Το AKT που ενεργοποιείται με προετοιμασία προετοιμασίας ελέγχει τη νευρωνική ανοχή στην ισχαιμία μέσω της οδού MDM2–p53Ⅰ

Αφηρημένη

Ένας από τους πιο σημαντικούς μηχανισμούς νευροπροστασίας με τη μεσολάβηση της προετοιμασίας είναι η εξασθένηση της κυτταρικής απόπτωσης, που προκαλεί ανοχή του εγκεφάλου μετά από επακόλουθη τραυματική ισχαιμία. Σε αυτό το πλαίσιο, η αντιαποπτωτική οδός σηματοδότησης PI3K/AKT παίζει βασικό ρόλο στη ρύθμιση της διαφοροποίησης και της επιβίωσης των κυττάρων.

Κάντε κλικ στο cistanche tubulosa σε σκόνη γιανευροπροστασία

Το ενεργό AKT είναι γνωστό ότι αυξάνει την έκφραση της διπλής λεπτής-2 (MDM2) ποντικού, μιας λιγάσης Ε3-ουβικιτίνης που αποσταθεροποιεί την ρ53 για να προάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Στους νευρώνες, δείξαμε πρόσφατα ότι η αλληλεπίδραση MDM2-p53 ενισχύεται από τη φαρμακολογική προετοιμασία, με βάση την υποτοξική διέγερση του υποδοχέα γλουταμικού NMDA, ο οποίος αποτρέπει την απόπτωση των νευρώνων που προκαλείται από ισχαιμία.

Ωστόσο, αν αυτός ο μηχανισμός συμβάλλει στην ανοχή των νευρώνων κατά τη διάρκεια της ισχαιμικής προετοιμασίας (IPC) είναι άγνωστο. Εδώ, δείχνουμε ότι η IPC προκάλεσε φωσφορυλίωση του AKT με τη μεσολάβηση PI3K στο Ser473, το οποίο με τη σειρά του φωσφορυλίωσε το MDM2 στο Ser166. Αυτή η φωσφορυλίωση πυροδότησε την πυρηνική σταθεροποίηση του MDM2, οδηγώντας σε αποσταθεροποίηση της ρ53, αποτρέποντας έτσι την απόπτωση των νευρώνων σε μια ισχαιμική προσβολή. Η αναστολή της οδού PI3K/AKT με wortmannin ή με σίγαση AKT προκάλεσε τη συσσώρευση του κυτταροπλασματικού MDM2, καταργώντας την επαγόμενη από IPC νευροπροστασία.

Έτσι, το IPC ενισχύει την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης PI3K/AKT και προάγει τη νευρωνική ανοχή ελέγχοντας την αλληλεπίδραση MDM2-p53. Τα ευρήματά μας παρέχουν ένα νέο μηχανιστικό μονοπάτι που εμπλέκεται στην επαγόμενη από IPC νευροπροστασία μέσω διαμόρφωσης της σηματοδότησης AKT, υποδηλώνοντας ότι το AKT είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος κατά της ισχαιμικής βλάβης. Λέξεις-κλειδιά: ΑΚΤ; MDM2; p53; PI3K; ισχαιμική ανοχή; προετοιμασία

1. Εισαγωγή

Στους ανθρώπους, η ύπαρξη παροδικού ισχαιμικού επεισοδίου (TIA) έχει αποκαλυφθεί ως μια ενδογενής προκαθορισμένη κατάσταση με τα οφέλη των λειτουργικών αποτελεσμάτων σε ασθενείς με εγκεφαλικό [1-3]. Η ενδογενής νευροπροστασία που προκαλείται από ένα σύντομο, υποτοξικό ισχαιμικό ερέθισμα, γνωστό ως ισχαιμική προετοιμασία (IPC), θεωρείται στρατηγική στον αναδυόμενο τομέα της νευροπροστασίας έναντι της ισχαιμικής βλάβης [4-6].

Τα στοιχεία δείχνουν ότι η προαγόμενη από την IPC νευροπροστασία εξαρτάται από μεταγραφικούς, μεταφραστικούς και μετα-μεταφραστικούς μηχανισμούς, οι οποίοι αλλάζουν τη λειτουργία των βασικών πρωτεϊνών μετά την ισχαιμία [6-11]. Ωστόσο, ο μηχανισμός που εμπλέκεται στην επαγόμενη από την IPC ισχαιμική ανοχή (ΙΤ) δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως στον ανθρώπινο εγκέφαλο [12,13].

Η ανάπτυξη νέων πειραματικών προσεγγίσεων για την κατανόηση της νευροπροστασίας με τη μεσολάβηση IPC αντιπροσωπεύει ένα ισχυρό εργαλείο για την αποκρυπτογράφηση των ενδογενών μηχανισμών που κρύβονται πίσω από την IT του εγκεφάλου [6], οι οποίοι έχουν τη δυνατότητα να αποκαλύψουν νέους θεραπευτικούς στόχους που στοχεύουν στην ελαχιστοποίηση της εγκεφαλικής βλάβης σε ασθενείς με εγκεφαλικό. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, ο θάνατος των αποπτωτικών νευρωνικών κυττάρων έχει τοποθετηθεί ως ένας ουσιαστικός μηχανισμός που εμπλέκεται στην εγκεφαλική ισχαιμική βλάβη [14-16]. Υπό αυτή την έννοια, η πρωτεϊνική κινάση Β ή η ΑΚΤ, μια κινάση σερίνης/θρεονίνης που απαιτεί την ενεργοποίηση μιας λειτουργικής κινάσης φωσφοϊνοσιτίδης (PI3K), έχει θεωρηθεί βασικός στόχος για νευροπροστατευτικές θεραπείες μετά την ισχαιμία [17,18].

Πρόσφατα, δείξαμε ότι η αναστολή της οδού σηματοδότησης PI3K/AKT αυξάνει την ευαισθησία των νευρώνων στην διεγερτική τοξικότητα [19]. Το AKT εμπλέκεται σε ένα σύνθετο αντι-αποπτωτικό δίκτυο σηματοδότησης [20], του οποίου τα συστατικά μπορεί να υπάρχουν σε διαφορετικές υποκυτταρικές θέσεις ανάλογα με τον τύπο ιστού [21,22]. Στην καρδιά, το AKT έχει εμπλακεί στην καρδιοπροστασία που προάγεται από την προετοιμασία [23].

Τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι το φωσφορυλιωμένο AKT προάγει τη νευρωνική επιβίωση κατά την έναρξη της εγκεφαλικής ισχαιμίας [24]. Αν και η ενεργοποίηση του AKT μπορεί να συμβάλει στην επαγωγή της ΙΤ στον εγκέφαλο [25], ο ακριβής μηχανισμός που περιλαμβάνει την ενεργοποίησή του με τη μεσολάβηση IPC παραμένει αδιευκρίνιστος. Στα καρκινικά κύτταρα, η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης PI3K/AKT οδηγεί σε φωσφορυλίωση MDM2 στο Ser166/186, η οποία προάγει την πυρηνική μετατόπιση του MDM2 [26,27] και ενισχύει τη δραστηριότητα ουβικουϊτινοποίησης του [28].

Στον πυρήνα, το MDM2 συνδέεται με την p53 και προάγει την ουβικουϊτινίωσή της και την επακόλουθη πρωτεασωμική αποδόμησή της, η οποία αναστέλλει τη λειτουργία της ρ53 [29]. Υπό συνθήκες στρες, η p53 θα μπορούσε επίσης να προκαλέσει υπερέκφραση MDM2, η οποία αντιστρόφως καταστέλλει την ενεργοποίηση της p53 σε έναν βρόχο αρνητικής ανάδρασης [30]. Η αναστολή του PI3K αποτρέπει την ενεργοποίηση AKT [31] και τη φωσφορυλίωση του MDM2 στην προρυθμισμένη καρδιά [32].

Σε αυτό το πλαίσιο, διαπιστώσαμε προηγουμένως ότι η in vivo προετοιμασία του εγκεφάλου μείωσε τον όγκο του εμφράγματος μετά από παροδική απόφραξη της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας (tMCAO) αυξάνοντας την έκφραση του επιπέδου πρωτεΐνης MDM2. Κατά συνέπεια, το σύμπλεγμα MDM2-p53 εξασθένησε την επαγόμενη από ισχαιμία ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης p53/PUMA/κασπάσης-3 στους πρωτογενείς νευρώνες του φλοιού [33].

Εδώ, ερευνούμε τον ρόλο της οδού σηματοδότησης PI3K/AKT στη νευρωνική ανοχή που προκαλείται από IPC έναντι ενός επακόλουθου ισχαιμικού τραυματισμού, καθώς και στον υποκείμενο μηχανισμό, και εστιάζουμε κυρίως στην πιθανή σύνδεση μεταξύ της ενεργοποίησης AKT και του συμπλέγματος MDM2-p53 .

2. Αποτελέσματα

2.1. Νευροπροστασία που προάγεται από IPC

Μεσολαβείται από φωσφορυλίωση του AKT στο Ser473, φωσφορυλίωση του MDM2 στο Ser166 και αποσταθεροποίηση p53 Περιγράψαμε προηγουμένως τον αντίκτυπο της αλληλεπίδρασης MDM2-p53 στην ευαισθησία των νευρώνων στην ισχαιμία [34] και στην IT [33]. Εδώ, διερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο του AKT στη νευροπροστασία με τη μεσολάβηση IPC ως υποψήφιος για συμμετοχή στο μονοπάτι MDM2-p53.

Πρώτον, επιβεβαιώσαμε ότι η ισχαιμία προήγαγε την ενεργοποίηση ΑΚΤ σε νευρώνες, όπως αποδεικνύεται από τη φωσφορυλίωση ΑΚΤ στο Ser473. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η σύντομη (20 λεπτά) OGD προκάλεσε σημαντικά την έκφραση p(Ser473)AKT και MDM2, ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης ΑΚΤ παρέμειναν αναλλοίωτα (Σχήμα S1A). Ωστόσο, η φωσφορυλίωση ΑΚΤ δεν παρατηρήθηκε όταν οι νευρώνες υποβλήθηκαν σε παρατεταμένη OGD (90 λεπτά). Επιπλέον, τα επίπεδα πρωτεΐνης MDM2 ήταν χαμηλότερα, γεγονός που είναι σύμφωνο με την υψηλότερη έκφραση της πρωτεΐνης ρ53 όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α.

Η εξαρτώμενη από το χρόνο ανοδική ρύθμιση της έκφρασης Mdm2 μετά την OGD (Εικόνα 1Β) επιβεβαιώνει ότι η υποξεία ισχαιμία μπορεί να είναι σημαντική για την πρόκληση μηχανισμών που αποτρέπουν τη σταθεροποίηση της p53 μετά την OGD, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Χρησιμοποιήσαμε σύντομη OGD (20 λεπτά) ακολουθούμενη από 2 ώρες επαναοξυγόνωσης ως μοντέλο IPC (Εικόνα S1B) [33]. Έτσι, αναλύσαμε τα νευρωνικά εκχυλίσματα που συλλέχθηκαν σε 4 ώρες επαναοξυγόνωσης μετά από OGD (OGD/R) ή μετά από OGD πριν από το πρωτόκολλο IPC (IPC συν OGD/R). Παράλληλα, οι νευρώνες επωάστηκαν σε ρυθμίσεις νορμοξίας (Nx) ή προετοιμασίας (IPC) (Εικόνα S1B).

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1C και στο Σχήμα S1C, το IPC προκάλεσε την πρώιμη ενεργοποίηση του AKT, όπως αποκαλύφθηκε από φωσφορυλίωση στο Ser473 [35], ακολουθούμενη από σταθεροποίηση πρωτεΐνης MDM2 και φωσφορυλίωση στο Ser166. Το IPC απέτρεψε επίσης τη σταθεροποίηση της ρ53 που προκλήθηκε από το OGD/R (Εικόνα 1C). Είναι ενδιαφέρον ότι οι εικόνες ανοσοφθορισμού που φαίνονται στο Σχήμα 1D αποκάλυψαν ότι η IPC προώθησε τη φωσφορυλίωση AKT στο Ser473 στους νευρώνες, οι οποίοι συσσωρεύτηκαν κυρίως στον πυρήνα και μείωσαν τη σταθεροποίηση του p53 μετά από OGD/R (IPC συν OGD/R) σε σύγκριση με νευρώνες που δεν είχαν προκαθοριστεί /R).

Συνεπώς, η IPC απέτρεψε την απόπτωση των νευρώνων και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 που προκαλείται από OGD/R, όπως μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα S1D) και φθορισμομέτρηση (Εικόνα S1E), αντίστοιχα. Για να επιβεβαιώσουμε τον ρόλο της ρ53 στη νευροπροστασία με τη μεσολάβηση IPC, χρησιμοποιήσαμε νευρώνες που εκφράζουν (άγριου τύπου, wt) ή όχι (knockout; ko) την πρωτεΐνη p53. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι νευρώνες που δεν είχαν p53 (Εικόνα S1F) ήταν πιο ανθεκτικοί στην απόπτωση που προκαλείται από OGD από τους νευρώνες p53 wt.

Επιπλέον, τα επίπεδα απόπτωσης στους νευρώνες p53KO ήταν παρόμοια με εκείνα που παρατηρήθηκαν σε προρυθμισμένους (IPC συν OGD/R) wt νευρώνες (Εικόνα S1G), επιβεβαιώνοντας έτσι τον βασικό ρόλο της αποσταθεροποίησης της p53 στη νευροπροστασία που μεσολαβεί η IPC [33]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η IPC προκάλεσε νευροπροστασία έναντι μιας ισχαιμικής προσβολής μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει φωσφορυλίωση του AKT στο Ser473, σταθεροποίηση MDM2 και φωσφορυλίωση στο Ser166 και αποσταθεροποίηση της p53.

2.2. Η IPC ​​ενεργοποιεί τη φωσφορυλίωση MDM2 στο Ser166 μέσω της οδού PI3K/AKT

Η οδός σηματοδότησης PI3K/AKT εμπλέκεται στη νευρωνική ΙΤ τόσο in vitro [36] όσο και in vivo [37]. Ωστόσο, ο ρόλος της ενεργοποίησης της οδού PI3K/AKT με τη μεσολάβηση IPC στη ρύθμιση του συμπλέγματος MDM2-p53 παραμένει ανεξερεύνητος. Για να διευκρινιστεί αυτό, οι νευρώνες επωάστηκαν με τον μη αναστρέψιμο και ειδικό αναστολέα της οδού PI3K/AKT, wortmannin [19].

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η wortmannin ακύρωσε την ενισχυμένη με IPC (Ser473) AKT φωσφορυλίωση και την αποσταθεροποίηση της ρ53, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1D. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια άμεση σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης AKT και της αναστολής της απόπτωσης των νευρώνων με τη μεσολάβηση p{5} (Εικόνα S1D) και της ενεργοποίησης της κασπάσης-3 (Εικόνα S1E) που προκαλείται μετά από OGD/R. Ο κύριος ρυθμιστής της σταθεροποίησης της p53, το MDM2, είναι στόχος του AKT [26], το οποίο φωσφορυλιώνει το MDM2 στο Ser166 και το Ser186 [26]. Η αναστολή PI3K με wortmannin απέτρεψε τη φωσφορυλίωση τόσο του (Ser473)AKT όσο και του (Ser166)MDM2 που επάγεται από IPC (Εικόνα 2Β).

Η ειδική φωσφορυλίωση του MDM2 με τη μεσολάβηση Akt στο Ser166 που προκλήθηκε από IPC επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ενός μικρού παρεμβαλλόμενου RNA (siRNA) ειδικά σχεδιασμένου έναντι της πρωτεΐνης AKT1 (siAkt), που εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους νευρώνες του φλοιού και του οποίου η δραστηριότητα είναι απαραίτητη για την επιβίωση των νευρώνων μετά από ισχαιμία [1]. 38]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, το siAkt μείωσε τα ολικά επίπεδα πρωτεΐνης AKT και p(Ser473)AKT την ημέρα 3 μετά τη διαμόλυνση, τόσο σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ (Εικόνα 3Α) όσο και σε νευρώνες του φλοιού (Εικόνα 3Β).

Επιπλέον, το knockdown AKT (siAkt) απέτρεψε τη φωσφορυλίωση (Ser166)MDM2 (Εικόνα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ενεργοποιημένη από IPC οδός σηματοδότησης PI3K/AKT προάγει τη φωσφορυλίωση του MDM2 στο Ser166, το οποίο μπορεί να είναι υπεύθυνο για τη σταθεροποίηση του MDM2 και την επακόλουθη αποσταθεροποίηση του p53 μετά από ισχαιμικό τραυματισμό.

2.3. Το IPC-Activated AKT ενεργοποιεί τη σταθεροποίηση της πυρηνικής πρωτεΐνης MDM2 μετά από ισχαιμία

Η ενεργοποίηση του AKT έχει εμπλακεί στην πυρηνική μετατόπιση του MDM2 σε κύτταρα όγκου [26]. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της σταθεροποίησης του πυρηνικού MDM2 για την επιβίωση των νευρώνων μετά από ισχαιμία [34] και, πιο συγκεκριμένα, τον νευροπροστατευτικό του ρόλο στην IPC [33], αποφασίσαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω τη σημασία της οδού σηματοδότησης PI3K/AKT στη ρύθμιση του υποκυτταρικού εντοπισμού του MDM2 πρωτεΐνη.

Έτσι, νευρώνες ή κύτταρα ΗΕΚ-293Τ επιμολύνθηκαν με ανθρώπινη πρωτεΐνη με ετικέτα2-MDM (MDM2-GFP). Αντιπροσωπευτικά στυπώματα επιμολυσμένων κυττάρων ΗΕΚ-293Τ και εικόνες από νευρώνες που εκφράζουν εκτοπικά ανθρώπινη πρωτεΐνη MDM2 μετά από τέσσερις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες (Nx, IPC, OGD/R και IPC συν OGD/R) φαίνονται στο Σχήμα 4Α και στο Σχήμα S1H , αντίστοιχα.

Η έκτοπη έκφραση του MDM2- GFP επιβεβαίωσε ότι το IPC προάγει την πυρηνική συσσώρευση του MDM2 σε σύγκριση με τους μη προετοιμασμένους ισχαιμικούς (OGD/R) ή φυσιολογικούς (Nx) νευρώνες (Εικόνα 4Α, Β), όπως αποκαλύπτεται από την ποσοτικοποίηση της αναλογίας πυρηνικού/κυτοσολικού φθορισμού (Εικόνα S2B) και ένταση πυρηνικού φθορισμού του MDM2-GFP (Εικόνα S2C).

2.4. Το IPC προάγει την αλληλεπίδραση p(Ser473)AKT και MDM2, η οποία ενισχύει τη σταθεροποίηση του MDM2 στον πυρήνα και μειώνει την επαγόμενη νευρωνική απόπτωση κατά την ισχαιμία

Μετά την επίδειξη του ρόλου της ενισχυμένης με IPC ενεργοποίησης της οδού PI3K/AKT στην πυρηνική σταθεροποίηση του MDM2, διερευνήσαμε περαιτέρω εάν το p(Ser473)AKT και το MDM2 αλληλεπιδρούν εντός του πυρήνα (Εικόνα 6Α). Η ανοσοκατακρήμνιση MDM2 από εκχυλίσματα πυρηνικής πρωτεΐνης, ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση έναντι του MDM2 και του p(Ser473)AKT, αποκάλυψε ότι το IPC προώθησε την αλληλεπίδραση μεταξύ του p(Ser473)AKT και του MDM2, μετά το OGD/R, αποτρέποντας έτσι τη σταθεροποίηση του πυρηνικού p53 που προκαλείται από OGD/R. όπως φαίνεται στην είσοδο του πυρήνα (Εικόνα 6Α).

Τέλος, μελετήσαμε την επιζήμια επίδραση της διαταραχής της οδού PI3K/AKT στην απόπτωση των νευρώνων (Εικόνα 6Β). Η αναστολή AKT εξουδετέρωσε την προστατευτική επίδραση της IPC πριν από την OGD, η οποία επιβεβαιώνει τον νευροπροστατευτικό ρόλο της AKT-MDM2 στο πλαίσιο της IT. Τα αποτελέσματά μας, επομένως, καταδεικνύουν ότι η IPC προκαλεί φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της AKT, η οποία προάγει τη φωσφορυλίωση του MDM2 στο Ser166 και την πυρηνική μετατόπιση, όπου αλληλεπιδρά με το p(Ser473)AKT. Αυτός ο μηχανισμός μπορεί να συμβάλει στην ενισχυμένη πυρηνική σταθεροποίηση του MDM2, το οποίο παίζει ουσιαστικό ρόλο στην επαγόμενη από την IPC ισχαιμική ανοχή.

Πώς το Cistanche προστατεύει τους νευρώνες;

Υπάρχουν κάποια στοιχεία που υποδηλώνουν ότι το Cistanche μπορεί να προστατεύει τους νευρώνες μειώνοντας την απόπτωση (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) και προάγοντας την επιβίωση των νευρώνων. Η απόπτωση είναι μια φυσική διαδικασία που συμβαίνει στο σώμα για την αφαίρεση κατεστραμμένων ή ανεπιθύμητων κυττάρων, αλλά μπορεί να είναι επιβλαβής όταν συμβαίνει υπερβολικά ή ακατάλληλα. Το Cistanche έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την απόπτωση σε εργαστηριακές μελέτες και αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να βοηθήσει στην προστασία των νευρώνων από βλάβη.

Επιπλέον, το Cistanche περιέχει μια σειρά από βιοδραστικές ενώσεις που έχει αποδειχθεί ότι έχουν νευροπροστατευτικά αποτελέσματα. Για παράδειγμα, περιέχει εχινακοσίδη, η οποία έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει τους νευρώνες από το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή. Περιέχει επίσης ακτεοσίδη, η οποία έχει βρεθεί ότι έχει αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές ιδιότητες.

Συνεχίζεται...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Alme 2,3 και Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institute of Functional Biology and Genomics, University of Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spain; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Institute of Biomedical Research of Salamanca, University Hospital of Salamanca, University of Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spain

3 Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Πανεπιστήμιο της Σαλαμάνκα, 37007 Σαλαμάνκα, Ισπανία 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Μαδρίτη, Ισπανία: {{*5} ; Τηλ.: συν 34-923-29-4908