Μέρος 1: Το Cistanoside του Cistanche Herba βελτιώνει την ανδρική αναπαραγωγική βλάβη που προκαλείται από την υποξία μέσω της καταστολής του οξειδωτικού στρες
Mar 26, 2022
Επαφή:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Φενγκί Γιαν1*, Σιαολιάνγκ Ντου1*, Γκουανγκφένγκ Ζου1*, Μινγκουάν Ξιά1, Γιαχούι Λιου3, Σιαοζί Λιου3, Γκουοτζούν Γου2, Χε Γουάνγκ1, Μπο Ζανγκ1, Τσιουτζού Σάο4, Γιονγκ Γουάνγκ1
Αφηρημένος:Αυξανόμενα στοιχεία δείχνουν ότι η υποξία είναι μια αιτία της ανδρικής υπογονιμότητας, και η υποξία μπορεί να σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες (OS). Το Cistanoside (Cis) είναι μια φαινυλαιθανοειδής ένωση γλυκοζιτών που μπορεί να εξαχθεί από το Cistanches Herba και διαθέτει διάφορες βιολογικές λειτουργίες. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τις προστατευτικές επιδράσεις του Cis στην αναγωγική βλάβη που προκαλείται από την υποξία και να διερευνήσει τους συγκεκριμένους υποκείμενους μηχανισμούς. Κατασκευάστηκαν πειραματικά μοντέλα υποξίας κυττάρων και ζώων και αξιολογήθηκαν τόσο in vitro όσο και in vivo οι προστατευτικές επιδράσεις των διαφόρων υποτύπων cis στο ανδρικό αναπαραγωγικό σύστημα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υποξία μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων GC-1 μέσω της διακοπής του κυτταρικού κύκλου και της ενεργοποίησης της απόπτωσης, οι οποίες συσχετίστηκαν με αυξημένη OS. Επιπλέον, το Cis έδειξε ισχυρές αντιοξειδωτικές επιδράσεις τόσο in vitro όσο και in vivo, αποκαθιστώντας σημαντικά τις αντιοξειδωτικές ενζυμικές δραστηριότητες και μειώνοντας τα επίπεδα των δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), αυξάνοντας παράλληλα τη βιωσιμότητα των κυττάρων και μειώνοντας τη βιωσιμότητα των κυττάρων απόπτωση. Είναι σημαντικό ότι οι υποτύποι Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C και Cis-H) που μελετήθηκαν εδώ έδειξαν όλοι ορισμένες αντιοξειδωτικές επιδράσεις, μεταξύ των οποίων οι επιδράσεις του Cis-B ήταν οι πιο σημαντικές. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι το Cis μετριάζει σημαντικά τις επιβλαβείς επιδράσεις του os που προκαλείται από υποξία επηρεάζοντας τις αντιοξειδωτικές ενζυμικές δραστηριότητες στους όρχεις και το GC-1 Κύτταρα.
Λέξεις-κλειδιά: Cistanoside, υποβαρική υποξία, ανδρική υπογονιμότητα, οξειδωτικό στρες, αναπαραγωγική προστασία
φρέσκο φυτό cistanche
Εισαγωγή
Επί του παρόντος, περίπου 48,5 εκατομμύρια (15%) τα ζευγάρια αναπαραγωγικής ηλικίας παγκοσμίως είναι που επηρεάζονται από τη στειρότητα [1], μεταξύ των οποίων το 40-50% των περιπτώσεων αποδίδονται στην ανδρική υπογονιμότητα [2], Μια κατάσταση που σχετίζεται στενά με περιβαλλοντικούς παράγοντες και παράγοντες του τρόπου ζωής. Απόδειξη υποδηλώνει ότι η ευαισθησία των θηλαστικών ο όρχις σε χαμηλή πίεση οξυγόνου είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας ορισμένων μορφών ανδρικής υπογονιμότητας [3]. Όπως αποδείχθηκε σε προηγούμενες μελέτες, η σπερματογένεση εξασθενεί και μειώνεται κατά την έκθεση σε υποβαρική υποξία [4-7].
Για τη διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού, μελέτες έχουν δείξει ότι η έκθεση σε υποβαρική υποξία αυξάνει την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) [8, 9]. Το ROS διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα. Σε χαμηλά επίπεδα, απαιτούνται για τη χωρητικότητα του σπέρματος, την αντίδραση ακροσώματος και τη σύντηξη σπερματοζωαρίων-ωαρίων [10]. Ωστόσο, το υπερβολικό ROS μπορεί να προκαλέσει σπέρμα βλάβη του πυρηνικού/μιτοχονδριακού DNA και υπεροξείδωση της μεμβράνης πλάσματος, η οποία σε στροφή είναι σημαντικοί αιτιολογικοί παράγοντες για τον αυξημένο κίνδυνο ανδρικής υπογονιμότητας [11, 12]. Έτσι η συσσώρευση ROS που προκαλείται από υποξία μπορεί να να είναι μια αιτία της ανδρικής υπογονιμότητας.
