Πρόβλεψη του ρόλου του LncRNA στη γήρανση των νεφρών με βάση την αλληλουχία RNA Ⅱ

Συσχέτιση του lncRNA Gm43360 και των πιθανών mRNA στόχων του

Το LncRNA Gm43360 επιλέχθηκε για μελέτη επειδή συνέδεσε δύο δίκτυα συνέκφρασης lncRNA-mRNA. Το επίπεδο έκφρασης του Adra1a συσχετίστηκε θετικά (rho=0.8650, p=0.026) με αυτό του Gm43360, το Csnk1a1 (κινάση καζεΐνης 1A1) συσχετίστηκε αρνητικά (rho{{12 }}.8084, σελ=0.0084) (Εικ. 5α). Για την περαιτέρω επαλήθευση της συσχέτισης του lncRNA Gm43360 και των δυνητικών στοχευόμενων mRNA Adra1a και Csnk1a1, σχεδιάστηκε σε αυτή τη μελέτη ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης του lncRNA Gm43360. Η έκφραση του Csnk1a1 μειώθηκε όπως αναμενόταν και η έκφραση Adra1a επίσης μειώθηκε, αλλά όχι σημαντικά. Στη συνέχεια, καταρρίψαμε το lncRNA Gm43360 από το siRNA για να ανιχνεύσουμε εάν επηρεάστηκε η έκφραση των mRNA-στόχων του. Όπως αναμενόταν, το Csnk1a1 αυξήθηκε σε κύτταρα lncRNA Gm43360 knockdown σε σχέση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου siRNA (Εικ. 5β). Δέκα, εντοπίσαμε το ρόλο του lncRNA Gm43360 στον κυτταρικό κύκλο. Τα αποτελέσματα του κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8) έδειξαν ότι το lncRNA Gm43360 προώθησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 5γ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το lncRNA Gm43360 αύξησε το ποσοστό των κυττάρων φάσης S και μείωσε το ποσοστό των κυττάρων φάσης G1 σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (Εικ. 5δ). Οι πρωτεΐνες p53 και p21 συμμετείχαν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και έτσι ήταν τα σημάδια της γήρανσης των κυττάρων. Τα επίπεδα έκφρασης των p53 και p21 μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα υπερέκφρασης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Τα επίπεδα έκφρασης των p53 και p21 αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα siRNA σε σχέση με την ομάδα ελέγχου siRNA (Εικ. 5e). Η υπερέκφραση του lncRNA Gm43360 μείωσε τον αριθμό των SA- -θετικών κυττάρων σε gal και τα θετικά σε -gal κύτταρα αυξήθηκαν στην ομάδα των επιμολυνθέντων Gm43360 (Εικ. 5στ). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το lncRNA Gm43360 ανέστειλε τη γήρανση των νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων μεαναστέλλοντας την έκφραση του Csnk1a1.

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΝΑ ΠΑΡΕΤΕ ΦΥΣΙΚΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 25% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 9% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ ΓΙΑ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε τα δεδομένα έκφρασης mRNA από νεαρούς και ηλικιωμένους νεφρούς ποντικιών και πραγματοποιήσαμε αναλύσεις βιοπληροφοριών που αποκάλυψαν τις λειτουργίες των mRNA που εκφράζονται ανώμαλα. Παρατηρήσαμε 347 ρυθμισμένα προς τα πάνω mRNA και 355 προς τα κάτω ρυθμισμένα mRNA καθώς και 130 ρυθμισμένα προς τα πάνω lncRNA και 91 προς τα κάτω ρυθμισμένα lncRNAνεφροί παλιών ποντικών σε σύγκριση με νεφρούς νεαρών ποντικών. Επιπλέον, αυτά τα mRNAs αποδείχθηκε ότι εμπλέκονται σε μονοπάτια που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως π.χοξειδωτική φωσφορυλίωση, το μονοπάτι σηματοδότησης AMPK, το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, το μονοπάτι σηματοδότησης Rap1 και ασθένεια που σχετίζεται με την ηλικία, που κατέδειξε τις λειτουργίες των διαφορικά εκφραζόμενων mRNAs στην παθογένεση της νεφρικής γήρανσης.

Το μακρύ μη κωδικοποιητικό RNA NEAT1 είναι ένας προστατευτικός παράγοντας στην εξέλιξη της ίνωσης των νεφρών σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρικών σωληναριακών [21]. Συμπτωματικά, στα αποτελέσματα της αλληλουχίας μας, το lncRNA NEAT1 εκφράστηκε σε χαμηλότερα επίπεδα στους νεφρούς ηλικιωμένων ποντικών από ό,τι σε νεαρά ποντίκια, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα. Το LincRNA-Gm4419 επιταχύνει τη φλεγμονή και την ίνωση από τους μηχανισμούς που προκαλούνται από το φλεγμονώδες NF-kB/NLRP3 στη διαβητική νεφροπάθεια [22]. Στα αποτελέσματα της αλληλουχίας μας, διαπιστώσαμε επίσης ότι η έκφραση του Gm4419 ήταν υψηλότερη στους νεφρούς ηλικιωμένων ποντικών από ό,τι σε νεαρά ποντίκια, αλλά δεν υπήρχε σημαντική διαφορά. Το LncRNA Gm43360 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 5 (Chr5:122494022–122494908, 2887 bp). Σύμφωνα με το UCSC Genome Browser, το Gm43360 βρίσκεται στο εσώνιο του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Atp2a2. Ωστόσο, δεν έχουν υπάρξει αναφορές για τη συμμετοχή του lncRNA Gm43360 σε ασθένειες μέχρι σήμερα. Σε αυτή τη μελέτη, η καταστροφή του lncRNA Gm43360 προώθησε τη γήρανση των νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, εντοπίσαμε πολλά διαφορικά εκφραζόμενα lncRNA στα αποτελέσματα αλληλουχίας και τα διερευνήσαμε.

Τα LncRNA ταξινομήθηκαν σε cis-regulation ή trans-regulation με βάση τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς lncRNA. Τα lncRNA που δρουν Cis θα μπορούσαν να επηρεάσουν την έκφραση των γειτονικών γονιδίων εξαρτώντας από στοιχεία που δρουν cis, όπως προαγωγείς, ενισχυτές και ρυθμιστικές αλληλουχίες, οι οποίες είναι αποστάσεις μεταξύ lncRNA και mRNA μικρότερες από 100 kb. Τα τρανς-δρώντα lncRNA αναφέρονται σε lncRNA που εγκαταλείπουν τη θέση της επιμόλυνσης και λειτουργούν σε απομακρυσμένες θέσεις (δηλαδή, η απόσταση μεταξύ lncRNA και mRNA είναι μεγαλύτερη από 100 kb) [23]. Το lncRNA MAAT αυξάνει την έκφραση του γειτονικού γονιδίου Mbnl1 μέσω μιας ρυθμιστικής ενότητας cis [24]. Το lncRNA Pnky παίζει ρόλο ως ρυθμιστής trans-δράσης στην ανάπτυξη του φλοιού [25]. Σε αυτή τη μελέτη, υπήρχε μια διαρυθμιστική σχέση μεταξύ του lncRNA Gm43360 και του Csnk1a1. Το Csnk1a1 είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο [26] που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που συμμετέχει στον κυτταρικό κύκλο και τη διαδικασία κυτταρικής διαίρεσης [27]. Η καθοδική ρύθμιση Csnk1a1 προκαλείφλεγμονώδης που σχετίζεται με τη γήρανσηαπόκριση με διακοπή ανάπτυξης σε όγκους του παχέος εντέρου [26]. Το Csnk1a1 ρυθμίστηκε προς τα κάτω όταν το Gm43360 ρυθμίστηκε προς τα πάνω. Έτσι, είναι πιθανό να συμμετέχει το lncRNA Gm43360γήρανση των νεφρώνμερυθμίζοντας την έκφραση Csnk1a1.

συμπεράσματα

Η έρευνά μας για το δίκτυο συνέκφρασης lncRNA-mRNA στογήρανση των νεφρώναποκάλυψε ένα lncRNA, το lncRNA Gm43360, μπορεί να διαδραματίσει προστατευτικό ρόλο στη γήρανση των νεφρών και διεύρυνε την κατανόησή μας για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται σεγήρανση των νεφρών

Υλικά και μέθοδοι

Δείγματα Νεαρά ({0}}μηνών) και μεγάλα (24-μηνών) αρσενικά ποντίκια C57BL/6J αγοράστηκαν από το Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Πανεπιστημίου Xiamen και ανατράφηκαν σε ένα τυπικό περιβάλλον. Όλα τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Τα ποντίκια εγκλιματίστηκαν στη νέα εγκατάσταση για ένα μήνα πριν θυσιαστούν. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ουρεθάνη με ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε δόση 750 mg/kg πριν από τη συλλογή του δείγματος. Μικρά και μεγάλα ποντίκια θυσιάστηκαν την ίδια μέρα.Υπολειμματικό νεφρό ποντικούιστός χρησιμοποιήθηκε για αλληλούχιση σε κάθε δοκιμασία. Πραγματοποιήθηκαν RNA-seq και ιστοπαθολογίαχωριστούς νεφρούςαπό το ίδιο ποντίκι. Συλλέχθηκε νεφρικός ιστός από ποντίκια. Ο ένας νεφρός βυθίστηκε αμέσως σε φορμαλίνη με ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα 10% για την επακόλουθη ενσωμάτωση του τμήματος και ο άλλος νεφρός χωρίστηκε σε πολλούς ιστούς και τοποθετήθηκε αμέσως σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε σε -80 βαθμό . Η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πρώτου Συνεργαζόμενου Νοσοκομείου του Πανεπιστημίου Xi'an Jiaotong (Shaanxi, Κίνα) (αρ. 2018-G-164). Όλες οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες και τους κανονισμούς για τη δεοντολογία των ζώων. Αυτή η μελέτη διεξήχθη σε συμμόρφωση με τις οδηγίες του ARRIVE.

Ιστοπαθολογία νεφρού

Δείγματα νεφρικού ιστού νεαρών και ηλικιωμένων ποντικών σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 10% όλη τη νύχτα. Δέκα από τα τμήματα αφυδατώθηκαν, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και κόπηκαν σε πάχος 4-μm. Η τριχρωματική χρώση PAS και Masson διεξήχθη χρησιμοποιώντας τυπικά πρωτόκολλα. Οι εικόνες καταγράφηκαν από την κάμερα και μετρήθηκε η θετική στη χρώση περιοχή. Η περιοχή για τις εικόνες της ιστοπαθολογικής κάμερας υπολογίστηκε με το Image-Pro Plus 6.0.

Χρώση SA‑ ‑gal

Η δραστηριότητα SA{{0}}gal αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ χρώσης SA- -gal (Cell Signaling Technology #9860) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετρήθηκε η περιοχή θετικής χρώσης και υπολογίστηκαν SA- -θετικά σε gal κύτταρα χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0.

Κατασκευή και αλληλούχιση βιβλιοθήκης εξαγωγής RNA

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή μιας βιβλιοθήκης αλληλουχίας. Μετά την εκχύλιση του ολικού RNA, το mRNA καθαρίστηκε από το ολικό RNA (5 μg) χρησιμοποιώντας Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) με δύο γύρους καθαρισμού. Μετά τον καθαρισμό, το mRNA διαιρέθηκε σε μικρά θραύσματα χρησιμοποιώντας δισθενή κατιόντα σε υψηλές θερμοκρασίες (Μονάδα κατακερματισμού RNA μαγνησίου (NEB, κατ. e6150, ΗΠΑ) κάτω από 94 βαθμούς 5-7 λεπτά). Στη συνέχεια, τα διασπασμένα θραύσματα RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα για να ληφθεί το cDNA από SuperScript™ II Αντίστροφη Μεταγραφάση (Invitrogen, κατ. 1.896.649, USA), τα οποία στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση σημασμένων U-επισημασμένων δευτεροκλώνων DNA με E. coli DNA πολυμεράση Ι ( NEB, cat.m0209, USA), RNase H (NEB, cat.m0297, USA) και dUTP Solution (Termo Fisher, cat.R0133, USA). Στη συνέχεια προστέθηκε μια βάση Α στα αμβλέα άκρα κάθε κλώνου, προετοιμάζοντάς τα για σύνδεση με τους προσαρμογείς με δείκτη. Κάθε προσαρμογέας περιείχε μια προεξοχή βάσης Τ για την απολίνωση του προσαρμογέα στο τεμαχισμένο DNA με ουρά Α. Προσαρμογείς διπλού δείκτη συνδέθηκαν στα θραύσματα και η επιλογή μεγέθους πραγματοποιήθηκε με σφαιρίδια AMPureXP. Μετά την επεξεργασία του ενζύμου UDG (NEB, cat.m0280, USA) των σημασμένων με U-επισήμανση δεύτερων κλώνων DNA, τα συνδεδεμένα προϊόντα ενισχύθηκαν με PCR με τις ακόλουθες συνθήκες: αρχική μετουσίωση στους 95 βαθμούς για 3 λεπτά. 8 κύκλοι μετουσίωσης στους 98 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 60 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 βαθμούς για 30 δευτερόλεπτα. και στη συνέχεια τελική επέκταση στους 72 βαθμούς για 5 λεπτά. Το μέσο μήκος εισαγωγής για τις τελικές βιβλιοθήκες cDNA ήταν 300±50 bp. Τέλος, πραγματοποιήσαμε την αλληλουχία ζευγαριού άκρου 2×150 bp (PE150) σε ένα Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή [28].

Βιοπληροφορική ανάλυση Ακολουθία και φιλτράρισμα καθαρών αναγνώσεων

Μια βιβλιοθήκη cDNA που κατασκευάστηκε με τεχνολογία από το συγκεντρωμένο RNA απόδείγματα νεφρώντων ποντικών αναλύθηκε η αλληλουχία και εκτελέστηκε με την πλατφόρμα ακολουθίας Illumina NovaseqTM 6000. Χρησιμοποιώντας την προσέγγιση RNA-seq ζευγαριού άκρου Illumina, προσδιορίσαμε την αλληλουχία του μεταγραφώματος, δημιουργώντας συνολικά εκατ. lon 2×150 bp αναγνώσεις ζευγαριού άκρου. Οι αναγνώσεις που λαμβάνονται από τις μηχανές προσδιορισμού αλληλουχίας περιλαμβάνουν ακατέργαστες αναγνώσεις που περιέχουν προσαρμογείς ή βάσεις χαμηλής ποιότητας που θα επηρεάσουν την ακόλουθη συναρμολόγηση και ανάλυση. Έτσι, για να έχετε καθαρές αναγνώσεις υψηλής ποιότητας, οι αναγνώσεις φιλτραρίστηκαν περαιτέρω από το Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, έκδοση:cutadapt-1.9). Οι παράμετροι ήταν οι εξής:

1) αφαίρεση ενδείξεων που περιέχουν προσαρμογείς.

2) αφαίρεση ενδείξεων που περιέχουν polyA και poly.

3) αφαίρεση αναγνώσεων που περιέχουν περισσότερο από 5% άγνωστων νουκλεοτιδίων (Ν).

4) αφαίρεση αναγνώσεων χαμηλής ποιότητας που περιέχουν περισσότερο από 20% βάσεων χαμηλής ποιότητας (τιμή Q Μικρότερη ή ίση με 20).

Η ποιότητα των δέκα ακολουθιών επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας το FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). συμπεριλαμβανομένου του περιεχομένου Q20, Q30 και GC των καθαρών δεδομένων. Μετά από αυτό, παρήχθησαν συνολικά G bp καθαρισμένων, ζευγαρωμένων αναγνώσεων. Τα ακατέργαστα δεδομένα ακολουθίας έχουν υποβληθεί στα σύνολα δεδομένων NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) με αριθμό πρόσβασης GSE154223.

Το γονιδίωμα/σχολιασμός αναφοράς ήταν Mus_musculus.GRCm38. Η πηγή και η έκδοση του σχολιασμού γονιδίου που χρησιμοποιήθηκε για τις αναλύσεις ήταν το Ensembl_v88.

Συναρμολόγηση μεταγραφών

Πρώτον, το Cutadapt [29] χρησιμοποιήθηκε για την αφαίρεση των αναγνώσεων που περιείχαν μόλυνση προσαρμογέα, βάσεις χαμηλής ποιότητας και απροσδιόριστες βάσεις. Η ποιότητα δέκα ακολουθιών τροφοδοτήθηκε πολύ χρησιμοποιώντας το FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Χρησιμοποιήσαμε το Bowtie2 [31] και το Hisat2 [32] για να χαρτογραφήσουμε τις αναγνώσεις στο γονιδίωμα του ποντικιού. Οι αντιστοιχισμένες αναγνώσεις κάθε δείγματος συγκεντρώθηκαν χρησιμοποιώντας το StringTie [33]. Δέκα, όλες οι μεταγραφές απόδείγματα νεφρώνσυγχωνεύτηκαν για να ανακατασκευάσουν ένα περιεκτικό μεταγραφικό χρησιμοποιώντας σενάρια Perl. Μετά τη δημιουργία του τελικού μεταγραφώματος, χρησιμοποιήθηκαν τα StringTie [33] και edgeR [34] για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης όλων των μεταγραφών.

Αναγνώριση LncRNA

Πρώτα απ 'όλα, απορρίφθηκαν μεταγραφές που επικαλύπτονταν με γνωστά mRNA και μεταγραφές μικρότερες από 200 bp. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το CPC [35] και το CNCI [36] για να προβλέψουμε μεταγραφές με δυνατότητα κωδικοποίησης. Όλες οι μεταγραφές με βαθμολογία CPC<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Ανάλυση γονιδίων ανάλυσης διαφορικής έκφρασης (DGEs).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένα γονίδια.

Πρόβλεψη γονιδίου στόχου και λειτουργική ανάλυση lncRNAs

Για να διερευνήσουμε τη λειτουργία των lncRNAs, προβλέψαμε τα γονίδια-στόχους cis των lncRNAs. Τα LncRNA μπορεί να παίζουν ρόλο cis στην δράση σε γειτονικά γονίδια στόχους. Σε αυτή τη μελέτη, τα γονίδια που κωδικοποιούν σε 100,000 ανάντη και κατάντη επιλέχθηκαν με το σενάριο Perl. Στη συνέχεια, δείξαμε μια λειτουργική ανάλυση των γονιδίων-στόχων για lncRNAs χρησιμοποιώντας τα σενάρια BLAST2GO [39]. Ο πλήρης σύνδεσμος εντολών στον δημόσιο τομέα ήταν Jie-Li/README.md στο main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Κατηγορίες γονιδιακής οντολογίας (GO) και ανάλυση Κιότο Εγκυκλοπαίδεια Γονιδίων και Γονιδιωμάτων (KEGG)

Η βιοπληροφορική ανάλυση για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εργαλεία OmicStudio (http://www.omicsudio. cn/tool). Η ανάλυση λειτουργικού εμπλουτισμού Gene Ontology (GO) και η ανάλυση εμπλουτισμού της Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [37–39] χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των βιολογικών λειτουργιών των προβλεπόμενων γονιδίων-στόχων. Η ανάλυση GO αποσαφηνίζει τις κύριες βιολογικές διεργασίες μέσω τριών πτυχών: σύνθεση κυττάρων, μοριακές λειτουργίες και βιολογικές διεργασίες (http://www.geneontology. org/). Η ανάλυση τοποθετεί πρώτα όλα τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια και τα γονίδια υποβάθρου στη βάση δεδομένων GO. Κάθε στοιχείο χαρτογραφείται, υπολογίζεται ο αριθμός των γονιδίων σε κάθε στοιχείο και η υπεργεωμετρική κατανομή χρησιμοποιείται για την εκτέλεση δοκιμής υποθέσεων για να ληφθεί η τιμή P του αποτελέσματος εμπλουτισμού. Όσο χαμηλότερη είναι η τιμή P, τόσο πιο σημαντικό είναι το αποτέλεσμα εμπλουτισμού. Το KEGG είναι ένας πόρος βάσης δεδομένων που αναλύει τα διαφορικά εκφραζόμενα mRNA από τη γενετική βιολογία για να διερευνήσει σημαντικά μονοπάτια που σχετίζονται με τα γονίδια-στόχους (https://www.genome.jp/kegg/). Τα αποτελέσματα εκφράζονται με τιμές p. Όσο χαμηλότερη είναι η τιμή p, τόσο πιο σημαντικό είναι το αποτέλεσμα εμπλουτισμού.

qRT–PCR

Το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος. Στη συνέχεια, υπολογίστηκαν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης άγνωστων γονιδίων. Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν ειδικά για αυτό το πείραμα. Οι εκκινητές για GAPDH έχουν κυκλοφορήσει στο εμπόριο. Η ειδικότητα των εκκινητών Adra1a και Csnk1a1 αναγνωρίστηκε από τη μοναδική κορυφή της καμπύλης τήγματος.

Δημιουργία δικτύου συνέκφρασης mRNA-lncRNA

Η μεταρρύθμιση βασίστηκε σε έρευνα και στη συνέχεια υπολογίστηκε η τρανς ενέργεια. Όσο μικρότερη ήταν η τρανς ενέργεια, τόσο μεγαλύτερη ήταν η πιθανότητα δέσμευσης. Στη συνέχεια, υπολογίστηκε και ο συντελεστής συσχέτισης του mRNA-lncRNA. Το δίκτυο mRNA-lncRNA κατασκευάστηκε επιλέγοντας έναν συντελεστή συσχέτισης Spearman που υπερβαίνει το 0.9. Το δίκτυο συνέκφρασης mRNA-lncRNA κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Cytoscape (v3.7.1).

Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα εγγύς νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού (MRPT-EpiCs) καλλιεργήθηκαν σε μέσο επιθηλιακών κυττάρων ζώου (EpiCM-a, Κατ. #4131) που περιείχε 2% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Κατ. #0010) και Συμπλήρωμα Ανάπτυξης Επιθηλιακών Κυττάρων-ζώο (EpiCGS-a, Κατ. #4182) χωρίς αντιβιοτικά σε υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 βαθμούς και 5% CO2. Το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε 2-3 ημέρες. Τα κύτταρα στη φάση της λογαριθμικής ανάπτυξης υποκαλλιεργήθηκαν όταν η ανάπτυξη έφτασε το 90%. Το κυτταρικό εναιώρημα που χωνεύτηκε από θρυψίνη σπάρθηκε σε 6-πλάκες με 2*104 -5*104 κύτταρα σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τη διαμόλυνση ήταν όλα μεταξύ των γενεών 2 και 5.

Κατασκευή πλασμιδίου και επιμόλυνση κυττάρων

Το πλασμίδιο υπερέκφρασης lncRNA Gm43360 κατασκευάστηκε από την GeneChem (Σαγκάη, Κίνα). Η ραχοκοκαλιά του πλασμιδίου ήταν GV658 και ο προαγωγέας CMV οδήγησε την έκφραση lncRNA. Η κλωνοποιημένη νουκλεοτιδική αλληλουχία παρέχεται στο συμπληρωματικό υλικό. Για το knockdown lncRNA Gm43360, τρία lncRNA ENS ΠΡΕΠΕΙ00000197656-να στοχεύουν τα siRNA (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'CUGURCACC Το UGAAGUUTT-3' και το lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν στη GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 2500 ng πλασμιδίου ή 100 pmol siRNA με 6 μΙ αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, USA) ανά φρεάτιο. Τα επίπεδα έκφρασης RNA και πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Χρησιμοποιήθηκε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο για την επικύρωση της αποτελεσματικότητας της υπερέκφρασης και του knockdown του lncRNA Gm43360.

Ανάλυση Western blot

Τα καλλιεργημένα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, προστέθηκαν 120 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος RIPA (Heart, China) και προστέθηκαν αναστολέας πρωτεάσης και PMSF (Heart, China) για 30 λεπτά σε πάγο. Μετά τη συλλογή κυττάρων σε διαφορετικούς σωλήνες μικροφυγοκέντρησης, η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά. Προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης σε κάθε δείγμα και στη συνέχεια βράστηκε για 7 λεπτά. Τριάντα μικρογραμμάρια του δείγματος διαχωρίστηκαν με 12% SDS–PAGE (Beyotime, Κίνα) και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Thermo Fisher, ΗΠΑ). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με γάλα 5%. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με συγκεκριμένα πρωτογενή αντισώματα: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) και anti-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς . Μετά από πλύση με TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ζώνες πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ χημειοφωταύγειας (Millipore, ΗΠΑ). Η έκφραση της GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την ομαλοποίηση των επιπέδων πρωτεΐνης.

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων

Η ικανότητα πολλαπλασιασμού κυττάρων προσδιορίστηκε από τη δοκιμασία κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8). Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη διαμόλυνση, 90 μΙ νέου μέσου και 10 μΙ διαλύματος CCK-8 προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο (Beyotime, C0042). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 1-4 ώρες στους 37 βαθμούς σε 5% CO2 και μετρήθηκαν στα 450 nm από έναν καθολικό αναγνώστη μικροπλακών (Bio-Tek, ΗΠΑ).

Κυτταρομετρική ανάλυση ροής

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίου την ημέρα πριν από τη διαμόλυνση. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θρυψίνη και φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε αιθανόλη 70% στους 4 βαθμούς για τουλάχιστον 4 ώρες. Μετά τη φυγοκέντρηση, το διάλυμα χρώσης RNase A και ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) προστέθηκε στα κύτταρα και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα κύτταρα που χρωματίστηκαν με Te αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ACEA NovoCyte (Biosciences, USA).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα μέτρησης με την κανονική κατανομή παρουσιάζονται ως η μέση τιμή±SD. Η διαφορά μεταξύ των δύο διαφορετικών ομάδων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωτά Student's t-tests και μια τιμή p < 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλοι οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Κυτταρική γήρανση στο νεφρό. J Am Soc Nephrol. 2019; 30 (5): 726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Αντιμετωπίζοντας τις παγκόσμιες προκλήσεις της γήρανσης. Φύση. 2018;561(7721):45–56.

3. Παν JX. Το LncRNA H19 προάγει την αθηροσκλήρωση ρυθμίζοντας τις οδούς σηματοδότησης MAPK και NF-kB. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017; 21 (2): 322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Το Long non-coding RNA HOTAIR οδηγεί την ενεργοποίηση των μυοϊνοβλαστών EZH2-εξαρτώμενη στη συστηματική σκλήρυνση μέσω της εξαρτώμενης από το miRNA 34a ενεργοποίησης του NOTCH. Ann Rheumatic Dis. 2020; 79 (4): 507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et al. Το LncRNA-p21 μεταβάλλει τη νευροενδοκρινική διαφοροποίηση του καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από το αντιανδρογόνο enzalutamide μέσω της διαμόρφωσης της σηματοδότησης EZH2/STAT3. Nat Commun. 2019; 10 (1): 2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et al. Ένα νέο lncRNA MCM3AP-AS1 προάγει την ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος στοχεύοντας τον άξονα miR-194-5p/FOXA1. Μολ Καρκίνος. 2019; 18 (1): 28.

7. Wu YY, Kuo HC. Λειτουργικοί ρόλοι και δίκτυα μη κωδικοποιητικών RNA στην παθογένεση νευροεκφυλιστικών ασθενειών. J Biomed Sci. 2020; 27 (1): 49.

8. Li Z, Wang Z. Γήρανση των νεφρών και ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση. Adv Experiment Med Biol. 2018; 1086:169–87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rule AD. Η ηλικία, η νεφρική λειτουργία και οι παράγοντες κινδύνου σχετίζονται διαφορετικά με τους όγκους του φλοιού και του μυελού του νεφρού. Kidney Int. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. Το LncRNA HOTAIR στοχεύει το miR-126-5p για την προώθηση της εξέλιξης της νόσου του Πάρκινσον μέσω του RAB3IP. Biol Chem. 2019; 400 (9): 1217–28.

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop