In Vitro And in Silico Insights Into Tyrosinase Inhibitors
Mar 28, 2022
Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a
Αφηρημένη
Η τυροσινάση είναι ένα βασικό ένζυμο υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση της μελανίνης και είναι αποτελεσματική στην προστασία της δερματικής βλάβης που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία. Ως μέρος των συνεχιζόμενων προσπαθειών για την ανακάλυψη ισχυρών αναστολέων τυροσινάσης, σχεδίασαν συστηματικά και συνέθεσαν δεκατρία (Ε)-βενζυλιδενο-1-παράγωγα ινδανόνης (BID1-13) και προσδιόρισαν τις ανασταλτικές τους δραστηριότητες έναντι της τυροσινάσης. Μεταξύ των ενώσεων που αξιολογήθηκαν, το BID3 ήταν ο πιο ισχυρός αναστολέας της τυροσινάσης μανιταριού (IC50=0.034 mM, μυκοφαινολική δραστηριότητα· IC50=1.39 mM, δραστικότητα διφαινολών). Οι κινητικές μελέτες αποκάλυψαν ότι το BID3 έδειξε έναν μικτό τύπο αναστολής τυροσινάσης με τιμή Ki 2,4 mM χρησιμοποιώντας L-DOPA ως υπόστρωμα. Στο silico μοριακές προσομοιώσεις σύνδεσης έδειξαν ότι το BID3 μπορεί να συνδεθεί με τις καταλυτικές και αλλοστερικές θέσεις της τυροσινάσης για να αναστείλει την ενζυμική δραστηριότητα, η οποία επιβεβαίωσε in vitro πειραματικές μελέτες μεταξύ BID3 και τυροσινάσης. Επιπλέον, τα περιεχόμενα μελανίνης μειώθηκαν και η δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης ανεστάλη μετά τη θεραπεία με BID3. Αυτές οι παρατηρήσεις αποκάλυψαν ότι το BID3 είναι ένας ισχυρός αναστολέας τυροσινάσης και δυνητικά θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως λευκαντικός παράγοντας για τη θεραπεία διαταραχών που σχετίζονται με τη μελάγχρωση.
Cistanche: βότανο λευκαντικού δέρματος
1. Εισαγωγή
Η μελανίνη συντίθεται από μελανοκύτταρα στο αγγειακό στρώμα της επιδερμίδας γενικά αναφέρεται στην οικογένεια των χρωστικών που είναι κοινώς γνωστές για την προστασία του δέρματος των θηλαστικών από βλάβες που προκαλούνται από την επιβλαβή υπεριώδη ακτινοβολία από τον καθαρισμό των ελεύθερων ριζών ή τη διασπορά του εισερχόμενου υπεριώδους φωτός [1]. Ωστόσο, η άφθονη παραγωγή μελανίνης προκαλεί ορατή υπερμελάγχρωση της επιδερμίδας, η οποία μπορεί να είναι εμφανής ως μέλασμα, φακίδες, κηλίδες ηλικίας ή γεροντικές φακίδες[2].
Η τυροσινάση (EC 1.14.18.1), ένα μεταλλοένζυμο που περιέχει χαλκό, είναι ένα βασικό ένζυμο που εμπλέκεται στις μελανογόνες διεργασίες. Η τυροσινάση καταλύει τα δύο στάδια περιορισμού του ρυθμού στη μελανογένεση. υδροξυλίωση της τυροσίνης (δραστικότητα κρεζολάσης ή μυκοφαινολικής) για την παραγωγή 3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνης (L-DOPA) και την επακόλουθη οξείδωση της L-DOPA (δραστηριότητα κατεχολάσης ή διφαινολών) στην αντίστοιχη DOPA-κινόνη. Όταν η L-τυροσίνη είναι το υπόστρωμα, το προϊόν της αντίδρασης που καταλύεται από τυροσινάση είναι η DOPA-κινόνη, η οποία στη συνέχεια μετατρέπεται σε μελανίνη [3]. Αυτά τα βήματα είναι ζωτικής σημασίας για την προστασία του δέρματος από την υπεριώδη ακτινοβολία. Το Mushroom Agaricus χρησιμοποιείται για την εμπορικά διαθέσιμη και υψηλή ομολογία του με το ένζυμο θηλαστικού τυροσινάση που το καθιστά κατάλληλο ως μοντέλο για μελέτες μελανογένεσης [4]. Στους ανθρώπους, η μελανίνη βοηθά στην προστασία του δέρματος από τη βλάβη που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία [5]. Ωστόσο, το υπερβολικό επίπεδο μελανίνης προκαλεί διάφορες δερματολογικές διαταραχές, όπως υπερμελάγχρωση, μέλασμα, πανάδες και κηλίδες ηλικίας [6]. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς της νεοτυροσινάσης που παρουσιάζουν ιδιότητες ομοιάζουσες με φάρμακα και λεύκανση του δέρματος απαιτούνται για την αναστολή της υπερβολικής μελάγχρωσης του δέρματος.
1-Η ινδανόνη, με σκελετό βενζοϋλο-κυκλοπεντανόνης, θεωρείται ως τα άκαμπτα ξαδέλφια των χαλκόνων, ενσωματώνοντας το ακόρεστο σύστημα κετόνης των χαλκόνων που σχηματίζει έναν κυκλικό 5μελή δακτύλιο, το οποίο είναι ένα συστατικό που απαντά στη φύση που υπάρχει σε διάφορες βρώσιμες φυτικές πηγές [7 ]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι οι ενώσεις που διαθέτουν ένα τμήμα 1-ινδανόνης έχουν φαρμακολογική σημασία, καθώς παρουσιάζουν διάφορες ευεργετικές βιολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων των αντιφλεγμονωδών [8-10], αντικαρκινικών [11,12], αντιοξειδωτικών [13], κατά της νόσου του Πάρκινσον ασθένεια [14], αντι-Αλτσχάιμερ [15-17], αντιμικροβιακή [18], αντι-ανοσοκατασταλτική [19], και αντι-τυροσινάση [20] ιδιότητες.
Οι χαλκόνες (1,3-διαρυλ-2-κατάλληλες-1-) είναι αρωματικές κετόνες που αποτελούνται από δύο αρωματικούς δακτυλίους συνδεδεμένους με ένα σύστημα τριών ανθράκων a,b-ακόρεστου καρβονυλίου ως κεντρικό πυρήνα [21, 22]. Αυτά τα φυσικά απαντώμενα συστατικά βρίσκονται σε διάφορα βρώσιμα φυσικά φυτά και θεωρούνται ως πρόδρομες ενώσεις για μια συνθετική οδό φλαβονοειδών και ισοφλαβονοειδών όπως πυραζολίνες, πυριμιδίνη, φλαβανόλη, φλαβόνες, φλαβανόνες, ισοφλαβόνες, αυρόνες, ανθοκυανιδίνη, διυδροφλαβανόλη [23–25]. Το σύστημα α,β ακόρεστου καρβονυλίου είναι υψίστης σημασίας για τον τύπο της βιολογικής δραστηριότητας, καθώς αυτά τα συστήματα κατανέμονται σε πολλά φυσικά προϊόντα όπως οι χαλκόνες καθώς και η ινδανόνη, όπου τα μοριακά είναι σχετικά πιο επίπεδα και η μετάδοση των ηλεκτρονικών επιδράσεων των αρυλικών υποκαταστατών κατευθύνεται στην ομάδα καρβονυλίου [7]. Προηγούμενοι πολλοί ερευνητές ανέφεραν ότι οι χαλκόνες επισημάνθηκαν ως μια νέα κατηγορία αναστολέων τυροσινάσης σε αρκετές δημοσιεύσεις [26-29]. Πρόσφατα, ο Kim και οι συνεργάτες του [30,31] σχεδίασαν και συνέθεσαν σειρές παραγώγων χαλκόνης και τις αξιολόγησαν για in vitro αντι- τυροσινάση και αντι-μελανογόνες δράσεις κατά των μελανοκυττάρων ποντικού.
Σύμφωνα με τα προηγουμένως αναφερθέντα δεδομένα μας, τα παράγωγα με ένα ικρίωμα ακόρεστου καρβονυλίου (Ε)-β-φαινυλ-α, β-ακόρεστα έδειξαν αναστολή της ποτεντυροσινάσης [32-34]. Οι (Ε)-βενζυλιδενο-1-ινδανόνες μπορεί να είναι ένας ελκυστικός αντιμελανογόνος παράγοντας, καθώς η ένωση έχει το ικρίωμα (Ε)-β-φαινυλ-α, β-ακόρεστο καρβονυλικό ικρίωμα στη χημική τους δομή. Συγκεκριμένα, οι Radhakrishnan et al. (2015) [20]σχεδίασε και συνέθεσε μια σειρά βενζυλιδενο-1-ινδανοπαραγώγων που έφεραν διαμόρφωση (Ζ) και αξιολόγησε τη δράση τους έναντι της τυροσινάσης. Αν και αυτά τα παράγωγα (Ζ)-βενζυλιδενο-1-ινδανόνης έχουν διερευνηθεί αντι-τυροσινάση και αντι-μελανογενετική δράση των παραγώγων (Ε)-βενζυλιδενο-1-ινδανόνης δεν έχουν ακόμη εξεταστεί.
Ως εκ τούτου, σχεδιάσαμε και συνθέσαμε δεκατρείς ενώσεις (BID1-13) του σκελετού 1-ινδανόνης που φέρει βενζυλιδένιο μορφής (Ε). Μεταξύ αυτών των συνθετικών ενώσεων, μια 2,4-διυδροξυομάδα στον δακτύλιο Β της 1-ινδανόνης έδειξε τη μεγαλύτερη αναστολή της τυροσινάσης (περίπου 400- φορές πιο αποτελεσματική από το κοτζικό οξύ, θετικός έλεγχος). Επιπλέον, αξιολογούμε περαιτέρω την ανασταλτική δραστηριότητα της τυροσινάσης BID3 καθώς και για να χαρακτηρίσουμε τον ρυθμιστικό ρόλο της στη σύνθεση μελανίνης χρησιμοποιώντας κύτταρα μελανώματος B16F10. Σε εκτεταμένα πειράματα, αξιολογήσαμε το αντιμελανογόνο δυναμικό του BID3 και προσπαθήσαμε να αναγνωρίσουμε την ενζυμική κινητική και τις μοριακές μελέτες σύνδεσης. Σε διαδοχικά πειράματα, διερευνήθηκε επίσης το δυναμικό της κυτταρικής τυροσινάσης BID3 και η παραγωγή μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος B16F10 που προκαλούνται από a-MSH και IBMX.
ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΣΗ ΚΑΙ ΜΕΣΑ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ: ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ CISTANCHE
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Αντιδραστήρια
Τυροσινάση μανιταριού (EC 1.14.18.1), ορμόνη διέγερσης άλφα μελανοκυττάρων (a-MSH), 3-ισοβουτυλ-1-μεθυλξανθίνη (IBMX), L-τυροσίνη, L-3,{{ 11}}διυδροξυφαινυλαλανίνη (L-DOPA), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), κοζικό οξύ, φθαλικό οξύ και τρανς-κινναμικό οξύ αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Το τροποποιημένο με Dulbecco μέσο Eagle (DMEM), ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS), η στρεπτομυκίνη και η αμφοτερικίνη αγοράστηκαν από την WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Νότια Κορέα). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich.
