Προληπτικές Επιδράσεις των Γλυκοζιδίων της Φαινυλαιθανόλης Από το Cistanche Tubulosa

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, et al

Αφηρημένη

Ιστορικό:Cistancheσωληνοειδήςείναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φυτικό φάρμακο που χρησιμοποιείται ευρέως για τη ρύθμιση της ανοσίας.Φαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδες(CPhGs) από αυτό το φυτό είναι τα πρωτίστως αποτελεσματικά υλικά. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τα προληπτικά και θεραπευτικά αποτελέσματα των CPhGs στην επαγόμενη από BSA ηπατική ίνωση σε αρουραίους και σε σχετικούς μοριακούς μηχανισμούς που περιλαμβάνουν ηπατικά αστερικά κύτταρα. Το Biejiarangan (BJRG), ένα άλλο παραδοσιακό κινέζικο φυτικό φάρμακο, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

Μέθοδοι:Σε πειράματα in vivo, 75 αρουραίοι SD χωρίστηκαν τυχαία σε 6 ομάδες: κανονικές (υπό επεξεργασία με απεσταγμένο νερό), μοντέλο (κατεργασμένο με BSA), θετικό φάρμακο (με θεραπεία BSA συν BJRG 600 mg/kg/ημέρα) και αγωγή με BSA συν ομάδες CPhGs (125, 250 και 500 mg/kg/ημέρα). Οι δείκτες ήπατος και σπλήνας, επίπεδα ορού ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST), αμινοτρανσφεράσης αλανίνης (ALT), δεκαεξανοϊκό οξύ (HA), λαμινίνη (LN), προκολλαγόνο τύπου III (PCIII), κολλαγόνο τύπου IV (IV-C), υδροξυπρολίνη (Hyp ), και ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού 1 (TGF- 1) μετρήθηκαν σε ήπατα αρουραίου. Οι ιστοπαθολογικοί βαθμοί για ηπατική ίνωση αξιολογήθηκαν για κάθε ομάδα χρησιμοποιώντας χρώση Η&Ε και τρίχρωμη χρώση Masson. Η έκφραση του TGF- 1, του κολλαγόνου Ι (Col-I) και του κολλαγόνου III (Col-III) προσδιορίστηκε με μια ανοσοϊστοχημική μέθοδο χρώσης. Αυτά τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν περαιτέρω in vitro με προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης του NF-κB p65 και του Col-I μέσω ποσοτικών αναλύσεων PCR σε πραγματικό χρόνο. Η έκφραση πρωτεΐνης Col-I εξετάστηκε επίσης με στύπωμα western.

Αποτελέσματα: Όλες οι ομάδες δόσης (125, 250 και 500 mg/kg/ημέρα) CPhG μείωσαν σημαντικά τον δείκτη ήπατος και σπλήνας, μείωσαν τα ALT, AST, HA, LN , επίπεδα ορού PCIII, IV-C, περιεχόμενο TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0.01="" και="" p="">< 0,01)="" και="" hyp="" περιεχόμενο.="" τα="" cphgs="" ανακούφισαν="" επίσης="" σημαντικά="" τη="" διόγκωση="" των="" ηπατικών="" κυττάρων="" και="" απέτρεψαν="" αποτελεσματικά="" τη="" νέκρωση="" των="" ηπατοκυττάρων="" και="" τη="" διήθηση="" των="" φλεγμονωδών="" κυττάρων.="" τα="" ανοσοϊστοχημικά="" αποτελέσματα="" έδειξαν="" ότι="" τα="" cphg="" μείωσαν="" σημαντικά="" την="" έκφραση="" του="" tgf-="" 1="" (p=""><0,01, p=""><0,01 και="" p=""><0,01), col-i="" και="" col-iii.="" οι="" in="" vitro="" επιδράσεις="" των="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" και="" 25="" ug/ml)="" στο="" hsc-t6="" έδειξαν="" ότι="" τα="" cphgs="" μείωσαν="" σημαντικά="" την="" έκφραση="" mrna="" του="" nf-κb="" p65="" και="" col-i,="" και="" τα="" cphgs="" επίσης="" μείωσαν="" την="" έκφραση="" της="" πρωτεΐνης="">

Συμπεράσματα:Οι CPhGs έχουν σημαντική δράση κατά της ηπατικής ίνωσης και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ηπατοπροστατευτικοί παράγοντες για τη θεραπεία της ηπατικής ίνωσης.

Λέξεις-κλειδιά:Ηπατική ίνωση,Cistanche tubulosa,Φαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδη,Chemokine BSA, Πρόληψη και θεραπεία

ΦαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδησεCistancheσωληνοειδής

Ιστορικό

Η ηπατική ίνωση είναι μια απάντηση επούλωσης πληγών σε σοβαρή βλάβη του ήπατος που εμφανίζεται στην παθογένεση της χρόνιας ηπατίτιδας που προκαλείται από διάφορους παράγοντες. Αυτοί οι παράγοντες είναι η ιογενής λοίμωξη, η κατάχρηση αλκοόλ, η χολόσταση και οι μεταβολικές και αυτοάνοσες ασθένειες [1-3]. Η προοδευτική συσσώρευση της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) και η μειωμένη αναδιαμόρφωση διαταράσσουν τη φυσιολογική αρχιτεκτονική του ήπατος, με αποτέλεσμα ηπατική ίνωση [4]. Η ηπατική ίνωση είναι κρίσιμη για χρόνια ηπατική νόσο και συχνά εξελίσσεται σε μη αναστρέψιμη κίρρωση και καρκινογένεση. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν μέθοδοι ή αποτελεσματικά φάρμακα για τη θεραπεία της ηπατικής ίνωσης. Ως εκ τούτου, είναι επείγον να βρεθεί ένα φάρμακο κατά της ηπατικής ίνωσης που θα μετριάσει την εξέλιξη της ηπατικής βλάβης σε ίνωση και καρκίνο.

CistancheσωληνοειδήςΤο W (της οικογένειας Orobanchaceae) είναι ένα παρασιτικό φυτό που καλλιεργείται ευρέως στη νότια περιοχή του Xinjiang στην Κίνα [5]. Οι άνθρωποι συνήθως το χρησιμοποιούν για να τονώσει τα νεφρά, να θρέψει το αίμα, να χαλαρώσει το έντερο και να καθυστερήσει τη γήρανση. Είναι επίσημα καταχωρημένο στην Κινεζική Φαρμακοποιία [6].Cistancheσωληνοειδήςπεριέχει μια ποικιλία ενεργών συστατικών. Αυτά περιλαμβάνουνΦαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδες(CPhGs), ιριδοειδή και πολυσακχαρίτες. Ως ένα από τα πολλά ενεργά συστατικά τουCistancheσωληνοειδής, το CPhGshave επέδειξε πειστικά αντιοξειδωτικά, κατά της κόπωσης, νευροπροστατευτικά και αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα τόσο σε μελέτες in vivo όσο και in vitro [7]. Τα τελευταία χρόνια, έχει αναφερθεί ότι τα CPhG έχουν ηπατοπροστατευτική δράση. Πιθανοί μηχανισμοί που διέπουν αυτές τις επιδράσεις είναι η σάρωση των ελεύθερων ριζών, η προστασία των ηπατικών μεμβρανών, η ανοσορύθμιση, η αναστολή της απόπτωσης, η αναστολή της έκφρασης των HBsAg και HBeAg και η αναστολή της αντιγραφής του HBV DNA και άλλα [8-11]. Ωστόσο, λίγες μελέτες στη βιβλιογραφία ασχολούνται με την αντι-ηπατική ίνωση επίδραση των GPhC. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη στόχευε στη διερεύνηση της δράσης κατά της ηπατικής ίνωσης των GPhC χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ηπατικής ίνωσης που προκαλείται από βόεια λευκωματίνη ορού (BSA) σε αρουραίους. Οι σχετικοί μοριακοί μηχανισμοί διερευνήθηκαν σε κύτταρα HSC-T6.

Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Ένα κιτ υδροξυπρολίνης (Αλκαλική υδρόλυση) (Παρτίδα:20140616) αγοράστηκε από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Κίνα). Τα κιτ σάντουιτς ELISA για αρουραίους TGF- 1 (Παρτίδα: 238240615) αγοράστηκαν από τη Lianke Biotech Co., Ltd. (Κίνα). Το αντίσωμα Rabbit Anti-CollagenI (Παρτίδα: 140619), το αντίσωμα Rabbit Anti-Collagen III (Παρτίδα: 980788 W) και το αντίσωμα Rabbit Anti-TGF- 1 (Παρτίδα: 140619) παρασχέθηκε από την Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD Κίνα). Περιλαμβάνεται με κανονικό ορό προβάτων (υγρό εργασίας) (Παρτίδα: WP141214), PV-6000(Παρτίδα: WK141225) και κιτ DAB (Παρτίδα: K136621D) αγοράστηκαν από την Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (Κίνα). Η ανίχνευση των πρωτογενών αντισωμάτων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 2. Διάλυμα αντισωμάτων (Alk-Phos.Conjugated, Anti-rabbit) και 2. Διάλυμα αντισώματος (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (παρτίδα: 272387) που αγοράστηκε από την Invitrogen Company (ΗΠΑ) .

Η αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) (Παρτίδα: SLBG8239V) αγοράστηκε από τη Sigma (ΗΠΑ). Πριν από τη χρήση, το BSA παρασκευάστηκε στα 18 g/L σε φυσιολογικό ορό, τα βακτήρια απομακρύνθηκαν με διήθηση και το BSA αποθηκεύτηκε στους 4 βαθμούς. Το ατελές ανοσοενισχυτικό Freund που περιείχε 1 g λιπιδίου από τρίχες προβάτου (Παρτίδα: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Κίνα,) αναμίχθηκε με 2 g υγρής παραφίνης (Παρτίδα:20130815, Tianjin Fuyu, C. Ltd. (Κίνα,), αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο με ατμό και αποθηκεύτηκε στους 4 βαθμούς. Το θετικό φάρμακο BJRG ελήφθη ως δισκία Biejiarangan από την Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Κίνα). Τα αποθέματα φαρμάκων BJRG παρασκευάστηκαν με διάλυση δισκίων BJRG σε απεσταγμένο νερό σε συγκέντρωση 600 mg/kg.

Φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδησεCistancheέχει προληπτικά αποτελέσματα

Φυτικά υλικά

Cistanche σωληνοειδής(οικογένεια Orobanchaceae) αγοράστηκε από την περιοχή Minfeng του Xinjiang της Κίνας. Το υλικό επικυρώθηκε από τον ερευνητή Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Δείγματα κουπονιών κατατέθηκαν στο Ινστιτούτο Materia Medica της Xinjiang.

Παρασκευή CPhG

Αποξηραμένα και κομμένα ριζώματα απόCistancheσωληνοειδής(6.0 kg) εκχυλίστηκαν διαδοχικά υπό αναρροή τρεις φορές με 70 τοις εκατό αιθανόλη και ο διαλύτης απομακρύνθηκε για να δώσει εκχύλισμα θεθανόλης. Τα εκχυλίσματα αιθανόλης καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ρητίνη ΑΒ-8 για να ληφθεί τοφαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδες(CPhGs). Αποθέματα διαλύματα CPhG που χρησιμοποιήθηκαν για ομάδες διαφορετικής δόσης σε μελέτες σε ζώα (5{3}}0 mg/kg, 250 mg/kg και 125 mg/kg, αντίστοιχα) διαλύθηκαν σε 0,5 τοις εκατό (5 g/L) καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη ( αλάτι νατρίου).

Ποσοτικοποίηση των CPhG

Τα περιεχόμενα δύο συστατικών (εχινακοσίδης και ακτεοσίδης) στα CPhG προσδιορίστηκαν με HPLC χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως αναφερθείσα μέθοδο (Zhang et al. 2004)[12]. Η HPLC πραγματοποιήθηκε με χρήση Shimadzu LC-10AHPLC εξοπλισμένου με ανιχνευτή UV. Η στήλη HPLC ήταν στήλη Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). Η ισοκρατική κινητή φάση αποτελούνταν από μεθανόλη-ακετονιτρίλιο-1 τοις εκατό οξικό οξύ (15:10:75, ν/ν/ν). Η έκλουση έγινε για 40 λεπτά και ο ρυθμός ροής διατηρήθηκε στα 0,6 mL/min. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε σταθερή στους 30 βαθμούς. Η ανίχνευση UV ήταν στα 334 nm.

Ζώα και κυτταρική σειρά HSC-T6

[Grade SPF] υγιείς ενήλικοι αρσενικοί αρουραίοι Sprague–Dawley (SD) (180–220 g) αγοράστηκαν από το Xinjiang Medical University Animal Center, Αριθμός άδειας: SCXK (Νέα) 2011–0004. Οι αρουραίοι τράφηκαν με τροφή χωρίς ειδικά παθογόνα (SPF). Όλες οι διαδικασίες που σχετίζονται με τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πρώτου Συνεργαζόμενου Νοσοκομείου του Ιατρικού Πανεπιστημίου Xinjiang. Οι αρουραίοι στεγάστηκαν σε κλουβιά κάτω από ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες (25 μοίρες και κύκλος φωτός/σκότους 12 ωρών) και είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τυπική τροφή σφαιριδίων επίμυων και νερό βρύσης. Οι αρουραίοι εγκλιματίστηκαν πριν από τη θεραπεία.

Μια απαθανατισμένη ηπατική αστερική κυτταρική σειρά αρουραίου, HSC-T6, ελήφθη από την Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Γουχάν, Κίνα). Τα κύτταρα HSC-T6 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Υψηλή γλυκόζη) (DMEM, Πεκίνο, Κίνα) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό ορό εμβρύου (Gibco, Νότια Αμερική), 100 IU/ml πενικιλίνη και 100 ug/ml στρεπτομυκίνη Κίνα (Πεκίνο, ) σε θερμοκοιτίδα με υγρασία στους 37 βαθμούς με 5 τοις εκατό CO2.

Ηπατική βλάβη που προκαλείται από BSA και θεραπείες

Εβδομήντα πέντε αρουραίοι SD χωρίστηκαν τυχαία σε έξι ομάδες: Κανονικός (επεξεργασμένος με απεσταγμένο νερό), μοντέλο (με θεραπεία με BSA), θετικό φάρμακο (με θεραπεία BSA συν BJRG 600 mg/kg/ημέρα) , και ομάδες που έλαβαν θεραπεία με BSA συν CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/ημέρα). Οι ομάδες που έλαβαν BSA συν CPhG (125, 250, 500 mg/kg/ημέρα) είχαν 13 αρουραίους σε κάθε ομάδα και η άλλη ομάδα είχε 12 αρουραίους σε κάθε ομάδα. Το μοντέλο ηπατικής βλάβης που προκαλείται από BSA χωρίζεται σε πρωτογενή ευαισθητοποίηση που ακολουθείται από ανοσολογικό επεισόδιο) [13]. Εκτός από τη φυσιολογική ομάδα, στις άλλες ομάδες χορηγήθηκαν πολλαπλές υποδόριες ενέσεις με 0,5 ml (9 mg/ml) ατελούς ανοσοενισχυτικού BSAFreund την ημέρα 1, ημέρα 15, ημέρα 22, ημέρα 29 και ημέρα 36 για πρωτογενή ευαισθητοποίηση. Επτά ημέρες μετά την πέμπτη ένεση, λήφθηκε αίμα μέσω του πλέγματος των φλεβών της ραμφηλιοειδούς και εξετάστηκε για αντισώματα λευκωματίνης ορού. Το αντίσωμα BSA στον ορό αρουραίου ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο διάχυσης διπλού άγαρ. Η ένεση επίθεσης πραγματοποιήθηκε με τη χορήγηση 0,4 ml BSA σε φυσιολογικό ορό μέσω της ουράς φλέβας σε αρουραίους θετικούς σε αντισώματα BSA δύο φορές την εβδομάδα για δέκα φορές. Οι συγκεντρώσεις και οι χρόνοι των ενέσεων ήταν 5.00, 5.50, 6.00, 6.50,7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 και 10.00 g/L την ημέρα 46 , ημέρα 50, ημέρα 53, ημέρα 57, ημέρα 60, ημέρα 64, ημέρα 67, ημέρα 71, ημέρα 74 και ημέρα 78, αντίστοιχα. Στην κανονική ομάδα, χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικό ορό για ανοσολογικές πρωτογενείς (ευαισθητοποίηση) και δευτερογενείς (επιθέσεις) ενέσεις αντί για BSA, και άλλες καταστάσεις ήταν οι ίδιες με αυτές της ομάδας μοντέλου.

