Προπιονικό οξύ που παράγεται από Cutibacterium Acnes Fermentation Βελτιώνει τη σύνθεση μελανίνης

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Hsin-Jou Kao1, Yan-HanWang2, Sunita Keshari3, John JacksonYang3, Shinta Simbolon1, Chun-Chuan Chen1 & Chun-Ming Huang1*

Η υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί συσσώρευση μελανίνης, η οποία μπορεί να μειωθεί με τη χρήση χημικών προϊόντων λεύκανσης. Ωστόσο, οι σχετικές ανησυχίες για την ασφάλεια τέτοιων προϊόντων έχουν ωθήσει την αναζήτηση φυσικών και αβλαβών εναλλακτικών λύσεων. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο τον εντοπισμό μιας φυσικής όξινης σύνθεσης για τη μείωση της μελάγχρωσης του δέρματος. Ο μεταβολίτης προπιονικό οξύ (CH3CH2COOH, PA) ήταν το πιο άφθονο λιπαρό οξύ στο διήθημα από τη ζύμωση Pluronic F68 (PF68) του Cutibacterium acnes (C. acnes) και μείωσε τα θετικά στο DOPA μελανοκύτταρα αναστέλλοντας σημαντικά τη δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης μέσω δέσμευσης υποδοχέας ελεύθερου λιπαρού οξέος 2 (FFAR2). Επιπλέον, η θεραπεία με 4 mM PA δεν άλλαξε τον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων, υποδεικνύοντας ότι είναι μια αποτελεσματική λύση για την υπερμελάγχρωση, που δεν προκαλεί κυτταρική βλάβη. Η μειωμένη DOPA-θετική μελανοκύτταρα και η δραστηριότητα τυροσινάσης παρατηρήθηκαν επίσης σε ιστό δέρματος αυτιών ποντικών που έγινε ένεση με μείγμα C. acnes και PF68, υποστηρίζοντας ότι η αναστολή της μελανογένεσης είναι πιθανό να μεσολαβεί μέσω μεταβολιτών ζύμωσης από C. acnesfermentation χρησιμοποιώντας PF68 ως πηγή άνθρακα. Επιπλέον, το PA δεν επηρέασε την ανάπτυξη του μητρικού του βακτηρίου C. acnes, επομένως είναι ένας ισχυρός μεταβολίτης ζύμωσης που δεν διαταράσσει την ισορροπία του μικροβιώματος του δέρματος.

Το δέρμα λειτουργεί ως διεπαφή μεταξύ του ανθρώπινου σώματος και του εξωτερικού περιβάλλοντος παρέχοντας άμυνα έναντι παθογόνων μικροοργανισμών, φυσικών και υπεριωδών βλαβών1. Εάν το ανθρώπινο δέρμα εκτίθεται υπερβολικά στην υπεριώδη ακτινοβολία (UVR) που επηρεάζει τη λειτουργία και την επιβίωση πολλών τύπων κυττάρων, προκαλώντας φλεγμονή του δέρματος, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο2,3. Η βλάβη του DNA που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία ενεργοποιεί τα κυτταρικά σήματα επιδιόρθωσης για την παραγωγή μελανίνης στα μελανοκύτταρα, με αποτέλεσμα τη μελάγχρωση του δέρματος4,5. Η υγιής επιφάνεια του ανθρώπινου δέρματος αποικίζεται από ποικίλο περιβάλλον μικροοργανισμών, πολλοί από τους οποίους είναι ακίνδυνοι ως συμπαραστάτες ή ευκαιριακά παθογόνα6,7. Τα προβιοτικά είναι κοινά παραδείγματα βακτηριοθεραπείας με δυνατότητα φωτοπροστασίας επιβραδύνοντας τα σημάδια γήρανσης του δέρματος και μετριάζοντας τις επιπτώσεις της δερματικής φλεγμονής που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία3,8,9. Για παράδειγμα, τα προβιοτικά βακτήρια γαλακτικού οξέος αποτρέπουν ιδιαίτερα τις φλεγμονώδεις, αλλεργικές αντιδράσεις και την ανοσοκαταστολή που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία στο δέρμα10. Επιπλέον, η ικανότητα του Cutibacterium acnes (C. acnes), ενός κυρίαρχου βακτηρίου στο μικροβίωμα του δέρματος, να παράγει πορφυρίνη ως απόκριση στην υπεριώδη ακτινοβολία UVR το καθιστά σημαντικό βιοδείκτη λόγω του ρόλου του στην προστασία και την πρόληψη της ανισορροπίας2,11,12, επομένως είναι πρακτικού ενδιαφέροντος13. Μελέτες αποκάλυψαν ότι το διήθημα ζύμωσης (GFF) μείωσε τη μελανίνη στα ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος, μειώνοντας έτσι τη μελάγχρωση του δέρματος14. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA) έχουν αξιοσημείωτα ρυθμιστικά αποτελέσματα στη μελανογένεση και καταστέλλουν τη δραστηριότητα τυροσινάσης σε καλλιεργημένα κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F1015. Οι περισσότερες θεραπευτικές επιλογές για την υπερμελάγχρωση εμποδίζουν τη μετατροπή της τυροσίνης σε μελανίνη, η οποία δρα ως αναστολέας της τυροσινάσης, ένα βασικό ρυθμιστικό ένζυμο που απαιτείται για τη βιοσύνθεση μελανίνης16. Πρόσφατα, η εκτεταμένη χρήση παραγόντων λεύκανσης του δέρματος, όπως οι φαινολικές ενώσεις και οι ενώσεις υδραργύρου, σε καλλυντικά σκευάσματα έχει εγείρει σοβαρές ανησυχίες για την ασφάλεια17. Επιπλέον, το FFAR2 (επίσης γνωστό ως GPR43) υπάρχει σε μια ποικιλία ιστών όπως ο μυελός των οστών, ο σπλήνας και το φυσιολογικό δέρμα18 και είναι ένας πολλά υποσχόμενος φαρμακευτικός στόχος για την παχυσαρκία, την κολίτιδα και ορισμένες φλεγμονώδεις αποκρίσεις19. Το FFAR2 είναι ένας υποδοχέας για λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας (SCFAs) με μήκος αλυσίδας μικρότερο από έξι άνθρακες όπως οξικό, βουτυρικό και προπιονικό, ο πιο ισχυρός αγωνιστής για το FFAR220,21. Προηγουμένως, δείξαμε ότι η in vivo αναστολή του FFAR2 στο δέρμα του ποντικού εμπόδισε τη μεσολάβηση βουτυρικού οξέος στον ερεθισμό με υπεριώδη ακτινοβολία3.

C. acnes is abundant on the human skin surface accounting for>60 τοις εκατό των βακτηρίων2. Επιπλέον, το προπιονικό οξύ (PA), ένας μεταβολίτης ζύμωσης από το C. acnes, και τα εστεροποιημένα παράγωγά του δρουν ως δυνητικός αντιμικροβιακός παράγοντας έναντι των επικαλύψεων Staphylococcus aureu11,22 και πολυ(αιθυλενοξειδίου) είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος αποφυγής λοιμώξεων23. Τα κοινά προβιοτικά βακτήρια του δέρματος μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη του USA300 μέσω ζύμωσης διμέ-μεθακρυλικής πολυ(αιθυλενογλυκόλης) ως εκλεκτικού εκκινητή της ζύμωσης24. Το PF68, ένα πολυμερές με βάση το PEG είναι ένας σταθερός φορέας γέλης για αντιμικροβιακούς παράγοντες, αυξάνοντας την επιφανειακή διαλυτότητα του φαρμάκου και χρησιμοποιείται συνήθως στη θεραπεία μολυσμένων τραυμάτων χωρίς εμφανείς παρενέργειες25. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε ότι το PF68 ως ένωση προερχόμενη από πολυμερές είναι ένας δυνητικά ασφαλής και αποτελεσματικός παράγοντας και η εφαρμογή μεταβολιτών από τη ζύμωση του PF68 από το δέρμα commensal C. acnes θα μπορούσε να αναστείλει την υπερμελάγχρωση ή τη μελανογένεση του δέρματος που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία.

Οφέλη cistanche tubolosa: αναστέλλει τη μελανογένεση του δέρματος.

Μέθοδοι

Δήλωση ηθικής.

Αυτή η μελέτη διεξήχθη αυστηρά με ένα εγκεκριμένο πρωτόκολλο Ιδρυματικής Επιτροπής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (IACUC) στο Εθνικό Κεντρικό Πανεπιστήμιο (NCU), Ταϊβάν (NCU-106-016) και σε συμμόρφωση με τις οδηγίες του Arrive (https://arriveguidelines .org/). Ποντίκια του Ινστιτούτου Έρευνας για τον Καρκίνο (ICR) (θηλυκά 8-9 εβδομάδων, Εθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων, Ταϊπέι, Ταϊβάν) θυσιάστηκαν χρησιμοποιώντας CO2 σε κλειστό κουτί. Όλες οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις σχετικές οδηγίες και κανονισμούς

Βακτηριακή καλλιέργεια.

Το C. acnes (ATCC 6919) καλλιεργήθηκε σε μέσο ενισχυμένου κλωστριδίου (RCM, Oxford, Hampshire, Αγγλία) υπό αναερόβιες συνθήκες χρησιμοποιώντας Gas-Pak (BD, Sparks, MD, USA). Τα βακτήρια καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς μέχρι τη φάση της λογαριθμικής ανάπτυξης. Τα βακτηριακά σφαιρίδια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 5,000×g για 10 λεπτά, πλύθηκαν σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και στη συνέχεια εναιωρήθηκαν σε PBS ή RCM για περαιτέρω πειράματα.

Ζύμωση βακτηρίων.

Το C. acnes (105 μονάδα σχηματισμού αποικιών (CFU)/mL) επωάστηκε σε 10 mL TSB παρουσία ή απουσία 2 τοις εκατό PF68 (BASF, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) υπό αναερόβιες συνθήκες χρησιμοποιώντας Gas-Pak στους 37 βαθμούς. Το PF68 μόνο στο TSB συμπεριλήφθηκε ως έλεγχος. Το 0,002 τοις εκατό (w/v) ερυθρό φαινόλης (Sigma) σε TSB χρησίμευσε ως δείκτης ζύμωσης. Μια αλλαγή χρώματος από κόκκινο-πορτοκαλί σε κίτρινο έδειξε την εμφάνιση βακτηριακής ζύμωσης, η οποία ανιχνεύθηκε με οπτική πυκνότητα στα 560 nm (OD560).

Ανάλυση αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC–MS).

Το C. acnes (105 CFU/mL) επωάστηκε σε TSB (10 mL) παρουσία 2 τοις εκατό PF68. Μετά από 1-ημέρα τα ζυμωμένα μέσα φυγοκεντρήθηκαν στα 5000 g για 10 λεπτά και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση SCFAs χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο26. Τα επίπεδα οξικού οξέος (AA), PA, βουτυρικού οξέος (BA) και ισοβουτυρικού οξέος (I-BA) στα μέσα ζύμωσης ποσοτικοποιήθηκαν με μια καμπύλη βαθμονόμησης που έγινε από έξι μη μηδενικά επίπεδα χρησιμοποιώντας το πρότυπο δοκιμής FFA ( Restek Corporation, Bellefonte, PA, USA) το οποίο αραιώνεται σε 500-, 1,{000-, 2,000-, 5,{000- και 10,000- πτυχή.

Καλλιέργεια κυττάρων μελανώματος B16F10.

Η κυτταρική σειρά μελανώματος B16F10 παρασχέθηκε ευγενικά από τον Δρ. Richard Gallo, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ, και τον Δρ. Cheng Ching-Yi, Chang Gung University of Science and Technology, Taiwan. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Life Technologies) και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Life Technologies) στους 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι 70-80 τοις εκατό συρροής και στη συνέχεια υποκαλλιεργήθηκαν με Τρυψίνη-Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA, Life Technologies).

Αντίστροφη μεταγραφή-ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT‑qPCR).

Χρησιμοποιήθηκε RT-qPCR για τη μελέτη της έκφρασης του γονιδίου τυροσινάσης σε κύτταρα μελανώματος B16F10 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4 mM PA για 48 ώρες. Το συνολικό κυτταρικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ Quick-RNA MiniPrep (Zymo Research, CA, USA), ακολουθούμενη από αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και ενισχύθηκε με RT-qPCR σε ένα σύστημα ABI 7300 (Applied Biosystems, Waltham, MA, ΗΠΑ). Το συγκριτικό κατώφλι κύκλου (ΔΔCT) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ποσοτικοποίησης της γονιδιακής έκφρασης. Το επίπεδο γονιδίου της γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση του γονιδίου της κινάσης τυροσίνης. Ο εκκινητής για τυροσινάση και GAPDH είναι 5'-TGACAAAGCCAAAACCCCCA-3′ (προς τα εμπρός). 5′-TTGTTCAAAAATACTTCCAGTGTGT-3′ (πίσω) και 5′-TGTGTCCGTCGRGGATCTGA-3′ (εμπρός). 5′-GATGCCTGCTTCACCACCTT3′(αντίστροφη).

Δραστηριότητα κυτταρικής τυροσινάσης μετά από καταστροφή του γονιδίου FFAR2.

B16F10 κύτταρα μελανώματος σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5×104 κύτταρα/φρεάτιο σε 24-πλάκες φρεατίου. Περαιτέρω, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FFAR2 εκλεκτικό ανταγωνιστή GLPG0974 (0,1 μΜ, GLPG) και ΡΑ (4 mM) και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θρυψίνη και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Fisher Scientific, NJ, USA). Τα λυμένα κύτταρα καταψύχθηκαν σε -80 βαθμό και αποψύχθηκαν δύο φορές και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 12,000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο αναμίχθηκε με 1 ug/mL λεβοντόπα (L-DOPA, Sigma) σε αναλογία 2:1 σε πλάκα 96-πηγαδιού, επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 1 ώρα και η OD στα 475 nm ήταν εντοπίστηκε27.

σε ποιες περιπτώσεις χρησιμοποιείται το cistanche: μειώνει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης

Επισήμανση BrdU.

Κύτταρα μελανώματος B16F10 αναπτύχθηκαν σε 8-διαφάνειες θαλάμου φρεατίου (Thermo Fisher Scientific) σε DMEM με 10 τοις εκατό FBS, πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη έως ότου επιτεύχθηκε συρροή 70 τοις εκατό. Στο μέσο καλλιέργειας προστέθηκε βρωμοδεοξυουριδίνη (10 μM, BrdU, ACROS, New Jersey, ΗΠΑ) μαζί με 4 mM PA. Το BrdU που προστέθηκε με PBS σε μέσα καλλιέργειας συμπεριλήφθηκε ως έλεγχος. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό υπερφθορο Roxy (PFA, Sigma) και στη συνέχεια διαπερατήθηκαν με 0,2 τοις εκατό Triton X-100 (Sigma) για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2Ν HCl στους 37 βαθμούς για 25 λεπτά, εξουδετερώθηκαν με HCl με ρυθμιστικό βορικού 0,1 Μ (ρΗ 8,5) για 10 λεπτά και αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού πριν από την επώαση αντισώματος αντι-BrdU (Abcam, ΜΑ, ΗΠΑ) ολονύκτια και γαϊδουριού αντι-κατσίκας Alexa Fluor 568 IgG (H plus L) (τεχνολογίες ζωής) ως δεύτερα αντισώματα για 1 ώρα στους 4 βαθμούς. Οι πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με 4,6-διαμιδινο2-φαινυλινδόλη (DAPI, Sigma). Οι εικόνες ελήφθησαν με το λογισμικό cellSens συνδεδεμένο σε μικροσκόπιο Olympus BX63.

Τα μοντέλα ποντικιών δημιουργήθηκαν με έκθεση στο υπεριώδες φως.

Τα μοντέλα ποντικιών έχουν συμβάλει καθοριστικά στην προώθηση της κατανόησης των πολλών ρόλων του UVR28. Η υπεριώδης ακτινοβολία αυξάνει τα θετικά στο DOPA μελανοκύτταρα στο δέρμα, ειδικά στο σημείο της έκθεσης29. Το πρωτόκολλο για τη θεραπεία της έγχυσης C. acnes στα αυτιά των ποντικών έχει περιγραφεί στην προηγούμενη μελέτη μας3 (Αυτή η αναφορά δεν μιλά για την έγχυση C. acnes). Στα αυτιά ποντικών ICR εγχύθηκαν ενδοδερμικά C. acnes (107 CFU) με και χωρίς 2 τοις εκατό PF68 ακολουθούμενη από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία Β (UVB) μήκους κύματος 312 nm σε δόση 200 mg/cm2 χρησιμοποιώντας λάμπα UV (Μοντέλο EB{ {10}}C, Spectronics Corp., Westbury, NY, USA) για 2 λεπτά κάθε μέρα για 3 ημέρες. Ως έλεγχος συμπεριλήφθηκαν αυτιά ποντικιού στα οποία έγινε ένεση PBS ή PF68 που ακολουθήθηκε από έκθεση σε UVB. Σε μια άλλη ομάδα ποντικών πειράματος, τα αυτιά εφαρμόστηκαν με 4 mM PA ακολουθούμενη από έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία, με PBS ως έλεγχο.

Σίγαση γονιδίου του FFAR2 με τη μεσολάβηση siRNA.

Προκειμένου να αποσιωπηθεί το γονίδιο FFAR2, χρησιμοποιήσαμε το χημικά τροποποιημένο siRNA που στοχεύει τον υποδοχέα FFAR2 (FFAR2 siRNA), τον αρνητικό μάρτυρα siRNA (NC siRNA) και τον έλεγχο χωρίς ένεση (C), τα οποία ελήφθησαν από την GenePharma Co. (Σανγκάη, Κίνα). Οι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες τους είναι siFFAR2: αισθητήριο κλώνος, 5'-CCGGUGCAGUACAAGUUUAUTT-3'; anti-sense σκέλος, 5′-AUAACUUGUACUGCACCGGTT-3′. έλεγχος: σκέλος αίσθησης, 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′; anti-sense σκέλος, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′. Αυτά τα χημικά τροποποιημένα siRNA χορηγούνταν κάθε μέρα για 3 ημέρες με ενδοδερμική ένεση στα αυτιά ποντικών χρησιμοποιώντας μικροβελόνα (2 mg/kg βάρους ποντικών). Από τη δεύτερη ημέρα, εφαρμόστε με 2 τοις εκατό έκθεση σε PA και UV για 3 ημέρες. Η προθεραπεία για την έγχυση siRNA στο ποντίκι όπως περιγράφεται στην αναφορά30. Δέκα, τα αυτιά των ποντικών αποκόπηκαν και χρωματίστηκαν την τέταρτη ημέρα.

Western blotting.

Τα αυτιά ποντικών εγχύθηκαν με χημικά τροποποιημένο FFAR2 και siRNAs ελέγχου που ακολουθήθηκε από εφαρμογή με 2 τοις εκατό έκθεση σε PA και UVB για 3 ημέρες. Την τρίτη ημέρα τα αυτιά των ποντικών κόπηκαν, ομογενοποιήθηκαν και στη συνέχεια λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Fisher Scientific). Τα κυτταρολύματα (30 μg) υποβλήθηκαν σε γέλη SDS-PAGE 10 τοις εκατό, το οποίο στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη πολυ(βινυλιδενοφθοριδίου) (PVDF) (Sigma) και μπλοκαρίστηκε με 5 τοις εκατό (β/ο) μη λιπαρό γάλα πριν από την επώαση όλη τη νύχτα με πρωτογενή αντισώματα στο FFAR2 Rabbit PolyAb (Proteintech, Rosemont, IL, ΗΠΑ) στους 4 βαθμούς ή -ακτίνη (1:1,000; Cusabio Technology, Χιούστον, Τέξας, ΗΠΑ). Ακολούθησε θεραπεία με δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας κατά κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου (1:5000) (Thermo Fisher Scientific) για 1 ώρα. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ένα αντιδραστήριο ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Thermo Fisher Scientific) και Omega Lum C Imaging System (Gel Co., San Francisco, CA, USA). Οι ζώνες πρωτεΐνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

Καταμέτρηση μελανοκυττάρων.

Οι χόνδροι από το ποντίκι αφαιρέθηκαν με το χέρι και οι ιστοί του δέρματος εμποτίστηκαν σε διάλυμα θειοκυανικού αμμωνίου (Sigma) στους 37 βαθμούς για 20 λεπτά. Η επιδερμική και η βασική στιβάδα απολεπίστηκαν από τον υπόλοιπο ιστό του δέρματος και τα μελανοκύτταρα χρωματίστηκαν με βύθιση σε 0.1 M PBS (pH 7,2) που περιείχε 0,14 τοις εκατό L-DOPA σε RT για 3 ώρες και τον αριθμό των μελανοκυττάρων στους ιστούς του δέρματος προσδιορίστηκε μικροσκοπικά σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο29.

Στατιστικές αναλύσεις.

Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με μη ζευγαρωμένη t-test χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism Τα επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας υποδείχθηκαν ως τα ακόλουθα: *Ρ<0.05,><0.01,><0.001, and="" ns="non-significant." the="" mean±standard="" deviation="" (sd)="" for="" at="" least="" three="" independent="" experiments="" except="" for="" two="" independent="" western="" blotting="" analyses="" for="" fig.="" 4c="" was="" displayed.="" animal="" experiments="" were="" performed="" with="" at="" least="" three="" animals="" per="" treatment="">

cistanche tubolosa

Αποτελέσματα

Το C. acnes προκαλεί ζύμωση του PF68.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει τη ζύμωση προβιοτικών του δέρματος για την επαγωγή παραγωγής SCFA παρουσία ενώσεων ως πηγής άνθρακα26. Για να διερευνηθεί εάν το C. acnes μπορούσε να ζυμώσει το PF68, το C. acnes επωάστηκε με PF68 σε μέσα TSB για 1 ημέρα με ερυθρό φαινόλης ως δείκτη για την παρακολούθηση της βακτηριακής ζύμωσης. Σε μέσα TSB που επωάστηκαν μόνο με βακτήρια, το κόκκινο της φαινόλης άλλαξε από κόκκινο σε πορτοκαλί λόγω βακτηριακής αντιγραφής, ενώ στα μέσα TSB που περιέχουν βακτήρια και PF68, το κόκκινο χρώμα της φαινόλης άλλαξε σε ανοιχτό κίτρινο με μείωση του pH υποδηλώνοντας τη χρήση του PF68 ως μια πηγή άνθρακα για ζύμωση (Εικ. 1Α). Επιπλέον, το OD560 του ερυθρού της φαινόλης έδειξε σημαντική μείωση στην τιμή του pH στα μέσα TSB που περιέχουν βακτήρια και PF68 (Εικ. 1Β) σε σύγκριση με βακτήρια ή PF68 μόνο. Τα SCFAs που περιέχονται στη ζύμωση C. acnes που καλλιεργήθηκαν με PF68 ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση GC-MS (Εικ. 1C) και βρέθηκαν ότι είναι οξύ AA, PA, BA και I-BA, με το PA11 να έχει την υψηλότερη συγκέντρωση (Εικ. 1D ).

Εικόνα 1. Η βακτηριακή ζύμωση με πολυμερές συνοδεύτηκε από μείωση του ενδοκυτταρικού pH.

Επίδραση in vitro του PA στην παραγωγή μελανίνης μέσω του PA-FFAR2.

Fatty acids modulate the degradation of tyrosinase, a crucial enzyme involved in melanin biosynthesis in melanocytes and melanoma cells31. Therefore, to detect the in vitro effect of PA on melanin synthesis, B16F10 melanoma cells were treated with 4 mM PA for 48 h, with the decreased expression of the tyrosinase in PA treated melanoma cells compared to the control (Fig. 2A). The immunostaining of PA-treated melanoma cells after BrdU labeling showed that PA did not alter the proliferation of melanoma cells (Fig. 2B). Furthermore, the effect of PA and AA, two highly expressed SCFAs in the fermentation filtrate (Fig. 1D)32, on melanin production was assessed in melanoma cells, with PA causing a>διπλάσια μείωση στην παραγωγή μελανίνης σε σύγκριση με την ΑΑ (Εικ. 2C). Τα SCFA, όπως τα PA και AA, ρυθμίζουν τις λειτουργίες τους μέσω αλληλεπίδρασης με τα FFAR2 και FFAR3, με τα PA να είναι μεταξύ των πιο ισχυρών SCFA και για τους δύο αυτούς υποδοχείς33. Λαμβάνοντας υπόψη τη ρύθμιση του PA μέσω της αλληλεπίδρασής του με το FFAR2, η παρεμπόδιση της σηματοδότησης αυτού του υποδοχέα χρησιμοποιώντας έναν εκλεκτικό αναστολέα θα μπορούσε να είναι μια χρήσιμη προσέγγιση για την αξιολόγηση του ρόλου του PA στη ρύθμιση της μελανογένεσης. Η δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης παρέμεινε αμετάβλητη αναστέλλοντας το FFAR2 χρησιμοποιώντας τον εκλεκτικό ανταγωνιστή FFAR2 GLPG πριν από τη θεραπεία με ΡΑ και μειώθηκε χωρίς GLPG σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 2D). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν τον αποτελεσματικό ρόλο του PA-FFAR2 στην εξασθένηση της περιεκτικότητας σε μελανίνη αναστέλλοντας τη δραστηριότητα κινάσης τυροσινάσης σε κύτταρα μελανώματος με αμετάβλητο κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Σχήμα 2. Τα αποτελέσματα της έκφρασης του γονιδίου τυροσινάσης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα μελανώματος μετά από θεραπεία με ΡΑ.

Το μείγμα C. acnes και PF68 ανέστειλε τα λειτουργικά μελανοκύτταρα που προκαλούνται από την UVB στα αυτιά του ποντικού.

Η τοπική εφαρμογή εκχυλισμάτων ζύμωσης ή λιπαρών οξέων έχει αποδειχθεί ότι μειώνει την υπερμελάγχρωση του δέρματος που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία ρυθμίζοντας την αποικοδόμηση της τυροσινάσης34,35. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η μελανογένεση μετά από έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία οφείλεται στην ενεργοποίηση λειτουργικών μελανοκυττάρων στην επιδερμίδα ή το χόριο36. Έχοντας διαπιστώσει ότι το PA ως κύριο SCFA από τη ζύμωση C. acnes του PF68 θα μπορούσε να μειώσει αποτελεσματικά την παραγωγή μελανίνης in vitro, στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση του C. acnes συν PF68 σε αυτό in vivo. Τα αυτιά ποντικών ICR εκτέθηκαν σε UVB κάθε δεύτερη μέρα για 3 ημέρες ταυτόχρονα με την ένεση C. acnes και PF68. Η ένεση με PBS ή C. acnes ή PF68 μόνο συμπεριλήφθηκε ως μάρτυρες. Η επιδερμική και η βασική στιβάδα απολεπίστηκαν από τον ιστό του δέρματος στο αυτί του ποντικού και τα μελανοκύτταρα χρωματίστηκαν με L-DOPA. Υπήρξε σημαντική αύξηση στον αριθμό των μελανοκυττάρων μετά από έκθεση σε UVB, χωρίς αλλαγή μετά την ένεση μόνο με C. acnes ή PF68. Ωστόσο, μια σημαντική μείωση στον αριθμό των θετικών στο DOPA μελανοκυττάρων ανιχνεύθηκε στις ομάδες έκθεσης σε UVB μετά από θεραπεία με ένα μείγμα C. acnes και PF68 (Εικ. 3Α).

Εικόνα 3. Επαγωγή μελανοκυττάρων από την UVB και αναστολή από διαφορετικές θεραπείες.

Βελτίωση των λειτουργικών μελανοκυττάρων που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία στο αυτί του ποντικού από το PA, έναν μεταβολίτη ζύμωσης C. acnes.

Αξιολογήθηκε η επίδραση της άμεσης εφαρμογής του PA στη μελανογένεση που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία. Η υπερμελάγχρωση που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία και η έκφραση της τυροσινάσης στο δέρμα του αυτιού ποντικού στην ομάδα ελέγχου μειώθηκαν σημαντικά μετά την τοπική εφαρμογή του PA για 3 ημέρες (Εικ. 3Β). Tus, PA, ένας μεταβολίτης από τη ζύμωση PF68 του C. acnes αναστέλλει την παραγωγή λειτουργικών μελανοκυττάρων με σύνθεση μελανίνης από την UVB-επαγόμενη. Η έκφραση της τυροσινάσης μειώθηκε αισθητά σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΡΑ σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 3C).

Το PA αναστέλλει τα επαγόμενα από την UVB λειτουργικά μελανοκύτταρα μέσω του FFAR2 in vivo.

Για να προσδιοριστεί εάν η μείωση της εξωγενούς μελανογένεσης προέκυψε μέσω της αλληλεπίδρασης PA με τον συγγενή του υποδοχέα, το FFAR2 καταρρίφθηκε στα μελανοκύτταρα του δέρματος του αυτιού του ποντικιού, ακολουθούμενο από έκθεση σε UVB και θεραπεία με PA. Η επαγόμενη από την UVB αύξηση στον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων και η δραστηριότητα τυροσινάσης μειώθηκε σημαντικά στην επιδερμίδα του αυτιού ποντικού στην οποία έγινε ένεση NC siRNA μετά την εφαρμογή του PA (Εικ. 4Α, Β). Ωστόσο, ο αριθμός των μελανοκυττάρων και η δραστηριότητα της τυροσινάσης παραμένει αμετάβλητος ακόμη και μετά την εφαρμογή PA σε ακτινοβολημένη με UVB επιδερμίδα αυτιού ποντικού που καταρρίφθηκε με FFAR2. Επιβεβαιώσαμε τη μείωση του γονιδίου FFAR2 μετρώντας το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης του FFAR2 με ανάλυση Western blot (Εικ. 4C). Έτσι, το PA παρεμβαίνει στη μελανογένεση καταστέλλοντας τη δραστηριότητα της τυροσινάσης, στην οποία το PA-FFAR2 παίζει πιθανό ρόλο στην παραγωγή μελανίνης.

εκχύλισμα cistanche tubolosa

Συζήτηση

Η μελανίνη, ένας κρίσιμος παράγοντας άμυνας του δέρματος έναντι της υπεριώδους ακτινοβολίας, συντίθεται στα μελανοσώματα των μελανοκυττάρων, μεταφέρεται στα γειτονικά κερατινοκύτταρα μέσω των δενδριτικών άκρων και τελικά κατανέμεται σε όλη την επιδερμίδα37. Οι μεταβολίτες της ζύμωσης βακτηρίων χρησιμοποιούνται ολοένα και περισσότερο στη θεραπεία του δέρματος λόγω της ευεργετικής τους επίδρασης στη φλεγμονή του δέρματος που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία και στις μολυσματικές διαταραχές3. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το PA, ο κύριος μεταβολίτης από τη ζύμωση PF68 του C. acnes, μείωσε τα επαγόμενα από την UVB επίπεδα λειτουργικών μελανοκυττάρων αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της τυροσινάσης in vitro και in vivo μέσω του FFAR2.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν την αναστολή της μελανογένεσης μέσω της αναστολής της τυροσινάσης από μεταβολίτες ζύμωσης από προβιοτικά βακτήρια LA και Lactobacillus24,38,39. Επίσης, το υψηλού μοριακού βάρους βασισμένο σε PEG πολυμερές (~20,000) αποικοδομήθηκε πλήρως μέσω ζύμωσης από αρνητικά κατά Gram βακτήρια που παράγουν οξικό και προπιονικό40. Σε αυτή τη μελέτη, το PA (~4 mM) ήταν το πιο άφθονο SCFA στο διήθημα από τη ζύμωση PF68 του C. acnes και μείωσε την περιεκτικότητα σε μελανίνη στα μελανοκύτταρα πιο αποτελεσματικά από το AA. Επιπλέον, η θεραπεία με 4 mM ΡΑ ανέστειλε σημαντικά τη δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης στα μελανοκύτταρα, αποδεικνύοντας ότι η αναστολή της μελανογένεσης από την ΡΑ συνέβη μέσω της μείωσης της έκφρασης του γονιδίου τυροσινάσης. Οι άνθρωποι έχουν τον ίδιο αριθμό μελανοκυττάρων που δεν είναι ο λόγος που επηρεάζει τη μελάγχρωση του δέρματος αλλά την ενεργοποίηση των λειτουργικών μελανοκυττάρων από την υπεριώδη ακτινοβολία36,41. Εδώ, η θεραπεία με 4 mM PA δεν άλλαξε τον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων, υποδεικνύοντας ότι είναι μια αποτελεσματική επιλογή θεραπείας, χωρίς να προκαλεί κυτταρική βλάβη. Ο μειωμένος αριθμός μελανοκυττάρων και η δραστηριότητα τυροσινάσης παρατηρήθηκαν επίσης σε ιστό δέρματος αυτιών ποντικών στους οποίους έγινε ένεση μείγματος C. acnes και PF68, αποδεικνύοντας ότι η αναστολή της μελανογένεσης είναι πιθανό να προκαλείται μέσω μεταβολιτών ζύμωσης από τη ζύμωση C. acnes χρησιμοποιώντας PF68 ως άνθρακα πηγή. Επιπλέον, η μελέτη μας επικύρωσε το PA ως έναν εξαιρετικό αντιμικροβιακό παράγοντα, χωρίς μεταβολή στην ανάπτυξη του μητρικού του βακτηρίου C. acnes, δείχνοντας το PA ως έναν ισχυρό μεταβολίτη που δεν διαταράσσει την ισορροπία του μικροβιώματος του δέρματος11.

Η παραγωγή μελανίνης ξεκινά και ρυθμίζεται από διάφορα συστήματα σηματοδότησης, όπου η τυροσινάση καταλύει τη μετατροπή της τυροσίνης σε DOPA και σε ντοπακινόνη, οδηγώντας στο σχηματισμό μελανοκυτταρικών χρωστικών ουσιών42,43. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα αντιδραστήρια λεύκανσης του δέρματος δρουν σε διάφορα επίπεδα παραγωγής μελανίνης μέσω του FFAR2 για να επηρεάσουν τη δραστηριότητα της τυροσινάσης ή να στοχεύσουν άμεσα την τυροσινάση για να αναστείλουν τη μελανογένεση στο δέρμα44–46. Τα SCFA όπως τα PA και AA ασκούν τα αποτελέσματά τους μέσω της δέσμευσης με τους εκλεκτικούς συγγενείς υποδοχείς τους όπως το FFAR2 ή το FFAR3, με το PA να είναι ένα από τα πιο ισχυρά SCFA και για τους δύο υποδοχείς47. GLPG, εκλεκτικός ανταγωνιστής FFAR2 και γονιδιακή σίγηση του FFAR2 με τη μεσολάβηση siRNA για την υποστήριξη του αποκλεισμού του FFAR23,48. Στην τρέχουσα μελέτη, ο αυξημένος αριθμός μελανοκυττάρων και η έκφραση του γονιδίου τυροσινάσης στον ιστό του δέρματος των αυτιών των ποντικών δεν άλλαξαν σε απόκριση στην ακτινοβολία UVB ακόμη και μετά την εφαρμογή PA στο FFAR2 knockdown σε ποντίκια (Εικ. 4Α). Επιπλέον, η έκφραση του γονιδίου της τυροσινάσης μειώθηκε μετά τη θεραπεία με ΡΑ in vitro, ωστόσο, ο αποκλεισμός του γονιδίου FFAR2 με GLPG, έναν εκλεκτικό ανταγωνιστή FFAR2, βελτίωσε την επίδραση του ΡΑ στην εξασθένιση της έκφρασης του γονιδίου της τυροσινάσης. Μετά τον αποκλεισμό του FFAR2, η απώλεια του FFAR2 έχει ως αποτέλεσμα ενισχυμένη έκφραση της δραστηριότητας τυροσινάσης μετά από θεραπεία με ΡΑ. Αν και τόσο το PA όσο και το AA, οι μεταβολίτες της ζύμωσης από το C. acnes, έχουν παρόμοια συγγένεια για τη δέσμευση FFAR220, η σχετικά χαμηλότερη αποτελεσματικότητα του AA στην εξασθένιση της δραστηριότητας τυροσινάσης στα μελανοκύτταρα επικυρώνει τη θεραπευτική δυνατότητα του PA ως μεταβιοτικού κατά της μελανογένεσης.

Τα καταστροφικά αποτελέσματα της φωτογραφίας που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία στο δέρμα έχουν προσελκύσει εκτεταμένη προσοχή. Τα προϊόντα προστασίας από τον ήλιο και κατά της μελάγχρωσης χρησιμοποιούνται ευρέως, αλλά η ασφάλεια, η διείσδυση στο δέρμα και η θεραπευτική τους αποτελεσματικότητα εξακολουθούν να αμφισβητούνται49. Αν και η αβοβενζόνη είναι ένα κοινό συστατικό στα αντηλιακά λόγω της υψηλής αποτελεσματικότητάς της έναντι της υπεριώδους ακτινοβολίας, είναι φωτο ασταθές και επομένως δεν είναι ασφαλές και έχει ανιχνευθεί στο αίμα μετά από χρόνιες εφαρμογές50,51. Η ανάπτυξη αποτελεσματικής λεύκανσης του δέρματος μέσω του αποκλεισμού της έκφρασης τυροσινάσης από μεταβολίτες ζύμωσης από προβιοτικά βακτήρια ή πολυμερή ως πηγή άνθρακα είναι ένας αποτελεσματικός και φυσικός τρόπος για την καταστολή της μελανογένεσης38,39. Καθώς η χρήση ζωντανών προβιοτικών για καλλυντικά ρυθμίζεται αυστηρά, η προώθηση των ευεργετικών τους επιδράσεων μέσω μεταβολιτών ζύμωσης από ζωντανά προβιοτικά βακτήρια έχει γίνει εφικτή εφαρμογή. Επιπλέον, το PF68 ως πρεβιοτικό μπορεί να ενισχύσει την παραγωγή SCFAs από τη ζύμωση του C. acnes και έχει χρησιμοποιηθεί για να ενισχύσει τη βιολογική σταθερότητα και να βοηθήσει διάφορους θεραπευτικούς παράγοντες όπως 6-μικροσφαιρίδια φορτωμένα με μερκαπτοπουρίνη στην αλληλεπίδρασή τους με το ανθρώπινο σώμα52. Επιπλέον, το PF68 μπορεί να ενσωματωθεί σε κυτταρικές μεμβράνες και να μετατοπιστεί σε κύτταρα και έχει χρησιμοποιηθεί ως σταθερός φορέας γέλης για αντιμικροβιακούς παράγοντες, αυξάνοντας την επιφανειακή διαλυτότητα του φαρμάκου στη θεραπεία του δέρματος12,23. Ως εκ τούτου, το PF68 έχει θεωρηθεί μια ασφαλής και αποτελεσματική επιλογή για την ανάπτυξη φαρμακευτικών και καλλυντικών. Εκτός από τη λειτουργία του PF68 ως εκκινητής ζύμωσης για την αύξηση της ζυμωτικής δραστηριότητας του C. acnes, έχει επίσης τη δυνατότητα να είναι ένα ανοσοενισχυτικό για τη μείωση των αποτελεσματικών δόσεων των φαρμακευτικών αντιδραστηρίων και τη βελτίωση της διαλυτότητας των φτωχά υδατοδιαλυτών φαρμάκων.

Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η αλληλεπίδραση PA-FFAR2 μπορεί να είναι ένας κεντρικός μηχανισμός στην επίδραση των προβιοτικών ή των μεταβιοτικών στην υπερμελάγχρωση που προκαλείται από την UVR. Η θεραπεία με PA δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων. Σε σύγκριση με τις χημικές θεραπείες, οι μεταβολίτες των προβιοτικών είναι πιο ήπιοι και φυσικοί53. Αν και ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο οι μεταβολίτες της ζύμωσης PF68 του C. acnes αναστέλλουν τη μελανογένεση είναι ασαφής, τα στοιχεία από την παρούσα μελέτη υποδηλώνουν τη συμμετοχή της οδού τυροσινάσης SCFAs-FFAR2-. Αυτά τα αποτελέσματα είναι ευεργετικά για τη μελλοντική κλινική θεραπεία των διαταραχών της μελάγχρωσης και για την ανάπτυξη καλλυντικών που αυξάνουν το εύρος των εφαρμογών των προϊόντων λεύκανσης. Τέλος, η ποικιλία των προβιοτικών προσφέρει εξατομικευμένες θεραπείες για την υπερμελάγχρωση και την ανάπτυξη αποκλειστικών προϊόντων με υψηλότερη απόδοση.

Οφέλη από το εκχύλισμα cistanche: λεύκανση δέρματος