2.2. Χημεία
2.2.1. Γενικές μέθοδοι
Όλα τα αντιδραστήρια ελήφθησαν στο εμπόριο και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) και η χρωματογραφία στήλης διεξήχθησαν σε προεπικαλυμμένες πλάκες Merck 60F245 και MP Silica 40–63, 60 Α, αντίστοιχα. Δεδομένα φασματοσκοπίας μάζας υψηλής ανάλυσης (HR) ελήφθησαν σε φασματόμετρο μάζας υγρής χρωματογραφίας (LC) τετραπλού χρόνου πτήσης Agilent AccurateMass (Q-TOF) (Agilent, Santa Clara, CA, USA) σε θετική λειτουργία ESI. Τα φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) καταγράφηκαν σε ένα φασματόμετρο Varian Unity INOVA 400 ή σε ένα φασματόμετρο Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ΗΠΑ) για 1H NMR (400 και 500 MHz) και για 130 Hz Rz (100 Cly NM) . DMSO d6, CD3OD και CDCl3 χρησιμοποιήθηκαν ως διαλύτες NMR για δείγματα NMR. Η σταθερά σύζευξης (J) και οι χημικές τιμές μετατόπισης μετρήθηκαν σε Hertz (Hz) και μέρη ανά εκατομμύριο (ppm), αντίστοιχα. Οι συντμήσεις που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση των δεδομένων 1H NMR είναι οι εξής: s (μονό), bs (ευρεία μονή), d (διπλή), dd (διπλό διπλών), t (τριπλή), TD (τριπλή διπλή), q ( κουαρτέτο), andm (πολλαπλά).
2.2.2. Διαδικασία για τη σύνθεση του BID1–13
Ένα διάλυμα βενζαλδεΰδης (1,1–1,2 ισοδύναμα) και 1-ινδανόνης (100 mg, 0,76 mmol) σε 1 Μ σε οξικό οξύ HCl (0,4 mL) αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 4–48 ώρες. Μετά την προσθήκη νερού, τα ιζήματα διηθήθηκαν και πλύθηκαν με νερό και εξάνιο: οξικό αιθυλεστέρα (1:1), εξάνιο: διχλωρομεθάνιο (4:1-1:1) ή μείγμα διχλωρομεθανίου και μεθανόλης, ανάλογα με τις ιδιότητες των υπόλοιπων βενζαλδεΰδων. για να δώσει (Ε)-βενζυλιδενο-1-ινδανόνες (BID1-13) σε αποδόσεις 32,8-99,1 τοις εκατό . Ο δομικός χαρακτηρισμός (1H και 13C NMR και δεδομένα μάζας όλων των BID) των συντιθέμενων ενώσεων παρέχεται στις Συμπληρωματικές πληροφορίες.
2.2.2.1. (Ε)-2-(4-Υδροξυβενζυλιδένιο)-2,3-διυδρο-1H-inden-1-one (BID1).
Κίτρινο στερεό; απόδοση, 93,4 τοις εκατό ; χρόνος αντίδρασης, 6 ώρες; μοριακός τύπος, C16H12O2; σ.τ., 224,7–225,9 C; 1Η NMR (400 MHz, DMSO d6) d 10.10 (s, 1H, OH), 7.72 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- Η), 7,64–7,58 (m, 4Η, 4-Η, 5-Η, 20-Η, 60-Η), 7,43 (s, 1Η, βινυλικό Η), 7.39 (t,1H, J=7.2 Hz, 6-H), 6.87 (d, 2H, J=8.0 Hz, 30-H, {{46 }}Η), 3,99 (s, 2Η, CH2); 13C NMR (100 ΜΗζ, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3, 135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 1,61, 126,1, 127,1, 126,1, 127,1, 126,1, 127,1, 126,1, 127,1, 126,1, 126,1, 126,1, 127,1, 126,1,1,1,1,1,1,1,3,1,6,1,6,1,6,1,6,1,3,1,1,6,1,6,1,3. Η) συν υπολ. 237.0910, παραβ. 237.0911.
2.2.2.2. (Ε)-2-(3,4-Διυδροξυβενζυλιδένιο)-2,3-διυδρο-1H-inden-1-one (BID2).
Κίτρινο στερεό; απόδοση, {{{0}}.6 τοις εκατό ; χρόνος αντίδρασης, 5 ώρες; μοριακός τύπος, C16H12O3; σ.τ., 251,2–252,4 C; 1Η NMR (400 MHz, DMSO d6) d 9.65 (s, 1H, OH), 9.24 (s, 1H, OH), 7.72 (d, 1H,J=7 .6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7.42 (t, 1H,J {{35 }}.2 Hz, 6-H), 7.35 (s, 1H, βινυλικό Η), 7.19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H). , J=8.0 Hz, 60-H), 6.83 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 3.98 (s, 2H, CH2 ) 13C NMR (100 MHz, DMSO D6) D 193,8, 150,4, 148,7, 146,3,138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 127,3, 127,1, 125,0, 124,0,118,2, 116,7, 32,7; HRMS (ESI συν) m/z C16H13O3 (Μ συν Η) συν υπολογ.253,0859, obsd 253,0857.
2.2.2.3. (Ε)-2-(2,4-Διυδροξυβενζυλιδένιο)-2,3-διυδρο-1H-inden-1-one (BID3).
Κίτρινο στερεό; απόδοση, 5{{2{0}},9 τοις εκατό ; χρόνος αντίδρασης, 10 ώρες; μοριακός τύπος, C16H12O3; σ.τ., 198,5–199,9 C (αποσ.); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, βινυλικό Η), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz,60-H), 7,67-7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7.45 (t, 1H, J=7.0 Hz, 6-H), 6.45 (d , 1Η, J=8.5 Hz, 50-Η), 6.39 (s, 1Η, 30-Η), 4.01 (s, 2Η, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.9, 161.6, 160.4, 150.3, 138.6, 134.8, 131.7, 130.3, 128.7, 128.2, 3.1, 127. HRMS (ESI συν) m/z C16H13O3 (Μ συν Η) συν υπολογ.253,0859, obsd 253,0858.
2.2.2.4. (Ε)-2-(4-Υδροξυ-3-μεθοξυβενζυλιδένιο)-2,3-διυδρο-1Hinden-1-one (BID4).
Κίτρινο στερεό; απόδοση, 52,0 τοις εκατό ; χρόνος αντίδρασης, 4 ώρες, μοριακός τύπος, C17H14O3; σ.τ., 186,9–187,4 C; 1Η NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9.71 (s, 1H, OH), 7.73 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz. , 20-H), 7.43 (t, 1H, J=7.2 Hz, 6-H), 7.31 (s, 1H, βινυλικό H), 7.24 (dd, 1H, J=8.0,2.0 Hz, 60-H), 6.87 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 4.05 (s, 2H, CH2 ), 3.84 (s, 3Η, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.9, 150.5, 149.7, 148.5, 138.3, 135.2, 134.4, 132.3, 128.2, 127.3, 128.2, 127.3, 128.2, 127.3, 128.2, 127.3, 1, 127 HRMS (ESI συν) m/z C17H15O3 (Μ συν Η) συν υπολ. 267,1016, obsd 267,1016.
2.3. Βιολογική αξιολόγηση
2.3.1. Ανασταλτικός προσδιορισμός τυροσινάσης μανιταριών
Ο προσδιορισμός ανασταλτικής δραστηριότητας τυροσινάσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τυροσινάση μανιταριού όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρή τροποποίηση[35,36]. Εν συντομία, 10 mL μιας καθορισμένης συγκέντρωσης κάθε ένωσης (0,0005–50 mM) και 20 mL τυροσινάσης μανιταριού (1000 μονάδες/mL) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM (pH 6,5) προστέθηκαν σε μια αντίδραση 170 mL μίγμα σε μικροπλάκα 96-πηγαδιού (Corning, ΗΠΑ). Η αναλογία διαλύματος L-τυροσίνης ή L-DOPA 1 mM, ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού καλίου 50 mM (ρΗ 6,5) και απεσταγμένου νερού ήταν 10:10:9. Τα μίγματα της αντίδρασης επωάστηκαν στους 37 C για 30 λεπτά. Μετά από αυτό, η ποσότητα ντοπαχρώματος που παρήχθη σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκε με φασματοφωτομετρική ανάλυση στα 492 nm (OD492) χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών. Ο ρυθμός αναστολής της τυροσινάσης (%) υπολογίστηκε ως (1 Abssample/Abscontrol) 100 τοις εκατό. Ο βαθμός αναστολής του δείγματος εκφράστηκε ως η συγκέντρωση που απαιτείται για 50 τοις εκατό αναστολή (IC50).
2.3.2. Ενζυμική κινητική ανάλυση με τυροσινάση
Για τον προσδιορισμό των κινητικών μηχανισμών αναστολής, χρησιμοποιήθηκαν δύο συμπληρωματικές μέθοδοι κινητικής: Lineweaver-Burk και Dixonplots [37-39]. Χρησιμοποιώντας διαγράμματα Lineweaver-Burk (διπλά αντίστροφα γραφήματα), προσδιορίστηκε ο τύπος αναστολής του BID3 χρησιμοποιώντας διάφορες συγκεντρώσεις L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 και 1 mM), ως υποστρώματα, απουσία και παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων BID3 (1, 2 και 4 lM). Μια γραφική παράσταση Dixon (μονές αντίστροφες γραφικές παραστάσεις) αναστολή φορτυροσινάσης λήφθηκε παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 και 1 mM ). Οι συγκεντρώσεις του BID3 ήταν 1, 2 και 4 mM. Οι ενζυματικές διαδικασίες αποτελούνταν από τις μεθόδους προσδιορισμού τυροσινάσης που περιγράφηκαν προηγουμένως. Η σταθερά αναστολής (Ki) προσδιορίστηκε από την ερμηνεία των διαγραμμάτων Dixon.
2.3.3. Προσομοιώσεις μοριακής σύνδεσης τυροσινάσης
Για να προσδιορίσουμε τη δομή του συμπλέγματος ενζύμου-αναστολέα και να διασφαλίσουμε την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα και την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων σύνδεσης, χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό AutoDock4.2. Για μελέτες κοψίματος, οι κρυσταλλικές δομές του στόχου πρωτεΐνης τυροσινάσης μανιταριού ελήφθησαν από την ευθυγράμμιση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας (Protein Data Bank(PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Πραγματοποιήθηκαν αυτοματοποιημένες προσομοιώσεις σύνδεσης μεταξύ τυροσινάσης και κοτζικού οξέος, φθαλικού οξέος, κινναμωμικού οξέος ή BID3. Για τη διαδικασία σύνδεσης: συνομιλία 2D σε τρισδιάστατες δομές, υπολογισμένα φορτία και προσθήκη ατόμων υδρογόνου χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41 Το LigandScout 4.1.5 χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ προσδεμάτων και τυροσινάσης και την ταυτοποίηση φαρμακοφόρων.
2.3.4. Κυτταρική καλλιέργεια και δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων
Κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 αγοράστηκαν από την Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) και καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό στρεπτομυκίνη, και στη συνέχεια επωάστηκαν σε 37 C, υγράνθηκαν με 5 τοις εκατό ατμοσφαιρικό CO2. Οι αναλύσεις βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 104 κύτταρα/πηγάδι σε 96-πλάκα φρεατίου για 24 ώρες. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις BID3 και επωάστηκαν για 24 ή 48 ώρες, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, 10 mL διαλύματος EZ-Cytox προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 2-4 ώρες. Η απορρόφηση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ELISA σε μήκος κύματος 450 nm. Κάθε δοκιμασία πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.
2.3.5. Δοκιμασία περιεχομένων μελανίνης
Η περιεκτικότητα σε μελανίνη προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Κύτταρα μελανώματος B16F10 (2 105 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 6-πλάκες καλλιέργειας φρεατίων. Για να προσδιοριστεί η ανασταλτική επίδραση της μελανογένεσης BID3, το φρέσκο μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε BID3 (1, 5 και 10 lM) ή κοτζικό οξύ (10 mM) ως θετικό μάρτυρα για 1 ώρα και στη συνέχεια διεγέρθηκε με a-MSH (5 lM ) και IBMX (200 mM) για 48 ώρες. Αφού πλύθηκαν δύο φορές με PBS, τα κύτταρα αποσπάστηκαν με επώαση σε Τρυψίνη/ΕϋΤΑ και τα σφαιρίδια διαλύθηκαν σε 100 mL 1 Ν NaOH, και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 60 C για 1 χέρι αναμειγνύονται για να διαλυτοποιηθεί η μελανίνη. Οι περιεκτικότητες σε μελανίνη προσδιορίστηκαν με μέτρηση της απορρόφησης στα 405 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη ELISA (TECAN, Sunrise, Αυστρία). Η περιεκτικότητα σε μελανίνη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: (δείγμα/μάρτυρας) - 100 τοις εκατό .Όλοι οι προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.
2.3.6. Δραστηριότητα κυτταρικής τυροσινάσης
Η δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης αξιολογήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με ελαφρές τροποποιήσεις [44,45]. Εν συντομία, 2 105/κελιά επιστρώθηκαν σε 6-πηγαδάκια και επωάστηκαν όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις BID3 (1, 5, και 10 mM) ορκοϊκού οξέος (10 mM) για 1 ώρα και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με a-MSH (5 mM) και IBMX (200 mM) για 48 ώρες. Αφού ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS, τα κύτταρα λύθηκαν με 100 mL διαλύματος λύσης που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM (ρΗ 6,5), 0,1 mM φαινυλμεθυλσουλφονυλφθορίδιο (PMSF) και 1 τοις εκατό Triton X-100 και καταψύχθηκαν στους 80 C για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης αποψύχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 rpm για 30 λεπτά στους 4 C. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο (80 mL) συνδυάστηκαν με 2 mg/mL L-DOPA (20 mL) σε μια πλάκα 96- φρεατίου . Μετά από επώαση στους 37 C για 30 λεπτά, η οπτική πυκνότητα στα 492 nm μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης ELISA (TECAN, Salzburg, Αυστρία). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA χρησιμοποιώντας BCA ως πρότυπο (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Οφέλη από το εκχύλισμα Cistanche: αναστέλλει την τυροσινάση.
2.3.7. Στατιστική ανάλυση
Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των θεραπειών, ακολουθούμενη από το Bonferroni posthoc test. Μια τιμή p < 0.05="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="">
3. Αποτελέσματα και συζήτηση
3.1. Χημεία
Τα παράγωγα (Ε)-βενζυλιδενο-1-ινδανονών (BID1-13) συντέθηκαν σύμφωνα με το γενικό σχήμα 1. Σε αυτήν την παρούσα μελέτη, συντέθηκαν δεκατρία (Ε)-2-βενζυλιδένιο-1-παράγωγα ινδανόνης και Οι ανασταλτικές ιδιότητες της τυροσινάσης εξετάστηκαν. Τα παράγωγα στόχου (Ε)-2-βενζυλιδενίου-1-ινδανόνης συντέθηκαν χρησιμοποιώντας όξινες (1 Μ HCl σε οξικό οξύ) συνθήκες. Αυτές οι αντιδράσεις δημιούργησαν τον στόχο (Ε)-2-βενζυλιδένιο-1- παράγωγα ινδανόνης σε αποδόσεις 32,8–99,1 τοις εκατό. Φαίνεται ότι μόνο τα Ε-ισομερή των 2-βενζυλιδενο-1-ινδανονών δημιουργήθηκαν λόγω του στελέχους Α που είναι γνωστό ως 1,3-αλλυλικό στέλεχος. Το στέλεχος Α (στεριχυδάτωση) μεταξύ του δακτυλίου φαινυλίου και της καρβονυλικής ομάδας στο ισομερές Ζ είναι προφανώς μεγαλύτερο από αυτό μεταξύ του δακτυλίου φαινυλίου και της ομάδας μεθυλενίου στο Ε-ισομερές. Οι δομές των συνθετικών ενώσεων επαληθεύτηκαν με 1Η και 13C NMR και φασματομετρία μάζας όπως περιγράφεται στην πειραματική ενότητα (Εικ. S1-S38). Ειδικότερα, η χημική μετατόπιση του ολεφινικού πρωτονίου θωρακίζεται στο Ε-ισομερές του 2- βενζυλιδένιο λόγω της ανισότροπης επίδρασης της ομάδας καρβονυλίου και εμφανίζεται κάτω από το πεδίο (πάνω από 7 ppm) σε σύγκριση με το ισομερές Ζ (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Σχήμα 1. Σύνθεση (Ε)-2-βενζυλιδενο-1-ινδανονών.
3.2. Ανασταλτικές ιδιότητες της τυροσινάσης των ενώσεων
Το δυναμικό αναστολής της τυροσινάσης των παραγώγων (Ε)-βενζυλιδενο-1-ινδανονών εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τυροσινάση μανιταριού. Το μυκοφαινολικό (L-τυροσίνη) και οι διφαινόλες (L-DOPA) χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για αυτά τα πειράματα [35]. Οι ενζυμικές αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με τυροσινάση, υπόστρωμα και αναστολείς δοκιμής. Όλες οι ενώσεις που δοκιμάστηκαν έδειξαν αναστολή που εξαρτάται από τη συγκέντρωση. Οι τιμές IC50 των παραγώγων (Ε)-βενζυλιδενο-1-ινδανόνης φαίνονται στον Πίνακα 1.
Και στα υποστρώματα L-τυροσίνης και L-DOPA, το BID3 εμφάνισε ισχυρή ανασταλτική δραστηριότητα με τιμές IC50 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM και 1,39 ± 0.00004 mM, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το θετικό μάρτυρα kojic acid, το οποίο είχε τιμές IC50 13,77 ± 0,20 mM και 33,14 ± 0,93 mM, αντίστοιχα (Εικ. 1Α). Επιπλέον, το BID6 έδειξε ισχυρή δράση προς την L-τυροσίνη και την L-DOPA με τιμές IC50 5,00 ± 0,91 mM και 53,11 ± 2,79 mM, αντίστοιχα. Το BID1 έδειξε σημαντική αναστολή έναντι της τυροσινάσης μέσω των οδών L-τυροσίνης και L-DOPA, με τιμές IC50 39,74 ± 3,71 mM και 130,0 ± 5,39 mM, αντίστοιχα. Οι BID4 και BID11 εμφάνισαν ανασταλτική δράση της μέτριας τυροσινάσης. Άλλα παράγωγα ήταν ανενεργά. Ομοίως, το BID2 έδειξε σημαντική δραστικότητα προς την L-τυροσίνη και την L-DOPA, με τιμές IC50 41,27 ± 3,03 mM και 52,93 ± 2,62 mM. Επιπλέον, αναφέρθηκαν αναστολείς μικτού τύπου, φθαλικό οξύ και φθαλικό οξύ αποτέλεσμα σε συγκέντρωση 200 mm [47].
Σε συμφωνία με τα ευρήματα των μελετών σχέσης δομής-δραστικότητας (SAR), τα παράγωγα που περιέχουν (Ε)-βενζυλιδενο-1-υποκαταστάτες ινδανόνης στον δακτύλιο φαινυλίου επηρέασαν αισθητά τη δυνητική αναστολή της τυροσινάσης. Το BID3, το οποίο ανέστειλε την τυροσινάση με την υψηλότερη ισχύ, φέρει μια 2-υδροξυ ομάδα παρουσία μιας 4-υδροξυ ομάδας και ανέστειλε σε μεγάλο βαθμό τη δραστηριότητα τυροσινάσης (BID1 vsBID3). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η 2,{9}}διυδροξυ ομάδα (μερίδα ρεσορκινόλης) στη δομή του δακτυλίου φαινυλίου μπορεί να είναι υπεύθυνη για την ενισχυμένη αναστολή της τυροσινάσης. Είναι ενδιαφέρον ότι σε μια προηγούμενη μελέτη σχετικά με πιθανούς συνθετικούς αναστολείς τυροσινάσης, δείξαμε ότι η 2,4-διυδροξυ υποκατάσταση ανέστειλε δυναμικά τη δραστηριότητα της τυροσινάσης [48,49]. Επιπλέον, τα δεδομένα SAR μας έδειξαν επίσης ότι η εισαγωγή μιας 3-υδροξυομάδας παρουσία μιας 4-υδροξυομάδας επηρεάζει την αναστολή της τυροσινάσης. Αυτά τα φαινόμενα αποδείχθηκαν από το εύρημα ότι ένας δακτύλιος 4-μεθοξυ-3-υδροξυφαινυλίου αύξησε την ανασταλτική δραστηριότητα έναντι της τυροσινάσης, ενώ η εισαγωγή μιας ομάδας 3,4-διυδροξυ (τμήμα κατεχόλης) μείωσε την ανασταλτική δραστηριότητα τυροσινάσης ( BID2 vs BID6) [35]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ομάδα 3-υδροξυ-4-μεθοξυ είναι επίσης υπεύθυνη ανασταλτική δραστηριότητα της σαραντοσινάσης. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη μας, τα BID9 και BID11, τα οποία περιέχουν 2,4-διμεθοξυ φαινυλ ή 3,5-διμεθοξυ φαινυλ ομάδες, έδειξαν μέτρια ανασταλτική δράση τυροσινάσης. Με βάση τις τιμές IC50 μέσω της οδού L-τυροσίνης και L-DOPA, το BID3 έδειξε την πιο ισχυρή ανασταλτική δράση της τυροσινάσης, επομένως, μελετήσαμε περαιτέρω τον μηχανισμό που βρίσκεται κάτω από αυτό το ανασταλτικό αποτέλεσμα. Οι Radhakrishnan et al. (2015) [20] ανέφεραν ότι ισχυροί αναστολείς τυροσινάσης με υδροξυλικά υποκατεστημένα (Ζ)-βενζυλιδενο-1-ενώσεις ινδανόνης. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα παράγωγα υδροξυλ-υποκατεστημένης (Ζ)-βενζυλιδενο-1-ινδανόνης διαθέτουν δράση κατά της τυροσινάσης, από όσο γνωρίζουμε, δεν έχουν υπάρξει αναφορές αναστολής της τυροσινάσης από το (Ε)-βενζυλιδένιο-1- παράγωγα ινδανόνης χρησιμοποιώντας πειράματα με βάση τα κύτταρα.
Πίνακας 1. Δυνατότητα αναστολής της τυροσινάσης μανιταριού της υποκατεστημένης 2,3-διυδρο-1H-inden-1-one (1-ινδανόνης) που μοιάζει με χαλκόνη
παράγωγα (BID1–13).
Εικ. 1. Αναστολή εξαρτώμενης από τη συγκέντρωση της δραστηριότητας της τυροσινάσης μανιταριού από το BID3 και το κοτζικό οξύ (θετικός έλεγχος) (n=3).
3.3. Ενζυμική κινητική ανάλυση της αναστολής της τυροσινάσης
Δεδομένου ότι το BID3 ήταν ο πιο ισχυρός αναστολέας, μελετήσαμε περαιτέρω τον μηχανισμό στον οποίο βασίζεται η ανασταλτική του δράση. Σε μια προσπάθεια να εξηγηθεί ο τρόπος αναστολής του ενζύμου, πραγματοποιήθηκαν κινητικές αναλύσεις σε διάφορες συγκεντρώσεις L-DOPA και σε διάφορες συγκεντρώσεις BID3. Τα διαγράμματα Dixon και Lineweaver-Burk σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας τα δεδομένα που ελήφθησαν από τις κινητικές μελέτες προκειμένου να επιβεβαιωθεί το πρότυπο αναστολής και οι σταθερές αναστολής (Ki) προσδιορίστηκαν με ερμηνεία των διαγραμμάτων Dixon (Σχ. 2Α και Β). Η συγκέντρωση του L-DOPA σημειώνεται ως εξής: 1, 2, 4 mM. Η τομή βρίσκεται στην αριστερή πλευρά, υποδεικνύοντας αναστολή μικτού τύπου έναντι της τυροσινάσης με τιμή Ki 2,4 mM (Εικ. 2Β). Η τιμή Ki αντιπροσωπεύει τις συγκεντρώσεις που απαιτούνται για να σχηματιστεί ένα σύμπλεγμα ενζύμου-αναστολέα, επομένως ένας αναστολέας με χαμηλότερη τιμή Ki υποδεικνύει μεγαλύτερη δραστηριότητα αναστολής τυροσινάσης.
Η μοριακή σύνδεση έχει συμβάλει σε σημαντικές γνώσεις για την ανακάλυψη φαρμάκων εδώ και πολλά χρόνια. Ωστόσο, οι διαδικασίες σύνδεσης στοχεύουν στον εντοπισμό των σωστών θέσεων των προσδεμάτων στον θύλακα δέσμευσης της απρωτεΐνης και στην πρόβλεψη της συγγένειας μεταξύ του συνδέτη και της πρωτεΐνης. Με άλλα λόγια, η σύνδεση περιγράφει μια διαδικασία μέσω της οποίας δύο μόρια ταιριάζουν μεταξύ τους σε έναν τρισδιάστατο χώρο. Για να προσδιοριστεί εάν το BID3 δεσμεύεται στην ενεργή θέση της τυροσινάσης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μοριακής δέσμευσης για τον εντοπισμό των πιθανών θέσεων δέσμευσης του BID3 στην κρυσταλλική δομή της τυροσινάσης μανιταριού (PDB ID: 2Y9X) (Εικ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το AutoDock4.2. πρόγραμμα. Η πιο σταθερή θέση δέσμευσης ήταν αυτή με τη χαμηλότερη βαθμολογία [50]. Πρόσφατα, οι Hassani et al. [47] ανέφερε ότι το κινναμωμικό οξύ και το φθαλικό οξύ ήταν αναστολείς τυροσινάσης μικτού τρόπου λειτουργίας. Έτσι, το βοήθημα, το κινναμωμικό οξύ και το φθαλικό οξύ χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση των αποτελεσμάτων σύνδεσης [51]. Τα μοντέλα μοριακής σύνδεσης του BID3 και του kojic acid (γνωστός αναστολέας ανταγωνιστικού τύπου) στην καταλυτική θέση της τυροσινάσης απεικονίζονται στο Σχ. 3Β [52 ]. Το σύμπλεγμα αναστολέα τυροσινάσης-BID3 παρουσίασε ενέργεια δέσμευσης 6,28 kcal/mol, συμπεριλαμβανομένων δύο δεσμών υδρογόνου με το υπόλειμμα ASN260 και MET280 της τυροσινάσης, και παρατηρήθηκαν υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπολειμμάτων BID3 και τυροσινάσης, οι οποίες σταθεροποίησαν περαιτέρω τη θέση VAL248, PHE248 και PHE248. mushroomtyrosinase (Πίνακας 2, και Σχήμα 3Ε και Η). Επιπλέον, μοντέλα μοριακής σύνδεσης BID3, φθαλικού οξέος (αλλοστερικός αναστολέας 1) και κινναμωμικού οξέος (αλλοστερικός αναστολέας 2) στις δύο αλλοστερικές θέσεις απεικονίζονται στο Σχήμα 3C και 3D. Το φθαλικό οξύ και το κινναμικό οξύ ελήφθησαν ως συνδέτες αναφοράς στις αλλοστερικές θέσεις 1 και 2, αντίστοιχα[47,51]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3F και Ι, το BID3 και το φθαλικό οξύ παρουσίασαν δεσμό υδρογόνου με το υπόλειμμα TRY140 της τυροσινάσης, και τρία υπολείμματα υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων με τα LEU24, PHE147, και ILE148 της τυροσινάσης στην αντίστοιχη θέση αλληλεπίδρασης και 3-ID της τυροσινάσης. στην αλλοστερική θέση2 της τυροσινάσης περιελάμβανε δεσμούς υδρογόνου μεταξύ ASP312 και LYS376 της τυροσινάσης, ενώ το THR308 αλληλεπιδρούσε υδροφοβικά στην αλλοστερική θέση 2 (Εικ. 3G και J). Επιπλέον, η BID{51}}δεσμευτική τυροσινάση βρέθηκε να ασκεί ενέργεια δέσμευσης και στις δύο αλλοστερικές θέσεις της τυροσινάσης (4,38 και 5,68 kcal/mol, αντίστοιχα), υποδεικνύοντας υψηλή συγγένεια δέσμευσης και με τις δύο αλλοστερικές θέσεις. Βάσει ενζυμοκινητικών μελετών, το BID3 άσκησε αναστολή μικτού τύπου, η δυνατότητα δέσμευσης του BID3 τόσο με την καταλυτική θέση όσο και με δύο αλλοστερικές θέσεις επιβεβαίωσε τη μικτού τύπου αναστολή της τυροσινάσης.
Εικ. 2. Διαγράμματα Lineweaver-Burk (Α) και Dixon (Β) για την αναστολή της τυροσινάσης μανιταριού από το BID3 χρησιμοποιώντας L-DOPA ως υπόστρωμα.
3.4. Βιολογική δραστηριότητα
Για να εκμεταλλευτούμε τα αποτελέσματα κατά της τυροσινάσης του BID3 στο μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας, εξετάσαμε τις κυτταροτοξικές του επιδράσεις στα κύτταρα B16F10. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις BID3 (1–20 mM) για 48 ώρες και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία EZ-Cytox. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το BID3 δεν είχε σημαντική κυτταροτοξική δράση σε μελανωματοκύτταρα B16F10 έως 20 mM (Εικ. 4Α και Β). Επομένως, τα επόμενα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας BID3 έως 20 mM.
Πίνακας 2 Θέσεις πρόσδεσης και βαθμολογίες πρόσδεσης του BID3 σε τυροσινάση μανιταριού (PDB ID: 2Y9X) όπως προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα AutoDock4.2.
Η μελανογένεση ρυθμίζεται από έναν ενζυματικό καταρράκτη τυροσινάσης. Για το λόγο αυτό, έχουν αναπτυχθεί αρκετές ενώσεις λεύκανσης του δέρματος για τη μείωση της δραστηριότητας της τυροσινάσης. Το Kojic acid, ένας αναστολέας τυροσινάσης, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος [53]. Έτσι, για τη διερεύνηση των επιδράσεων του BID3 στην υπερμελάγχρωση που προκαλείται από την αύξηση της cAMP, τα κύτταρα B16F10 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με a-MSH και IBMX παρουσία BID3 (1, 5 και 2{{2{0}} mM) για 48 ώρες και προσδιορίστηκαν τα περιεχόμενα μελανίνης και οι δραστικότητες κυτταρικής τυροσινάσης (Εικ. 4C και D). Η θεραπεία με a-MSH και IBMX προκάλεσε σημαντική αύξηση (P <0,001#) στα="" περιεχόμενα="" μελανίνης="" (εικ.="" 4c)="" και="" στη="" δραστηριότητα="" της="" κυτταρικής="" τυροσινάσης="" (εικ.="" 4d)="" στα="" κύτταρα="" b16f10="" σε="" σύγκριση="" με="" τον="" μάρτυρα="" που="" δεν="" υποβλήθηκε="" σε="" θεραπεία.="" ωστόσο,="" η="" θεραπεία="" bid3="" σημαντικά="" (ρ="">< 0,01**,="" p="">< 0,001***)="" και="" εξαρτώμενα="" από="" τη="" συγκέντρωση="" μειωμένα="" περιεχόμενα="" μελανίνης="" και="" δραστηριότητα="" κυτταρικής="" τυροσινάσης="" των="" κυττάρων="" b16f10="" σε="" σύγκριση="" με="" κύτταρα="" που="" έχουν="" υποστεί="" αγωγή="" με="" a-msh="" ή="" ibmx,="" υποδεικνύοντας="" ότι="" η="" μείωση="" της="" κυτταρικής="" μελανίνης="" μπορεί="" να="" οφείλεται="" στην="" αναστολή="" της="" δραστηριότητας="" τυροσινάσης="" .="" έτσι,="" αυτά="" τα="" ευρήματα="" δείχνουν="" ξεκάθαρα="" ότι="" το="" bid3="" άσκησε="" αντι-μελανογόνο="" δράση="" αναστέλλοντας="" τη="" δραστηριότητα="" τυροσινάσης="" και="" τη="" σύνθεση="" μελανίνης="" στα="" κύτταρα="" b16f10="" χωρίς="" να="" προκαλεί="">
Η ινδανόνη είναι μια από τις προνομιούχες δομές της φαρμακευτικής χημείας και γενικά συνδέεται με μια ποικιλία φαρμακολογικά ενεργών ενώσεων [54]. Το τμήμα ινδανόνης υπάρχει σε μια ποικιλία φυσιολογικά ενεργών φυσικών προϊόντων. Λαμβάνοντας υπόψη αυτό, ο Okpekonet al., [55] ανέφερε ότι μια νέα ένωση 1-ινδανόνης απομονώθηκε από τις ρίζες Uvaria. Αυτή η ένωση είναι το πρώτο παράγωγο 1-ινδανόνης που απομονώθηκε από φυτά. Οι Nagle et al., [56] ανέφεραν μια νέα μεθυλιωμένη ινδανοαλδεΰδη απομονώθηκε από το marinecyanobacterium ως ρυθμιστής αγγειογένεσης όγκου. Ομοίως, λόγω της βιολογικής σημασίας του πυρήνα της ινδανόνης, τα τελευταία χρόνια οι ερευνητές έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη φαρμακολογικά ενεργών αναλόγων ινδανόνης ως θεραπευτικών παραγόντων. Η δομική ποικιλομορφία των 1-ινδανονών συνεπάγεται μια ποικιλία βιολογικών αποκρίσεων και αυτές οι ενώσεις μπορούν να εφαρμοστούν στη γεωργία και την ιατρική. Διάφορες ενώσεις με βάση την ινδανόνη έχουν αναπτυχθεί ως κατά της νόσου Alzheimer [16,57-59], αντικαρκινικά [60– 62], αντιμικροβιακούς[63,64] και αντιιικούς παράγοντες [65,66]. Λόγω του ευρέος δυναμικού εφαρμογής, 1-οι ινδανόνες ήταν ενδιαφέροντα αντικείμενα για περαιτέρω έρευνα και είναι επιθυμητό να σχεδιαστούν νέες κλάσεις για τη σύνθεσή τους.
cistanche tubolosa: αντιγηραντική
4. Συμπέρασμα
Για να εντοπίσουμε νέους ισχυρούς αναστολείς τυροσινάσης, έχουμε σχεδιάσει και συνθέσει δεκατρία (Ε)-βενζυλιδενο-1-παράγωγα ινδανόνης. Μεταξύ αυτών των ενώσεων, (Ε)-2-(2,4-διυδροξυ-βενζυλιδένιο){ {6}},3-διυδρο-1Η-σε{10}}ένα (BID3) ανέστειλε δυναμικά τη δραστηριότητα τυροσινάσης (IC50=0.034 και 1,39 mM, για L-τυροσίνη και L-DOPA, αντίστοιχα), η οποία ήταν καλύτερη από την ένωση αναφοράς, το κοτζικό οξύ (IC50=13,77 mM και 33,14 mM, αντίστοιχα). Η σχέση δομής-δραστικότητας αποκάλυψε ότι η παρουσία της ομάδας διυδροξυλίου στη θέση 2 και στη 4-θέση της (Ε)-βενζυλιδενο-1-ινδανόνης βελτίωσε τη δράση έναντι της τυροσινάσης. Ο τρόπος ενζυματικής αναστολής του ενζύμου, που προσδιορίστηκε από τις γραφικές παραστάσεις Lineweaver-Burk και Dixon, έδειξε ότι ο BID3 είναι ένας αναστολέας μικτού τύπου. Οι μελέτες μοριακής σύνδεσης καταδεικνύουν ότι η δέσμευση στην ενεργό θέση και στις αλλοστερικές θέσεις είναι σημαντικοί μηχανισμοί για την ανασταλτική δραστηριότητα της τυροσινάσης. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, το BID3 φαινόταν να είναι ένας ισχυρός αναστολέας τυροσινάσης για τη θεραπεία δερματικών διαταραχών όπως η υπερμελάγχρωση.
Οφέλη από το κιστανάκι της ερήμου: αναστέλλει το σχηματισμό μελανίνης