Στην κανονική ομάδα χορηγήθηκε από το στόμα απεσταγμένο νερό με δόση 10 ml/kg/ημέρα. Στην ομάδα μοντέλου χορηγήθηκε από το στόμα 10 ml/kg/ημέρα διάλυμα CMC-Na 0,5 τοις εκατό. Η θετική ομάδα φαρμάκου χορηγήθηκε από το στόμα 600 mg/kg/ημέρα BJRG. Στις ομάδες που έλαβαν BSA συν CPhGs (125.250 και 500 mg/kg/ημέρα) χορηγήθηκαν από το στόμα 125, 250 και 500 mg/kg/ημέρα CPhGs, αντίστοιχα. Η ημερήσια δόση των αρουραίων συνεχίστηκε για δύο εβδομάδες μετά την τελευταία ένεση.

Μετά την πειραματική περίοδο, οι αρουραίοι έμειναν νηστικοί για 12 ώρες πριν από την ένυδρη χλωράλη 10 τοις εκατό και στη συνέχεια υποβλήθηκαν αμέσως σε ευθανασία. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν από κάθε αρουραίο που χρησιμοποιήθηκε αμέσως. Τα συκώτια συλλέχθηκαν για δύο σκοπούς: (1) διατήρηση σε υγρό άζωτο για Hyp kits και (2) καθήλωση σε 10 τοις εκατό φορμαλδεΰδη για ιστολογικές και ανοσοϊστοχημικές εξετάσεις. Η συνολική διάρκεια των μελετών σε ζώα ήταν 93 ημέρες.

Φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδησεCistancheέχει προληπτικά αποτελέσματα

Δείκτες ήπατος και σπλήνας

Το ήπαρ και ο σπλήνας ανατέμθηκαν με λαπαροτομία και πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό 4 βαθμών. Μετά την απορρόφηση της περίσσειας νερού με διηθητικό χαρτί, το ήπαρ και ο σπλήνας ζυγίστηκαν για να υπολογιστούν οι αντίστοιχοι δείκτες: Σχετικό βάρος οργάνου=μάζα οργάνου (g)/ατομική μάζα σώματος (g) × 100 τοις εκατό [14].

Ανάλυση δεικτών ηπατικής ίνωσης

Η προστατευτική επίδραση των CPhGs έναντι του ηπατικού τραυματισμού που προκαλείται από BSA αξιολογήθηκε με μέτρηση ALT και AST (Mind ray automatic biochemical analyser, A086A0182). Η ανάπτυξη ηπατικής ίνωσης και τα αποτελέσματα της θεραπείας προσδιορίστηκαν με εξέταση των HA, LN, PC III και IV-C (αναλυτής χημειοφωταύγειας, TaiGeKeXin, MP2808).

Hyp περιεχόμενο και ανάλυση TGF- 1

Το επίπεδο Hyp στον ηπατικό ιστό προσδιορίστηκε με μια φασματοφωτομετρική μέθοδο σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ. Το επίπεδο Hyp εκφράστηκε ως Hyp (ug)/πρωτεΐνη (mg). - τυφλό OD)/(τυπικό τυφλό OD)×5 (ug/ml) × 10/υγρό βάρος ιστού (ml/mg). Η ηπατική συγκέντρωση του TGF- 1 ανιχνεύθηκε με τη χρήση κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανασταλτική επίδραση των CPhGs στην ίνωση επιβεβαιώθηκε από τα επίπεδα έκφρασης του TGF- 1.

Ιστοπαθολογική εξέταση

Ο ηπατικός ιστός στο ίδιο τμήμα του αριστερού λοβού αφαιρέθηκε και στερεώθηκε σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 10 τοις εκατό. Οι ιστοί χρωματίστηκαν με συμβατική χρώση H&E και Masson'strichrome για να παρατηρηθούν ιστοπαθολογικές αλλαγές κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Η έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι, του κολλαγόνου τύπου III και του TGF- 1 στους ιστούς του ήπατος αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση [15].

Πραγματοποιήθηκε ημιποσοτική ανοσοϊστοχημεία σύμφωνα με τις αναφερόμενες μεθόδους [16, 17]. Οι ακόλουθες ταξινομήσεις χρησιμοποιήθηκαν για τα θετικά κύτταρα TGF- 1: "-" υποδηλώνει σχεδόν καμία έκφραση, 20=l; Το "συν" υποδηλώνει θετικά κύτταρα που συγκεντρώθηκαν μεμονωμένα στην περιοχή της βλάβης, 21=2. Το "συν συν" υποδηλώνει θετικά κύτταρα σε μικρές ομάδες συγκεντρωμένες γύρω από την περιοχή της βλάβης, 22=4. Το "συν συν συν" υποδηλώνει διασκορπισμένα θετικά κύτταρα που εκφράζονται ως 23=8. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μια ιεραρχική ολοκλήρωση. Ο χρωμογόνος βαθμός και ο βαθμός κολλαγόνου τύπου Ι και κολλαγόνου τύπου III μετατράπηκαν σε CRI για στατιστική ανάλυση (χρωμογόνος βαθμός × χρωμογόνο εύρος). Ο χρωμογόνος βαθμός χωρίζεται σε ασθενές «συν», μέτριο «συν συν» και ισχυρό «συν συν συν». Το εύρος χρωμογόνου χωρίζεται σε "συν", το χρωμογόνο του εύρος < προβολή="" 1/4.="" "συν="" συν="" ",="" το="" χρωμογόνο="" της="" όρασης/4-2/4;="" "συν="" συν="" συν",="" το="" χρωμογόνο="" εύρος="" όρασής="" του="" 2/4-3/4.="" "συν="" συν="" συν="" συν",="" το="" χρωμογόνο="" του="" εύρος=""> 3/4. Το Blindedscoring πραγματοποιήθηκε από δύο άτομα όπου το "συν" είναι 1. " συν συν "είναι 2, "συν συν συν" είναι 3 και "συν συν συν συν" είναι 4. Τρία πεδία παρατήρησης μικροσκοπίου (μεγέθυνση × 200) επιλέχθηκαν τυχαία για κάθε τμήμα, με το μέσο επίπεδο των δειγμάτων να χρησιμοποιείται ως ημιποσοτικό επίπεδο.

Πειράματα κυττάρων

Τα κύτταρα HSC-T6 επιστρώθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού. Αρχικά, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με DMEM που περιείχε 10 τοις εκατό FBS για 48 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με DMEM χωρίς FBS για να λιμοκτονήσουν τα κύτταρα για 12 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με DMEM που περιείχε 5,0 ng/mLTGF- 1 (χωρίς FBS) για 24 ώρες. Τέλος, διαφορετικές συγκεντρώσεις CPhGs (100ug/ml, 50ug/ml και 25ug/ml), ακτεοσίδης (6 ug/ml, 3 ug/ml και 1,5 ug/ml), andechinacoside (500ug/ml, 250ug/ml, και 125 μg/ml) μεταφέρθηκαν στην πλάκα σε τετραπλά φρεάτια και επωάστηκαν για 48 ώρες.

Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο

Το επίπεδο έκφρασης mRNA του NF-κB, του p65 και του κολλαγόνου Ι προσδιορίστηκε με PCR σε πραγματικό χρόνο. Για να προσδιοριστούν οι εκφράσεις mRNA σε κύτταρα HSC-T6, τα κύτταρα (4 × 105 κύτταρα) σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων με 3 mL DMEM με 10 τοις εκατό FBS και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2, μετά την οποία η Τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας άλλαξαν DMEM χωρίς τον ορό. Στη συνέχεια, CPhGs (100 ug/ml, 50 ug/ml και 25 ug/ml), ακτεοσίδη (6 ug/ml, 3 ug/ml και 1,5 ug/ml) και εχινακοσίδη (500 ug/ml, 250 ug /ml, και 125 μg/ml) προστέθηκαν στα φρεάτια. Μετά από 48 ώρες επώασης με CPhGs ή μονομερείς συνθέσεις, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol (Invitrogen, USA) και αναδεύτηκε έντονα με χλωροφόρμιο για 15 δευτερόλεπτα. Μετά από παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά, το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στους 12,000 × g για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς. Το RNA στην υδατική φάση κατακρημνίστηκε με ισοπροπανόλη και η ανώτερη υδατική φάση μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα μικροφυγοκέντρησης. Το RNA καταβυθίστηκε με προσθήκη 0,75 τοις εκατό αιθανόλης, μετά την οποία ο σωλήνας της μικροφυγοκέντρησης και φυγοκεντρήθηκε στους 12,{34}} × g στους 4 βαθμούς για όχι περισσότερο από 5 λεπτά. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και το RNA ξηράνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 5-10 λεπτά. Ειδικά σύνολα εκκινητών (Sangon, Shanghai, Κίνα) που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση της ακτίνης αρουραίου [GenBank: NM{_031144.3], Collagen I [GenBank: NM{_ 053304.1] και NF- Τα γονίδια κΒ p65[GenBank: NM{_199267.2] σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας τον εκκινητή παρτίδας 3. Οι εκκινητές εμπρόσθιου (FW) και ανάστροφου (RV) ήταν οι εξής: Κολλαγόνο Ι (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -ακτίνη (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGATAGA CAG GGA ΥΠΑ CAC A). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν στο mRNA του housekeepinggene -actin ως εσωτερικός έλεγχος και παρουσιάζονται ως σχετικά επίπεδα mRNA

Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με 8 μL IQ SYBR GreenSupermix, 1 μL ζεύγος εκκινητών 10 pM, 8,5 μL απεσταγμένου νερού και 2,5 μL cDNA. Κάθε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης εκτελέστηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 95 μοίρες για 3 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλοι των 10 δευτερολέπτων στους 95 βαθμούς, 30 δευτερόλεπτα στους 55 βαθμούς και 10 δευτερόλεπτα στους 55 βαθμούς - 95 μοίρες για επέκταση, ακολουθούμενοι από μέτρηση απλού φθορισμού. Τα τελικά αποτελέσματα περιγράφηκαν με τις σχετικές τιμές (2-ΔΔCt). Ο υπολογισμός και η ανάλυση πραγματοποιήθηκαν από το iQ5 Real-Time PCR Detection System.

Ανάλυση Western blot

Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης κολλαγόνου Ι (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) προσδιορίστηκαν με Westernblotting [με -ακτίνη (Παρτίδα: 60008-1-lg; Proteintech, Κίνα) ως έλεγχος καθαριότητας. Εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα Ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA) (Thermo Scientific, USA) με 1 τοις εκατό κοκτέιλ αναστολέα Haltprotease (Thermo Scientific, USA) και 1 τοις εκατό κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης Halt (Thermo Scientific, USA). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε και ποσοτικοποιήθηκε με τη μέθοδο Bradford [18]. Πρωτεΐνη (10-50 ug) διαχωρίστηκε σε πήκτωμα 10 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF (Millipore, ΗΠΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με 5 τοις εκατό BSA και τα πρωτογενή αντισώματα (Anti-Colla gen I αντίσωμα, αραίωση 1:200 ή mAb ποντικού -ακτίνης, αραίωση 1:5000) επωάστηκαν στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα. Η αντίστοιχη Αλκ-Φωσ. συζευγμένα δευτερεύοντα αντισώματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με 1 × Tris-HClsaline με 0,1 τοις εκατό Tween 20 και τα σήματα σαρώθηκαν και οπτικοποιήθηκαν με σύστημα απεικόνισης GEL DOC XR (Bio-Rad). Πραγματοποιήθηκε πυκνομετρική ανάλυση στις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος και κανονικοποιήθηκε σε -ακτίνη με το λογισμικό GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -χρησιμοποιήθηκε ακτίνη ως εσωτερικός έλεγχος.

Στατιστική ανάλυση

Το τεστ κανονικότητας Shapiro-Wilk και το τεστ διακύμανσης ομοιογένειας του Levene εφαρμόστηκαν για την επαλήθευση της κανονικότητας και της ομοιογένειας της διακύμανσης. Η ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από τη δοκιμασία post hoc του Tukey χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό στατιστικών διαφορών ανομοιογενών, κανονικά κατανεμημένων δεδομένων. Η μη παραμετρική δοκιμή Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση δεδομένων που δεν είναι κανονικά κατανεμημένα ή ομοιογενή. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD. Η σημασία ορίστηκε στο P < 0.05.="" όλα="" τα="" δεδομένα="" αναλύθηκαν="" με="" λογισμικό="" spss="" 16.0="" (ιατρικό="" πανεπιστήμιο="">

Αποτελέσματα

Ποσοτικός προσδιορισμός των CPhGsCPhGs σεCistancheσωληνοειδήςπεριέχει δύοΦαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδες, εχινακοσίδη και ακτεοσίδη και τα περιεχόμενά τους στα CPhG προσδιορίστηκαν με ανάλυση HPLC (Εικ. 1) ότι είναι 42,71 ± 0,42 τοις εκατό και 14,27 ± 0,18 τοις εκατό, αντίστοιχα.

Δείκτες ήπατος και σπλήνας

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, οι δείκτες ήπατος και σπλήνας της ομάδας μοντέλου ήταν σημαντικά αυξημένοι [P < 0.01,p=""><0,05]. οι="" δείκτες="" ήπατος="" και="" σπλήνας="" του="" θετικού="" φαρμάκου="" bjrg="" και="" cphgs="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" δόσης="" μειώθηκαν="" σημαντικά="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" μοντέλου[pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024,PSpleen=0.070," αντίστοιχα].="" οι="" δείκτες="" του="" ήπατος="" και="" του="" σπλήνα="" ήταν="" χαμηλότεροι="" από="" εκείνους="" της="" ομάδας="">

Επιδράσεις των CPhG στις δραστηριότητες ALT, AST και δείκτες ηπατικής ίνωσης

Στην παρούσα μελέτη, τα επίπεδα ορού των ηπατικών ενζύμων AST και ALT αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα του μοντέλου, αντανακλώντας την ηπατοκυτταρική βλάβη σε αρουραίους με ηπατική ίνωση που προκαλείται από BSA. Ωστόσο, τα πειράματα έδειξαν ότι η θεραπεία με BJRG (600 mg/kg) και CPhGs (125, 250 και 500 mg/kg) μειώθηκε σημαντικά AST[PAST < 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" αντίστοιχα]="" και="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189" ,="" palt="0.255," αντίστοιχα]="" επίπεδα="" σε="" ηπατικούς="" ινώδες="" αρουραίους.="" (πίνακας="">

Τα επίπεδα HA, LN, PC και IV-C σε αρουραίους-μοντέλους αυξήθηκαν σημαντικά [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" αντίστοιχα].="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" μοντέλων,="" τα="" επίπεδα="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007,PHA=0.009," pha="0.023," αντίστοιχα],="" ln="" [pln="0.011," pln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," αντίστοιχα],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," pciii="0.136," p="" pciii="0.296," αντίστοιχα]="" και="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" αντίστοιχα]="" σε="" αρουραίους="" μειώθηκαν="" σημαντικά="" από="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" και="" cphgs="" σε="" διαφορετικές="" ομάδες="" δόσης="" (125,="" 250="" και="" 500="" mg/kg="" )="" (πίνακας="">

Hyp περιεχόμενο και TGF- 1

Η περιεκτικότητα σε κολλαγόνο ανιχνεύθηκε επίσης με μέτρηση των Υπερεπιπέδων στον ηπατικό ιστό. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, το μέσο επίπεδο Hyp στην ομάδα μοντέλου ήταν σημαντικά υψηλότερο από την κανονική ομάδα, αλλά ήταν σημαντικά μειωμένο στην ομάδα BJRG και στις διαφορετικές ομάδες δόσης CPhGs.

Η ηπατική συγκέντρωση του TGF{{0}} της ομάδας μοντέλου σε αρουραίους ήταν σημαντικά αυξημένη [P < 0.001].="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" μοντέλων,="" τα="" επίπεδα="" tgf-="" 1="" του="" θετικού="" φαρμάκου="" και="" των="" διαφορετικών="" ομάδων="" δόσης="" cphgs="" ήταν="" σημαντικά="" μειωμένα="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,p="" tgf{{10="" }}="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" αντίστοιχα].="" τα="" αποτελέσματα="" συνοψίζονται="" στον="" πίνακα="">

Ιστοπαθολογική εξέταση

Παρατηρήσεις τομέων φυσιολογικού ηπατικού ιστού που χρωματίστηκαν με H&E και τρίχρωμο Masson εμφανίζουν διακριτά ηπατικά σφαιρίδια και ηπατικά ιγμοροειδή. Η δομή του ηπατικού ιστού στους αρουραίους μοντέλου ήταν διαταραγμένη και ο ηπατικός ιστός και τα ηπατικά ιγμοροειδή αντικαταστάθηκαν από μεγάλη ποσότητα συνδετικού ιστού. Ωστόσο, ανιχνεύθηκε πιο φυσιολογική κυτταροαρχιτεκτονική και λιγότερος συνδετικός ιστός στην ομάδα θεραπείας από ό,τι στην ομάδα του μοντέλου.

Χρώση H&E

Στην φυσιολογική ομάδα, παρατηρήθηκε η δομική ακεραιότητα του ηπατικού λοβού χωρίς παθολογικές πυλαίες περιοχές και ηπατικά ιγμοροειδή. Τα ηπατικά κορδόνια ήταν διατεταγμένα με τάξη, με τον πυρήνα στρογγυλό και καθαρό. Οι πυρήνες βρίσκονται στο κέντρο του κυττάρου, με άφθονο κυτταρόπλασμα. Μόνο η περιοχή της πύλης έχει μικρή ποσότητα ινώδους ιστού (Εικ. 2α).

Στην ομάδα μοντέλων, η λοβιακή δομή υπέστη σοβαρή βλάβη. Τα ηπατικά κύτταρα εμφάνισαν ήπιο υδαρή εκφύλιση, κυρίως εκφυλισμό με μπαλόνια και/ή λιπώδη εκφυλισμό. Παρατηρήθηκαν επίσης ο σχηματισμός διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων, εκτεταμένη υπερπλασία ινώδους ιστού, ο σχηματισμός μεγάλου αριθμού ινώδους διαφράγματος, σπασμένων λοβών και σημαντικός πολλαπλασιασμός ηπατικών κυττάρων. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαίωσαν την επιτυχία της δημιουργίας του ζωικού μοντέλου ανοσοποιητικού τραυματισμού αρουραίου ηπατική ίνωση (Εικ. 2β).

Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου, υπήρξε μείωση της διήθησης των φλεγμονωδών κυττάρων στα διαφορετικά CPhGs. Επίσης, παρατηρήθηκε λιγότερη νέκρωση και λιπώδης εκφύλιση των ηπατικών κυττάρων καθώς και ανακούφιση της ίνωσης. Το CPhGs μετρίασε σημαντικά την παθολογία της επαγόμενης από BSA ηπατικής ίνωσης σε αρουραίους, ανακούφισε τη διόγκωση των ηπατικών κυττάρων και απέτρεψε αποτελεσματικά τη νέκρωση των ηπατοκυττάρων και τη διήθηση των φλεγμονωδών κυττάρων, υποδηλώνοντας ότι το CPhG ασκεί προστατευτική δράση στην επαγόμενη από BSA ηπατική ηπατική ίνωση. (Εικ. 2γ–στ).

Τριχρωμική χρώση Masson

Στην φυσιολογική ομάδα, ο ηπατικός ιστός ήταν φυσιολογικός. Η περιοχή της ηπατικής πύλης έδειξε μικρό αριθμό ινών μπλε κολλαγόνου και ο ηπατικός ιστός ήταν κανονικά δομημένος (Εικ. 3α). Σε σύγκριση με τον ηπατικό ιστό της φυσιολογικής ομάδας, ο ινώδης ιστός πολλαπλασιάστηκε από το κεντρικό φύλλο και επεκτάθηκε στο ηπατικό παρέγχυμα. Οι ίνες κολλαγόνου επεκτάθηκαν και συνδέθηκαν και περιέβαλαν ολόκληρο το λοβό και περιέβαλλαν την κεντρική φλέβα. Αυτές οι επιδράσεις, μαζί με την ίνωση των ηπατοκυττάρων, τη δομική βλάβη των λοβίων, την περιπυλαία ίνωση και το σχηματισμό ψευδολυβλίων (Εικ. 3β) παρείχαν στοιχεία ότι το μοντέλο καθιερώθηκε.

Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου, οι ίνες κολλαγόνου στην ομάδα θετικού ελέγχου φαρμάκου επεκτάθηκαν ελαφρά προς τα έξω από την περιφερειακή πύλη (Εικ. 3γ). Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου, οι ίνες κολλαγόνου στις διαφορετικές ομάδες δόσης CPhGs μειώθηκαν σημαντικά, ο πολλαπλασιασμός των ινών αναστάλθηκε και ο πολλαπλασιασμός του ινώδους ιστού εντός του ηπατικού παρεγχύματος μειώθηκε σημαντικά. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα CPhGs προστάτευαν τα αρουραία από την επαγόμενη από BSA ηπατική ίνωση (Εικ. 3d–f).

Ανοσοϊστοχημική χρώση

Είναι σημαντικό ότι η έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι και του κολλαγόνου τύπου III διαδραματίζει ουσιαστικούς ρόλους στην ανάπτυξη της ηπατικής ίνωσης και η δημιουργία και η εναπόθεσή τους στον ηπατικό ιστό θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της αποτελεσματικότητας κατά της ηπατικής ίνωσης. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 5.

Κολλαγόνο τύπου Ι

Η φυσιολογική ομάδα εξέφραζε κολλαγόνο τύπου Ι κυρίως στα αιμοφόρα αγγεία και την περιοχή της πύλης. Η ομάδα μοντέλων εξέφρασε υψηλά επίπεδα αγγειακής ίνωσης κολλαγόνου τύπου Ι σε περιοχές της πύλης. Στο χώρο του Disse, η χρώση κολλαγόνου τύπου Ι παρατηρήθηκε ως ραβδώσεις ή ως αποσπασματική κατανομή. Το κολλαγόνο περιείχε τα ινώδη σηπτά για να σχηματίσει ψευδολόβιο. Σε αυτά τα πειράματα, σχηματίστηκαν λιγότερα ινώδη διαφράγματα για BJRJ (600 mg/kg) και ομάδες διαφορετικής δόσης CPhGs (125, 250 και 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023, και PCol I=0.044, αντίστοιχα]. Τα ημιποσοτικά αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η έκφραση του κολλαγόνου τους τύπου Ι ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με την ομάδα του μοντέλου (Εικ. 4).

Κολλαγόνο τύπου III

Το κολλαγόνο τύπου III εκφράστηκε ασθενώς στη φυσιολογική ομάδα και οι περιφερειακές περιοχές που περιβάλλουν την πύλη και τις ηπατικές φλέβες εμφάνισαν μια μικρή ποσότητα λεπτού κίτρινου αντί για συνεχείς ίνες (Εικ. 5α). Στην ομάδα μοντέλων, οι ίνες κολλαγόνου εμφάνισαν φαρδιά και παχιά κορδόνια, υποδεικνύοντας ισχυρή έκφραση, που εντοπίζεται κυρίως στην πύλη και τις περιοχές του ινώδους ιστού (Εικ. 5β).

Οι ίνες κολλαγόνου του BJRJ (600 mg/kg) και οι διαφορετικές δοσοομάδες CPhGs (125, 250 και 500 mg/kg) ήταν νηματώδεις και κατανεμήθηκαν γύρω από την κεντρική φλέβα και τις περιοχές της πύλης. Σε σύγκριση με την ομάδα του μοντέλου, οι ίνες κολλαγόνου μειώθηκαν σημαντικά, η χρώση ήταν ωχρή και λεπτή και η ανοσοϊστοχημική χρώση ήταν ασθενώς θετική (Εικ. 5c–f). Αυτά τα ημι-ποσοτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι τα θετικά εκφρασμένα κύτταρα στις θετικές και διαφορετικές ομάδες δόσης [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 και PCol III=0.037, αντίστοιχα] ήταν διαφορετικά από αυτά της ομάδας μοντέλων.

TGF- 1

Υπήρχε μικρή έκφραση του TGIF- 1 σε φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα αρουραίου. Η έκφραση περιορίστηκε σε ένα μικρό αριθμό διάμεσων κυττάρων (Εικ. 6a). Στην ομάδα μοντέλων, η έκφραση του TGF- 1 κατανεμήθηκε ευρέως στην περιοχή της πύλης, στους ινώδεις χώρους, στα ηπατικά αστερικά κύτταρα, στα φλεγμονώδη κύτταρα, στο ημιτονοειδές τοίχωμα και στο κυτταρόπλασμα. Μια συγκεκριμένη περιοχή πύλης εμφάνισε μια έντονα θετική έκφραση με καστανοκίτρινη χρώση (Εικ. 6β)

Υπήρχε μια μικρή ποσότητα έκφρασης στην περιοχή της πύλης και στα ινώδη διαφράγματα του BJRJ (600 mg/kg) και διαφορετικές ομάδες δόσης CPhGs (125, 250 και 500 mg/kg). Η έκταση της θετικής χρώσης σε αυτές τις ομάδες ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με αυτήν της ομάδας μοντέλου. Η χρώση στα διάμεση κύτταρα στα ινώδη διαφράγματα και στο κυτταρόπλασμα των φλεγμονωδών κυττάρων μειώθηκε (Εικ. 6c–f). Τα ημιποσοτικά αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το BJRJ και διαφορετικές ομάδες δόσης CphGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 <0.001, p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0." 004,="" αντίστοιχα]="" ήταν="" σημαντικά="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="">

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως στο άρθρο, ο TGF- 1 είναι σημαντική κυτοκίνη στην παθοφυσιολογία της ηπατικής ίνωσης, διεγείροντας την παραγωγή εξωκυτταρικής μήτρας [19]. Δείξαμε ότι το επίπεδο του TGF- 1 αυξήθηκε στην ομάδα μοντέλων κατά τρόπο συνεπή με τη σοβαρότητα της ηπατικής ίνωσης. Τα επίπεδα έκφρασης του TGF- 1 στο ήπαρ ήταν σύμφωνα με τα επίπεδα του TGF- 1 στον ορό. Αυτό υποδεικνύει ότι τα CPhG μπορούν να μειώσουν σημαντικά την ηπατική ίνωση λόγω της έκφρασης του TGF- 1 συμμετέχοντας στη σύνθεση και την αποικοδόμηση του ECM.

Η έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι, του κολλαγόνου τύπου III και του TGF- 1 μπορεί να ανιχνεύσει την παθολογική διαδικασία της ηπατικής ίνωσης. Τα επίπεδα έκφρασής τους στις ομάδες θεραπείας μειώθηκαν σημαντικά και έδειξαν ότι τα CPhG μπορούν να βελτιώσουν τη δραστηριότητα της κολλαγενάσης, διατηρώντας τη δυναμική ισορροπία σύνθεσης και αποικοδόμησης ECM του ήπατος, καθυστερώντας και αποτρέποντας έτσι το σχηματισμό ηπατικής ίνωσης.

Έκφραση NF-κB p65 και κολλαγόνου Ι μετά από παρέμβαση φαρμάκου σε κύτταρα HSC-T6

Προκειμένου να χαρακτηριστούν σήματα ηπατικής ίνωσης, προσδιορίστηκαν δύο βασικά ρυθμιστικά γονίδια στο ήπαρ μέσω της ανάλυσης RT-PCR. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τα κύτταρα tHSC-T6 από την ομάδα ελέγχου είχαν χαμηλότερα επίπεδα NF κΒ και mRNA κολλαγόνου τύπου Ι. Αντίστροφα, ο TGF- 1 προκάλεσε τα κύτταρα HSC-T6 να ρυθμίζουν σημαντικά προς τα πάνω το NF-κB (P < 0.01)="" και="" το="" col-i="" (p=""><0,01) mrna,="" με="" επίπεδα="" υψηλότερα="" από="" αυτά="" της="" ομάδας="" ελέγχου.="" παρουσία="" διαφορετικών="" συγκεντρώσεων="" cphgs,="" τα="" αποτελέσματα="" του="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" για="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" για="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="0.007" για="" 50="" ug/ml,="" και="" p="" nf-κb="0.012" για="" 25="" ug/ml,="" αντίστοιχα]="" και="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," αντίστοιχα]="" εμφάνισαν="" μειωμένες="" εκφράσεις="" αυτών="" των="" mrna="" (="" εικ.="">

Ανάλυση Western blot του επιπέδου κολλαγόνου Ι μετά από παρέμβαση φαρμάκου σε κύτταρα HSC-T6

Το Σχήμα 8 δείχνει τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης κολλαγόνου Ι σε κύτταρα HSC-T6 των διαφορετικών πειραματικών ομάδων. Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης κολλαγόνου Ι μειώθηκε σημαντικά στις διάφορες ομάδες δόσης των CPhGs (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, και 25 ug/ml) σε σύγκριση με την ομάδα TGF- 1.

Συζήτηση

Το CPhGs είναι ένα φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο που απομονώνεται και καθαρίζεται από το ρίζωμα του Cistanche, το οποίο χρησιμοποιείται ως παραδοσιακό κινέζικο φυτικό φάρμακο. Τα τελευταία χρόνια, το CPhGshad είχε αποδειχθεί ότι έχει μια ισχυρή ικανότητα να προλαμβάνει ηπατικές βλάβες [20]. Ως εκ τούτου, στοχεύσαμε να διερευνήσουμε εάν τα CPhG έχουν ανασταλτικές επιδράσεις στην ίνωση της ηπατίτιδας από την επαγόμενη από BSA ηπατική ίνωση σε αρουραίους. Το BJRG χρησιμοποιείται συνήθως ως θεραπευτικό φάρμακο για την ηπατική ίνωση στην Κίνα. Είναι φτιαγμένο από κοχύλια χελώνας. Τα Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis κ.λπ. έχουν τα αποτελέσματα της αναπλήρωσης του Qi και του αίματος, ανακουφίζοντας από την κούραση, μαλακώνοντας τους κόμβους. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι έχει την προφανή λειτουργία του αποκλεισμού της πρώιμης ηπατικής ίνωσης, της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που αποθηκεύουν λίπος και της μείωσης της σύνθεσης κολλαγόνου [21]. Ως εκ τούτου, το BJRG χρησιμοποιήθηκε ως θετικό φάρμακο σε αυτή τη μελέτη.

Οι παθολογικές αλλαγές της ηπατικής ίνωσης σε αρουραίους που προκαλούνται από ενέσεις BSA είναι παρόμοιες με αυτές στην κίρρωση της ανθρώπινης πύλης [22]. Τα CPhGs ανακούφισαν δοσοεξαρτώμενα τον βαθμό της ηπατικής ίνωσης και ανέστειλαν τον μετασχηματισμό του HSC σε κύτταρα που μοιάζουν με μυοϊνοβλάστες, μείωσαν τα αυξημένα επίπεδα των ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 στον ορό και τον ηπατικό δείκτη και κατέστειλαν σημαντικά την έκφραση του κο I, κολλαγόνο III και TGF- 1 στον ηπατικό ιστό.

Τα στάδια της ηπατικής ίνωσης συσχετίζονται με αυτά τα επίπεδα HA, LN και IV-C στο αίμα, τα οποία ως δείκτες μπορεί να παίζουν ρόλο στην ανίχνευση του βαθμού ηπατικής ίνωσης [23]. Έχει αναφερθεί ότι το ΗΑ είναι η κύρια πηγή της εξωκυτταρικής μήτρας. Το IV-C ως το βασικό στοιχείο της βασικής μεμβράνης θα συντεθεί άφθονα και θα εναποτεθεί σε μεγάλο βαθμό στις προηγούμενες φάσεις της ηπατικής κίρρωσης. Τα επίπεδα LN και IV-C στον ορό είναι οι δείκτες του ρυθμού ανακύκλωσης της βασικής μεμβράνης και δείχνουν τον βαθμό ίνωσης στην περιοχή της πύλης και στα ημιτονοειδή τριχοειδή [24]. Το PC III είναι ένας δείκτης στη διάγνωση της ηπατικής ίνωσης και της πρώιμης κίρρωσης, αλλά η ευαισθησία και η ειδικότητά του δεν είναι υψηλές και δεν υπάρχει καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των διαφόρων σταδίων της ίνωσης σε πολλές αναφορές [24, 25]. Αυτή η μελέτη έφερε παρόμοιο αποτέλεσμα.

Επιπλέον, οι παρατηρήσεις της τομής με χρώση τριχρωμίου H&E και Masson εμφανίζουν φυσιολογικούς ηπατικούς ιστούς με διακριτούς ηπατικούς λοβούς και ηπατικά ιγμοροειδή. Η δομή του ηπατικού ιστού στην ομάδα του μοντέλου ήταν διαταραγμένη και ο ηπατικός ιστός και το ηπατικό ημιτονοειδές αντικαταστάθηκαν από μεγάλη ποσότητα συνδετικού ιστού. Ωστόσο, παρατηρήθηκε σημαντική βελτίωση στις ομάδες θεραπείας σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου.

Είναι σημαντικό ότι το κολλαγόνο τύπου Ι και η έκφραση του κολλαγόνου τύπου III παίζουν ουσιαστικούς ρόλους στην ανάπτυξη της ηπατικής ίνωσης, ο αποκλεισμός της οποίας μπορεί να αποτρέψει και να θεραπεύσει την ηπατική ίνωση. Ως εκ τούτου, η δημιουργία και εναπόθεση στον ηπατικό ιστό κολλαγόνου τύπου Ι και κολλαγόνου τύπου III θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της αποτελεσματικότητας κατά της ηπατικής ίνωσης. Ο TGF- 1 είναι επίσης μια σημαντική προϊνογονική κυτοκίνη σε ηπατική βλάβη και είναι βιολογικά ενεργή με πολλαπλές φαρμακολογικές δράσεις[26]. Απαιτείται ισορροπία μεταξύ αυτών των ενεργειών για τη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών. Η ανώμαλη έκφραση του TGF 1 εμπλέκεται στην παθογένεση των ηπατικών παθήσεων [27, 28]. Είναι γνωστό ότι ο TGF- 1 είναι μια κρίσιμη κυτοκίνη που εμπλέκεται στα πρώιμα στάδια της ηπατικής ίνωσης. Το οξειδωτικό στρες διεγείρει τον TGF- 1, με αποτέλεσμα ο τελευταίος να διεγείρει την παραγωγή και την εναπόθεση ECM [29]. Επομένως, μία από τις αποτελεσματικές στρατηγικές για την παραγωγή φαρμάκου κατά της ηπατικής ίνωσης είναι ο εντοπισμός παραγόντων κατά του TGF- 1. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι οι εκφράσεις του κολλαγόνου τύπου Ι, του κολλαγόνου τύπου III και του TGF- 1 θα μπορούσαν να ανιχνεύσουν την παθολογική διαδικασία της ηπατικής ίνωσης. Οι εκφράσεις του κολλαγόνου τύπου Ι, του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ και του TGF- 1 στις ομάδες θεραπείας μειώνονται, οι οποίες ήταν σημαντικά χαμηλότερες στην ομάδα θεραπείας με υψηλή δόση CPhGs ιδιαίτερα, και πρότειναν ότι το CPhGs είναι ένα αποτελεσματικό κολλαγόνο τύπου Ι, κολλαγόνο τύπου III και αναστολέας TGF- 1. Πιθανώς, το CPhGs μπορεί να βελτιώσει τη δραστηριότητα της κολλαγενάσης, διατηρώντας τη δυναμική ισορροπία της σύνθεσης και της αποικοδόμησης της ECM, καθυστερώντας και αποτρέποντας έτσι το σχηματισμό ηπατικής ίνωσης.

Τα CPhG όχι μόνο θα μπορούσαν να βελτιώσουν την επαγόμενη από BSA ηπατική ίνωση σε αρουραίους, αλλά μπορεί επίσης να συσχετιστούν με την αναστολή της ενεργοποίησης του HSC in vitro. Η ενεργοποίηση HSC θεωρείται ότι αντιπροσωπεύει το κρίσιμο βήμα της ινογένεσης. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χορήγηση CphGs από 25 έως 100 ug/ml εξασθένησε αξιοσημείωτα τη μειωμένη έκφραση του NF-κB p65, την έκφραση mRNA του κολλαγόνου Ι και την έκφραση πρωτεΐνης κολλαγόνου Ι σε HSC.

Ο NF-κΒ παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης σε μόλυνση ή ερεθίσματα [30]. Η συσσώρευση NF-κΒ στα ηπατικά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει στη στρατολόγηση φλεγμονωδών κυτοκινών/μεσολαβητών, προκαλώντας έτσι την ανάπτυξη ίνωσης [31, 32]. Επιπλέον, το κολλαγόνο είναι επίσης ένας ευαίσθητος δείκτης που αντανακλά το επίπεδο ίνωσης και αντιπροσωπεύει περίπου το 50 τοις εκατό της συνολικής πρωτεΐνης στο ινώδες ήπαρ [33]. Ως αποτέλεσμα, υποθέσαμε ότι ο μοριακός μηχανισμός κατά της ηπατικής ίνωσης συνδέεται με την αδρανοποίηση της έκφρασης NF-κB με τη μεσολάβηση CPhGs, στην οποία το όφελος συμβάλλει στους συνεργιστικούς ρόλους της άμβλυνσης της ανοσοτοξικότητας και του στρες φλεγμονής στον αλλοιωμένο από BSA ηπατικό ιστό, διορθώνοντας περαιτέρω τον δυσμεταβολισμό του δυσμεταβολισμού.

συμπεράσματα

Συμπερασματικά, οι μελέτες μας υποδεικνύουν ότι τα CPhG εξασθενούν σημαντικά την έκταση της ηπατικής ίνωσης που προκαλείται από το BSA σε αρουραίους. Ο μηχανισμός του μπορεί τουλάχιστον εν μέρει να οφείλεται στην ανασταλτική επίδραση των CPhG στη σύνθεση του ECM και στη διέγερση της αποικοδόμησης του ECM ή/και στην άμεση αναστολή της σύνθεσης του κολλαγόνου τύπου Ι, του κολλαγόνου τύπου III και της έκφρασης του TGF{{0 }}. Επομένως, αναμέναμε ότι τα CPhGs μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε προϊόντα υγειονομικής περίθαλψης ή σε κλινικά φάρμακα για την πρόληψη της ανθρώπινης ηπατικής ίνωσης. Απαιτούνται μελλοντικές μελέτες για να τεκμηριωθεί η αποτελεσματικότητα των CPhGs ως ισχυρού φαρμάκου κατά της ηπατικής ίνωσης.

Συντομογραφίες

CPhGs: γλυκοσίδες ανόλης από το cistanche.

BSA: Αλβουμίνη ορού βοοειδών.

HSC-T6: Ηπατικά αστερικά κύτταρα.

Hyp: Υδροξυπρολίνη;

BJRG: CompoundBiejiarangan δισκία.

TGF- 1: Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας 1.

ALT: αλανινοαμινοτρανσφεράση;

AST: Ασπαρτική αμινοτρανσφεράση.

HA: Υαλουρονικό οξύ;

LN: Λαμινίνη; PC III: Προκολλαγόνο τύπου III.

IV-C: Κολλαγόνο τύπου IV.

NF-κB: Πυρηνικός παράγοντας κάπα-ελαφριά αλυσίδα-ενισχυτής ενεργοποιημένων Β κυττάρων.

RT-PCR: αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης τρανσκριπτάσης-πολυμεράσης.

SDS-PAGE: Ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συνεισφορές συγγραφέων

Οι TL, JZ, SPY, LM, MT και SLZ συνέλαβαν και σχεδίασαν τα πειράματα. Οι SPY, TL και JZ ανέλυσαν τα δεδομένα. Ο SPY και ο JZ έγραψαν το χειρόγραφο. Οι TL, LM και JZ εξέτασαν το χειρόγραφο. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Αναγνώριση

Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81260624). Οι συγγραφείς θα ήθελαν να εκφράσουν τις ειλικρινείς τους ευχαριστίες στον καθηγητή Tao Liu για τις προτεινόμενες βελτιώσεις στη συγγραφή αυτής της εργασίας.

Στοιχεία συγγραφέα

1 Τμήμα Τοξικολογίας, Σχολή Δημόσιας Υγείας, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Xinjiang, No. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011 Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Κίνα. 2Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of MateriaMedica of Xinjiang, Urumqi 830004, Κίνα. 3 Όχι. 140 Xinhua South Road, Περιοχή Tianshan, Urumqi 830000 Xinjiang Uyghur Αυτόνομη Περιοχή, Κίνα.

Κάντε κλικ εδώ για έλεγχοCistancheσωληνοειδήςπροϊόντα

βιβλιογραφικές αναφορές
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Τρέχουσα κατάσταση των νέων αντιινωτικών θεραπειών σε ασθενείς με χρόνια ηπατική νόσο. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Ηπατικά αστερικά κύτταρα και ηπατική ίνωση. Compr Physiol. 2013; 3(4): 1473–92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Παθογένεση ηπατικής ίνωσης. Annu Rev Pathol. 2011; 6:425-56.
4. Sohrabpour AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Ανασκόπηση άρθρου: η αναστρεψιμότητα της κίρρωσης. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 36 (9): 824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. Κινεζική ακαδημία επιστημών. 23η έκδ. Κίνα: Συντακτική Επιτροπή της Flora of China; 2013. Σελ. 1–16.
6. Επιτροπή Κινεζικής Φαρμακοποιίας του Υγειονομικού Υπουργείου της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας. Κινεζική φαρμακοποιία, Μέρος 1. Κίνα: Εκδοτικός Οίκος Χημικής Βιομηχανίας; 2010. Σελ. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Research progress ofφαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδεςαπόCistancheσωληνοειδής. Central South Pharm. 2012; 10:692–5.
8. Li J, Huang D, He L. Επίδραση του Rou Cong Rong (Herba Cistanches Deserticolae) στην αναπαραγωγική τοξικότητα σε ποντικούς που προκαλείται από γλυκοσίδη του Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014; 34 (3): 324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H, et αϊ. ΜΕΑ και αναστολείς συσσώρευσης αιμοπεταλίων από το Tamarix hohenackeri Bunge (φυτό ξενιστήHerbaΚιστανάκια) αναπτύσσεται στο Xinjiang. Pharmacogn Mag. 2014; 10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh Β, Guo Y, Tu P, et αϊ. Βελτίωση της κολίτιδας που προκαλείται από θειική δεξτράνη σε ποντίκια με εκχύλισμα εμπλουτισμένο με εχινακοσίδηCistancheσωληνοειδής. Phytother Res. 2014; 28 (1): 110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Το Herba Cistanches διεγείρει τον κύκλο της οξειδοαναγωγής της γλουταθειόνης από τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου που παράγονται από τη μιτοχονδριακή αναπνοή στα καρδιομυοκύτταρα H9c2. Pharm Biol. 2013; 51 (1): 64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: Μια μέθοδος RP-HPLC για ταυτόχρονο προσδιορισμό εχινακοσίδης και ακτεοσίδης σε Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Η μελέτη του ζωικού μοντέλου ανοσίας ηπατικής ίνωσης που προκαλείται από αλβουμίνη ορού βοοειδών. Chin J Pathol. 1993; 22:121-2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Επίδραση των εκχυλισμάτων Cichorium glandulosum στην επαγόμενη από CCl4-ηπατική ίνωση. Iran Red Crescent Med J. 2013; 15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF, et al. Διτερπενοειδή κλεροδάνη και πρενυλιωμένα φλαβονοειδή από την Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010; 12 (1): 7–14.
16. Li WW, Song XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Συσχέτιση NF-κB και παθολογικής σταδιοποίησης της ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β. Chin J Immunol. 2013; 29 (3): 251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Επιδράσεις των ολικών σαπωνινών του Panax notoginseng κατά της ηπατικής ίνωσης σε αρουραίους. Acta Academiae Medicinae Militaris Τριτοβάθμιο. 2007; 29:2212-4.
18. Rossi Ο, Maggiore L, Necci F, Koberling Ο, MacLennan CA, et al. Σύγκριση χρωματομετρικών δοκιμασιών με ποσοτική ανάλυση αμινοξέων για ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών γενικευμένων μονάδων για αντιγόνα μεμβράνης (GMMA). ΜοΙ Biotechnol. 2015; 57 (1): 84–93.
19. Dang SS, Li YP. Προόδους στην κατανόηση του ρόλου του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα- 1 στην παθογένεση της ηπατικής ίνωσης. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010; 18:1631–6.
20. Zhao J, Liu Τ, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, et αϊ. Προστατευτική δράση της ακτεοσίδης σε ανοσολογική ηπατική βλάβη που προκαλείται από Bacillus Calmette-Guerin συν λιποπολυσακχαρίτη. Planta Med. 2009; 75(14):1463–9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Επιδράσεις των χαπιών Fufang Biejia Ruangan στην ηπατική ίνωση in vivo και in vitro. World J Gastroenterol. 2013; 19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. Ο ρόλος του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα 1 και του υποδοχέα του στην ανοσολογικά επαγόμενη ινογένεση ήπατος σε αρουραίους και η επίδραση του πολυσακχαρίτη Cordyceps σε αυτούς. Chin J Hepatol. 1998; 6:232-3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. Η σχέση μεταξύ της σταδιοποίησης της ηπατικήςίνωση και τα επίπεδα της βιοχημείας του ορού. HBPD INT. 2002; 1:246-8.You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Σελίδα 12 από 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Δείκτες ίνωσης ορού στη διάγνωση της ίνωσης του ήπατος. ΠηγούνιJ Intern Med. 2006; 145:475-7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP, et αϊ. Μια προκαταρκτική μελέτη του συνδυασμού μη επεμβατικών παραμέτρων στη διάγνωση της ηπατικής ίνωσης. Chin J Hepatol. 2001; 9:261-3.

26. Chen YL, Li ZY. Η σχέση μεταξύ TGF- 1, PDGF-BB, CTGF και χρόνιας ηπατίτιδας Β με ίνωση. Chin J Diffic Compl Cas. 2010; 9:19–20.

27. Sferra R, Vetuschi Α, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D, et al. Τα εκχυλίσματα Boswellia serrata και Salvia miltiorrhiza μειώνουν την επαγόμενη από DMN ηπατική ίνωση σε ποντίκια με μείωση της ρύθμισης του TGF-beta1. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012; 16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY, et al. Η επίδραση των Γυπενοσίδων στην οδό TGF- 1/Smad στην ηπατική ίνωση που προκαλείται από τετραχλωράνθρακα σε αρουραίους. Intern J Integr Med. 2013; 1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Προστασία από έναν αντιοξειδωτικό μηχανισμό της βερβερίνης έναντι της ίνωσης του ήπατος αρουραίου που προκαλείται από πολλαπλούς ηπατοτοξικούς παράγοντες. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008; 35 (3): 303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. Το σηματοδοτικό μονοπάτι του πυρηνικού παράγοντα κάπα Β: ενσωμάτωση του μεταβολισμού με τη φλεγμονή. Trends Cell Biol. 2012; 22 (11): 557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-κB σε τραυματισμό που συνδέεται με το ήπαρ, ίνωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011; 8 (2): 108–18.
32. Petrasek J, Csak Τ, Szabo G. Toll-like receptors in liver disease. Adv Clin Chem. 2013; 59:155–201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. Η διατροφική συμπλήρωση χυμού βατόμουρου ενισχύει την ηπατική έκφραση της μεταλλοθειονίνης και εξασθενεί την ηπατική ίνωση σε αρουραίους. PLoS One. 2013; 8, e58659.