Το Cistanches Herba, ένα πολυετές παρασιτικό φαρμακευτικό φυτό, διανέμεται ευρέως σε άγονες περιοχές [13] και χρησιμοποιείται ευρέως λόγω της φαρμακολογικής του δραστηριότητες [14-17]. Μεταξύ όλων των αποτελεσματικών περιεχομένων του Cistanches Herba, οι PhGs έχουν θεωρείται ως το κύριο δραστικό συστατικό. Μέχρι σήμερα, 34 PhGs έχουν απομονωθεί από τα φυτάcistanches [13]. Κιστανοσάιντ (Cis), ένα ενεργό PhG που απομονώθηκε από την Cistanches Herba, έχει λάβει προσοχή για το αντιοξειδωτικό του Αποτελέσματα.
Λαμβάνοντας υπόψη τις αντιοξειδωτικές επιδράσεις του Cis και ο ρόλος του ROS στην ανδρική υποξία που προκαλείται από υποξία, το Cis θεωρείται πιθανό υποψήφιο φάρμακο για τη θεραπεία του αρσενικού που προκαλείται από υποξία στειρότητα. Ωστόσο, λίγες αναφορές έχουν αντιμετωπίσει οι αντιοξειδωτικές επιδράσεις του Cis που εξάγονται απόCistanches Herba στη θεραπεία της υποξίας που προκαλείται από την ανδρική υπογονιμότητα ή τις οδούς σηματοδότησης που εμπλέκονται. Σε αυτή τη μελέτη, κατασκευάστηκαν πειραματικά μοντέλα in vitro και in vivo υποξίας και τα συστατικά των αποτελεσμάτων των διαφόρων CIS αξιολογήθηκαν.
Η Cistanche έχει έναεπίδραση της αναπαραγωγικής παραγωγής.
Υλικά και μέθοδοι
Κυτταροκαλλιέργεια και αντιδραστήριο
Η κυτταρική σειρά σπερματογονίας ποντικού GC-1spg (GC-1) αγοράστηκε από τον αμερικανικό τύπο Συλλογή Πολιτισμού (ATCC) και καλλιεργείται σε DMEM (Invitrogen, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορός βοοειδών, 1% L-γλουταμίνη (100 mM), πενικιλίνη (100 U/mL) και στρεπτομυκίνη (100 μg/ mL) στους 37°C σε υγροποιημένο εκκολαπτήριο με 5%CO2. Το Cis (Cis-A, B, C, H) αγοράστηκε από την Chengdu Gelipu Βιοτεχνολογία Co, Ε.Π.Ε. (Κίνα).
Δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας
Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε με τη δοκιμασία kit-8 μέτρησης κυττάρων (CCK-8). Εν συντομία, τα κύτταρα GC-1 ήταν σπόροι σε πλάκες 96 φρεατίων με 1,5×103 ανά φρεάτιο και καλλιεργούνται στους 37°C επί 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ήταν που υποβάλλονται σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (20%, 15%, 10%, 5%) οξυγόνου ή διαφορετικές συγκεντρώσεις (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C, Cis-H) για τον απαιτούμενο χρόνο. Τότε Το υπερκείμενο υγρό απορρίφθηκε και ανιχνεύθηκαν κυτταρικές βιαιότητες χρησιμοποιώντας ένα κιτ CCK-8 (DojindoJapan). Η απορρόφηση κάθε φρέατος μετρήθηκε στα 450 nm με τη χρήση συσκευής ανάγνωσης μικροπλάκας (BioRad ΗΠΑ). Τέλος, οι κυτταρικές βιαιότητες ήταν υπολογίζεται σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:
Κυτταρική βιωσιμότητα = (ODexperimental ομάδα - ODblank ομάδα)/ (ομάδα ODcontrol - ομάδα ODblank) × 100%.
Ανάλυση δυτικής κηλίδας
Τα συλλεγέντα κύτταρα ή οι ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε Ripa ρυθμιστικό διάλυμα για την εξαγωγή πρωτεϊνών (RIPA BeyotimeΚίνα; Κοκτέιλ Roche Ελβετία). Συλλέχθηκαν υπερκείμενα και η συγκέντρωση των πρωτεϊνών ελέγχθηκε με τη μέθοδο BCA (Beyotime). Περίπου 40 μg των εκχυλισμένων πρωτεϊνών από κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ηλεκτρομεταφερόμενο σε μεμβράνη φίλτρου νιτροκυτταρίνης (NC) (Beyotime Κίνα). Οι μεμβράνες φίλτρου NC αποκλείστηκαν με 5% μη λιπαρό γάλα για 1,5 ώρα και επωασμένο με ειδικά αντισώματα (anti-PARP 1:1000, αντι-Κασπάση-3 1:1000, αντι-Bcl-2 1:1000, αντι-Bax 1:1000, αντι-GAPDH 1:1000. όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης, ΗΠΑ) διανυκτέρευση στους 4°C. Στη συνέχεια, όλες οι NC μεμβράνες επωάστηκαν με το αντίστοιχο δευτεροβάθμιο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου για 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και απεικονίστηκαν με σύστημα απεικόνισης (Tannon, Κίνα).
cistanche εκχύλισμα συμπληρώματα σε σκόνη
Ανίχνευση κυτταρικού κύκλου
Μια κυτταρομετρική δοκιμασία ροής (FCM) πραγματοποιήθηκε για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία υπό διαφορετικές συνθήκες για 72 ώρες και συγκομίζεται. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με προπίδιο ιωδιούχο (PI). Για κάθε δείγμα, 1×104 κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACSCalibur, BD Biosciences). Στη συνέχεια, η αναλογία των κυττάρων φάσης G1/S/G2 και του πολλαπλασιασμού [Φάση (S+G2)/Φάση (G1+S+G2) × 100%] ήταν Υπολογίζεται.
Χρώση Ki-67
Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα συνεστιακό τρυβλίο και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υποξία ή διαφορετικούς υποτύπους Cis για72 ώρες. Αφού σταθεροποιήθηκαν όλα τα κύτταρα με 4% παραφορμαλδεΰδη, επωάστηκαν με αντι-Ki-67 αντι-σώμα (1:200, Τεχνολογία Κυτταρικής Σηματοδότησης). Τότε όλα τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα αντίστοιχο αντι-συζευγμένο με CY-3-συζευγμένο αντίσωμα IgG κουνελιού (1:200, Boster, Κίνα) και διάλυμα DAPI (1,0μg/mL, Beyotime). Ο φθορισμός παρατηρήθηκε με ένα συνεστιακό μικροσκόπιο Fluoview FV1000 (Όλυμπος, Ιαπωνία).
Ανίχνευση ROS
Το FCM εισήχθη για τη μέτρηση της ενδοκυτταρικής Επίπεδα ROS χρησιμοποιώντας DCFH-DA. Αιωρούμενα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκαν σε διαφορετικές θεραπείες. Μετά από 72 ώρες θεραπείας, αναρτήθηκαν σε DMEM χωρίς ορό με 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Το περιεχόμενο του ROS ήταν στη συνέχεια προσδιορίζεται με ταξινόμηση κυττάρων που ενεργοποιείται με φθορισμό σε σύστημα κυτταρομετρίας ροής Beckman Coulter με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και μήκος κύματος εκπομπής 525 nm [18].
Προσδιορισμός υπεροξείδωσης λιπιδίων (LPO)
Οι αντιδραστικές ουσίες του θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBARS) πραγματοποιήθηκε δοκιμασία για την ανίχνευση LPO. Όλοι τα βήματα λειτουργίας εκτελέστηκαν σύμφωνα με με τις οδηγίες (Sigma ΗΠΑ). Οι συγκεντρώσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας συντελεστή μοριακής απόσβεσης 1,56×105/(M·cm), ο οποίος ήταν που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας τη μαλονοδιαλδεΰδη ως πρότυπο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως nmol του Ισοδύναμα MDA/mg πρωτεΐνης.
Προσδιορισμός των ενζυμικών δραστηριοτήτων
Οι ενζυμικές δραστηριότητες ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανάλυσης, συμπεριλαμβανομένης της αναγωγάσης της γλουταθειόνης (GR), της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPx) και της δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD). Όλα τα βήματα λειτουργίας εκτελέστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες παρέχεται (Ναν Τζινγκ Τζιαν Τσενγκ Εμβιομηχανική Ινστιτούτο Κίνα).
Ζώα και πειραματικό πρωτόκολλο
Ώριμοι αρσενικοί αρουραίοι Wistar (180-220 g, 8 w ηλικίας) ελήφθησαν από το κέντρο των ζώων του Τέταρτο Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Xi'an, Κίνα. Η άδεια για τη χρήση των ζώων ελήφθη από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου (Αριθμός αναφοράς: 20190506). Το ζώο το πείραμα πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του πανεπιστημίου για τη φροντίδα και τη χρήση πειραματόζωων.
Σε όλους τους αρουραίους επετράπη να προσαρμοστούν για περίπου μία εβδομάδα πριν από την έναρξη του πειράματος. Μετά τον εγκλιματισμό, οι αρουραίοι ήταν τυχαία κατανεμημένα σε 6 ομάδες με 5 ζώα σε κάθε μία ομάδα. Οι αρουραίοι στην ομάδα ελέγχου ανατράφηκαν υπό κανονική πίεση (PO2: 20%, πίεση αέρα:101,3 kPa), ενώ οι αρουραίοι στις ομάδες μοντέλου και Cis επεξεργασμένοι ανυψώθηκαν σε θάλαμο οξυγόνου χαμηλής πίεσης (εσωτερική πίεση 61,6 kPa, ισοδύναμη με ύψος 4000 μέτρων πάνω το επίπεδο της θάλασσας · ΣΠ2: 14,55%) για την προσομοίωση ενός υποξικού περιβάλλοντος μεγάλου υψομέτρου. Όλοι οι αρουραίοι είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τρόφιμα και νερό σε πλαστικούς κλωβούς στα 22 ± συνθήκες 2°C και υγρασίας με αυτόματο κύκλο φωτός/σκούρου 12 ωρών. Οι αρουραίοι στο μοντέλο και οι ομάδες που έλαβαν θεραπεία με Cis παρέμειναν κάτω από υποβαρικές καταστάσεις, αλλά μεταφέρθηκαν σε νορμοβαρικές συνθήκες κάθε 96 ώρες, στις οποίες χρόνος τους δόθηκαν τρόφιμα και νερό και καθαρίστηκαν τα κλουβιά. Η διάρκεια της μετάβασης από υποβαρική σε υποβαρική ήταν περίπου 2 η. Όλες οι ομάδες θεραπείας έλαβαν θεραπεία με το αντίστοιχο Cis (8 mg/kg/ημέρα) μέσω από του στόματος καθετήρα για 8 εβδομάδες, ενώ οι επίλεκτοι και οι επίμυες-μοντέλα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ίσο όγκο Νερό.
Μετά από 8 εβδομάδες, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν υπό αναισθησία. Όρχεις, επιδιδυμίδες και σπερματοδόχα κυστίδια διαχωρίστηκαν και ζυγίστηκαν, και το όργανο ο δείκτης υπολογίστηκε σύμφωνα με τα ακόλουθα τύπος: (βάρος οργάνου/ζωικού βάρους) × 100%. Στη συνέχεια, σπέρμα στην επιδιδυμίδα συλλέχθηκαν και η κινητικότητά τους και το ακρόσωμα τους ελέγχθηκε η ενζυμική δραστηριότητα. Ομοίως, οι ιστοί των όρχεων συλλέχθηκαν για ιστοπαθολογικούς μελέτες και ROS, LPO και αντιοξειδωτικό ένζυμο ανίχνευση δραστηριότητας.
Αξιολόγηση του ποσοστού ζωντανών σπερματοζωαρίων
Η επιδιδυμίδα ήταν χαραγμένη με χειρουργικό ψαλίδι και παρασκευάστηκε το εναιώρημα σπέρματος σε φυσιολογικό ορό. Για να εκτιμηθεί ο ρυθμός ζωντανού σπέρματος, 5 μL του εναιωρήματος σπέρματος αναμειγνύονται προσεκτικά με ίσο όγκο ηωσίνης-Υ λεκές. Στη συνέχεια, το σπέρμα μετρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Τα ποσοστά ζωντανών σπερματοζωαρίων ήταν αξιολογείται με τον υπολογισμό και των δύο χρωματισμένων (νεκρών σπέρμα) και μη χρωματισμένο σπέρμα (ζωντανό σπέρμα).
Cistanche tubulosa σε σκόνηαυξάνει τοποσοστά ζωντανών σπερματοζωαρίων.
Για περισσότερες πληροφορίες, κάντε κλικ εδώ.
Προσδιορισμός του ενζύμου ακροσώματος σπέρματος δραστηριότητα
Η δοκιμασία ενζυμικής δραστικότητας του σπερματοζωαρίου ακροσώματος χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του ακροσώματος του σπέρματος ένζυμα [19]. Τα αποτελέσματα σε κάθε ομάδα ήταν υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Ενζυμική δραστικότητα ακροσώματος (μIU) = (ODExperiment ομάδα - ομάδα ODBlank)/(247,5×10) × 106.
Στατιστική ανάλυση
Όλα τα ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SD και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 22.0. Το t-test του Ανεξάρτητου Φοιτητή χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνετε τα δεδομένα μεταξύ δύο ομάδων. *Π< 0.05="" and="" **p="">< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">