Βρέθηκαν πρωτεΐνες με συχνότητα τουλάχιστον 2 σε κάθε εξεταζόμενη κατάσταση

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Επιπλέον, όπως και από τα διαγράμματα ράβδων στα Σχήματα 5Β και 6Β, η διακριτή κατανομή πρωτεΐνης σύμφωνα με την υποξική προετοιμασία του εκκρινόμενου κυττάρου είναι αισθητή. Σε αυτή την περίπτωση, για πλήρη ενημέρωση, αναφέρθηκαν επίσης πρωτεΐνες που δεν υπερβαίνουν το όριο του συνόλου DAve και DCI. Το εμβρυϊκό έχει αποτελέσματα έκκρισης εμπλουτισμένα με την πρωτεΐνη θερμικού σοκ 60 kDa (HSPD1, Εικόνα 5Β, αριστερό πλαίσιο) στην υποξική του σύνθεση, ενώ το αντίστοιχο περιγεννητικό εκφράζει έντονα το ρυθμιστικό [52]ελαφρύ πολυπεπτίδιο 9 (MYL9, Σχήμα) της συσταλτικής μυοσίνης των λείων μυϊκών κυττάρων 5Β, δεξιός πίνακας). Ένα σημαντικό μερίδιο της διαφοράς μεταξύ των σταδίων κύησης φαίνεται να εξαρτάται περισσότερο από την υποξική προετοιμασία στο hAFS. EVs; Τα f-have-EVs που ελήφθησαν από την εκκίνηση υποξικών κυττάρων βρέθηκαν εμπλουτισμένα με παράγοντες όπως Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Υπομονάδα Λαμινίνης -5 και -1(LAMA5 και LAMB1), Θρομβοσποντίνη{{17 }} (THBS1, Εικόνα 6Β, αριστερό πλαίσιο). Τα υποξικά p-hAFS-EVs περιείχαν βαριά αλυσίδα φερριτίνης (FTH1), πρωτεΐνες σκαλωσιάς όπως Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6 (ANXA6), αναστολέα διάστασης GDP Rab βήτα (GDI2), μαζί με Thy -1 γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης (THY1), Neuropilin-1(NRP1) και Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, Εικόνα 6Β, δεξιός πίνακας).

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Πρωτεΐνες βρέθηκαν με συχνότητα τουλάχιστον 2 σε κάθε εξεταζόμενη κατάσταση στο f-hAFS. Τα EV και τα p-hAFS-EV συγκρίθηκαν περαιτέρω με τη βάση δεδομένων Vesciclepedia [53]. Όπως αναμενόταν, η πλειονότητα των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών (96 τοις εκατό ) έχουν περιγραφεί προηγουμένως σε EV και εξωσώματα στη βάση δεδομένων αναφοράς (Εικόνα S3A).οφέλη από το cistancheΑπό αυτή την άποψη, η ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακής οντολογίας (GO) πραγματοποιήθηκε μέσω του FunRich [54]. Η αφθονία των όρων GO στο σύνολο δεδομένων συγκρίθηκε με τη φυσική τους ποσότητα στη βάση δεδομένων αναφοράς για να βρεθούν στατιστικά υπερεκπροσωπούμενες ομάδες πρωτεϊνών, σύμφωνα με τη συμμετοχή τους σε βιολογικές διεργασίες, μοριακή λειτουργία και κυτταρικά συστατικά (για αυτήν την τελευταία πτυχή, τα δεδομένα δεν είναι εμφανίζεται, αλλά διατίθεται κατόπιν αιτήματος). Όσον αφορά την ανάλυση των μοριακών λειτουργιών που σχετίζονται με ταυτοποιημένες πρωτεΐνες, τα κλάσματα hAFS-CM έδειξαν εμπλουτισμό σε ένα δομικό συστατικό εξωκυτταρικής μήτρας και κυτταροσκελετού, δέσμευση κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών και δομική μοριακή δραστηριότητα (Εικόνα S2), ενώ τα hAFS-EVs ήταν δομικά εμπλουτισμένα συστατικό του κυτταροσκελετού και του ριβοσώματος, σύνδεση DNA και RNA και παράγοντες σύνδεσης GTPase και συνοδηγού (Εικόνα S3C).

Η ανάλυση εμπλουτισμού βιολογικών διεργασιών τόσο για το hAFS-CM όσο και για το have-EV έδειξε ότι η πλειονότητα των πρωτεϊνών που διαμορφώνονται στα κλάσματα εκκρίματος hAFS του εμβρύου και του περιγεννητικού συστήματος ανήκουν στην κυτταρική ανάπτυξη/συντήρηση και στον μεταβολισμό των πρωτεϊνών (Εικόνες 5C και 6C). Στα hAFS-EV παρατηρήσαμε ότι ο όρος "δομικά συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας" συσχετίστηκε αποκλειστικά με τα υποξικά f-hAF-EV. οι όροι "σύνδεση ιόντων ασβεστίου" και "δομική μοριακή δραστηριότητα" εμπλουτίστηκαν κυρίως σε υποξικά δείγματα f-hAFS και p-hAFS (Εικόνα S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I και DCI (βεβαιότητα διαφορικής έκφρασης) Μεγαλύτερο ή ίσο με I5I πέρασαν τα φίλτρα και θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένα. δείτε τον Πίνακα S3 για τον πλήρη κατάλογο και τις λεπτομερείς παραμέτρους των αναφερόμενων πρωτεϊνών. (Γ) Ανάλυση εμπλουτισμού βιολογικών διεργασιών πρωτεϊνών που προσδιορίζονται με συχνότητα τουλάχιστον 2 σε f-hAFS-EVs (αριστερό πλαίσιο) και p-hAFS-EVs (δεξιό πλαίσιο) μετά από υποξική προετοιμασία. Με βάση το εργαλείο FunRich, οι όροι γονιδιακής οντολογίας εμφανίζονται σε ραβδόγραμμα που αναφέρουν το ποσοστό των γονιδίων που εμπλουτίστηκαν για κάθε κατηγορία (σκούρες κίτρινες ράβδοι για f-hAFS-EVsnormo, κόκκινες ράβδοι για f-hAFS-EVShypo, ανοιχτό πράσινο ράβδοι για p-hAFS -EVsnormo και σκούρες πράσινες μπάρες για p-hAFS-EVShypo). Μόνο οι όροι γονιδιακής οντολογίας με Bonferroni διορθώθηκαν*σελ<0.05 are="">

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

2.6. Το προφίλ κυτοκίνης και χημειοκίνης του εμβρύου έναντι του περιγεννητικού έχει-CM και έχουν-EVs αποκάλυψαν διαφορετικά πρότυπα κατανομής

Έχουμε επικυρώσει προηγουμένως την αναγεννητική ικανότητα του f-hAFS-CMhypo σε τραυματισμένα καρδιαγγειακά κύτταρα μέσω παρακρινών επιδράσεων [34,35,49]. Εδώ συγκρίναμε την περιεκτικότητα σε κυτοκίνη και χημειοκίνη του f-hAFS-CMHypo με το αντίστοιχο αντίστοιχο p-hAFS (Εικόνα 7Α, Εικόνα S4A και Πίνακας S4) και βρήκαμε ορισμένους παράγοντες διάκρισης.

Η ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΙΝΗ, ο Επαγωγέας Μεταλλοπρωτεϊνάσης Εξωκυτταρικής Μήτρας (EMMPRIN), η Ιντερλευκίνη 8 (IL-8) και η μονοκυτταρική χημειοελκυστική πρωτεΐνη-1 (MCP-1) βρέθηκαν αποκλειστικά εμπλουτισμένα inf-hAFS-CMNypo και δεν ήταν ανιχνεύεται στο p-hAFS-CMhypo. Η πρωτεΐνη 2 που δεσμεύει τον αυξητικό παράγοντα τύπου ινσουλίνης (IGFBP2) και η οστεοποντίνη (OPN) αυξήθηκαν σημαντικά στο f-hAFS-CMhypo έναντι του p-hAFS-CMHypo κατά 3.{16}}και 3.8- φορές (" Π<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Ενώ το εμβρυϊκό έναντι του περιγεννητικού έχουν-CM έδειξε διαφορική έκφραση στο προφίλ κυτοκίνης και χημειοκίνης τους, τα αντίστοιχα εμβρυϊκά έναντι περιγεννητικής EV ήταν πιο ομοιογενώς κατανεμημένα, αν και με χαμηλότερα προφίλ έκφρασης (Εικόνα 7Β, Εικόνα S4B και Πίνακας S5). Ωστόσο, ορισμένες διαφορές θα μπορούσαν να εκτιμηθούν: η διπεπτιδυλ-πεπτιδάση IV (DPPIV), ο αυξητικός/διαφοροποιητικός παράγοντας 15 (GDF-15) και η IL-8 εκφράστηκαν μόνο από το f-hAFS-EVSHypo, αν και σε χαμηλό επίπεδα? Η ΑΓΓΕΙΟΠΟΙΕΤΙΝΗ2, το CD40 LIGAND και η πρωτεΐνη που δεσμεύει τη βιταμίνη D (VDBP) βρέθηκαν μόνο στο p-hAFS-EVShypo, παρόλο που για άλλη μια φορά ανιχνεύθηκαν σε χαμηλές ποσότητες. Άλλες κυτοκίνες όπως νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF) ENDOGLIN, FGF-19, Πρωτεΐνη 3 που δεσμεύει τον αυξητικό παράγοντα παρόμοια με την ινσουλίνη (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, παράγοντας που προέρχεται από στρωματικό υλικό{ {23}} άλφα (SDF-1a), βρέθηκαν τόσο στο f-hAFS-EVShypo όσο και στο p-hAFS-EVSHvpo, με το PAI-1 και το EMMPRIN να είναι πιο εκφρασμένα (Εικόνα 7Β)

Οι BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 και SDF-lo εμπλουτίστηκαν αποκλειστικά σε όλα τα υποξικά έχουν-EV σε σύγκριση με τα αντίστοιχα hAFS-CM, ανεξάρτητα από το στάδιο κύησης. Επιπλέον, ενώ το EMMPRIN δεν ανιχνεύθηκε εντός του p-hAFS-CMhypo, βρέθηκε εμπλουτισμένο στο αντίστοιχο κλάσμα EV. Αντίθετα, το OPN ήταν πιο άφθονο στο f-have-CMhypo από ότι στο f-have-EVShypo, ενώ ήταν συγκρίσιμο μεταξύ των αντίστοιχων κλασμάτων έκκρισης p-hAFS. Τα FGF-19, MIF και PTX3 εκφράστηκαν με παρόμοιο τρόπο τόσο στο εμβρυϊκό όσο και στο περιγεννητικό has-CM και στα αντίστοιχα hAFS-EV. Το PAI-1 ήταν πολύ εμπλουτισμένο σε κλάσματα υποξικού εκκριτώματος.

Εικόνα 7. Προφίλ κυτοκίνης και χημειοκίνης σε εμβρυϊκά και περιγεννητικά σκευάσματα εκκρίματος hAFS. (Α) Η έκφραση των κυτοκινών και των χημειοκινών που ανιχνεύονται εντός του υποξικού εμβρυϊκού-έναντι περιγεννητικού έχουν-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) αναφέρονται σε πυκνότητα εικονοστοιχείων ανά αυθαίρετη μονάδα [AU]. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ±sem ανεξάρτητων πειραμάτων και αναφέρονται στον Πίνακα S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B) Το περιεχόμενο κυτοκίνης και χημειοκίνης ανιχνεύθηκε στο υποξικό έμβρυο έναντι των περιγεννητικών hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) και εκφράζονται με πυκνότητα εικονοστοιχείων σε αυθαίρετες μονάδες [AU].cistanche χοληστερόληΟι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος±sem n=3 ανεξάρτητων πειραμάτων και αναφέρονται στον Πίνακα S5. CST3: Κυστατίνη C;EMMPRIN:Επαγωγέας Μεταλλοπρωτεϊνάσης Εξωκυτταρικής Μήτρας;FCFF-19: Αυξητικός Παράγοντας Ινοβλαστών-19;IGFBP2:Αυξητικός Παράγοντας Παρόμοιος με Ινσουλίνη(IGF)Πρωτεΐνη δέσμευσης 2;IL{8}}:Ιντερλευκίνη -8;IL-17α:Ιντερλευκίνη-17α; MCP-1: Μονοκυτταρική χημειοελκυστική πρωτεΐνη-1;MIF: Ανασταλτικός Παράγοντας μετανάστευσης Μακροφάγων. PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Αναστολέας ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1; BDNF: Νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο. DPPIV: Διπεπτιδυλική πεπτιδάση IV; GDF-15:Growth Differentiation Factor-15;IGFBP3:Insulin-like Growth Factor(IGF) Binding Protein 3;SDF-1a: Stromal Produced Factor-1 alpha; VDBP: Πρωτεΐνη που δεσμεύει τη βιταμίνη D.

2.7. Τα εμβρυϊκά και περιγεννητικά έχουν-EV εμπλουτίζονται με πληροφορίες RNA στο φορτίο τους

Δεδομένου ότι τα μικρά μη κωδικοποιητικά RNA θεωρήθηκαν κύριοι ρυθμιστές της παρακρινικής επίδρασης EV στα κύτταρα-στόχους [4,55], εστιάσαμε κυρίως την ανάλυση αλληλουχίας RNA στο περιεχόμενο microRNA (miRNA) στα f-hAFS-EVs και p-hAFS-EVs. Το προφίλ μικρού RNA έδειξε εμπλουτισμό του miRNA τόσο στα εμβρυϊκά όσο και στα περιγεννητικά hAFS-EV (περίπου 35-36 τοις εκατό ) σε σύγκριση με τη συνολική μικρή ποσότητα RNA (Εικόνα 8Α). Το συστατικό miRNA ήταν πράγματι μεταξύ των δύο πιο αντιπροσωπευόμενων ειδών RNA και στις δύο συνθέσεις EV, μαζί με το rRNA(***p) p < 0.0001).="" τα="" ακόλουθα="" mirna="" ήταν="" τα="" πιο="" εμπλουτισμένα="" στα="" δείγματα="" ev="" που="" αναλύθηκαν:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" και="" mir-221-3p.="" αξίζει="" να="" σημειωθεί="" ότι="" τα="" εμβρυϊκά="" και="" περιγεννητικά="" έχουν-evs="" μοιράζονται="" την="" πλειονότητα="" αυτών="" των="" mirna="" (δηλαδή="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" έστω-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b{-5p,="" mir-155-5p,="" mir{-191-5p="" και="" mir-221-3p,="" σχήμα="" 7β).="" τα="" 15="" πιο="" εμπλουτισμένα="" είδη="" mirnas="" κάλυψαν="" περισσότερο="" από="" το="" 60="" τοις="" εκατό="" της="" συνολικής="" περιεκτικότητας="" σε="" mirna="" σε="" κάθε="" δείγμα.="" από="" την="" άλλη="" πλευρά,="" περίπου="" 100="" mirnas="" βρέθηκαν="" στο="" υπόλοιπο="" 30="" τοις="" εκατό="" της="" περιεκτικότητας="" σε="" φυσαλιδώδες="" mirna="" (εικόνα="">

Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω το περιεχόμενο miRNA στα hAFS-EVs, διερευνήσαμε εάν το στάδιο κύησης hAFS ή η προετοιμασία των υποξικών κυττάρων in vitro θα μπορούσε να επηρεάσει τον εμπλουτισμό συγκεκριμένων miRNA. Η ισχυρότερη διαμόρφωση βρέθηκε μεταξύ των σταδίων κύησης, όπου σχεδόν όλα τα διαμορφωμένα miRNA εμπλουτίστηκαν σε f-hAFS-EVs σε σχέση με το περιγεννητικό αντίστοιχο (Εικόνα 9Α και Πίνακας 1). Η υποξική προετοιμασία είχε ηπιότερη επίδραση στο φορτίο miRNA, ενώ σε αυτή τη σύγκριση η διαμόρφωση ήταν προς οποιαδήποτε κατεύθυνση, με μερικά miRNA να εμπλουτίζονται σε υποξικά-και άλλα σε συνθήκες νορμοξικού ελέγχου (Εικόνα 9Α).

Ως συμπληρωματική ανάλυση, εστιάσαμε στον εντοπισμό των ερευνηθέντων miRNAs με τη χαμηλότερη μεταβλητότητα μεταξύ των διαφορετικών δοτών και την προετοιμασία καλλιέργειας, για EVs που προέρχονται και από τα δύο στάδια κύησης που διερευνήθηκαν. Τα miRNA που προέκυψαν από αυτήν την ανάλυση εκτείνονταν από υψηλά έως χαμηλά επίπεδα έκφρασης (Εικόνα 9Β). Μέσα στον πιο σταθερό πυρήνα miRNA του φορτίου hAFS-EVs, εντοπίστηκαν ορισμένα κοινά miRNA μεταξύ f-hAFS-EV και p-hAFS-EVs (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p σε υψηλό επίπεδο· miR-221-3p, miR-221-5p και miR-22-3p σε χαμηλό επίπεδο, Πίνακας 2).

Εικόνα 9. Ανάλυση διαφορικού εμπλουτισμού των miRNAs σε εμβρυϊκά και περιγεννητικά hAFS-EVs. (Α) Οικόπεδα ηφαιστείου για διαφορικό εμπλουτισμό του φορτίου hAFS-EV miRNA σύμφωνα με το στάδιο κύησης (αριστερό πλαίσιο) και in vitro υποξική προετοιμασία των εκκρινόμενων κυττάρων (δεξιός πίνακας). Για λεπτομέρειες miRNA, ανατρέξτε στον Πίνακα 1. (Β) Διάγραμμα διασποράς της συσχέτισης μεταξύ της μεταβλητότητας (άξονας X) και του επιπέδου εμπλουτισμού (άξονας Y) των σταθερών miRNAs εντός των εμβρυϊκών hAFS-EV (αριστερό πλαίσιο) και περιγεννητικών hAFS-EVs (δεξιός πίνακας) σύμφωνα με το υψηλό (κίτρινες κουκκίδες), αμυδρός (πράσινες κουκκίδες) και χαμηλός (σκούρες μωβ κουκκίδες) εμπλουτισμός. Για λεπτομέρειες miRNA, ανατρέξτε στον Πίνακα 2.RPM: αναγνώσεις ανά εκατομμύριο.

3. Συζήτηση

Τα υπολείμματα απορριπτόμενων δειγμάτων ανθρώπινου αμνιακού υγρού έχουν αναγνωριστεί ως πολύτιμη πηγή στρωματικών κυττάρων με πολλά υποσχόμενες δυνατότητες στην αναγεννητική ιατρική και τη μηχανική ιστών. Οι ηθικές ανησυχίες που σχετίζονται με την απομόνωσή τους είναι ελάχιστες, καθώς μπορούν να ληφθούν είτε από υπολείμματα δειγμάτων προγεννητικής εξέτασης ρουτίνας αμνιοπαρακέντησης, κατά τη διάρκεια του ΙΙ τριμήνου της κύησης (εμβρυϊκό hAFS) ή από αμνιακό υγρό που απορρίπτεται ως κλινικό απόβλητο στην προγραμματισμένη καισαρική τομή III τριμήνου διαδικασίες (περιγεννητικό hAFS). Τα τελευταία χρόνια, το hAFS έχει προταθεί ως πιθανά θεραπευτικά μέσα για την επισκευή και την αναγέννηση του ανθρώπινου ιστού, δεδομένων των ενθαρρυντικών στοιχείων που προέκυψαν από πειραματικά μοντέλα ασθενειών. Είναι ενδιαφέρον ότι έχουν προταθεί και για in utero θεραπεία νευρολογικών παθήσεων εμβρύου-νεογνών. Πράγματι, προκλινικές μελέτες πρότειναν ότι το hAFS που χορηγήθηκε προγεννητικά μέσω ενδοαμνιακού τοκετού προστατεύει τον νωτιαίο μυελό κατά τη διάρκεια της κύησης μέσω παρακρινικής δραστηριότητας σε ένα μοντέλο μυελομηνιγγοκήλης σε αρουραίο [56-58] και μείωσε τη βλάβη του εκτεθειμένου εντέρου σε πειραματική γαστροσχισία τρωκτικών[59 ]. Από μεταφραστική σκοπιά, η ενδομήτρια μεταμόσχευση των hAFS θα μπορούσε να αντικατασταθεί από τη χορήγηση του καταλληλότερου παρασκευάσματος του εκκριτικού τους (hAFS-CM ή hAFS-EVs).παρενέργειες cistanche deserticolaΑυτή η στρατηγική θα επέτρεπε την έγκαιρη και έγκαιρη παρέμβαση κατά τη διάρκεια της κύησης υπερβαίνοντας τους περιορισμούς της κανονικής κυτταρικής θεραπείας (δηλαδή, χρονοβόρα in vitro κυτταρική επέκταση) παρέχοντας παράλληλα και έτοιμα προς χρήση φαρμακευτικά σκευάσματα.

Η πρόσφατη ανάπτυξη λιγότερο επεμβατικών προγεννητικών διαγνωστικών τεχνικών μπορεί να οδηγήσει σε μείωση των διαδικασιών αμνιοπαρακέντησης στο εγγύς μέλλον, υποστηρίζοντας έτσι το περιγεννητικό hAFS ως την πιο προσιτή επιλογή. Ωστόσο, δεδομένου ότι τα εμβρυϊκά hAFS είναι πιο αναπτυξιακά ανώριμα, μπορεί να έχουν πιο αποτελεσματικό παρακρινικό δυναμικό. Σε αυτό το σενάριο, εδώ συγκρίναμε το εμβρυϊκό και το περιγεννητικό c-KITt hAFS και επικεντρωθήκαμε στη διαμόρφωση του προφίλ των κλασμάτων έκκρισής τους. Επισημάναμε τις σχετικές διακρίσεις που πρέπει να ληφθούν υπόψη για την πιθανή κλινική μετάφραση της παρακρινής τους ικανότητας.

Σε συμφωνία με προηγούμενες ανεξάρτητες μελέτες, δείχνουμε ότι το στάδιο κύησης δεν επηρέασε την ετερογενή μορφολογία του hAFS και το προφίλ του μεσεγχυματικού αντιγόνου [25,26]. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε παραμέτρους που είναι πιο πιθανό να επηρεάσουν την εκκριτική και παρακρινή δραστηριότητα των κυττάρων πέρα ​​από τον κανονικό στρωματικό ανοσοφαινότυπο. Ιδιαίτερα η παρουσία ενός CD146-υψηλού υποπληθυσμού υψηλού σε CD107a στους μεσεγχυματικούς προγόνους του μυελού των οστών έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με αξιοσημείωτη ρυθμιστική και θεραπευτική παρακρινική δραστηριότητα [47]. Εδώ αποκαλύψαμε ότι τόσο το εμβρυϊκό όσο και το περιγεννητικό hAFS χαρακτηρίζονται έντονα από αυτή τη μοριακή υπογραφή που υποστηρίζει την εκκριτική τους ισχύ με σχετικές μεταφραστικές επιπτώσεις. Επιπλέον, τα εμβρυϊκά hAFS χαρακτηρίστηκαν από αναποτελεσματικό αερόβιο μεταβολισμό, ενώ τα πιο ώριμα περιγεννητικά εμφάνισαν υψηλότερο ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου και σύνθεση ATP. Αυτό μπορεί να υποδηλώνει ένα πιο ανώριμο μεταβολικό προφίλ του hAFS ΙΙ τριμήνου που μοιάζει με τα στρωματικά κύτταρα του ομφάλιου λώρου των πρόωρων νεογνών, τα οποία έχουν δείξει την ίδια τάση [60].

Προκειμένου να ενεργοποιηθεί το παρακρινικό δυναμικό, οι hAFS εκτέθηκαν σε υποξική εκκίνηση χωρίς ορό για 24 ώρες, μια στρατηγική που έχουμε αναπτύξει προηγουμένως με επιτυχία [34,35,37] για τα εμβρυϊκά κύτταρα και που εδώ ερευνήσαμε για πρώτη φορά στο περιγεννητικό αντίστοιχο. Η προετοιμασία του εμβρυϊκού και περιγεννητικού hAFS υπό υποξία οδήγησε σε θετική τάση στην αύξηση της συγκέντρωσης εκκριμάτων τους και στην ποσότητα των EVs που απελευθερώθηκαν, ενώ το στάδιο της κύησης δεν άσκησε καμία επίδραση στην απόδοση του κυτταρικού εκκρίματος ούτε στη μορφολογία και την κατανομή μεγέθους του EV.

Συγκεκριμένα, ο χαρακτηρισμός του παρακρινούς φορτίου hAFS αποκάλυψε ορισμένες συγκεκριμένες διαφορές, σύμφωνα με τις διαφορετικές συνθήκες που αξιολογήσαμε. Το πρωτεομικό προφίλ του εμβρυϊκού εκκρίματος hAFS αποκάλυψε ευδιάκριτες κατανομές παραγόντων με βάση το στάδιο κύησης και την κυτταρική υποξική προετοιμασία. Αυτό υποδεικνύει ότι το παρακρινικό δυναμικό hAFS μπορεί να αποκτήσει μια ξεχωριστή ταυτότητα κατά την ωρίμανση από το Ⅱ έως το Ⅲ τρίμηνο κύησης που με τη σειρά του μπορεί να ρυθμιστεί διεγείροντας τα κύτταρα που εκκρίνουν in vitro. Η ανάλυση εμπλουτισμού βιολογικών διεργασιών των hAFS-CM και hAFS-EVs έδειξε ότι οι περισσότερες από τις διαμορφωμένες πρωτεΐνες μπορεί να συμφωνούν με την ανάπτυξη/συντήρηση των κυττάρων και τον μεταβολισμό των πρωτεϊνών, υποστηρίζοντας έτσι τα ευεργετικά παρακρινικά αποτελέσματα των κυττάρων που έχουν αναφερθεί μέχρι τώρα. Ειδικότερα, το υποξικό εμβρυϊκό ολικό έκκριμα hAFS βρέθηκε εμπλουτισμένο με την πρωτεΐνη θερμικού σοκ HSPD1 (HSP60), η οποία αποδείχθηκε ότι υποστηρίζει την επούλωση τραυμάτων σε μοντέλο τραυματισμού δέρματος διαβητικού ποντικού και προάγει την λοξή διόρθωση των μακροφάγων στον φαινότυπο Μ2 [61] . Ομοίως, τα υποξικά εμβρυϊκά hAFS-EVs εμπλουτίστηκαν για παράγοντες που προάγουν τη νευρογένεση (HSPG2[62], την κυτταρική αυτοανανέωση και την εγκεφαλική και καρδιαγγειακή ανάπτυξη (LAMA5[63]και LAMB1[64]και μετανάστευση (THBS1 [2]). Η πρωτεογλυκάνη Το AGRN βρέθηκε επίσης σε EV μετά από υποξική εκκίνηση του εμβρυϊκού hAFS.cistanche δοσολογία redditΤα ευρήματά μας συνάδουν με προηγούμενες ενδείξεις ότι το AGRN ρυθμίζεται προς τα πάνω στο πρωτείωμα των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων υπό φλεγμονώδη και υποξικά διδακτικά ερεθίσματα[65]. Το AGRN έχει επίσης αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στη σηματοδότηση των ανοσολογικών συνάψεων [66] και ότι συμφωνεί με την αναγέννηση της καρδιάς του νεογνού ποντικού [67], υποστηρίζοντας έτσι μια έντονη προδιάθεση του αναπτυξιακά νεαρού εμβρύου hAFS προς αναγεννητικές παρακρινικές επιδράσεις. Επιπλέον, το εμβρυϊκό hAFS επιβεβαιώθηκε ότι ανταποκρίνεται περισσότερο στην υποξική προετοιμασία, όπως φαίνεται από τον εμπλουτισμό των προγνωστικών παραγόντων αγγειακής αναγεννητικής αποτελεσματικότητας, όπως η ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΙΝΗ, το EMMPRIM, η IL-8 και η MCP-1 κυτοκίνη[68], σε ρυθμισμένο μέσο τους. Αυτό υποστηρίζει προηγούμενα στοιχεία της παρακρινής ισχύος του εμβρυϊκού hAFS-CM στην ενίσχυση της ενδογενούς νεοαρτηριογένεσης σε προκλινικά μοντέλα τρωκτικών με έμφραγμα του μυοκαρδίου, ισχαιμία οπίσθιου άκρου και ισχαιμικό περιτονιακό δερματικό κρημνό [34,{10}}]Επιπλέον, το AFS Το ολικό έκκριμα βρέθηκε σημαντικά πιο εμπλουτισμένο με IGFBP2 και OPN σε σύγκριση με το περιγεννητικό, υποδηλώνοντας έτσι ένα πιο έντονο ρυθμιστικό προφίλ προ-ανάλυσης και αντιγήρανσης[72-75]. Το περιγεννητικό have-CM, ενώ ήταν λιγότερο ενισχυμένο σε παρακρινείς παράγοντες, συμπληρώθηκε ομοίως με νευροτροφικούς και ανοσοτροποποιητικούς παράγοντες, όπως CST3[76,77] και MIF[78].

Σε σύγκριση με το συνολικό hAFS-CM, τα αντίστοιχα υποξικά εμβρυϊκά και περιγεννητικά EV εμφάνισαν χαμηλότερη έκφραση κυτοκινών και χημειοκινών, με εξαίρεση τον μεσολαβητή αγγειακής αναδιαμόρφωσης EMMPRIN [79], ο οποίος ήταν ως επί το πλείστον εμπλουτισμένος στο διαμέρισμα των κυστιδίων. Το προηγουμένως αναφερθέν καρδιοενεργό και προ-αναγεννητικό προφίλ των εμβρυϊκών hAFS-EVs[34,37] έχει επιβεβαιωθεί εδώ με στοιχεία της αποκλειστικής τους έκφρασης καρδιοπροστατευτικής IL-8 [80] και GDF{-15, ένας βασικός παρακρινικός παράγοντας που πυροδοτεί την ενδογενή νευρογένεση του ιππόκαμπου ενηλίκου[81,82], καθώς και την εξουδετέρωση της καρδιοτοξικότητας που προκαλείται από τις ανθρακυκλίνες [78]. Τόσο τα εμβρυϊκά όσο και τα περιγεννητικά hAFS-EV έδειξαν παρόμοια έκφραση για τον ρυθμιστή εμπορίας προγονικών κυττάρων/βλαστικών κυττάρων SDF-1 [83-85]. Η πρωτεομική ανάλυση ανέφερε αυξημένη έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την αγγειογένεση, όπως το NRP1 [86] και το MP14[87] σε υποξικά περιγεννητικά hAFS-EV. τέτοιο διεγερτικό προφίλ μπορεί να εξηγήσει προηγούμενα αποτελέσματα για τις ενδοθηλιακές αναγεννητικές ιδιότητες του hAFS Ⅲ τριμήνου σε ένα προκλινικό μοντέλο ισχαιμικού τραυματισμού σκελετικών μυών σε ποντίκια [25], παρά τις ενδείξεις ότι το hAFS-CM τους είναι λιγότερο προ-αγγειογενές από το αντίστοιχο εμβρυϊκό. Συγκεκριμένα, ο νευρικός αυξητικός παράγοντας BDNF βρέθηκε τόσο σε εμβρυϊκό όσο και σε περιγεννητικό φορτίο EV, αν και σε χαμηλές ποσότητες, υποδηλώνοντας έτσι μια υποτιθέμενη νευροτροφική δραστηριότητα για τα hAFS-EVs στη νευρωνική επιβίωση και στις νευροαναπτυξιακές διεργασίες, όπως επίσης παρατηρήθηκε για εξωκυτταρικά κυστίδια που εκκρίνονται από ανθρώπινο οστό μυελού και αίματος ομφάλιου λώρου-MSC[8889]. Και τα δύο σκευάσματα έκκρισης από εμβρυϊκό και περιγεννητικό hAFS που υποβλήθηκαν σε υποξική διέγερση έδειξαν ότι είναι εμπλουτισμένα με PAI-1, έναν διευκολυντή της ενδοθηλιακής ενεργοποίησης [90] που έχει επίσης εμπλακεί στην πόλωση των μακροφάγων Μ2 στην καρδιά και είναι προικισμένος με καρδιοπροστατευτικό και αντι-ινωτικό δυναμικό [91].

Τα MicroRNA (miRNAs) έχουν αντιμετωπιστεί ευρέως ως κρίσιμοι ρυθμιστές της παρακρινής δραστηριότητας βλαστικών κυττάρων και μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων-EV [92,93]. Εδώ βρήκαμε ότι τα 15 πιο εμπλουτισμένα είδη miRNA στα hAFS-EVs καλύπτουν περισσότερο από το 60 τοις εκατό της συνολικής περιεκτικότητας σε miRNA σε κάθε δείγμα. Αυτά τα miRNAs έχει αναφερθεί ότι χαρακτηρίζουν το μοριακό φορτίο των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων-EVs (έστω-7a-5p [4,95]), προστατεύουν από την ισχαιμία του μυοκαρδίου επηρεάζοντας την αγγειακή αναγέννηση και αναστέλλοντας την ίνωση (ας -7b-5p, let-7f-5p, miR-21-5p and miR-155-5p [96,97]), προώθηση επούλωση πληγών ρυθμίζοντας τη λειτουργία των κερατινοκυττάρων (miR-16-5p [98]) και εξουδετερώνοντας τον νευρωνικό θάνατο μετά από ισχαιμία του πρόσθιου εγκεφάλου (miR-29a-3p [99,100]). Από την άλλη πλευρά, περίπου 1000 miRNAs βρέθηκαν στο υπόλοιπο 30 τοις εκατό του περιεχομένου φυσαλιδώδους miRNA. Αυτή η μη ισορροπημένη κατανομή είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες [4] και υπογραμμίζει τα ως επί το πλείστον εμπλουτισμένα miRNA ως τα υποτιθέμενα υπεύθυνα για την κύρια βιολογική δραστηριότητα των hAFS-EV. Είναι ενδιαφέρον ότι τα εμβρυϊκά και περιγεννητικά hAFS-EVs μοιράζονταν την πλειοψηφία των 15 miRNA. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρήσαμε επίσης ότι τόσο τα εμβρυϊκά hAFS-EV όσο και τα περιγεννητικά περιείχαν ένα σύνολο πολύ σταθερών miRNA σε διαφορετικά επίπεδα εμπλουτισμού. Τέτοια στοιχεία μπορεί να υποδεικνύουν ένα ευρύ φάσμα υποψηφίων «οικιακής φροντίδας» που θα χρησιμοποιηθούν ως εσωτερικός έλεγχος αναφοράς σε πειράματα qPCR σε hAFS-EV. Επιπλέον, ένα συνεπές υποσύνολο τέτοιων σταθερών miRNAs (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ Το {40}}y miR-221-5p) μοιράζεται μεταξύ των δύο σταδίων κύησης και επικαλύπτεται με τα 15 ως επί το πλείστον εμπλουτισμένα, υποδηλώνοντας μια ακόμη πιο σταθερή συμπεριφορά και μια αξιόπιστη μοριακή υπογραφή προ-ανάλυσης([96,{{45 }}]). Αξίζει να σημειωθεί ότι μερικοί υποψήφιοι εντός αυτού του διακριτικού πυρήνα έχουν πρόσφατα αναφερθεί ως miRNA αναφοράς σε νευροπροστατευτικά EVs που λαμβάνονται από μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από αμνιακό υγρό ΙΙ τριμήνου (miR-29a-3p και miR{{ 49}}p[95]). Ωστόσο, παρατηρήσαμε επίσης ότι η ηλικία κύησης μπορεί να τροποποιεί το φορτίο miRNA περισσότερο από την υποξική προετοιμασία. Αναπτυξιακά πιο νεανικά EVs που ελήφθησαν από εμβρυϊκό hAFS III τριμήνου εμπλουτίστηκαν με miRNAs που είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι υποστηρίζουν τη βιωσιμότητα των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (miR-302-3p [101]), τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την οστεογονική διαφοροποίηση των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών (miR -217 [102]), ενώ φιλοξενεί επίσης ογκοκατασταλτικό δυναμικό (miR-302-3p[103,104]); miR-383-5p[105,106]).

Με βάση τα αποτελέσματά μας, εδώ επιβεβαιώνουμε ότι το εμβρυϊκό και περιγεννητικό hAFS μπορεί να αντιπροσωπεύει ελκυστικές παρακρινές πηγές που πρέπει να αξιοποιηθούν για την αναγεννητική ιατρική. Ενώ ο φαινότυπος και η εκκριτική τους δραστηριότητα ήταν παρόμοια, έχουμε επισημάνει ορισμένες ιδιόμορφες πτυχές στις συνθέσεις εκκριτικών τους ως χρήσιμες πληροφορίες για τη μελλοντική θεραπευτική τους μετάφραση.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1.Απομόνωση βλαστικών κυττάρων ανθρώπινου αμνιακού υγρού και καλλιέργεια in vitro

Ανθρώπινα βλαστοκύτταρα αμνιακού υγρού (hAFS) απομονώθηκαν από υπολείμματα δείγματα αμνιακού υγρού (AF) που συλλέχθηκαν με προγεννητικό έλεγχο ρουτίνας μέσω αμνιοπαρακέντησης Ⅱ τριμήνου (εμβρυϊκό hAFS, f-hAFS) ή ως κλινικά απόβλητα κατά τη διάρκεια προγραμματισμένης καισαρικής τομής κατά τη διάρκεια του Ⅲ τριμήνου (περιγεννητική hAFS,p-hAFS) στη Μονάδα Προγεννητικής Διάγνωσης και Περιγεννητικής Ιατρικής, IRCCS San Martino Hospital, στη Μονάδα Εμβρυϊκής και Περιγεννητικής Ιατρικής και Χειρουργικής και στο Εργαστήριο Ανθρώπινης Γενετικής στο νοσοκομείο IRCCS Istituto Gaslini (Γένοβα, Ιταλία). Ελήφθη ενημερωμένη γραπτή συγκατάθεση από όλους τους δωρητές σύμφωνα με την εξουσιοδότηση της τοπικής επιτροπής δεοντολογίας (πρωτόκολλο PR428REG2015) και σύμφωνα με τις οδηγίες της Διακήρυξης του Ελσίνκι. Δείγματα εμβρυϊκής κολπικής μαρμαρυγής ΙΙ τριμήνου ελήφθησαν από γυναίκες δότριες με μέση ηλικία περίπου 37,42±0,32 ετών (n=15 που κυμαίνονται από 36-έως 41 ετών). γυναίκες δότριες με μέση ηλικία 34,25±1,31 ετών (n=10 που κυμαίνονται από 26- έως 42 ετών). Τα εμβρυϊκά και περιγεννητικά hAFS ελήφθησαν από δείγματα που επικυρώθηκαν για φυσιολογικό καρυότυπο και απομονώθηκαν με ανοσομαγνητική ταξινόμηση για έκφραση c-KIT (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Ιταλία) από προσκολλημένα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα AF[16].οφέλη από το εκχύλισμα κιστάνςc-KIT* hAFS καλλιεργήθηκαν σε Minimal Essential Medium (MEM)-alpha με 15% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy), 18% Chang B και 2% Chang C Medium (Irvine Scientific , Santa Ana, CA, USA) με 1 τοις εκατό L-γλουταμίνη και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία), σε θερμοκοιτίδα στους 37 βαθμούς με 5 τοις εκατό CO2 και 20 τοις εκατό ατμόσφαιρα Oz και καλλιεργημένα σε 5 διελεύσεις in vitro πριν χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση του εκκρίματός τους.

4.2.Βιοχημική αξιολόγηση του μεταβολισμού του hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα για κάθε πείραμα. Για την αξιολόγηση της βασικής αναπνοής, τα hAFS διαπερατήθηκαν με 0,03 mg/mL διγιτονίνη για 10 λεπτά και εναιωρήθηκαν σε φυσιολογικό ορό φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS). Προστέθηκαν 10 mM πυροσταφυλικό συν 5 mM μηλικό ή 20 mM ηλεκτρικό για να διεγείρεται η διαδρομή -τρόποι που αποτελούνται από τα σύμπλοκα I, II και IV ή τα σύμπλοκα Ⅱ και IV, αντίστοιχα [60].

Για να αξιολογηθεί η σχετική συμβολή στην αναπνοή της γλουταμίνης, της οξείδωσης λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας και της γλυκόζης, μετά τη διαπερατότητα της διγιτονίνης, τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε ένα μέσο ανάπτυξης και 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir και 4 uM UK5{{22} }99 προστέθηκαν για την αναστολή της γλουταμινάσης, της καρνιτίνης παλμιτοϋλο-τρανσφεράσης 1Α(CPT1A) ή του μιτοχονδριακού πυροσταφυλικού φορέα (MPC), αντίστοιχα. Η δραστηριότητα της συνθάσης Fi-F.ATP (ATP συνθάσης) ανιχνεύθηκε με μέτρηση της παραγωγής ΑΤΡ με την εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδο λουσιφερίνης/λουσιφεράσης. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν στους 37 βαθμούς , για 2 λεπτά, και τα δεδομένα συλλέγονταν κάθε 30 δευτερόλεπτα. Σε ένα πρώτο σετ πειραμάτων, κύτταρα 10 βαθμού επωάστηκαν για 10 λεπτό σε μέσο που περιείχε 50 mM KCl, 1 mMEGTA, 2 mMEDTA, 5 mMKH2PO4, 2 mMMgC12, 0,6 mMouabain, 1 mM P1P{{26}Di (αδενοσίνη-5')πεντα-φωσφορική, 0,040 mg/mL αμπικιλλίνη και 10 mM Tris-HCl ρΗ 7,4. Στη συνέχεια, η σύνθεση ΑΤΡ προκλήθηκε με την προσθήκη των αναπνευστικών υποστρωμάτων (10 mM πυροσταφυλικό συν 5 mM μηλικό ή 20 mM ηλεκτρικό) και 0,1 mM ADP. Η αντίδραση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας βιοφωταύγειας λουσιφερίνης/λουσιφεράσης ATP CLSII (Roche, Basel, Switzerland) σε ένα Luminometer (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milan, Italy) τυπικά διαλύματα ATP (Roche, Basel, Switzerland) σε σειρά 42}}/M χρησιμοποιήθηκαν για βαθμονόμηση. Στο δεύτερο σετ πειραμάτων, η σύνθεση ATP αξιολογήθηκε παρουσία 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir ή 4 uM UK5099. Σε αυτή την περίπτωση, 10 κύτταρα επωάστηκαν για 10 λεπτά σε ένα μέσο ανάπτυξης απουσία ή παρουσία αναστολέα μεταβολισμού, και η σύνθεση ΑΤΡ προκλήθηκε με 0,1 mM ADP. Η απόδοση του OxPhos (οξειδωτική φωσφορυλίωση) (αναλογία P/O) υπολογίστηκε ως η αναλογία μεταξύ της συγκέντρωσης του παραγόμενου ATP και της ποσότητας του οξυγόνου που καταναλώθηκε παρουσία αναπνευστικού υποστρώματος και ADP. Όταν η κατανάλωση οξυγόνου αφιερώνεται πλήρως στην παραγωγή ενέργειας, η αναλογία P/O θα πρέπει να είναι περίπου 2,5 και 1,5 μετά την προσθήκη πυροσταφυλικού συν μηλικού ή ηλεκτρικού, αντίστοιχα [48]Για να αξιολογηθεί η συμβολή της αναερόβιας γλυκόλυσης στον μεταβολισμό του hAFS, αξιολογήθηκαν οι συγκεντρώσεις γλυκόζης και γαλακτικού στο μέσο ανάπτυξης. Η κατανάλωση γλυκόζης αξιολογήθηκε από το σύστημα σύζευξης της εξοκινάσης (HK) και της αφυδρογονάσης της γλυκόζης{{56}(G6PD), μετά τη μείωση του NADP στα 340 nm. Το μέσο της ανάλυσης περιείχε 100 mM Tris-HCl, pH7,4,2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU εξοκινάσης και 2 IU αφυδρογονάσης γλυκόζης{{69} φωσφορικής. Η απελευθέρωση γαλακτικού προσδιορίστηκε μετά την αναγωγή του NAD συν στα 340 nm. Το μέσο της ανάλυσης περιείχε 100 mM Tris-HCl (ρΗ8), 5 mM NAD συν, και 1 IU/mL γαλακτικής αφυδρογονάσης. Τα δείγματα αναλύθηκαν πριν και μετά την προσθήκη 4 ug καθαρισμένης γαλακτικής αφυδρογονάσης. Και στις δύο περιπτώσεις, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στον αριθμό των κυττάρων και εκφράστηκαν ως mM γλυκόζη/κύτταρα 10 μοιρών ή mM απελευθερωμένο γαλακτικό/κύτταρα 10 μοιρών, αντίστοιχα[107].

4.3.Κυτταρομετρία ροής Χαρακτηρισμός hAFS

Εκατό χιλιάδες (105) εμβρυϊκά και p-hAFS κύτταρα αποσπάστηκαν και επωάστηκαν με ποντίκι anti-human-CD107a-Alexa Fluor 647-και αντι-ανθρώπινο CD146-FITC- συζευγμένα αντισώματα (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία). Η κυτταρική απόπτωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης απόπτωσης FITC Annexin V (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Ιταλία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα συμβάντα λήφθηκαν σε διαλογέα και αναλυτή BD Bioscience FACS Aria II, εξοπλισμένο με λογισμικό FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Μιλάνο, Ιταλία). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milan , Ιταλία). 4.4.Χρώση γηρασμού

Ο φαινότυπος γήρανσης του hAFS που καλλιεργήθηκε μέχρι το πέρασμα 5 σε τυπικές συνθήκες in vitro αξιολογήθηκε με κιτ χρώσης Senescence-Galactosidase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): f-hand p-hAFS σταθεροποιήθηκαν με 1x Fixative διάλυμα στο 70 τοις εκατό συρροή και χρώση για SA- -gal στους 37 βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα γερασμένα συμβάντα λήφθηκαν σε μικροσκόπιο Leica DMil (εξοπλισμένο με λογισμικό Leica Acquire V3.4.4, Leica Microsystems, Μιλάνο, Ιταλία) και αξιολογήθηκαν ως ποσοστό SA{11}}θετικών κυττάρων σε gal έναντι των συνολικών κυττάρων ανά πεδίο.

4.5. Διαχωρισμός και συμπύκνωση των κλασμάτων έκκρισης hAFS

Τα f-hAFS και p-hAFS καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού (SF) σε 1 τοις εκατό υποξία O2 έναντι 20 τοις εκατό O2 normoxia (μάρτυρας), το τελευταίο από το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως η βασική αναφορά. Αυτή η στρατηγική προετοιμασίας χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση της απελευθέρωσης βιοδραστικών παρακρινών παραγόντων, όπως αναφέραμε προηγουμένως [34,35,37,49]. Τα hAFS καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό (SF) (υψηλή γλυκόζη Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, με 1 τοις εκατό L-γλουταμίνη και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη, όλα από Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία), υπό normox (20 τοις εκατό O2 και 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς ) ή υποξικές (1 τοις εκατό O2 και 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς σε θερμοκοιτίδες CellXpert C170i και Galaxy 48R CO2, από Eppendorf, Μιλάνο, Ιταλία) συνθήκες.

Τα f-hAFS-CM και p-hAFS-CM συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στους 4 βαθμούς σε 300x g για 10 λεπτά και 2000× g για 20 λεπτά για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Το hAFS-CM συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας μεμβράνες υπερδιήθησης με επιλεκτική αποκοπή 3 kDa (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Γερμανία) στους 4 βαθμούς σε 3000× g για 90 λεπτά και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε περαιτέρω στα 4 βαθμός σε 3000× g για 30 λεπτά. Τα hAFS-EV διαχωρίστηκαν και συμπυκνώθηκαν με σειριακή υπερφυγοκέντρηση από το hAFS-CM. Εν συντομία, το hAFS-CM συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στους 4 βαθμούς στα 300 x g για 10 λεπτά και 2000 x g για 20 λεπτά για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Το υπερκείμενο στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία στα 10.000 χ g για 40 λεπτά. Το ίζημα απορρίφθηκε και το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία με υπερφυγοκέντρηση σε Optima L-90K (Beckmann Coulter, Μιλάνο, Ιταλία) στα 10.000×g για 120 λεπτά χρησιμοποιώντας τους στροφείς φυγοκέντρου SW55Ti με αιωρούμενο κάδο της Beckman Coulter. Το σφαιρίδιο που περιείχε ετερογενή hAFS-EVs πλύθηκε σε PBS με τελική φυγοκέντρηση στα 100.000 x g για 120 λεπτά και στη συνέχεια επαναιωρήθηκε σε PBS διηθημένο με μεμβράνη φίλτρου πόρων 0,22 um. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στο hAFS-CM και στην επιφάνεια των hAFS-EVs μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BiCinchoninic Acid (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία). Τα δείγματα ελήφθησαν σε Gen5 Microplate Reader στα 570 nm για να αξιολογηθεί η απόδοση των hAFS-CM και hAFS-EVs σε όρους μg διαλύματος/10 μοιρών κυττάρων παραγωγής.

4.6. Χαρακτηρισμός των hAFS-EV με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Μετάδοσης και Ανάλυση Παρακολούθησης Νανοσωματιδίων

Η ανάλυση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) πραγματοποιήθηκε σε μικροσκόπιο Hitachi TEM (σειρά HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, Ιταλία). Οι ψηφιακές εικόνες λήφθηκαν με κάμερα Mega view 3 και λογισμικό Radius (EMSIS, Muenster, Γερμανία). Τα f-hAFS και p-hAFS σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης (PA) 3,7 τοις εκατό αραιωμένο 1:1 με πλήρες μέσο hAFS, πλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κακοδυλικού {{32}.1 M και στη συνέχεια επωάστηκαν αμέσως για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε Ρυθμιστικό διάλυμα κακοδυλικού 0,1 Μ που περιέχει 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). Τα σφαιρίδια κυττάρων μονιμοποιήθηκαν εκ των υστέρων σε τετροξείδιο του οσμίου για lh και σε διάλυμα οξικού ουρανυλίου 1 τοις εκατό για 1 ώρα. Τα δείγματα αφυδατώθηκαν για 24 ώρες στους 42 βαθμούς και 48 ώρες στους 60 βαθμούς μέσω μιας σειράς διαβαθμισμένης αιθανόλης και ενσωματώθηκαν σε εποξική ρητίνη (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Γερμανία). Υπερλεπτές τομές (50 nm) κόπηκαν με μικροτόμο Leica Ultracut (Leica Microsystems, Μιλάνο, Ιταλία) και αντιχρωματίστηκαν με 5% οξικό ουρανύλιο σε διάλυμα αιθανόλης 50%. Τα f-hAFS-EVs και p-hAFS-EVs επαναιωρήθηκαν σε 20 uL διαλύματος PBS και σταθεροποιήθηκαν με προσθήκη ίσου όγκου 2 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ (ρΗ 7,4). Στη συνέχεια, τα EVs προσροφήθηκαν για 10 λεπτά σε χάλκινα πλέγματα επικαλυμμένα με άνθρακα, επιπλέοντας τα πλέγματα σε σταγόνες 5 μL σε parafilm. Στη συνέχεια, πλέγματα με προσκολλημένα EVs ξεπλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν αρνητικά με διάλυμα οξικού ουρανυλίου 2 τοις εκατό για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα χρωματισμένα πλέγματα ενσωματώθηκαν σε 2,5 τοις εκατό μεθυλοκυτταρίνη για βελτιωμένη συντήρηση και στέγνωσαν στον αέρα πριν από την εξέταση. Η μορφομετρική ανάλυση των hAFS-EVs μετρήθηκε σε 10 μικρογραφίες που ελήφθησαν τυχαία στα 40.{46}}× g μεγέθυνσης. Το μέγεθος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την αυθαίρετη συνάρτηση γραμμής που είναι ενσωματωμένη στο πλαίσιο διαλόγου μέτρησης του λογισμικού Radius (EMSIS, Muenster Γερμανίας). Για να απεικονιστεί η κατανομή μεγέθους hAFS-EV, τα αποτελέσματα σχεδιάστηκαν ως διάγραμμα κουκκίδας διασποράς και ως κατανομή συχνότητας στην οποία κάθε μέγεθος αναπαρίσταται ως ένα σημείο μαζί με γραμμές για τη διάμεση τιμή και το εύρος.

Τα f-hAFS-EV και p-hAFS-EVs αναλύθηκαν επίσης με Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) για την αξιολόγηση των σωματιδίων που απελευθερώνονται από κύτταρα 10 μοιρών. Τα hAFS-EVs αραιώθηκαν 1:100 σε διάλυμα PBS και αποκτήθηκαν σε NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, UK) που κατέγραψε τουλάχιστον 3 διαφορετικά καρέ των 60 δευτερολέπτων το καθένα. Τρεις διαφορετικές αποκτήσεις κάθε δείγματος αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την επιλογή Batch Process στο λογισμικό. 4.7.LC-MS/MS Ανάλυση hAFS-CM και hAFS-EVs 4.7.1. Πέψη εντός διαλύματος

Πραγματοποιήθηκε πρωτεομική ανάλυση σε 3 βιολογικά αντίγραφα των hAFS-CM και hAFS. EVs από f-hAFS και p-hAFS μετά από φυσιολογική ή υποξική προετοιμασία (n=24 διαφορετικές συνθήκες). Τα δείγματα hAFS-CM και hAFS-EVs εναιωρήθηκαν σε 0.1M NHCO3 pH 7,9 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RapigestIM Αντιδραστήριο SF (Waters Co, Milford, MA, ΗΠΑ) στην τελική συγκέντρωση 0,25 τοις εκατό (w/v). Τα προκύπτοντα εναιωρήματα επωάστηκαν ενώ αναδεύονταν στον 100 βαθμό για 2{{40}} λεπτά. Η πέψη διεξήχθη σε κάθε δείγμα με την προσθήκη Τροποποιημένης Τρυψίνης Βαθμού Αλληλουχίας (Promega Inc, Madison, WI, USA) σε αναλογία ενζύμου/υποστρώματος 1:50 (β/β) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 37 βαθμούς σε 0,1 Μ NH4HCO3 ρΗ 7,9 ρυθμιστικό διάλυμα με 10 τοις εκατό CHSCN. Ένα επιπλέον κλάσμα θρυψίνης (1:100 β/β) προστέθηκε το πρωί και η πέψη συνεχίστηκε για 4 ώρες. Επιπλέον, η προσθήκη 0,5 τοις εκατό Trifluoroacetic acid (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) σταμάτησε την ενζυματική αντίδραση και μια επακόλουθη επώαση στους 37 βαθμούς για 45 λεπτά ολοκλήρωσε την υδρόλυση οξέος RapiGest[108]. Τα μη αναμίξιμα με το νερό προϊόντα αποικοδόμησης απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στις 13.{37}} rpm για 10 λεπτά. Τέλος, τα μείγματα θρυπτικής χώνευσης αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας στήλες περιστροφής PierceTM C-18 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και επαναιωρήθηκαν σε μυρμηκικό οξύ 0,1 τοις εκατό (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, ΗΠΑ) σε νερό (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, ΗΠΑ) σε συγκέντρωση 0,1 ug/μL.

4.7.2.Υγρή Χρωματογραφία

Τα μείγματα που υπέστησαν πέψη με θρυψίνη αναλύθηκαν μέσω μιας πλατφόρμας που αποτελείται από ένα νανο-υγρό χρωματογραφικό σύστημα, σύστημα Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D (Eksigent, μέρος της AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA) διαμορφωμένο σε λειτουργία παγίδας-έκλουσης, σε συνδυασμό με φασματόμετρο μάζας υψηλής ευκρίνειας. Εν συντομία, τα δείγματα (0.8 ug εγχύθηκαν) πρώτα φορτώθηκαν σε μια παγίδα πεπτιδίων (200 μμ × 500 μ.μ. ChromXP C18- CL,3 um,120 A) και πλύθηκε με την αντλία φόρτωσης να λειτουργεί σε ισοκρατική λειτουργία με 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε νερό για 10 λεπτά με ροή 3 μL/min. Η αυτόματη εναλλαγή μιας βαλβίδας δέκα θυρών στη συνέχεια έκλουσε το παγιδευμένο μείγμα σε μια στήλη νανο-αντίστροφης φάσης (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um,120 A) μέσω βαθμίδας 150 λεπτών του εκλούτη Β (διαλύτης έκλουσης Α, 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε νερό, μέσο έκλουσης Β, 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο) με ρυθμό ροής 300 nL/min. Σε βάθος, η κλίση ήταν: από 5-10% Bin 3min,10-40% Bin 130min,40-95% Bin 10min και διατήρηση στο 95% B για 7min. 4.7.3.Φασματομετρία μάζας

Οι αναλύσεις MS/MS πραγματοποιήθηκαν σε φασματόμετρο μάζας LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία) εξοπλισμένο με πηγή ιόντων νανοψεκασμού. Η τριχοειδής τάση ψεκασμού ορίστηκε στα 1,7 kV και η θερμοκρασία του τριχοειδούς μεταφοράς ιόντων διατηρήθηκε στους 220 βαθμούς . Τα φάσματα πλήρους MS καταγράφηκαν σε ένα εύρος 400-1600 m/z σε λειτουργία θετικών ιόντων, με ισχύ ανάλυσης 60000 (πλήρες πλάτος στο μισό μέγιστο) και ρυθμό σάρωσης 2 φάσματα/s. Αυτό το βήμα ακολουθήθηκε από πέντε συμβάντα MS/MS χαμηλής ανάλυσης που δημιουργήθηκαν διαδοχικά με τρόπο που εξαρτάται από δεδομένα στα κορυφαία πέντε ιόντα που επιλέχθηκαν από το πλήρες φάσμα MS (σε 35 τοις εκατό ενέργεια σύγκρουσης), χρησιμοποιώντας τη δυναμική εξαίρεση 0,5 λεπτών για Ανάλυση MS/MS. Οι λειτουργίες σάρωσης φασματόμετρου μάζας και οι βαθμίδες διαλυτών υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ελέγχονταν από το σύστημα δεδομένων Xcalibur έκδοση 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία).

4.7.4.Πρωτεομική Επεξεργασία Δεδομένων και Εξόρυξη Δεδομένων

Όλα τα δεδομένα που δημιουργήθηκαν αναζητήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναζήτησης Sequest HT που περιέχεται στο λογισμικό Thermo Scientific Proteome Discoverer, έκδοση 2.1. Τα πειραματικά φάσματα MS/MS συσχετίστηκαν με ακολουθίες τρυπτικών πεπτιδίων σε σύγκριση με τα θεωρητικά φάσματα μάζας που λήφθηκαν με πέψη σε πυρίτιο της βάσης δεδομένων πρωτεώματος Uniprot Homo Sapiens (74600 καταχωρήσεις), που λήφθηκαν στις 2 Ιανουαρίου 020 (www.uniprot.org, πρόσβαση στις 10 2 Μαρτίου021). Τα ακόλουθα κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση των αλληλουχιών πεπτιδίων και των σχετικών πρωτεϊνών: θρυψίνη ως ένζυμο, τρεις χαμένες διασπάσεις ανά πεπτίδιο, ανοχές μάζας ±50 ppm για πρόδρομα ιόντα και ±0,8 Da για ιόντα θραύσματος. Ο κόμβος διήθησης χρησιμοποιήθηκε με μια στρατηγική απορρόφησης στόχου για να δώσει ένα τελικό ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) σε επίπεδο Αντιστοίχισης φάσματος πεπτιδίου (PSM) 0,01 (αυστηρό) με βάση τις τιμές q, λαμβάνοντας υπόψη ένα μέγιστο deltaCN 0,05 [109]. Μόνο πεπτίδια με ελάχιστο μήκος πεπτιδίου έξι αμινοξέα και κατάταξη 1 λήφθηκαν υπόψη. Εφαρμόστηκαν η ομαδοποίηση πρωτεϊνών και οι αυστηρές αρχές της παρρησίας. Τα δεδομένα MS έχουν κατατεθεί στην Κοινοπραξία ProteomeXchange μέσω του αποθετηρίου συνεργατών PRIDE [10] (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, πρόσβαση στις 10 Μαρτίου 2021) Οι 48 πρωτεΐνες που ελήφθησαν από τον αλγόριθμο SEQUEST ευθυγραμμίστηκαν, κανονικοποιήθηκαν , και σε σύγκριση χωρίς ετικέτα. Ένας εσωτερικός αλγόριθμος, συγκεκριμένα, ο Πολυδιάστατος Αλγόριθμος Πρωτεϊνικός Χάρτης (MAProMa) χρησιμοποιήθηκε για αυτόν τον σκοπό, χρησιμοποιώντας τις μέσες αντιστοιχίσεις φάσματος πεπτιδίων (aPSM) [111,112] που αντιστοιχούν στον μέσο όρο όλων των φασμάτων που προσδιορίζονται για μια πρωτεΐνη και, κατά συνέπεια , στη σχετική αφθονία του, σε κάθε αναλυόμενη κατάσταση. Σε βάθος, για την επιλογή διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών, υποομάδες (και για τα εμβρυϊκά έναντι των περιγεννητικών-hAFS-CM και hAFS-EV, λαμβάνοντας υπόψη και τη διέγερση προετοιμασίας των υποξικών κυττάρων), συγκρίθηκαν κατά ζεύγη εφαρμόζοντας ένα όριο 0,4 και 5 στα δύο MAProMa δείκτες DAve (Διαφορικός μέσος όρος) και DCI (Δείκτης διαφορικής εμπιστοσύνης), αντίστοιχα. Το DAve, το οποίο αξιολογεί τις αλλαγές στην έκφραση πρωτεΐνης, ορίστηκε ως (XY)/(X＋Y)/0,5, ενώ το DCI που αξιολογεί την εμπιστοσύνη της διαφορικής έκφρασης ορίστηκε ως (X συν Υ)×(XY)/2 Τα X και Y Οι όροι αντιπροσωπεύουν το PSM μιας δεδομένης πρωτεΐνης σε δύο συγκριτικά δείγματα. Επιπλέον, οι μέσες λίστες πρωτεϊνών, που ελήφθησαν από κάθε εξεταζόμενη συνθήκη, υποβλήθηκαν σε ανάλυση γραμμικής διάκρισης (LDA) και πρωτεΐνες με τη μεγαλύτερη αναλογία F (Μεγαλύτερη ή ίση με 4,5) και τη μικρότερη τιμή p (Μικρότερη ή ίση με 0,001) διατηρήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ιεραρχική ομαδοποίηση, εφαρμόζοντας τη μέθοδο του Ward και τη μετρική απόστασης του Ευκλείδειου χρησιμοποιώντας το λογισμικό JMP 15.2. Συγκεκριμένα, ο λόγος F αντιπροσώπευε το μέσο τετράγωνο του μοντέλου διαιρούμενο με το μέσο τετράγωνο σφάλματος, ενώ η τιμή p έδειξε την πιθανότητα να ληφθεί μια τιμή F μεγαλύτερη από αυτή που υπολογίστηκε εάν, στην πραγματικότητα, δεν υπήρχε διαφορά μεταξύ του μέσου όρου της ομάδας πληθυσμού. 4.8. Προφίλ κυτοκίνης και χημειοκίνης του hAFS-CM και του have-EV

Το προφίλ κυτοκίνης και χημειοκίνης του hAFS-CM και του has-EVs που ελήφθη από τα f-hAFS και p-hAFS μετά από υποξική προετοιμασία αξιολογήθηκε μέσω του κιτ Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array (R&D System, Minneapolis, MN, USA) σύμφωνα με οδηγίες του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήθηκαν είκοσι ug των δειγμάτων hAFS-CM και hAFS-EVs. Οι εικόνες μεμβρανών αποκτήθηκαν από ένα Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK) Το ειδικό περιεχόμενο κυτοκίνης/χημειοκίνης αξιολογήθηκε με την ποσοτικοποίηση της θετικής έντασης εικονοστοιχείων (μέσω της αυθαίρετης μονάδας) για κάθε ανιχνεύσιμη κυτοκίνη χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (διαθέσιμο στο https: //imagej.nih.gov/ij/, πρόσβαση στις 10 Μαρτίου 2021 [13]). 4.9.Εξαγωγή RNA από hAFS-EV και Επόμενο

Αλληλουχία Γενιάς

Το RNA απομονώθηκε από τα f-hAFS-EV και p-have-EV με miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Μιλάνο, Ιταλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ακεραιότητα και η κατανομή μεγέθους του RNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Agilent Small RNA με το μικρό μη κωδικοποιητικό τσιπ RNA προκειμένου να αξιολογηθεί το περιεχόμενο μικρών RNA που κυμαίνονται από 6 έως 150 νουκλεοτίδια (nt). Το Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Ιταλία) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του περιεχομένου microRNA (miRNAs), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι βιβλιοθήκες αλληλουχίας miRNA προετοιμάστηκαν και ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ QIAseq miRNA Library (Qiagen, Μιλάνο, Ιταλία) χρησιμοποιώντας 18,5 ng απομονωμένων miRNA ως είσοδο και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι βιβλιοθήκες συγκεντρώθηκαν μετά από ποιοτικό έλεγχο και ποσοτικοποίηση από το TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Οι συγκεντρωτικές βιβλιοθήκες αξιολογήθηκαν για ποιοτικό έλεγχο με qPCR σε πραγματικό χρόνο ακολουθώντας τον Οδηγό "Sequencing Library qPCR Quantification" (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) και αλληλουχήθηκαν από την πλατφόρμα Illumina NextSeq χρησιμοποιώντας High Output Hit v2.5 (75 κύκλοι) ( Illumina Inc, Σαν Ντιέγκο, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Η βασική κλήση πραγματοποιήθηκε με την προεπιλεγμένη ροή εργασίας Illumina NextSeq500.

4.10. Βιοπληροφορική Ανάλυση Δεδομένων Αλληλουχίας miRNA

Τα αρχεία Fastq υποβλήθηκαν αρχικά σε επεξεργασία με περικοπή του προσαρμογέα 3' και των βάσεων χαμηλής ποιότητας χρησιμοποιώντας το Cutadapt [114]. Μετά το κόψιμο, αναγνωρίστηκαν οι αλληλουχίες εισαγωγής και οι αλληλουχίες UMI. Οι αναγνώσεις χωρίς ακολουθία προσαρμογέα, οι αναγνώσεις με αλληλουχίες ένθεσης μικρότερες από 16 bp και οι αναγνώσεις με λιγότερο από 10 bp ακολουθίες UMI απορρίφθηκαν. Για τον σχολιασμό των ενθέτων αλληλουχιών, οι αναγνώσεις ευθυγραμμίστηκαν με τη διάταξη ανθρώπινου γονιδιώματος GRCh38 χρησιμοποιώντας Bowtie [15]Για κάθε δείγμα μετρήθηκαν όλες οι αναγνώσεις που είχαν εκχωρηθεί σε ένα συγκεκριμένο miRNA και τα συσχετισμένα UMI συγκεντρώθηκαν για να μετρηθούν μοναδικά μόρια. Η δευτερεύουσα ανάλυση πραγματοποιήθηκε με προσαρμοσμένα σενάρια R που είναι διαθέσιμα κατόπιν εύλογου αιτήματος. Η ανάλυση διαφορικού εμπλουτισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πακέτα Limma [116] και EdgeR Bioconductor [117].

4.11. Στατιστικές αναλύσεις

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ±sem τουλάχιστον τριών(n{0}}) ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι συγκρίσεις έγιναν με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από μεταθλιπτική δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey ή με δοκιμή t Student. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Graph-Pad Prism Version 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, πρόσβαση στις 10 Μαρτίου 2021) με στατιστική σημασία που ορίστηκε σε* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Συμπερασματικά, τα εμβρυϊκά και περιγεννητικά hAFS βρέθηκαν φαινοτυπικά ισοδύναμα με συγκρίσιμη εκκριτική ισχύ και EV εμπλουτισμό σε μέγεθος και κατανομή. Ωστόσο, ορισμένες διακρίσεις στο προφίλ εκκρίματός τους θα μπορούσαν να εκτιμηθούν. Συγκεκριμένα, το αναπτυξιακά ανώριμο προφίλ του εμβρυϊκού hAFS μπορεί να ανακεφαλαιωθεί από τα σκευάσματα εκκριμάτων τους που είναι προικισμένα με ένα πιο έντονο προ-αγγειογενές, προ-αναγεννητικό και αναζωογονητικό έκκριμα. Ωστόσο, τα περιγεννητικά hAFS εξακολουθούν να διατηρούν ένα σχετικό παρακρινικό προφίλ μέσω της έκφρασης παραγόντων που σχετίζονται με τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, το ανοσοτροποποιητικό, αντιφλεγμονώδες και νευροτροφικό δυναμικό παρόμοιο με το εμβρυϊκό hAFS. Αυτά τα ευρήματα μπορεί να παρέχουν χρήσιμες γνώσεις που υποστηρίζουν μια μελλοντική παρακρινή θεραπεία της σχετιζόμενης με τραυματισμό και της φλεγμονώδους/ισχαιμικής νόσου. Επομένως, η επιλογή είτε του εμβρυϊκού είτε του περιγεννητικού hAFS ως η ιδανικότερη κυτταρική πηγή θα πρέπει να αξιολογηθεί λαμβάνοντας υπόψη το συγκεκριμένο κλινικό σενάριο.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Int. J. ΜοΙ. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms