας, τα επίπεδα γλυκόζης στον ορό στο ασημένιο γατόψαρο, το Rhamdia queen [12] και το αμβλύ ρύγχος τσιπούρα, Megalobrama amblycephala [44], που τρέφονταν με τροφή που περιείχε κερκετίνη παρέμειναν αμετάβλητα.

Η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), η καταλάση (CAT) και η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) είναι τα κύρια ένζυμα που καθαρίζουν τα ενεργά είδη οξυγόνου (ROS) και την αποτοξίνωση του H2O2 και των υδροϋπεροξειδίων, αντίστοιχα. Επιπλέον, η μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) χρησιμοποιείται συχνά ως βιοδείκτης της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Τα αποτελέσματά μας όσον αφορά την αύξηση του SOD και τη μείωση της δραστηριότητας του MDA συμφωνούν πλήρως με τα ευρήματα προηγούμενων μελετών σε δίαιτες κοινού κυπρίνου, C. carpio, που τροφοδοτήθηκαν με 800 mg/kg κερκετίνης. Ομοίως, ο Ibrahim et al. [45] ανέφεραν την αυξημένη SOD και GPx και τη μειωμένη επίδραση MDA της κερκετίνης στην τιλάπια του Νείλου, Oreochromis niloticus.

Επιπλέον, η έκφραση του mRNA SOD [46] και τα επίπεδα δραστηριότητας SOD και CAT του εγκεφάλου, των βραγχίων, του ήπατος και/ή των μυών [12] ήταν υψηλότερα σε ψάρια που τρέφονταν με δίαιτες κερκετίνης. Οι παράμετροι SOD, CAT, MDA και GPx παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιοξειδωτική απόκριση σε διαφορετικές συνθήκες στρες όπως φυτοφάρμακα [47], μέταλλα [48], υψηλές θερμοκρασίες [49, 5{0], υποξία [50] και χαμηλές θερμοκρασίες [51]. Ωστόσο, δεν υπάρχει διαθέσιμη μελέτη σχετικά με τις επιδράσεις της κερσετίνης στην αντιοξειδωτική ικανότητα σε ψάρια υπό συνθήκες στρες υψηλής θερμοκρασίας. Στην παρούσα μελέτη, τα μειωμένα επίπεδα CAT, MDA και GPx και αυξημένα επίπεδα SOD που παρατηρήθηκαν σε συνθήκες στρες μετά από υψηλή θερμοκρασία υποδεικνύουν σημαντική αντιοξειδωτική δράση της κερκετίνης. Ομοίως, το διατροφικό εκχύλισμα ανθρακινόνης, ειδικά σε επίπεδα 0,{12}},2 τοις εκατό αύξησε σημαντικά το SOD και μειωμένα επίπεδα MDA στο ήπαρ αναφέρθηκαν στο M. rosenbergii υπό στρες υψηλής θερμοκρασίας [25].

Οι ενζυμικές δραστηριότητες του ορού γίνονται αποδεκτές ως σημαντικοί δείκτες ιστικής βλάβης. για παράδειγμα, το AST και το ALT είναι δείκτες ηπατικής βλάβης και η γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) για ηπατική ή μυϊκή βλάβη στα ψάρια [52]. Επομένως, οι αυξήσεις σε αυτά τα ένζυμα στο αίμα θα μπορούσαν να αποδοθούν σε βλάβη του ήπατος και του μυϊκού ιστού. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι οι δραστηριότητες ALT και AST στον ορό που παρέχονται μειώθηκαν όταν τα ψάρια τρέφονταν με κερκετίνη [13, 16]. Καμία μελέτη σχετικά με τις επιδράσεις της κερσετίνης υπό πίεση υψηλής θερμοκρασίας στα επίπεδα ενζύμων στον ορό των ψαριών δεν έχει βρεθεί μέχρι στιγμής στη βιβλιογραφία. Ωστόσο, [25] ανέφερε ότι οι δραστηριότητες AST και ALT σε γαρίδες γλυκού νερού (M. rosenbergii) που τροφοδοτούνταν με δίαιτα που περιείχε εκχύλισμα ανθρακινόνης από το R. officinale Bail υπό πίεση υψηλής θερμοκρασίας ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των ψαριών ελέγχου. Σε αυτή τη μελέτη, η AST και η ALT ορού (εκτός από 200 mg/kg) μειώθηκαν σε ψάρια που τρέφονταν με τροφές συμπληρωμένες με κερκετίνη πριν από το στρες υψηλής θερμοκρασίας. Αυτή η τάση διατηρήθηκε και μετά από καταπόνηση υψηλής θερμοκρασίας.

Τα χαμηλά επίπεδα γλυκόζης στον ορό στα ψάρια που έχουν στρες σε υψηλή θερμοκρασία μπορεί να είναι αποτέλεσμα υποσιτισμού, διαταραχών του ήπατος και φλεγμονής [25, 50, 53]. Αυτό μπορεί να σχετίζεται με τις αυξήσεις στη χρήση γλυκόζης στους περιφερικούς ιστούς, που πιθανώς σχετίζεται με την ενίσχυση της ενεργειακής ζήτησης που δημιουργείται από την απόκριση στο στρες [54]. Παρόμοια μείωση στο επίπεδο γλυκόζης του ορού σε υψηλότερη θερμοκρασία (21 βαθμοί C) παρατηρήθηκε στην ιριδίζουσα πέστροφα, Oncorhynchus mykiss [50]. Σε αντίθεση με τα ευρήματά μας, ωστόσο, αυξημένα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα αναφέρθηκαν στην τσιπούρα Wuchang, M. amblycephala, υπό υψηλή θερμοκρασία [26]. Αυτά τα διαφορετικά αποτελέσματα μπορεί να σχετίζονται με διαφορές στις συνθήκες εκτροφής, στο χρόνο έκθεσης, στα είδη ψαριών, στο μέγεθος των ψαριών ή/και στην ηλικία.

Η κορτιζόλη του αίματος είναι ένας από τους πιο σημαντικούς δείκτες της απόκρισης στο θερμικό στρες στα ψάρια [55]. Σε αυτή τη μελέτη, τα επίπεδα κορτιζόλης ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε ψάρια που τρέφονταν με διαφορετικά επίπεδα κερσετίνης πριν από το θερμικό στρες. Επίσης, τα ψάρια που τρέφονταν με δίαιτες συμπληρωμένες με κερκετίνη εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα κορτιζόλης μετά από θερμικό στρες, υπογραμμίζοντας την προστατευτική δυνατότητα της συμπλήρωσης κερκετίνης στον μεταβολισμό του κοινού κυπρίνου. Ομοίως, τα τιλάπια του Νείλου που τρέφονταν με διαιτητικό βουτυρικό νάτριο παρουσίασαν μείωση στα επίπεδα κορτιζόλης όταν εκτέθηκαν σε θερμικό στρες [30]. Σε αυτή τη μελέτη, η κορτιζόλη ήταν σημαντικά χαμηλότερη κατά τη διάρκεια της θερμικής καταπόνησης στην κερκετίνη που τρέφονταν με ψάρια σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να σχετίζονται με τις αντιστρες επιδράσεις της κερσετίνης που ανέστειλε τον τομέα της αυξημένης κορτιζόλης.

Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, μπορεί να προταθεί ότι η κερσετίνη (400-600 mg/kg) μπορεί να είναι μια χρήσιμη ουσία για τη θεραπεία και την προστασία των κυττάρων από πιθανό οξειδωτικό στρες.

Διαθεσιμότητα δεδομένων

Τα σύνολα δεδομένων που δημιουργήθηκαν κατά τη διάρκεια ή/και αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια της τρέχουσας μελέτης είναι διαθέσιμα από τους αντίστοιχους συγγραφείς κατόπιν εύλογου αιτήματος.

Συγκρούσεις συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων

Ευχαριστίες

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο του Zabol (Ιράν) με κωδικό επιχορήγησης (IR-UOZ-GR-6313). Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Πανεπιστήμιο Chiang Mai.

βιβλιογραφικές αναφορές

[1] F. Wu, C. Yang, H. Wen, et al., "Improving low-temperature stress tolerance of tilapia, Oreochromis niloticus: a functional analysis of Astragalus membranaceus", Journal of the World Aquaculture Society, τομ. 50, αρ. 4, σελ. 749–762, 2019.

[2] ME Abd El-Hack, SA Abdelnour, AE Taha, et al., "Herbs as thermoregulatory agents in poultry: an overview," Science of the Total Environment, τομ. 703, άρθρο 134399, 2020.

[3] C. Liu, W. Shen, C. Hou et al., "Low temperature-induced variation in plasma biochemical indices and aquaglyceroporin gene expression in the large yellow croaker Larimichthys crocea", Scientific Reports, τομ. 9, αρ. 1, σελ. 1–10, 2019.

[4] J. Qiang, H. Yang, H. Wang, P. Xu, Z. Qi, and J. He, "Μελέτες για βιοχημικούς δείκτες αίματος και έκφραση ηπατικού HSP70 mRNA διαφορετικών στελεχών τιλάπιας που προκαλούνται τεχνητά με streptococcus iniae, " Journal of Fisheries of China, τομ. 36, αρ. 6, σελ. 958–968, 2012.

[5] IS Vicente, LF Fleuri, PL Carvalho, et al., "Το θραύσμα φλοιού πορτοκαλιού βελτιώνει την αντιοξειδωτική ικανότητα και το αιματολογικό προφίλ της τιλάπιας του Νείλου που υποβάλλεται σε στρες που προκαλείται από τη θερμότητα/διαλυμένο οξυγόνο," Aquaculture Research, τομ. 50, αρ. 1, σελ. 80– 92, 2019.

[6] E. Ahmadifar, M. Yousefi, M. Karimi, et al., "Onefits of diet polyphenols and polyphenol-rich additives to aquatic animal health: an overview," Reviews in Fisheries Science & Aquaculture, vol. 29, αρ. 4, σελ. 478–511, 2021.

[7] E. Ahmadifar, M. Eslami, N. Kalhor, et al., «Επίδραση μιας δίαιτας εμπλουτισμένης με προπιονικό νάτριο στην απόδοση ανάπτυξης, την αντιοξειδωτική ιδιότητα, την εγγενή-προσαρμοστική ανοσοαπόκριση και την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη σε κρίσιμα απειλούμενα οξύρρυγχος beluga (Huso huso)," Fish & Shellfish Immunology, τομ. 125, σελ. 101–108, 2022.

[8] H. Memariani, M. Memariani, and A. Ghasemian, "An overview on anti-biofilm properties of quercetin against bacterial pathogens," World Journal of Microbiology and Biotechnology, τομ. 35, αρ. 9, 2019.

[9] SS Baghel, N. Shrivastava, RS Baghel, P. Agrawal, and S. Rajput, "A review of quercetin: antioxidant and anticancer ιδιότητες", World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, τομ. 1, αρ. 1, σελ. 146–160, 2012.

[10] M. Lesjak, I. Beara, N. Simin, et al., "Αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδης δράση της κερκετίνης και των παραγώγων της", Journal of Functional Foods, τομ. 40, σελ. 68–75, 2018.

[11] TS Pês, EM Saccol, É. P. Londero et al., "Protective effect of quercetin έναντι οξειδωτικού στρες που προκαλείται από oxytetracycline in the muscle of silver catfish", Aquaculture, τομ. 484, σελ. 120–125, 2018.

[12] TS Pês, EM Saccol, GM Ourique, et al., "Quercetin in the diet of silver catfish: effect on antioxidant status, blood parameters, and pituitary hormone expression," Aquaculture, vol. 458, σελ. 100–106, 2016.

[13] H. Ghafarifarsani, SH Hoseinifar, S. Javahery, M. Yazici, and H. Van Doan, "Αναπτυξιακή απόδοση, βιοχημικές παράμετροι και πεπτικά ένζυμα στον κοινό κυπρίνο (Cyprinus carpio) που τρέφονται με πειραματικές δίαιτες συμπληρωμένες με βιταμίνη C, θυμάρι αιθέριο έλαιο και κερκετίνη", Italian Journal of Animal Science, τομ. 21, αρ. 1, σελ. 291–302, 2022.

[14] SW Zhai και SL Liu, "Επιδράσεις της διαιτητικής κερκετίνης στην απόδοση ανάπτυξης, τα επίπεδα λιπιδίων ορού και τη σωματική σύνθεση της τιλάπιας (Oreochromis niloticus)," Italian Journal of Animal Science, τομ. 12, αρ. 4, άρθρο ε85, 2013.

[15] Z. Xu, X. Li, H. Yang, G. Liang, B. Gao, and X. Leng, "Η διαιτητική κερσετίνη βελτίωσε την ανάπτυξη, την αντιοξείδωση και την ποιότητα της σάρκας του χόρτου κυπρίνου (Ctenopharyngodon idella)," Περιοδικό of the World Aquaculture Society, τομ. 50, αρ. 6, σελ. 1182–1195, 2019.

For more information:1950477648nn@gmail.com