Προβλεπτική σημασία της έκφρασης πρωτεΐνης 8 που σχετίζεται με το μυελοειδή νεφρό σε ασθενείς με παχυσαρκία ή νεφρικές παθήσεις που σχετίζονται με διαβήτη τύπου 2

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Takashige Kuwabara¹, Kiyoshi Mori1,^2*, Μασάτο Κασαχάρα^1,3, Hideki Yokoi¹, Χιροτάκα Ιμαμάκη¹,Akira Ishii¹, Kenichi Koga¹, Akira Sugawara⁴, Σίντζι Γιασούνο³, Kenji Ueshima³, Takashi Morikawa⁵, Yoshio Konishi⁵, Μασαχίτο Ιμανίσι⁵, Akira Nishiyama⁶, Kazuwa Nakao^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Τμήμα Ιατρικής και Κλινικής Επιστήμης, Μεταπτυχιακή Σχολή Ιατρικής του Πανεπιστημίου του Κιότο, Κιότο, Ιαπωνία,

²Κέντρο Ιατρικής Καινοτομίας, Μεταπτυχιακό Σχολείο Ιατρικής από το Πανεπιστήμιο του Κιότο, Κιότο, Ιαπωνία,

³Τμήμα Έρευνας EBM, Ινστιτούτο για την Προώθηση της Κλινικής και Μεταφραστικής Επιστήμης, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Κιότο, Κιότο, Ιαπωνία,

⁴Τμήμα Νεφρολογίας, Νοσοκομείο Ερυθρού Σταυρού της Οσάκα, Οσάκα, Ιαπωνία,

5 Division of Nephrology and Hypertension, Osaka City General Hospital, Osaka, Japan,

6 Τμήμα Φαρμακολογίας, Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Kagawa, Kagawa, Ιαπωνία

Αφηρημένη

Ιστορικό και Σκοπός: Έχουμε αναφέρει ότι ο υποδοχέας 4 (TLR4) και ένας από τους ενδογενείς συνδέτες του, η πρωτεΐνη 8 που σχετίζεται με το μυελοειδή (MRP8 ή S100A8), παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της διαβητικής νεφροπάθειας σε ποντικούς. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τη σημασία τουνεφρόΈκφραση MRP8 σε ασθενείς μεευσαρκία- ή που σχετίζεται με διαβήτη τύπου 2νεφρικές παθήσεις. Μέθοδοι: Σε διαβητικούς, παχύσαρκους ή ελέγχους, τα επίπεδα έκφρασης MRP8 mRNA και πρωτεΐνης σε δείγματα νεφρικής βιοψίας προσδιορίστηκαν με RT-PCR και ανοσοϊστοχημεία σε πραγματικό χρόνο (n=28 και 65, αντίστοιχα) και οι συσχετίσεις τους με την αρχική τιμή και αναλύθηκαν οι προγνωστικές παράμετροι. Οι επιδράσεις του MRP8 σε εκφράσεις προφλεγμονώδους γονιδίου εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μακροφάγα. Αποτελέσματα:ΝεφρόΤα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου MRP8 και της πρωτεΐνης ήταν αυξημένα σε παχύσαρκες ή διαβητικές ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Μεταξύ όλων των υποκειμένων, με ανάλυση μονομεταβλητής γραμμικής παλινδρόμησης, ο αριθμός των σπειραματικών MRP8-θετικών κυττάρων και η θετική περιοχή του σωληναρίσκου MRP8-στην έναρξη, αντίστοιχα, συσχετίστηκαν όχι μόνο με διάφορους γνωστούς παράγοντες κινδύνου για διαβητική νεφροπάθεια (όπως π.χ. όπως συστολική αρτηριακή πίεση, πρωτεϊνουρία και κρεατινίνη ορού) αλλά και με την έκταση της σπειραματοσκλήρωσης και της σωληναριακής διάμεσης ίνωσης. Ανεξάρτητοι παράγοντες που προβλέπουν τα επίπεδα πρωτεΐνης στα ούρα ένα χρόνο αργότερα εξετάστηκαν με πολυπαραγοντική ανάλυση και περιελάμβαναν σπειραματικό MRP8-θετικό αριθμό κυττάρων (b=0.59, P,{0.001), πρωτεϊνουρία (b=0.37, P=0.002) και συστολική αρτηριακή πίεση (b=0.21, P=0.04) στην έναρξη, μετά από προσαρμογή για γνωστό κίνδυνο παράγοντες. Η έκφραση της πρωτεΐνης MRP8 παρατηρήθηκε σε CD{17}θετικά μακροφάγα και ατροφικά σωληνάρια. Σε καλλιεργημένα μακροφάγα ποντικού, οι προφλεγμονώδεις εκφράσεις κυτοκίνης που προκαλούνται από την πρωτεΐνη MRP8 προκάλεσαν επίσης την αυτόματη επαγωγή του MRP8 με τρόπο που εξαρτάται από το TLR4-.

Συμπεράσματα: Η σπειραματική έκφραση MRP8 φαίνεται να σχετίζεται με την εξέλιξη της πρωτεϊνουρίας σε παχύσαρκους ή διαβητικούς τύπου 2 ασθενείς, πιθανώς με την πρόκληση φλεγμονωδών αλλαγών στα μακροφάγα μέσω της σηματοδότησης TLR4.

Επιδράσεις του cistanche: θεραπεία νεφρικών παθήσεων

Εισαγωγή

Η χρόνια φλεγμονή παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του διαβήτη ήευσαρκίακαι των καρδιαγγειακών επιπλοκών του [1]. Η εμπλοκή των έμφυτων ανοσιακών υποδοχέων και των ενδογενών προσδεμάτων στη διαδικασία της χρόνιας φλεγμονής έχει εμπλακεί. Η πρωτεΐνη 8 που σχετίζεται με το μυελοειδή (MRP8, επίσης γνωστή ως S100A8 ή καλγκρανουλίνη Α) αναγνωρίστηκε αρχικά ως κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που δεσμεύει ασβέστιο σε ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα [2] και έχει αναγνωριστεί ευρέως ως ισχυρός ενδογενής συνδέτης για τον υποδοχέα 4 (TL4). ) σε διάφορες ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του σηπτικού σοκ, των αγγειακών και αυτοάνοσων διαταραχών [3,4,5]. Πρόσφατα προτείναμε ότι η σηματοδότηση MRP8/TLR4 παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγόμενη από υπερλιπιδαιμία εξέλιξη της διαβητικής νεφροπάθειας [6]. Τα σπειραματικά μακροφάγα και τα κύτταρα του αγωγού συλλογής είναι κύριες πηγές MRP8 σε μοντέλα ποντικών με διαβητική νεφροπάθεια[6] και νεφρική ίνωση [7], αντίστοιχα. Τα επίπεδα του MRP8 στο πλάσμα, το οποίο συνήθως σχηματίζει ένα ετεροδιμερές σύμπλεγμα με έναν εταίρο δέσμευσης MRP14 στην κυκλοφορία του αίματος, είναι αυξημένα σε παχύσαρκα άτομα [8,9]. Ωστόσο, δεν έχουν υπάρξει αναφορές που να διερευνούν τη νεφρική έκφραση του MRP8 σε ασθενείς με παχυσαρκία ήτύπος2 διαβήτηςκαι η συσχέτισή του με την νεφρική πρόγνωση.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης mRNA και πρωτεΐνης του MRP8 στονεφρότων Ιαπώνων ασθενών με διαβητική νεφροπάθεια (DN),ευσαρκία-σχετιζόμενη σπειραματοπάθεια (ORG), νεφρωσικό σύνδρομο ελάχιστης αλλαγής (MCNS) ή ελάσσονα σπειραματική ανωμαλία (MGA), που όλα διαγνώστηκαν με βιοψία νεφρού και για να αξιολογηθεί εάν η νεφρική έκφραση MRP8 μπορεί να προβλέψει τα νεφρικά αποτελέσματα.

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

Υλικά και μέθοδοι

Δήλωση ηθικής

Η μελέτη σε ανθρώπους διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που εκφράζονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από τις Επιτροπές Δεοντολογίας για την Ανθρώπινη Έρευνα της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Κιότο και του Γενικού Νοσοκομείου της Πόλης της Οσάκα, αντίστοιχα. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση. Το πρωτόκολλο μελέτης σε ζώα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Έρευνας Ζώων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Κιότο (Αριθμός Άδειας: Med Kyo 13318). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις σε ζώα έγιναν με αναισθησία με πεντοβαρβιτάλη νατρίου και καταβλήθηκαν όλες οι προσπάθειες για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία.

Θέματα μελέτης

Πρωτεϊνουρικοί ασθενείς μεευσαρκίαή διαβήτη τύπου 2 που υποβλήθηκαν σε βιοψία νεφρού εντάχθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Ασθενείς με λοιμώδη νόσο, καρκίνο, ηπατική νόσο ή νόσο του κολλαγόνου αποκλείστηκαν. Η πρωτεϊνουρία ορίστηκε ως πρωτεΐνη ούρων μεγαλύτερη από0.5 g/g κρεατινίνης ή λευκωματίνη ούρων μεγαλύτερη από 300 mg/g κρεατινίνης σε τουλάχιστον δύο διαδοχικές μετρήσεις.Ευσαρκίαορίστηκε ως δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ) μεγαλύτερος από 25.0 (kg/m)²). Ο διαβήτης τύπου 2 διαγνώστηκε σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Οι βιοχημικές μετρήσεις κατά την εισαγωγή για βιοψία νεφρού χρησιμοποιήθηκαν ως βασικά χαρακτηριστικά για τη διατομική ανάλυση. Ο εκτιμώμενος ρυθμός σπειραματικής διήθησης (eGFR) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μια απλοποιημένη εξίσωση πρόβλεψης που προτάθηκε από την Ιαπωνική Εταιρεία Νεφρολογίας: eGFR (ml/min/1,73 m²)=1946 [ηλικία (έτη)]20.287 6 [κρεατινίνη ορού (mg perdl)]21.094 60.739 (για γυναίκες), η οποία είναι μια επικυρωμένη τοπική τροποποίηση του MDRD [ 10]. Οι συγκεντρώσεις της κρεατινίνης στον ορό μετρήθηκαν με χρήση ενζυματικής μεθόδου.

Για την ανοσοϊστοχημεία, αναλύθηκαν 65 Ιάπωνες ασθενείς που υποβλήθηκαν σε βιοψία νεφρού στο Τμήμα Ιατρικής και Κλινικής Επιστήμης του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Κιότο μεταξύ 2000 και 2011. Οι αποδεδειγμένες με βιοψία διαγνώσεις όλων των ασθενών κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου παρατίθενται στον Πίνακα S1 στο Αρχείο S1. Τα άτομα που εξετάστηκαν σε αυτήν την εργασία περιελάμβαναν DN (n=19), ORG (n=10) και μη παχύσαρκα, μη διαβητικά άτομα ελέγχου που διαγνώστηκαν ως MGA(n=19) ή MCNS (n=17). Ορισμένες περιπτώσεις σε αυτές τις κατηγορίες εξαιρέθηκαν επειδή τα διαθέσιμα δείγματα περιείχαν λιγότερα από 10 σπειράματα. Ο ορισμός της DN συνίστατο σε (1) διάρκεια μεγαλύτερη από 5 χρόνια μετά την εμφάνιση του διαβήτη, (2) ύπαρξη μικρο- ή μακρο-λευκωματουρίας, (3) συμβατές ιστοπαθολογικές αλλαγές με DN όπως πάχυνση της βασικής μεμβράνης σπειραμάτων, μεσαγγειακή επέκταση, οζώδης σκλήρυνση (όζοι Kimmelstiel-Wilson) και/ή αρτηριακή υαλίνωση και (4) αποκλεισμός άλλων αιτιών για νεφρικές διαταραχές [11]. Το ORG ορίστηκε μορφολογικά ως εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρωση και/ή σπειραματομεγαλία σε άτομα που είχαν και τα δύοευσαρκίακαι πρωτεϊνουρία, των οποίων οι ορισμοί περιγράφηκαν παραπάνω [12,13].

Για ανάλυση έκφρασης mRNA, δείγματα χαμηλής ποιότητας, στα οποία τα επίπεδα 18S ριβοσωμικού RNA (rRNA) ήταν χαμηλότερα από το όριο ευαισθησίας ανίχνευσης με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, αποκλείστηκαν. Τα υποκείμενα που εγγράφηκαν αποτελούνταν από 22 διαβητικούς τύπου 2 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε βιοψία νεφρού στο Γενικό Νοσοκομείο της πόλης της Οσάκα μεταξύ 2000 και 2010, και 6 μη διαβητικά άτομα ελέγχου, τα οποία είχαν αποδεδειγμένη βιοψία MGA.

Οι Πίνακες 1 και 2 συνοψίζουν τα βασικά κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών που εξετάστηκαν με ανοσοϊστοχημική ανάλυση ή ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, αντίστοιχα. Για τη μικροσκοπία φωτός, τα δείγματα ιστών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη, περιοδικό οξύ-Schiff, άργυρο μεθεναμίνης περιοδικού οξέος ή τρίχρωμο Masson (Εικ. S1). Οι αναλογίες του αριθμού των σπειραμάτων με σφαιρική σκλήρυνση μεταξύ των ολικών σπειραμάτων και των σχετικών περιοχών της σωληναριδικής διάμεσης ίνωσης αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παθολόγους που δεν γνώριζαν τη διάγνωση και τα κλινικά δεδομένα.

Επιδράσεις του cistanche: θεραπεία νεφρικών παθήσεων

Ορισμός νεφρικών εκβάσεων

Οι ακόλουθοι δύο προγνωστικοί δείκτες εξετάστηκαν με αναλύσεις γραμμικής παλινδρόμησης και λογιστικής παλινδρόμησης, αντίστοιχα: (1) η έκταση της πρωτεϊνουρίας που μετρήθηκε ένα χρόνο μετά τη βιοψία και (2) το νεφρικό επεισόδιο ορίστηκε ως η ετήσια αύξηση της κρεατινίνης ορού κατά 0,50 τοις εκατό από την έναρξη ή την έναρξη της χρόνιας αιμοκάθαρσης.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία των MRP8 και CD68 διεξήχθη χρησιμοποιώνταςνεφρότομές (πάχους 4 mm) στερεώνονται με 4 τοις εκατό ρυθμισμένη παραφορμαλδεΰδη. Μετά την ανάκτηση αντιγόνου με κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, οι τομές νεφρών επωάστηκαν με 10 τοις εκατό ορό κατσίκας, ακολουθούμενες από αντι-ανθρώπινο MRP8 ποντικού (1:100; BMA biomedicals, Augst, Switzerland)[14] ή αντισώματα αντι-ανθρώπινου CD68 ποντικού (1:50 DAKO, Ely, UK), αντίστοιχα. Τα πρωτογενή αντισώματα οπτικοποιήθηκαν με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου και τετραϋδροχλωρική 3,{{14}διαμινοβενζιδίνη (Dako USA, Carpinteria, CA). Οι πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Τα θετικά MRP{15}}κύτταρα μετρήθηκαν σε περισσότερα από 10 σπειράματα και η θετική περιοχή MRP{{17} στο σωληνάριο διάμεσο μετρήθηκε ποσοτικά για να ληφθεί ένας μέσος όρος για κάθε άτομο χρησιμοποιώντας λογισμικό MetaMorph 7.5 (Molecular Devices, Downingtown, PA, ΗΠΑ ). Ο εντοπισμός των θετικών κυττάρων CD{68- και MRP8- αξιολογήθηκε με σειριακές τομές. Δεν υπήρχε ούτε σήμα MRP8 ούτε CD68 σε αρνητικούς μάρτυρες που χρωματίστηκαν χωρίς πρώτο αντίσωμα (Εικ. S2). Προεπώαση αντισώματος αντι-MRP8 με 20 γραμμομοριακή περίσσεια ανασυνδυασμένης ανθρώπινης πρωτεΐνης MRP8 (Life Technologies, Carlsbad, CA, ΗΠΑ) στους 4 oC κατά τη διάρκεια της νύχτας, η χρώση μειώθηκε σημαντικά, αν όχι πλήρως, υποστηρίζοντας περαιτέρω την ειδικότητα του αντισώματος (Εικ. S3) .

Cistanche για τη θεραπεία των νεφρών

Αξιολόγηση έκφρασης mRNA

ΠαγωμένοςνεφρόΟι τομές διαχωρίστηκαν σε ιστούς σπειραμάτων και μη σπειραμάτων με μικρο-ανατομή σύλληψης με λέιζερ (LM200; Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε με το μίνι κιτ RNeasy (Qiagen, Τόκιο, Ιαπωνία). Τα επίπεδα έκφρασης mRNA προσδιορίστηκαν με TaqMan σε πραγματικό χρόνο PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [16,17]. Τα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων κανονικοποιήθηκαν με επίπεδα 18S rRNA (εσωτερικός έλεγχος). Δείτε τον Πίνακα S2 στο Αρχείο S1 για τις αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών. Το Ευκαρυωτικό 18S rRNA ανιχνεύθηκε με αντιδραστήρια δοκιμασίας PreDeveloped TaqMan (Applied Biosystems).

Πίνακας 1. Βασικά κλινικά χαρακτηριστικά ασθενών σε βιοψία νεφρού που αναλύθηκαν για έκφραση πρωτεΐνης MRP8 με ανοσοϊστοχημεία.

MGA: ελάχιστη σπειραματική ανωμαλία, MCNS: νεφρωσικό σύνδρομο ελάχιστης αλλαγής, ORG:ευσαρκία-σχετιζόμενη σπειραματοπάθεια, DN: διαβητική νεφροπάθεια, BMI: δείκτης μάζας σώματος, BUN: άζωτο ουρίας αίματος, CRP: C-αντιδρώσα πρωτεΐνη. Τα δεδομένα είναι μέσα 6 SD. *Οι συνολικές διαφορές μεταξύ των ομάδων MGA, MCNS, ORG και DN συγκρίθηκαν με ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

MRP8 θεραπεία μακροφάγων

Μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών δημιουργήθηκαν από ποντίκια άγριου τύπου ή TLR4 knockout (KO) [18] σε γενετικό υπόβαθρο C57BL/6J (Oriental BioService, Kyoto, Ιαπωνία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Εν συντομία, μετά τη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, τα κύτταρα του μυελού των οστών επαναιωρήθηκαν σε ένα μέσο που περιείχε 20 τοις εκατό ορό εμβρύου μόσχου και 50 ng/ml ανασυνδυασμένο ανθρώπινο παράγοντα διέγερσης αποικιών μακροφάγων (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) και καλλιεργήθηκαν σε 37uC σε ατμόσφαιρα CO2 5 τοις εκατό. Την ημέρα 7, τα μακροφάγα επωάστηκαν με ανασυνδυασμένο MRP8 ποντικού (Abnova, Taipei, Taiwan) ή όχημα για 4 ώρες. Πολυμυξίνη Β (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japan) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για να ελαχιστοποιηθεί η μόλυνση της ενδοτοξίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3,19]. Η μη ενδοτοξίνη ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε συγκέντρωση MRP8 που δοκιμάστηκε στη συνέχεια επώαση με 25 mg/ml πολυμυξίνης Β από το ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Το συνολικό RNA από τα κύτταρα εκχυλίστηκε με το RNeasy MiniKit και τα επίπεδα έκφρασης mRNA της ιντερλευκίνης-1 βήτα (IL-1b), του παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNFa) και του MRP8 προσδιορίστηκαν με TaqMan σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Τα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων κανονικοποιήθηκαν από τα επίπεδα GAPDH τρωκτικών (εσωτερικός έλεγχος, Pre-Developed TaqMan Assay Reagents). Οι αλληλουχίες Primer και Probe για PCR πραγματικού χρόνου παρατίθενται στον Πίνακα S2 στο Αρχείο S1.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος 6 SD ή μέσος όρος 695 τοις εκατό διάστημα εμπιστοσύνης (CI) όταν χρειάζεται. Για τη σύγκριση μεταξύ τεσσάρων ομάδων, χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA με την εκ των υστέρων ανάλυση του Bonferroni και οι κατηγορικές μεταβλητές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή x2. Το μη ζευγαρωμένο t-test του μαθητή εφαρμόστηκε για σύγκριση μεταξύ δύο ομάδων, ανάλογα με την περίπτωση. Οι συντελεστές συσχέτισης Spearman υπολογίστηκαν για να καθορίσουν συσχετίσεις μεταξύ δύο μεταβλητών. Για να εξεταστούν οι επιδράσεις των βασικών συμμεταβλητών που καθορίζουν την έκταση της σπειραματικής ή σωληναριακής έκφρασης MRP8 ή των επιπέδων πρωτεΐνης στα ούρα ένα χρόνο μετά τη βιοψία, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις μονομεταβλητής και πολυπαραγοντικής γραμμικής παλινδρόμησης. Η ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση επεξηγηματικών μεταβλητών που προβλέπουν την εμφάνιση νεφρικών επεισοδίων. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό StatView 5.0 (SAS InstituteInc., Cary, NC, USA). Οι τιμές P,0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Επιδράσεις του cistanche: θεραπεία νεφρικών παθήσεων

Αποτελέσματα

Συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης MRP8 στονεφρόμεταξύ των ομάδων DN, ORG και μη παχύσαρκων, μη διαβητικού ελέγχου (MGA και CNS). Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση αποκάλυψε ότι τόσο ο αριθμός των θετικών κυττάρων του σπειραματικού MRP (Εικ. 1Α) όσο και η θετική περιοχή του ενδιάμεσου MRP (Εικ. 1Β) στο DN ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από εκείνες σε άλλες ομάδες συμπεριλαμβανομένων των MGA, MCNS, και ORG (Π<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Πίνακας 2. Βασικά κλινικά χαρακτηριστικά ασθενών σε βιοψία νεφρού που αναλύθηκαν για έκφραση mRNA MRP8 με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο.

Οι συσχετισμοί μεταξύνεφρόΤα σήματα MRP8 και οι βασικές κλινικές παράμετροι τη στιγμή της νεφρικής βιοψίας αναλύθηκαν διατομικά (Πίνακας 3). Με μονομεταβλητή ανάλυση, η σπειραματική και/ή σωληναριακή έκφραση της πρωτεΐνης MRP8 συσχετίστηκε σημαντικά με την ηλικία, τη συστολική και διαστολική αρτηριακή πίεση, την πρωτεΐνη των ούρων, τα επίπεδα κρεατινίνης στον ορό, την BUN και την HDL χοληστερόλη, eGFR και την έκταση της παγκόσμιας σπειραματοσκλήρωσης και ινώδους σωληναρίου. Αυτές οι παράμετροι εξετάστηκαν περαιτέρω με πολυπαραγοντική ανάλυση μετά τον αποκλεισμό της διαστολικής αρτηριακής πίεσης, του eGFR και του BUN λόγω συγγραμμικότητας. Το ποσοστό της σωληναριδικής διάμεσης ίνωσης συσχετίστηκε ανεξάρτητα με σπειραματικά σήματα MRP8 (b=0.62, προσαρμοσμένο P=0.02) και σωληνοειδή ενδιάμεση σήματα MRP8 (b=0}.85, προσαρμοσμένο P 0,001), αντίστοιχα. Επιπλέον, τα σωληναριακά σήματα MRP8 συσχετίστηκαν επίσης ανεξάρτητα με την αρχική πρωτεϊνουρία (b=0.20, προσαρμοσμένο P=0.01). Οι αναλύσεις διάσπαρτης γραφικής παράστασης μεταξύ των σημάτων MRP8 σε σπειράματα ή σωληναριστήριο και κλινικές παραμέτρους έδειξαν ότι η ομάδα MCNS είχε ένα ξεχωριστό πρότυπο κατανομής από άλλες ομάδες, ειδικά ως προς τα επίπεδα πρωτεΐνης ούρων και χοληστερόλης LDL ορού (Εικ. S5A–D, S6A–D). Ο αποκλεισμός της ομάδας MCNS βελτίωσε τη συσχέτιση μεταξύ των σημάτων MRP8 και των επιπέδων πρωτεΐνης ούρων ή LDL-χοληστερόλης ορού (Εικ. S5E–F, S6E–F). Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μια υπο-ανάλυση εξαιρουμένων των ασθενών με MCNS και βρήκαμε ότι η πρωτεΐνη των ούρων ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας που συσχετίστηκε με σπειραματικά σήματα MRP8 μέσω πολυπαραγοντικής ανάλυσης (Πίνακας 4; b=0.36, προσαρμοσμένο P=0.03 ).

Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις γραμμικής παλινδρόμησης ή λογιστικής παλινδρόμησης για να εντοπίσουμε επεξηγηματικούς παράγοντες που προβλέπουν νεφρικά αποτελέσματα που ήταν η έκταση της πρωτεϊνουρίας ένα χρόνο αργότερα και το νεφρικό επεισόδιο εντός ενός έτους. Δεδομένου ότι υπήρχε καλή συσχέτιση μεταξύ σπειραματικών και σωληναρισιακών σημάτων MRP8 (Εικ. S7; R=0.67,P,0.001), αυτές οι παράμετροι καταγράφηκαν εναλλακτικά σε περαιτέρω αναλύσεις. . Αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των βασικών παραμέτρων και της πρωτεΐνης των ούρων 1 έτος μετά τη βιοψία νεφρού με ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5, το σπειραματικό σήμα MRP8 (b=0.59, προσαρμοσμένο P,0.001) ήταν ένας προγνωστικός παράγοντας για την έκταση της πρωτεϊνουρίας ένα χρόνο αργότερα, καθώς και η αρχική συστολική αρτηριακή πίεση (b {{13} }.21, προσαρμοσμένο P=0.04) και βασική πρωτεϊνουρία (b=0.37, προσαρμοσμένο P=0.002). Αυτές οι παράμετροι ήταν ανεξάρτητες από άλλους γνωστούς παράγοντες κινδύνου διαβητικής νεφροπάθειας, συμπεριλαμβανομένης της νεφρικής δυσλειτουργίας (κρεατινίνη ορού) και της έκτασης της ολικής σκλήρυνσης και της σωληναριακής διάμεσης ίνωσης [11,21-24]. Από την άλλη πλευρά, το σωληναριακό σήμα MRP8 (b=0.34, προσαρμοσμένο P=0.09) δεν ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τα επίπεδα πρωτεΐνης στα ούρα ένα χρόνο αργότερα. Νεφρικά επεισόδια εμφανίστηκαν σε 7 ασθενείς (6 σε περιπτώσεις DN και 1 σε περιπτώσεις ORG) εντός ενός έτους μετά τη νεφρική βιοψία. Με μονομεταβλητή ανάλυση, όχι μόνο η έκταση της σπειραματοσκλήρωσης και της σωληναριακής διάμεσης ίνωσης, και τα σπειραματικά και σωληναρισιακά σήματα MRP8, αλλά και οι αρτηριακές πιέσεις, η νεφρική δυσλειτουργία και τα επίπεδα πρωτεϊνών στα ούρα κατά την έναρξη ήταν σημαντικοί προγνωστικοί παράγοντες για την εμφάνιση νεφρικών επεισοδίων. Ωστόσο, με πολυμεταβλητή ανάλυση, οι συμμεταβλητές τους ακυρώθηκαν η μία από την άλλη (Πίνακας S3 στο Αρχείο S1), πιθανότατα λόγω υψηλών συσχετίσεων μεταξύ αυτών των παραμέτρων.

Τέλος, εξετάσαμε την ισχύ του MRP8 ως ενδογενούς συνδέτη για το TLR4 χρησιμοποιώντας καλλιεργημένα μακροφάγα. Σε μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών από ποντίκια άγριου τύπου, η προκαλούμενη από την πρωτεΐνη MRP8 ανοδική ρύθμιση των προφλεγμονωδών γονιδίων κυτοκίνης όπως το IL-1b και το TNFa και επίσης προκάλεσε αυτόματη επαγωγή του MRP8, με δοσοεξαρτώμενο τρόπο μεταξύ 1{{ 15}}–1000 ng/ml. Αυτές οι επιδράσεις του MRP8 κατεστάλησαν περίπου κατά τα δύο τρίτα σε μακροφάγους που ελήφθησαν από ποντικούς TLR4 KO (Ρ, 0,01) (Εικ. 3).

Εικόνα 1. Ανοσοϊστοχημικές και mRNA αναλύσεις για MRP8 σενεφρόδείγματα βιοψίας. Ποσοτικοποίηση του σπειραματικού MRP{{0}}του αριθμού θετικών κυττάρων (A) και της σωληναριακής διάμεσης MRP8-θετικής περιοχής (Β). Έκφραση mRNA του MRP8 σε σπειραματικά και μη σπειραματικά κλάσματα (C). Ανοιχτές μπάρες: μη παχύσαρκοι, μη διαβητικοί μάρτυρες που είναι MGA ή MCNS, κλειστές ράβδοι: ORG ή DN (A–C). Αντιπροσωπευτικές εικόνες ομάδων MGA, MCNS, ORG και DN (D–G). MGA: ελάχιστη σπειραματική ανωμαλία, MCNS: νεφρωσικό σύνδρομο ελάχιστης αλλαγής, ORG: σπειραματοπάθεια σχετιζόμενη με την παχυσαρκία, DN: διαβητική νεφροπάθεια. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι το MRP8 εκφράζεται σε αφθονία στα σπειράματα και στο διάμεσο των σωληναρίων ασθενών με DNas σε σύγκριση με το ORG και το μη παχύσαρκο, μη διαβητικό μάρτυρα (MGA και MCNS). Επιπλέον, σε άτομα με ORG, τα επίπεδα έκφρασης MRP8 έτειναν να είναι υψηλότερα από τα άτομα MGA ή MCNS. Στην αρχική διερεύνηση εγκάρσιας τομής συμπεριλαμβανομένων όλων των υποκειμένων, με μονομεταβλητή ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης, ο αριθμός των θετικών κυττάρων του σπειραματικού MRP8-και η θετική περιοχή του σωληνοειδούς διάμεσου MRP8-αντίστοιχα συσχετίστηκαν όχι μόνο με διάφορους γνωστούς παράγοντες κινδύνου για διαβητική νεφροπάθεια (όπως συστολική αρτηριακή πίεση, πρωτεϊνουρία και κρεατινίνη ορού) αλλά και με την έκταση της σπειραματοσκλήρωσης και της σωληναριακής διάμεσης ίνωσης. Με πολυπαραγοντική ανάλυση, η θετική περιοχή του σωληνοειδούς διάμεσου MRP8-συσχετίστηκε σημαντικά με την πρωτεϊνουρία και τη σωληναρισιακή διάμεση ίνωση. Ο αριθμός των θετικών κυττάρων του σπειραματικού MRP8-συσχετίστηκε σημαντικά με τη σωληναρισιακή διάμεση ίνωση στην αρχική ανάλυση και με την πρωτεϊνουρία σε μια υπο-ανάλυση εξαιρουμένης της ομάδας MCNS. Η ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι το MRP8 εκφράστηκε, τουλάχιστον εν μέρει, από μακροφάγα που εκφράζουν CD68(συν) και ατροφικά σωληνάρια. Αυτά τα ευρήματα εγείρουν την πιθανότητα ότινεφρόΤα σήματα MRP8 σε σπειράματα ή σωληναρίσιο μπορεί να χρησιμεύσουν ως νέοι δείκτες διαβητικής νεφροπάθειας.

Εικόνα 2. Εντοπισμός έκφρασης πρωτεΐνης CD68 και MRP8 σε σειριακές τομές περιπτώσεων διαβητικής νεφροπάθειας. Έκφραση της έκφρασης CD68(A, B) και MRP8 (C, D) σε ζευγαρωμένα νεφρικά δείγματα (A και C, orB και D). Τα βέλη υποδεικνύουν εντοπισμό των σημάτων CD68 και MRP8.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

Στην προγνωστική μελέτη, η πολυπαραγοντική ανάλυση αποκάλυψε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης στα ούρα ένα χρόνο μετά τη βιοψία νεφρού συσχετίστηκαν ανεξάρτητα με τον αριθμό{0}}θετικών κυττάρων του σπειραματικού MRP, την πρωτεΐνη των ούρων και τη συστολική αρτηριακή πίεση κατά την έναρξη. Αξίζει να σημειωθεί ότι η σπειραματική έκφραση MRP8 έδειξε την ισχυρότερη συσχέτιση με την πρωτεΐνη των ούρων ένα χρόνο αργότερα (b= 0.87), ακόμη πιο ισχυρή από την αρχική πρωτεΐνη των ούρων (b=0.78), με μονομεταβλητή ανάλυση. Οφείλεται εν μέρει στο ότι η σπειραματική έκφραση MRP8 δεν είναι σε μεγάλο βαθμό αυξημένη σε «καλοήθεις» μορφές πρωτεϊνουρίας, όπως αυτές που παρατηρούνται σε ασθενείς με MCNS, των οποίων τα επίπεδα πρωτεϊνουρίας είναι εξαιρετικά υψηλά κατά τη διάγνωση με βιοψία νεφρού, αλλά συνήθως υποχωρούν εντός ενός έτους μετά την έναρξη της ανοσοκατασταλτικής θεραπείας. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η σπειραματική έκφραση MRP8 μπορεί να έχει μια μοναδική προγνωστική φύση ως δείκτης νόσου, η οποία δεν μπορεί να υποκατασταθεί από πρωτεϊνουρία ή παθολογική ανάλυση ρουτίνας που αξιολογεί την σφαιρική σπειραματοσκλήρωση και τη σωληναρισιακή διάμεση ίνωση. Επιπλέον, εικάζουμε ότι η σπειραματική έκφραση MRP8 δεν είναι ένας απλός δείκτης ή ένας παρευρισκόμενος, αλλά ένας ενεργός παίκτης σε σπειραματική βλάβη, όπως συζητείται παρακάτω.

Ο συντελεστής προσδιορισμού (R2) που υπολογίστηκε με τις επεξηγηματικές παραμέτρους που εγγράφηκαν στην ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης ήταν 0.52* και 0.74#, αντίστοιχα. y, χρόνια? ΑΠ, αρτηριακή πίεση; gCr, g κρεατινίνη; T-chol, ολική χοληστερόλη; HDL-Chol, HDL χοληστερόλη; LDL-χολ, LDL χοληστερόλη; GS, σπειραματοσκλήρωση; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Πίνακας 4. Υποανάλυση της σχέσης μεταξύ βασικών κλινικών παραμέτρων και σημάτων MRP8, μετά τον αποκλεισμό της ομάδας MCNS.

Πίνακας 5. Ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης για ταυτοποίηση παραγόντων που προβλέπουν τα επίπεδα πρωτεΐνης στα ούρα 1 έτος μετά τη βιοψία νεφρού

Εικόνα 3. Επιδράσεις του MRP8 σε μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών. Μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών (BMDM) διεγέρθηκαν με ανασυνδυασμένο MRP8 ποντικού για 4 ώρες. Οι ράβδοι σφαλμάτων υποδεικνύουν 95 τοις εκατό CI και οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με μετασχηματισμένες λογαριθμικές τιμές. Η αμφίδρομη ANOVA αποκάλυψε σημαντικές επιδράσεις των γονότυπων, των συγκεντρώσεων MRP8 και των αλληλεπιδράσεών τους για την έκφραση και των 3 γονιδίων (P,0.001 για όλες τις συγκρίσεις). n=4. WT, άγριου τύπου; KO, νοκ άουτ? IL-1b, ιντερλευκίνη 1 βήτα. TNFa, παράγοντας νέκρωσης όγκου-άλφα. *P,0,01 μεταξύ διαφορετικών συγκεντρώσεων, #P,0,01 μεταξύ genotypes.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

Σε μια άλλη προσπάθεια διαχρονικής μελέτης, η ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης απέτυχε να βρει ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες για την εμφάνιση νεφρικού επεισοδίου εντός ενός έτους. Υποθέτουμε ότι αυτό οφείλεται εν μέρει στο ότι η σωληναρισιακή έκφραση του MRP8 και η σωληναρισμενική διάμεση ίνωση ήταν δύο ισχυροί προγνωστικοί παράγοντες για το νεφρικό επεισόδιο σε μονοπαραγοντική ανάλυση, αλλά η σημασία τους ακυρώθηκε μεταξύ τους στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Αυτές οι δύο παράμετροι έδειξαν ισχυρή συσχέτιση (R=0.68, P,0.001) (Εικ. S8), υποδηλώνοντας ότι αυτές οι δύο παράμετροι μπορεί να είναι ισοδύναμες με την πρόβλεψη νεφρικών συμβάντων. Πράγματι, η διάμεση έκφραση MRP8 έδειξε αρκετά παρόμοιο μοτίβο με τη διάμεση ίνωση που αξιολογήθηκε με χρώση τριχρωμίου Masson. Η ποσότητα του ενδιάμεσου MRP8 εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τα θετικά σήματα στα ατροφικά σωληνάρια παρά από αυτά στα μακροφάγα, των οποίων το χαρακτηριστικό διαφέρει από αυτό του σπειραματικού MRP8 σε μια σημαδιακή κατανομή. Επιπλέον, ένα μικρό μέγεθος δείγματος, μια σύντομη περίοδος παρατήρησης και λίγα άτομα που ανέπτυξαν νεφρικά επεισόδια μπορεί να έχουν μειώσει την ισχύ ανίχνευσης. Δεδομένου ότι η έκφραση του MRP8 σε σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα παίζει αιτιολογικό ρόλο στην εξέλιξη της σωληναριδικής φλεγμονής σε ένα μοντέλο νεφρικής ίνωσης σε ποντίκια[7], θα χρειαστεί περαιτέρω ανάλυση για να διευκρινιστεί ο ρόλος του σωληναρισμοειδούς MRP8 στο DN.

Σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη μας [6], το MRP8 mRNA ρυθμίστηκε προς τα πάνω κυρίως στο σπειραματικό κλάσμα των ανθρώπινων ατόμων DN σε σύγκριση με τα άτομα ελέγχου με MGA. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση της πρωτεΐνης MRP8 παρατηρήθηκε όχι μόνο στο σπείραμα αλλά και στο διάμεσο του σωληναρίου. Από αυτή την άποψη, θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπήρχαν δύο διακριτά μοτίβα χρώσης MRP8 στο σωληνάριο διάμεσο του DN. Το ένα ήταν έντονη και εστιακή χρώση σε σοβαρά ατροφικά σωληνάρια. Η άλλη ήταν ήπια χρώση που κατανεμήθηκε κατά μήκος του ορίου της βούρτσας των εγγύς σωληναρίων, η οποία βρέθηκε επίσης σε ORG και MCNS. Τα τελευταία σήματα πιθανότατα αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνη MRP8 που προέρχεται από το αίμα και επαναρροφάται από εγγύς σωληνάρια, τα οποία δεν θα πρέπει να συνοδεύονται από αυξημένη έκφραση mRNA MRP8. Όσον αφορά τις πρωτεΐνες εκτός της MRP8, εμείς και άλλοι αναφέραμε πρόσφατα παρόμοια φαινόμενα ανίχνευσης ανοσοαντιδραστικής πρωτεΐνης στα εγγύς σωληνάρια που προκαλούνται από επαναρρόφηση αλλά όχι από νεφρική σύνθεση [25,26]. Από την άλλη πλευρά, δεδομένου ότι παρέμεινε λίγη χρώση MRP8 στη δοκιμή απορρόφησης αντισωμάτων, ειδικά σε σπειραματικές εξιδρωματικές βλάβες και σοβαρές ουλώδεις, ινώδεις βλάβες γύρω από ατροφικά σωληνάρια, η παρουσία μη ειδικών σημάτων δεν μπορεί να αναιρεθεί πλήρως (Εικ. S3).

Τα σπειραματικά σήματα MRP8 έδειξαν κυρίως σημεία στίξης σε υποκείμενα DN (Εικ. 1, Εικ. S4). Εφόσον και τα δύο CD68 και MRP8 ανιχνεύθηκαν από μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού, ο εντοπισμός αυτών των μορίων αξιολογήθηκε με σειριακές τομές και όχι με διπλή ανοσοχρώση. Τα πρότυπα χρώσης του MRP8 ήταν συμβατά με αυτά σε άλλες φλεγμονώδεις νεφρικές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένης της IgAnephritis [27], της μεμβρανοπολλαπλασιαστικής σπειραματονεφρίτιδας [14] και της σχετιζόμενης με ANCA σπειραματονεφρίτιδα [20], στην οποία τα μακροφάγα προτάθηκαν ως κύρια πηγή MRP8, όπως αναφέραμε στο ένα μοντέλο τρωκτικού [6]. Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως μια άλλη πηγή MRP8 που επηρεάζει τις αγγειακές επιπλοκές [28]. Επί του παρόντος, διερευνούμε τον μοριακό μηχανισμό γιατί το MRP8 ρυθμίζεται κυρίως προς τα πάνω σε κύτταρα μυελοειδούς γενεαλογίας που διεισδύουν σε σπειράματα. Η in vitro μελέτη αποκάλυψε ότι το MRP8 προκάλεσε έκφραση φλεγμονώδους κυτοκίνης και επίσης ενίσχυσε την έκφραση του ίδιου του MRP8 σε μακροφάγους με τρόπο που εξαρτάται από το TLR{18}. Επιπλέον, τα θετικά κύτταρα MRP{19}}απουσίαζαν στις οζώδεις σκληρυντικές βλάβες, υποδηλώνοντας ότι το σπειραματικό MRP8 μπορεί να αντανακλά συνεχιζόμενη σπειραματική βλάβη [20]. Είναι σημαντικό ότι μια μεγαλύτερης κλίμακας ανθρώπινη μελέτη ανέφερε ότι η έκφραση του γονιδίου MRP8 σε μονοπύρηνα κύτταρα αίματος ασθενών με διαβήτη τύπου 1 είναι σημαντικά αυξημένη σε άτομα με διαβητικές επιπλοκές συμπεριλαμβανομένης της νεφροπάθειας [29].

Δεδομένου ότι η αναστολή του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης (RAS) είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας των νεφρικών εκβάσεων, εξετάσαμε τις επιδράσεις του αποκλεισμού RAS στονεφρόΈκφραση MRP8. Δεν βρήκαμε σημαντική διαφορά στην έκφραση mRNA του νεφρού MRP8 μεταξύ ασθενών με DN που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς αποκλεισμό RAS (Εικ. S9), πιθανώς επειδή οι περιπτώσεις που έλαβαν θεραπεία με αποκλεισμό RAS έτειναν να έχουν πιο σοβαρή υπέρταση και πρωτεϊνουρία από τις περιπτώσεις χωρίς αποκλεισμό RAS

Σε παχύσαρκους ανθρώπους και ποντίκια, το αυξημένο σύμπλεγμα MRP8/14 του πλάσματος μπορεί να αντανακλά έναν βαθμόευσαρκίακαι προέρχονται από λιποκύτταρα καθώς και από λευκοκύτταρα [8,9]. Οι περιπτώσεις μας ORG είχαν ήπια χρώση του MRP8 στα εγγύς σωληνάρια, υποδηλώνοντας αυξημένα επίπεδα του MRP8 στο πλάσμα. Αντίθετα, δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του σωληνοειδούς διάμεσου MRP8 και του δείκτη μάζας σώματος (Εικ. S6G). Επομένως, τοπική έκφραση MRP8 στονεφρόμπορεί να χρησιμεύσει καλύτερα ως δείκτης για νεφρική βλάβη παρά γιαευσαρκία[8,9].

Cistanche για τη βελτίωση της νεφρικής δυσλειτουργίας

Η μελέτη μας έχει αρκετούς περιορισμούς. Ο αριθμός των δειγμάτων κάθε ομάδας που μελετήθηκε ήταν μικρός. Μη πανομοιότυπα άτομα εγγράφηκαν στις αναλύσεις mRNA και ανοσοϊστοχημικών. Δεδομένου ότι αναλύσαμε μόνο ασθενείς που υποβλήθηκαν σε βιοψία νεφρού, η σύνθεση των ασθενών που ερευνήθηκαν εδώ μπορεί να μην αντικατοπτρίζει τη σύνθεση των ασθενών με διαβήτη γενικού τύπου 2 ή γενικά σε χρόνια χρόνιανεφρόυποκείμενα της νόσου. Αν και η ηλικία δεν διατηρήθηκε ως ανεξάρτητος παράγοντας που σχετίζεται με τα σήματα MRP8 στα δεδομένα μας (Πίνακας 3), είναι γνωστό ότι η γήρανση σχετίζεται με χρόνια φλεγμονή [30]. Οι επιπτώσεις της ηλικίας δεν μπορούν να αγνοηθούν εντελώς. Αν και τα περισσότερα σήματα MRP8 χάθηκαν στη δοκιμή απορρόφησης αντισωμάτων, παρέμειναν κάποια θετικά σήματα, τα οποία μπορεί να προκληθούν από τη μη ειδική δέσμευση του πρώτου αντισώματος. Όπως συζητήθηκε παραπάνω, η διερεύνηση της νεφρικής έκφρασης MRP8 με νεφρική βιοψία μας βοηθά να κατανοήσουμε την παθοφυσιολογία και την πρόγνωση των χρόνιων νεφρικών παθήσεων, ειδικά που σχετίζονται μεευσαρκίακαι του διαβήτη, αλλά έχει ένα μειονέκτημα για τη συνήθη και επαναλαμβανόμενη χρήση σε εξωτερικά ιατρεία

Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη προτείνει ότι η έκφραση του MRP8 στονεφρόαντανακλά την τρέχουσα παθολογική κατάσταση και επίσης προβλέπει τα νεφρικά αποτελέσματα σε ασθενείς μεευσαρκίαήδιαβήτης τύπου 2. Περαιτέρω έρευνες για τη μελέτη των επιπέδων MRP8 στα ούρα μεταξύ παχύσαρκων ή διαβητικών ασθενών σε μεγάλη κλίμακα μπορεί να δικαιολογούνται

βοηθητικές πληροφορίες

Εικόνα S1 Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες που δείχνουν τομές νεφρικής βιοψίας ενός ασθενούς με DN χρωματισμένο με (Α) περιοδικό οξύ Schiff, (Β) άργυρο μεθεναμίνης περιοδικού οξέος ή (C) τρίχρωμο Masson. Η αναλογία του αριθμού των σπειραμάτων με σφαιρική σκλήρυνση (βέλη) μεταξύ αυτού των ολικών σπειραμάτων και της σχετικής περιοχής της σωληναριδικής διάμεσης ίνωσης ήταν 33 τοις εκατό και 65 τοις εκατό, αντίστοιχα, σε αυτόν τον ασθενή. (ΜΙΚΡΗ ΦΙΛΟΝΙΚΙΑ)

Εικόνα S2 Ανοσοϊστοχημεία για πρωτεΐνες MRP8 και CD68 σε ασθενείς με DN. Οι φωτογραφίες στη δεξιά στήλη δείχνουν πειράματα αρνητικού ελέγχου χωρίς 1ο αντίσωμα. (ΔΕΘ)

Εικόνα S3 Δοκιμή απορρόφησης αντισωμάτων για χρώση MRP8. PBS: αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά, rhMRP8: ανασυνδυασμένο ανθρώπινο MRP8.(TIF)

Εικόνα S4 Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της έκφρασης MRP8 σε ομάδες MGA, MCNS, ORG και DN.(TIF)

Σχήμα S5 Συσχέτιση μεταξύ του σπειραματικού MRP8-θετικού αριθμού κυττάρων και των κλινικών παραμέτρων. Χρησιμοποιήθηκαν οι μετασχηματισμένες λογαριθμικές τιμές των σημάτων MRP8. Οι συσχετίσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας και τις 4 ομάδες (A–D, G) ή 3 ομάδες εξαιρουμένης της ομάδας MCNS (E, F). Ανοιχτοί κύκλοι: μικρή σπειραματική ανωμαλία (MGA), κλειστοί κύκλοι: νεφρωσικό σύνδρομο ελάχιστης αλλαγής (MCNS), ανοιχτά τρίγωνα:ευσαρκία-σχετιζόμενη σπειραματοπάθεια (ORG), κλειστά τρίγωνα: διαβητική νεφροπάθεια (DN).(TIF)

Σχήμα S6 Συσχέτιση μεταξύ της θετικής περιοχής του σωληνοειδούς διάμεσου MRP8- και των κλινικών παραμέτρων. Χρησιμοποιήθηκαν οι μετασχηματισμένες λογαριθμικές τιμές των σημάτων MRP8. Αυτές οι συσχετίσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας και τις 4 ομάδες (A–D, G) ή 3 ομάδες εξαιρουμένης της ομάδας MCNS (E, F).(TIF)

Σχήμα S7 Συσχέτιση μεταξύ σπειραματικής και σωληναριακής διάμεσης έκφρασης MRP8. Χρησιμοποιήθηκαν οι μετασχηματισμένες τιμές καταγραφής των σημάτων MRP8. (TIF)

Σχήμα S8 Συσχέτιση μεταξύ της θετικής περιοχής του σωληνοειδούς διάμεσου MRP8- και της σωληναριδικής διάμεσης ίνωσης. Χρησιμοποιήθηκαν οι μετασχηματισμένες τιμές καταγραφής των σημάτων MRP8.(TIF)

Σχήμα S9 Έκφραση νεφρικού mRNA του MRP8 σε ασθενείς με DN με ή χωρίς αποκλεισμό ρενίνης-αγγειοτενσίνης.NS: μη σημαντικό. n=15 (Ναι), 6 (Όχι). Μεταξύ 22 περιπτώσεων DN, πληροφορίες σχετικά με τη φαρμακευτική αγωγή δεν ήταν διαθέσιμες σε έναν ασθενή.(TIF)

Αρχείο S1 Υποστηρικτικοί πίνακες.

Πίνακας S1, Παθολογικές διαγνώσεις όλων των περιπτώσεων που υποβλήθηκαν σε βιοψία νεφρού στο Τμήμα Ιατρικής και Κλινικής Επιστήμης, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Κιότο μεταξύ 2000 και 2011. Πίνακας S2, Αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών για RT-PCR σε πραγματικό χρόνο TaqMan. Πίνακας S3, Ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης για την εμφάνιση νεφρικού επεισοδίου εντός ενός έτους. (DOC) Ευχαριστίες Ευχαριστούμε με ευγνωμοσύνη τον S. Tanaka για τις στατιστικές συμβουλές, τους Y. Ogawa, N.Igarashi και C. Kimura για την τεχνική βοήθεια και τους A. Yamamoto και SOgino για τη βοήθεια γραμματέα. Συνεισφορές συγγραφέα Σχεδίασε και σχεδίασε τα πειράματα: TK KM MK HY MI AN KNMM. Πραγματοποίησε τα πειράματα: TK HI AI KK TM YK MI AN. Ανάλυσε τα δεδομένα: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Συνεισφερόμενα αντιδραστήρια/υλικά/εργαλεία ανάλυσης: TK KM. Έγραψε το χαρτί: TK KMMM.

Επιδράσεις του cistanche: θεραπεία νεφρικών παθήσεων

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) Ο διαβήτης τύπου 2 ως φλεγμονώδης νόσος. Nat Rev Immunol 11: 98–107.

2. Odink Κ, Cerletti Ν, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L, et αϊ. (1987) Twocalcium-binding proteins in infiltating macrophages of rheumatoid arthritis.Nature 330: 80-82.

3. Vogl Τ, Tenbrock Κ, Ludwig S, Leukert Ν, Ehrhardt C, et αϊ. (2007) Τα Mrp8 καιMrp14 είναι ενδογενείς ενεργοποιητές του υποδοχέα τύπου Toll 4, προάγοντας θανατηφόρο, επαγόμενο από την ενδοτοξίνη σοκ. Nat Med 13: 1042–1049.

4. Croce K, Gao Η, Wang Y, Mooroka T, Sakuma Μ, et al. (2009) Η πρωτεΐνη που σχετίζεται με το μυελοειδές-8/14 είναι κρίσιμη για τη βιολογική απόκριση στην αγγειακή βλάβη. Circulation 120: 427-436.

5. Loser Κ, Vogl Τ, Voskort Μ, Lueken Α, Kupas V, et αϊ. (2010) Οι συνδέτες του υποδοχέα τύπου Toll 4 Mrp8 και Mrp14 είναι κρίσιμοι για την ανάπτυξη αυτοαντιδραστικών CD8 συν Τ κυττάρων. Nat Med 16: 713–717.

6. Kuwabara Τ, Mori Κ, Mukoyama Μ, Kasahara Μ, Yokoi Η, et αϊ. (2012) Η έξαρση της διαβητικής νεφροπάθειας από υπερλιπιδαιμία προκαλείται από τον υποδοχέα τύπου Toll 4 σε ποντίκια. Diabetologia 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) Τα επιθηλιακά κύτταρα του νεφρικού συλλεκτικού πόρου ρυθμίζουν τη φλεγμονή σε σωληναριδική βλάβη σε ποντίκια. J Clin Invest 121: 3425–3441.

8. Sekimoto R, Kishida Κ, Nakatsuji Η, Nakagawa Τ, Funahashi Τ, et αϊ. (2012) Υψηλά κυκλοφορικά επίπεδα συμπλόκου S100A8/A9 (καλπροτεκτίνη) σε αρσενικούς Ιάπωνες με κοιλιακό λίπος και απορρυθμισμένη έκφραση των S100A8 και S100A9 σε λιπώδεις ιστούς παχύσαρκων ποντικών. Biochem Biophys Res Commun 419: 782-789.

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard Ρ, Fischer CP, et al. (2009) Καλπροτεκτίνη—ένας νέος δείκτης τουευσαρκία. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai Ε, Horio Μ, Yasuda Υ, Tomita Κ, et αϊ. (2009) Αναθεωρημένες εξισώσεις για εκτιμώμενο GFR από κρεατινίνη ορού στην Ιαπωνία. Είμαι ο JΝεφρόDis53: 982–992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) Διαβητική νεφροπάθεια: διάγνωση, πρόληψη και θεραπεία. Diabetes Care 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)Ευσαρκία-σχετιζόμενη σπειραματοπάθεια: μια αναδυόμενη επιδημία.ΝεφρόInt 59: 1498–1509.

13. Praga M, Morales E (2006)Ευσαρκία, πρωτεϊνουρία και εξέλιξη της νεφρικής ανεπάρκειας. Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486.

14. Kawasaki Υ, Hosoya Μ, Takahashi Α, Isome Μ, Tanji Μ, et αϊ. (2005) Οι εκφράσεις πρωτεΐνης 8 που σχετίζονται με μυελοειδή σε μακροφάγα είναι ένας χρήσιμος προγνωστικός δείκτης για τη νεφρική δυσλειτουργία σε παιδιά με MPGN τύπου 1. Am JΝεφρόDis 45: 510–518.

15. Nishiyama Α, Konishi Υ, Ohashi Ν, Morikawa Τ, Urushihara Μ, et αϊ. (2011) Το αγγειοτενσινογόνο των ούρων αντανακλά τη δραστηριότητα του ενδονεφρικού συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης σε ασθενείς με νεφροπάθεια IgA. Nephrol Dial Transplant 26: 170–177.

16. Ogawa Υ, Mukoyama Μ, Yokoi Η, Kasahara Μ, Mori Κ, et αϊ. (2012) Ο υποδοχέας του νατριουρητικού πεπτιδίου γουανυλυλ κυκλάση-Α προστατεύει τα ποδοκύτταρα από σπειραματική βλάβη που προκαλείται από την αλδοστερόνη. J Am Soc Nephrol 23: 1198–1209.

17. Yokoi Η, Mukoyama Μ, Mori Κ, Kasahara Μ, Suganami Τ, et αϊ. (2008) Η υπερέκφραση του αυξητικού παράγοντα συνδετικού ιστού στα ποδοκύτταρα επιδεινώνει τη διαβητική νεφροπάθεια σε ποντίκια.ΝεφρόInt 73: 446–455.

18. Hoshino Κ, Takeuchi Ο, Kawai Τ, Sanjo Η, Ogawa Τ, et αϊ. (1999) Αιχμή: Τα ποντίκια με έλλειψη υποδοχέα 4 (TLR4) που μοιάζουν με Toll είναι υπο-ανταποκρινόμενα στον λιποπολυσακχαρίτη: στοιχεία για το TLR4 ως προϊόν γονιδίου Lps. J Immunol162: 3749-3752.

19. Suganami Τ, Tanimoto-Koyama Κ, Nishida J, Itoh Μ, Yuan Χ, et αϊ. (2007) Ο ρόλος του μονοπατιού του υποδοχέα τύπου Toll 4/NF-kappaB στις φλεγμονώδεις αλλαγές που προκαλούνται από κορεσμένα λιπαρά οξέα στην αλληλεπίδραση μεταξύ λιποκυττάρων και μακροφάγων. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84–91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen Ν, et αϊ. (2013) Η έκφραση των λευκοκυττάρων και του ορού S100A8/S100A9 αντικατοπτρίζει τη δραστηριότητα της νόσου στη σχετιζόμενη με ANCA αγγειίτιδα και σπειραματονεφρίτιδα.ΝεφρόInt 83: 1150–1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) Κύριοι παράγοντες κινδύνου για νεφροπάθεια στον σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 είναι τα επίπεδα χοληστερόλης στο πλάσμα, η μέση αρτηριακή πίεση και η υπεργλυκαιμία. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil ΗΑ, Yudkin JS, Matthews DR, et al. (2000) Συσχέτιση της συστολικής αρτηριακής πίεσης με τις μακροαγγειακές και μικροαγγειακές επιπλοκές του διαβήτη τύπου 2 (UKPDS 36): μια προοπτική μελέτη παρατήρησης. BMJ 321: 412-419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Νεφροπάθεια τύπου-2 σακχαρώδη διαβήτη. J Assoc Nephrol 9: 2157–2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Κλινικές και ιστολογικές συσχετίσεις μείωσης της νεφρικής λειτουργίας σε διαβητικούς ασθενείς με πρωτεϊνουρία. Diabetes 43: 1046–1051.

25. Matsusaka Τ, Niimura F, Shimizu Α, Pastan Ι, Saito Α, et αϊ. (2012) Το λιβεραγγειοτενσινογόνο είναι η κύρια πηγή νεφρικής αγγειοτενσίνης II. J Am Soc Nephrol23: 1181–1189.

26. Kuwabara Τ, Mori Κ, Mukoyama Μ, Kasahara Μ, Yokoi Η, et αϊ. (2009) Τα επίπεδα λιποκαλίνης που σχετίζονται με τη ζελατινάση των ουδετερόφιλων ούρων αντικατοπτρίζουν βλάβη στα σπειράματα, στα εγγύς σωληνάρια και στους απομακρυσμένους νεφρώνες.ΝεφρόInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y, et al. (2009) Συσσώρευση μακροφάγων που εκφράζουν πρωτεΐνη 8 που σχετίζεται με το μυελοειδή που σχετίζεται με την εξέλιξη των σκληρωτικών αλλαγών σε παιδιά με νεφροπάθεια IgA.Tohoku J Exp Med 218: 49-55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, et al. (2013) Η υπεργλυκαιμία προάγει τη μυελοποίηση και μειώνει την επίλυση της αθηροσκλήρωσης. Cell Metab 17: 695–708.

29. Jin Y, Sharma Α, Carey C, Hopkins D, Wang X, et αϊ. (2013) Η έκφραση των φλεγμονωδών γονιδίων ρυθμίζεται προς τα πάνω στο περιφερικό αίμα ασθενών με διαβήτη τύπου 1. Φροντίδα Διαβήτη.

30. Longo VD, Finch CE (2003) Εξελικτική ιατρική: από συστήματα νάνων μοντέλων σε υγιείς αιωνόβιους; Science 299: 1342–1346.

Αναφορά: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) Predictive Significance ofΝεφρόΈκφραση πρωτεΐνης 8 που σχετίζεται με μυελοειδή σε ασθενείς μεΕυσαρκία- ή νεφρικές παθήσεις που σχετίζονται με διαβήτη τύπου 2. PLoS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Επιμέλεια: Utpal Sen, University of Louisville, Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής

Λήψη 11 Σεπτεμβρίου 2013. Αποδεκτό στις 14 Ιανουαρίου 2014. Δημοσιεύθηκε στις 18 Φεβρουαρίου 2014

Πνευματικά δικαιώματα: 2014 Kuwabara et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται σύμφωνα με τους όρους της Άδειας Αναφοράς Creative Commons, η οποία επιτρέπει την απεριόριστη χρήση, διανομή και αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​υπό την προϋπόθεση ότι αναφέρεται ο αρχικός συγγραφέας και η πηγή.

Χρηματοδότηση: Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε εν μέρει από Grant-in-Aid for Diabetic Nephropathy and Nephrosclerosis Research από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας (στο KM), ερευνητικές επιχορηγήσεις από το ιαπωνικό Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστήμης , και Technology (στο TK, KM και MM), από το Japan Foundation for Applied Enzymology (στο TK) και από το Smoking Research Foundation (στο MM). Οι χρηματοδότες δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και την ανάλυση, την απόφαση για δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

* E-mail: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp