Φυτοχημικός έλεγχος και οιστρογονική δράση των συνολικών γλυκοζιδίων του Cistanche Deserticola

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Αφηρημένη

Κατά τη διάρκεια των δεκαετιών, έχουν γίνει συνεχείς προσπάθειες για τη βελτίωση της ποιότητας της ανθρώπινης ζωής. Το μετεμμηνοπαυσιακό σύνδρομο αποτελεί σοβαρή ανησυχία για την ευημερία της υγείας των γυναικών. Η ορμονική θεραπεία είναι επί του παρόντος η κύρια θεραπεία για αυτήν την πάθηση. Ωστόσο, αυτή η θεραπεία θα μπορούσε να οδηγήσει σε κατάχρηση οιστρογόνων, οδηγώντας σε ανεπιθύμητες ενέργειες και παρενέργειες. Ως αποτέλεσμα, η ορμονική θεραπεία ήταν ανεπιτυχής στη βελτίωση του μετεμμηνοπαυσιακού συνδρόμου.Cistanche deserticolaείναι ένα κλασικό τονωτικό βότανο στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Παρουσιάζει σημαντική οιστρογονική δράση. Οι κύριες δραστικές ενώσεις αυτού του βοτάνου είναι οι γλυκοσίδες. Σε ένα προηγούμενο πείραμα, ταυτοποιήθηκαν τρεις σημαντικοί παράγοντες που συνεισφέρουν στη συνολική απόδοση γλυκοσιδίου, την απόδοση ακτεοσιδίου και την οιστρογονική δραστηριότητα, συγκεκριμένα, η συγκέντρωση του εκλούσματος, το pH και ο όγκος του εκλούσματος. Σε αυτό το πείραμα, προσδιορίστηκε μια βέλτιστη διαδικασία καθαρισμού χρησιμοποιώντας μια κεντρική σύνθετη μεθοδολογία επιφάνειας σχεδιασμού-απόκρισης για τη λήψη γλυκοσιδών από αυτό το βότανο. Μια συγκέντρωση υγρού έκλουσης (αιθανόλη) 85 τοις εκατό και όγκος 25 BV σε ρΗ 11 βρέθηκε ότι ήταν η βέλτιστη. Είκοσι μία δραστικές ενώσεις ταυτοποιήθηκαν με μια υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία/τετραπολικός προσδιορισμός φασματομετρίας μάζας χρόνου πτήσης. Αυτή η μελέτη παρέχει πολύτιμες γνώσεις για περαιτέρω σε βάθος έρευνα που αξιολογεί τις οιστρογονικές δραστηριότητες των ολικών γλυκοσιδών τουCistanche deserticola.

Λέξεις-κλειδιά: Κεντρικός σύνθετος σχεδιασμός; Ολικές γλυκοσίδες Cistanche deserticola; LC/Q-TOF-MS; τεχνολογία καθαρισμού· τεστ ανάπτυξης της μήτρας.

Εισαγωγή

Cistanche deserticolaείναι ένα βρώσιμο, κλασικό τονωτικό βότανο. Αναφέρθηκε για πρώτη φορά στο κλασικό βότανο του Shen Nong και κατατάχθηκε στην κορυφαία τάξη. Είναι ένα ζεστό βότανο και γλυκό. Έχει πολυάριθμες φαρμακευτικές ιδιότητες, όπως θρέψη του ήπατος και των νεφρών, ενδυνάμωση μυών και οστών και βελτίωση της ανοσολογικής ρύθμισης μαζί με αντιγηραντικές και αντικαρκινικές δραστηριότητες [1-4]. Ορισμένες φυσικές ενώσεις έχουν απομονωθεί και ταυτοποιηθεί από τα εκχυλίσματα αυτού του βοτάνου, με τα κυριότερα από αυτά να είναι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, τα λιγνανοειδή, τα ιριδοειδή, οι πολυσακχαρίτες και τα αλκαλοειδή [5-8].

Τα φάρμακα που λαμβάνονται από φαρμακευτικά φυτά περιέχουν διάφορες δραστικές ενώσεις, οι οποίες είναι κυρίως υπεύθυνες για τις θεραπευτικές τους δράσεις. Η αποτελεσματικότητα του ίδιου φαρμάκου που λαμβάνεται από διαφορετικές φυτικές πηγές μπορεί να ποικίλλει λόγω των διαφορών στον τύπο και την ποσότητα των δραστικών ενώσεων που υπάρχουν σε αυτό. Επομένως, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν και να ποσοτικοποιηθούν όλες οι δραστικές ενώσεις που υπάρχουν στα φάρμακα που λαμβάνονται από φαρμακευτικά φυτά. Το ίδιο ισχύει και για το C. deserticola. Η μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης είναι μια πειραματική μέθοδος για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ διαφορετικών παραγόντων ταυτόχρονα [9-10]. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων εκχύλισης για φυτοφάρμακα και την ποσοτική εκτίμηση των δραστικών ενώσεων σε φάρμακα. Ο κεντρικός σύνθετος σχεδιασμός (CCD) είναι ένα από τα πειραματικά σχέδια που είναι χρήσιμα στη μεθοδολογία της επιφάνειας απόκρισης. Σε σύγκριση με τα ορθογώνια και ομοιόμορφα σχέδια, το CCD έχει μεγαλύτερη ακρίβεια και καλύτερη προβλεψιμότητα [11].

Το μετεμμηνοπαυσιακό σύνδρομο μπορεί να μειώσει σημαντικά την ποιότητα ζωής στις γυναίκες. Κανονικά, τα οιστρογόνα χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία αυτής της πάθησης. Ωστόσο, η μακροχρόνια χρήση οιστρογόνων μπορεί να οδηγήσει σε κατάχρηση, προκαλώντας έτσι διάφορες ανεπιθύμητες ενέργειες και παρενέργειες. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική η επιλογή μιας εναλλακτικής θεραπείας, κατά προτίμηση ενός φυτικού φαρμάκου που περιέχει οιστρογόνα ως ενεργό συστατικό για τη θεραπεία του μετεμμηνοπαυσιακού συνδρόμου [12-13].

Σε ένα προκαταρκτικό πείραμα, οι δομές διαφόρων φυσικών ενώσεων που ελήφθησαν από το C. deserticola αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας (MS) [14]. Επιβεβαιώθηκε ότι οι γλυκοσίδες είναι οι κύριες δραστικές ενώσεις με σημαντική οιστρογονική δράση [14-15]. Για να αναπτυχθεί ένα ασφαλές και αποτελεσματικό οιστρογονικό δραστικό συστατικό σε ένα νέο φάρμακο, χρειάζεται μια εις βάθος έρευνα για το TGCD μετά τον καθαρισμό. Σε αυτή τη μελέτη, το CCD χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για τη βελτιστοποίηση του καθαρισμού των συνολικών γλυκοσιδών του C. deserticola (TGCD). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το τεστ ανάπτυξης της μήτρας για να αξιολογηθούν οι οιστρογονικές δραστηριότητες του ίδιου γλυκοσιδίου. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης/φασματομετρία μάζας τετραπολικού χρόνου πτήσης (HPLC/Q-TOF-MS) χρησιμοποιήθηκε για ποιοτική ανάλυση των ενώσεων του TGCD μετά τον καθαρισμό. Αυτή η διαδικασία εφαρμόστηκε για να καταδείξει ρητά την παρουσία διαφόρων δραστικών ενώσεων με οιστρογονική δράση στο TGCD. Αυτό μπορεί ταυτόχρονα να παρέχει τη βάση για την κλινική χρήση του στο μετεμμηνοπαυσιακό σύνδρομο που αντικαθιστά τα οιστρογόνα.

Πειραματική διαδικασία

Οργανα

Σύστημα HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, ΗΠΑ), σύστημα τετραπολικού χρόνου πτήσης LC/MS (Q-TOF) της σειράς Agilent 6530 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) και Chemical HPLC{ {5}}Οι σταθμοί εργασίας D χρησιμοποιήθηκαν ως χρωματογραφικά όργανα για την επεξεργασία δεδομένων. Για όλη τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε υπερκαθαρό νερό Milli-Q. AR1140 ηλεκτρονικό αναλυτικό ισοζύγιο (Ohaus International Ltd.); 680 microplate reader (Bio-Rad Corporation); και φυγόκεντρος υψηλής ταχύτητας 64R (Beckman Coulter Allegra) χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία του δείγματος.

Φάρμακα και χημικά

Το C. deserticola αγοράστηκε από την αγορά φαρμάκων και αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Zhang Delian (Εμπορικό Πανεπιστήμιο Harbin, Κίνα). Η τυπική διαιθυλοστιλβεστρόλη (99 τοις εκατό καθαρή, αρ. παρτίδας 60518) αγοράστηκε από τον Dr. Ehrenstorfer (Γερμανία). Άλλα πρότυπα ακτεοσίδης (111530-200505) και εχινακοσίδης (111670-200503) ελήφθησαν από το Εθνικό Ινστιτούτο για τον Έλεγχο Φαρμακευτικών και Βιολογικών Προϊόντων, Πεκίνο, Κίνα. Η καθαρότητα κάθε προτύπου ήταν > 98 τοις εκατό. Το ακετονιτρίλιο (ACN), η μεθανόλη και το μυρμηκικό οξύ (βαθμός MS) αγοράστηκαν από την Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL, USA). Το υπερκαθαρό νερό ελήφθη από την Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Hangzhou, Κίνα). Όλα τα εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής ποιότητας.

Παρασκευή ολικών γλυκοσιδών του διαλύματος καθαρισμού C. deserticola

Μετά από βύθιση σε αιθανόλη 75 τοις εκατό για 12 ώρες, η ακατέργαστη σκόνη του C. deserticola (100 g) εκχυλίστηκε με 800 mL αιθανόλης 75 τοις εκατό (ο/ο) στους 80 βαθμούς για 150 λεπτά υπό αναρροή. Στη συνέχεια διηθήθηκε μέσω φίλτρου διπλού ορόφου και στη συνέχεια εκχυλίστηκε με 800 mL αιθανόλης 75 τοις εκατό δύο φορές για επιπλέον 150 λεπτά. Στη συνέχεια, τα διηθήματα συνδυάστηκαν και συμπυκνώθηκαν σε κενό στους 45 βαθμούς. Το εκχύλισμα ελήφθη με απομάκρυνση του διαλύτη. Μια ορισμένη ποσότητα απεσταγμένου νερού προστέθηκε στο εκχύλισμα για να ληφθεί συγκέντρωση 0,5 g/mL, η οποία χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή της διαδικασίας καθαρισμού.

Για την προσρόφηση με χρήση μακροπορώδους ρητίνης ΑΒ-8, το pH του διαλύματος του δείγματος δοκιμής ρυθμίστηκε στο 11. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε 2 BV απεσταγμένο νερό για να απομακρυνθούν οι ακαθαρσίες. Στη συνέχεια, το έκλουσμα σε συγκέντρωση 25 BV 85 τοις εκατό αιθανόλη εκλούστηκε και συλλέχθηκε. Τέλος, το συλλεγμένο καθαρισμένο εκλουστικό συγχωνεύθηκε. Μια ορισμένη ποσότητα απεσταγμένου νερού προστέθηκε στο εκχύλισμα για να ληφθεί συγκέντρωση 1,5 g/mL, η οποία χρησιμοποιήθηκε για ενδογαστρική χορήγηση. Για θετικό έλεγχο, διάλυμα διαιθυλοστιλβεστρόλης (20 μg/mL) παρασκευάστηκε με σκόνη διαιθυλοστιλβεστρόλης.

Σύμφωνα με την αναλογία καθαρισμού ({{0}}.6), μια ορισμένη ποσότητα του εκχυλίσματος (ισοδύναμη με 1 g C. deserticola) μεταφέρθηκε σε ογκομετρική φιάλη 10 mL, διαλύθηκε σε διάλυμα μεθανόλης 50 τοις εκατό (ο/ο) σε λουτρό υπερήχων για 5 λεπτά και αραιώθηκε σε 10 mL. Το φαρμακευτικό διάλυμα ελήφθη μετά από διήθηση του υπερκειμένου μέσω μεμβράνης φίλτρου 0,45 μm. Ακτεοσίδη και εχινακοσίδη (1 mg το καθένα) αναμίχθηκαν και διαλύθηκαν πλήρως σε 10 mL 50 τοις εκατό (ο/ο) διάλυμα μεθανόλης. Τέλος, το πρότυπο διάλυμα διηθήθηκε μέσω φίλτρου Millipore 0,45 μm πριν από την ανάλυση.

Συνθήκες LC-MS

Ο διαχωρισμός χρωματογραφίας πραγματοποιήθηκε σε σύστημα HPLC (Agilent 129{{1{0}}), εξοπλισμένο με σύστημα παροχής τεταρτοταγούς διαλύτη, απαεριωτή κενού και ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδου. Η ανάλυση MS/MS πραγματοποιήθηκε σε ένα όργανο Agilent-1290 HPLC/6530 σύστημα Q-TOF-MS, εξοπλισμένο με μια πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού και σε τρόπο θετικού και αρνητικού ιόντος. Για τον διαχωρισμό χρησιμοποιήθηκε στήλη Waters Symmetry shield RP C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, MA, ΗΠΑ). Η κινητή φάση περιελάμβανε 0,2 τοις εκατό υδατικό διάλυμα μυρμηκικού οξέος (ο/ο) (Α) και ACN (Β), και αντλήθηκε με ρυθμό ροής 0,5 mL/min. Ο όγκος έγχυσης κάθε δείγματος ήταν 10 μL. Το πρόγραμμα έκλουσης βαθμίδωσης ήταν ως εξής: 5−23 τοις εκατό Β για 0−35 λεπτά, 23−25 τοις εκατό Β για 35−65 λεπτά και 25−5 τοις εκατό Β για 65−70 λεπτά. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 30 βαθμούς. Τα χρωματογραφήματα παρακολουθήθηκαν και καταγράφηκαν στα 330 nm. Η πίεση αερίου ψεκασμού ρυθμίστηκε στα 30 Psi και η τριχοειδής τάση ήταν 3,5 kV. Ο ρυθμός ροής του ξηρού αερίου ήταν 8 L/min σε θερμοκρασία 30 βαθμών. Η θερμοκρασία του αερίου περιβλήματος ρυθμίστηκε στους 400 βαθμούς με ρυθμό ροής 12 L/min. Η ενέργεια σύγκρουσης ορίστηκε στα 10–20 eV για σαρώσεις χαμηλής ενέργειας και 30–50 eV για σαρώσεις υψηλής ενέργειας. Τα δεδομένα φασμάτων μάζας καταγράφηκαν εντός του εύρους σάρωσης 50-1000 Da σε θετικούς και αρνητικούς τρόπους σάρωσης ιόντων. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήθηκε μια γρήγορη και αποτελεσματική σύγκριση μεταξύ του TGCD και των προτύπων υπό την ίδια συνθήκη LC-MS.

Τεστ ανάπτυξης της μήτρας

Αυτό πραγματοποιήθηκε σε αυστηρή συμφωνία με τις συστάσεις του Οδηγού για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Εμπορικού Πανεπιστημίου Harbin, Κίνα.

Ανώριμα θηλυκά ποντίκια Kunming (περίπου 21 ημερών από τη γέννηση, απογαλακτισμένα) βάρους 12 ± 2 g, αγοράστηκαν από το Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, Κίνα). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε ένα δωμάτιο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας (22 ± 2 μοίρες) με τροφή και νερό κατά βούληση. Ο πειραματισμός σε ζώα ξεκίνησε μετά από πέντε ημέρες εγκλιματισμού. Τα ποντίκια νήστευαν όλη τη νύχτα με νερό κατά βούληση πριν από την ενδογαστρική χορήγηση του διαλύματος δοκιμής.

Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 22 ομάδες, με 10 ζώα σε κάθε ομάδα. Τους χορηγήθηκαν πειραματικά φάρμακα του ίδιου όγκου δύο φορές την ημέρα (πρωί και βράδυ) για τέσσερις ημέρες ως εξής:

Ομάδα 1: Ενδογαστρικές ολικές γλυκοσίδες του διαλύματος καθαρισμού του C. deserticola (20 mL/kg), (όγκος διαλύματος/βάρος ποντικού),

Ομάδα II: Ενδογαστρικό απεσταγμένο νερό (ομάδα αρνητικού ελέγχου) και

Ομάδα III: Ενδογαστρική διαιθυλοστιλβεστρόλη (20 ug/mL) (ομάδα θετικού ελέγχου).

Την πέμπτη μέρα θυσιάστηκαν όλα τα ποντίκια. Οι μήτρες αφαιρέθηκαν αμέσως και ζυγίστηκαν και υπολογίστηκαν οι συντελεστές της μήτρας.

Στατιστική ανάλυση

Χρησιμοποιήθηκε ένα t-test ζευγαρωμένου δείγματος δύο ουρών για τον εντοπισμό στατιστικά σημαντικών διαφορών στις διάφορες παραμέτρους στις διαφορετικές πειραματικές ομάδες. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με χρήση στατιστικού λογισμικού SPSS (SPSS για Windows v21.{4}}, SPSS Inc., ΗΠΑ). Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95 τοις εκατό (p <>

Αποτελέσματα και συζήτηση

Γραμμικότητα και συσχέτιση των αποδόσεων ακτεοσιδίου και ολικών γλυκοσιδών

Η γραμμική εξίσωση παλινδρόμησης της απόδοσης ακτεοσίδης ήταν y {{0}}x – 14,75 (όπου x είναι η συγκέντρωση του ακτεοσιδίου και y η αντίστοιχη περιοχή κορυφής) με συντελεστή συσχέτισης r=1 στο εύρος συγκέντρωσης 0.12−{{1{0}}.72 mg/mL. Αυτό έδειξε μια γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης. Η εξίσωση γραμμικής παλινδρόμησης της συνολικής απόδοσης γλυκοσιδίων ήταν y=26.074x συν 0,0866 (όπου x είναι η συγκέντρωση των συνολικών γλυκοσιδών και y η αντίστοιχη περιοχή κορυφής) με συντελεστή συσχέτισης r { {12}}.9982 στο εύρος συγκέντρωσης 0,013−0,065 mg/mL. Αυτό έδειξε επίσης μια γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης.

Μεθοδολογική διερεύνηση

Η ακρίβεια, η αναπαραγωγιμότητα, η σταθερότητα και η ανάκτηση των δειγμάτων διερευνήθηκαν στη μεθοδολογική έρευνα. Στο πείραμα ακριβείας, η σχετική τυπική απόκλιση (RSD) των ακτεοσιδών και των συνολικών γλυκοσιδών ήταν 1,43 τοις εκατό και 0.05 τοις εκατό αντίστοιχα. Στο πείραμα αναπαραγωγιμότητας, το RSD του ακτεοσιδίου και των συνολικών γλυκοσιδών ήταν 0,10 τοις εκατό και 1,44 τοις εκατό αντίστοιχα. Στο πείραμα σταθερότητας 24 ωρών, το RSD του ακτεοσιδίου και των συνολικών γλυκοσιδών ήταν 0,14 τοις εκατό και 0,90 τοις εκατό αντίστοιχα. Στο πείραμα ανάκτησης, η ανάκτηση ακτεοσίδης ήταν 100,50 τοις εκατό με RSD 2,08 τοις εκατό, ενώ η ανάκτηση των συνολικών γλυκοσιδών ήταν 99,12 τοις εκατό με RSD 1,65 τοις εκατό. Όλες οι τιμές RSD ήταν μικρότερες από 3 τοις εκατό. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν καλή ακρίβεια και αναπαραγωγιμότητα. Επιπλέον, το δείγμα ήταν σταθερό για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα της ανάκτησης είναι επίσης εντός του επιτρεπόμενου εύρους (95−105 τοις εκατό ). Επομένως, αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της απόδοσης ακτεοσίδης και ολικών γλυκοσιδών μετά τον καθαρισμό.

Διερεύνηση ενός παράγοντα του TGCD

Ο καθαρισμός του TGCD χρησιμοποιώντας μακροπορώδη ρητίνη μπορεί να επηρεαστεί από πολλούς παράγοντες, όπως ο τύπος ρητίνης, οι στατικοί παράγοντες προσρόφησης (χρόνος προσρόφησης, συγκέντρωση διαρροής και pH του διαλύματος δείγματος) και οι συνθήκες έκλουσης (ταχύτητα ροής, όγκος και συγκέντρωση). Χρησιμοποιώντας την ικανότητα προσρόφησης και τους ρυθμούς εκρόφησης και έκλουσης του TGCD ως δείκτες, η πειραματική συνθήκη προσδιορίστηκε με βάση τα αποτελέσματα πειραμάτων ενός παράγοντα. Χρησιμοποιώντας μακροπορώδη ρητίνη προσρόφησης τύπου ΑΒ-8, προσδιορίστηκαν οι ακόλουθες βέλτιστες συνθήκες: 0.5 mg/mL διάλυμα δείγματος, pH 10, χρόνος στατικής προσρόφησης 8 h, 2 BV απεσταγμένο νερό για το πλύσιμο των ακαθαρσιών, 20 BV 80 τοις εκατό αιθανόλη ως υγρό έκλουσης και ταχύτητα ροής 0,5 BV/min. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα φαίνονται στα Σχήματα 1−7.

CCD για βελτιστοποίηση της τεχνολογίας καθαρισμού TGCD

Με βάση τα αποτελέσματα της έρευνας ενός παράγοντα, επιλέχθηκαν ως δείκτες τρεις παράγοντες που επηρεάζουν σημαντικά τη μέθοδο καθαρισμού, δηλαδή το pH του διαλύματος του δείγματος (x1), η συγκέντρωση του διαλύματος έκλουσης (x2) και ο όγκος του διαλύματος έκλουσης (x3). Σύμφωνα με την αρχή της CCD, κάθε παράγοντας έχει πέντε επίπεδα. Τα μέγιστα και ελάχιστα επίπεδα αυτών των διαφόρων παραγόντων ορίστηκαν σύμφωνα με τα αποτελέσματα του προκαταρκτικού πειράματος. Τα επίπεδα παραγόντων φαίνονται στον Πίνακα 1 και τα πειραματικά αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 2.

Οι συνολικές αποδόσεις γλυκοσιδίων και ακτεοσιδίων προσδιορίστηκαν για να βελτιστοποιηθεί η μέθοδος καθαρισμού για TGCD. Πρώτον, οι συνολικές αποδόσεις γλυκοσιδίων και ακτεοσιδών ορίστηκαν στα αριθμητικά κριτήρια επιθυμίας (d) μεταξύ {{0}}-1. Στη συνέχεια, υπολογίστηκε η συνολική επιθυμία (OD) [OD=(d1, d2, d3,....,dn)1/n, όπου n είναι ο αριθμός του δείκτη]. SPSS21.{{10}} λογισμικό και λογισμικό ειδικού σχεδιασμού χρησιμοποιήθηκαν για πολλαπλή γραμμική παλινδρόμηση και διωνυμική προσαρμογή ανεξάρτητων μεταβλητών και OD, με p < 0.0λήφθηκε="" υπόψη="" το="" 5.="" ένα="" στατιστικά="" σημαντικό="" πρότυπο="" της="" εξίσωσης.="" η="" εξίσωση="" με="" μεγαλύτερη="" τιμή="" r="" (πολλαπλός="" συντελεστής="" συσχέτισης)="" επιλέχθηκε="" ως="" το="" καλύτερο="" μοντέλο="" προσαρμογής.="" η="" πολυμεταβλητή="" γραμμική="" εξίσωση="" αντιπροσωπεύεται="" ως="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" συν="" 0.034x2="" συν="" 0,012x3="" (r="" {{{="" 25}}.55,="" σ="0.004)." η="" διωνυμική="" εξίσωση="" είναι="" y="–" 21,92173="" –="" 0,74079x1="" συν="" 0,62914x2="" συν="" 0,041161x3="" συν="" 0,014972x1x2="" συν="" 2,06050*10-4x1x3="" συν="" 2,06050*10-4x1x3="" συν="" 2,06050*10-4x1x3="" συν="" 8.="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0.012)." από="" τις="" παραπάνω="" εξισώσεις="" φαίνεται="" ότι="" ο="" συντελεστής="" συσχέτισης="" της="" εξίσωσης="" πολυμεταβλητής="" γραμμικής="" παλινδρόμησης="" είναι="" χαμηλότερος.="" η="" συσχέτιση="" μεταξύ="" των="" ανεξάρτητων="" και="" των="" εξαρτημένων="" μεταβλητών="" είναι="" πολύ="" χαμηλή="" και="" θεωρήθηκε="" δυσμενής="" η="" χρήση="" της="" στο="" γραμμικό="">

Όμως, ο συντελεστής συσχέτισης της διωνυμικής εξίσωσης ήταν υψηλός και οδήγησε σε καλή προσαρμογή. Ως εκ τούτου, επιλέχθηκε το διωνυμικό μοντέλο. Με βάση μια ολοκληρωμένη ανάλυση της εικόνας της επιφάνειας και του χάρτη περιγράμματος σε συνδυασμό με τα πειραματικά δεδομένα (τιμή OD κοντά στο {{0}}.6), λήφθηκε το βέλτιστο εύρος της μεθόδου καθαρισμού. Από το Σχήμα 8, μπορεί να φανεί ότι η μέγιστη τιμή OD δημιουργήθηκε όταν το pH του διαλύματος δείγματος (Α) ήταν στην περιοχή 9-10 και η συγκέντρωση του εκλούτη (Β) ήταν στο εύρος του 79-85 τοις εκατό . Το Σχήμα 9 δείχνει ότι η μέγιστη τιμή OD λήφθηκε όταν η τιμή pH του διαλύματος δείγματος (Α) ήταν στην περιοχή 9−10 και ο όγκος του εκλούτη (C) ήταν στην περιοχή 20−25 BV. Το Σχήμα 10 δείχνει ότι η μέγιστη τιμή OD λήφθηκε όταν η συγκέντρωση του εκλούσματος (B) ήταν στην περιοχή του 80-85 τοις εκατό και ο όγκος του εκλούσματος (C) ήταν στο εύρος των 20-25 BV. Από μια περιεκτική ανάλυση αυτών των δεδομένων, το pH του διαλύματος του δείγματος, η συγκέντρωση του διαλύματος έκλουσης και ο όγκος του εκλούσματος προσδιορίστηκε ότι είναι στην περιοχή 9−10, 80−85 τοις εκατό και 20−25 BV αντίστοιχα. Με βάση την πολυμεταβλητή διωνυμική εξίσωση για τα αποτελέσματα μεταβλητών παραγώγων και το βέλτιστο σχήμα, η καλύτερη μέθοδος καθαρισμού TGCD βρέθηκε να είναι σε συγκέντρωση υγρού έκλουσης (αιθανόλη) 85 τοις εκατό και όγκο 25 BV σε pH 11. Η αντίστοιχη τιμή OD ήταν 0,8332 και η συνολική απόδοση γλυκοσιδίων ήταν 73,0339 τοις εκατό. Η οπτική εντύπωση από τα σχήματα 8-10 προσδιορίζει ότι η καλύτερη μέθοδος είναι αυτή στην οποία ελήφθησαν υπόψη οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο παραγόντων, αν και η καλύτερη μέθοδος που προκύπτει από τον τύπο αναγνωρίζει εκείνη στην οποία συμπεριλήφθηκαν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των τριών παραγόντων. Τα δύο αποτελέσματα διέφεραν και η βέλτιστη μέθοδος καθαρισμού θεωρήθηκε ότι ήταν με συγκέντρωση υγρού έκλουσης (αιθανόλη) 85 τοις εκατό και όγκο 25 BV σε pH 11.

Μέτρηση ανάπτυξης της μήτρας

Ο συντελεστής μήτρας κάθε ομάδας φαίνεται στον Πίνακα 3. Σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου, τα αποτελέσματα των άλλων ομάδων ήταν σημαντικά διαφορετικά. Βρέθηκε ότι το TGCD που ελήφθη από 20 διαφορετικές μεθόδους καθαρισμού άσκησαν οιστρογονικές δράσεις.

Επιβεβαιωτικό πείραμα

Τα ολοκληρωμένα αποτελέσματα της δοκιμής ανάπτυξης CCD και μήτρας έδειξαν ότι η βέλτιστη μέθοδος καθαρισμού θεωρήθηκε ότι ήταν με συγκέντρωση υγρού έκλουσης (αιθανόλη) 85 τοις εκατό και όγκο 25 BV σε pH 11.

διαδικασία επικύρωσης, η μέση απόδοση των συνολικών γλυκοσιδών ήταν 70,9150 τοις εκατό. Η μέση απόκλιση μεταξύ των προβλεπόμενων και των πραγματικών τιμών ήταν 2,1180 τοις εκατό. Ως εκ τούτου, μπορεί να προταθεί ότι η προβλεψιμότητα και η πειραματική αξιοπιστία αυτού του μοντέλου είναι καλές.

Ταυτοποίηση του TGCD μετά τον καθαρισμό

Με βάση τον χρόνο κατακράτησης και τα δεδομένα MS, εικάζονται 21 φυσικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων καμπνεοσίδης 1, 2'-ακετυλολακτεοσίδης, κιστανοζίτης Α, κιστανοσίδης Β, συριγγαλίδης Α 3'- - L-ραμνοπυρανοσίδης, τουμπουλοσίδης Α, τουμπουλοσίδης Β, σαλιδροσίδης, κιστανοσίδη G, τενιποσίδιο οξύ, δεκαφεοϋλακτεοσίδη, 8-επιλογανικό οξύ, εχινακοσίδη, κιστανοζίτη F, κισταντοβουλοσίδη Β1, ισοακτεοσίδη, ακτεοσίδη, cis-ακτεοσίδη, κανκανοσίδη Ε, οσμανθουσίδη Β, και ρετανοσίδης/ΜS, χρόνος C. Οι πληροφορίες MS, ο τύπος και οι εικαζόμενες ενώσεις φαίνονται στον Πίνακα 4.

Το Q-TOF-MS είναι ιδιαίτερα κατάλληλο για τη δομική ταυτοποίηση πολύπλοκων μοριακών συστατικών φαρμάκων και τροφίμων επειδή μπορεί να παρέχει πιθανές στοιχειώδεις συνθέσεις μέσω της ακριβούς μοριακής μάζας και των δομικών χαρακτηριστικών των ιόντων θραυσμάτων. Για την καθιέρωση ενός συστηματικού δομικού χαρακτηρισμού, χρησιμοποιήθηκαν επίσης δεδομένα Q-TOF-MS, MS, αναζήτηση βάσεων δεδομένων και δημοσιευμένη βιβλιογραφία αναφοράς για ταυτοποίηση. Ο μοριακός τύπος κάθε συστατικού στόχου συνήχθη από το μητρικό ιόν και αντιστοιχίστηκε με τις γνωστές ενώσεις. Αυτός ο τύπος θα μπορούσε να προσδιοριστεί περαιτέρω από τα σχετικά ιόντα θραύσματος. Για παράδειγμα, η κορυφή 5 έδειξε ένα κυρίαρχο αποπρωτονιωμένο ιόν σε m/z 654 (C30H38O16), το οποίο ήταν πανομοιότυπο με τη στοιχειακή σύνθεση του καμπνεοζίτη 1. Η απώλεια καφεοϋλίου σχηματίστηκε από ένα ιόν θραύσματος σε m/z 493 και η απώλεια Το τμήμα rha σχηματίστηκε από ένα ιόν θραύσματος σε m/z 347.

συμπέρασμα

Χρησιμοποιώντας μια τεχνολογία LC-Q-TOF-MS, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε πλήρως μια απλή και ισχυρή μέθοδος ποιοτικής ανάλυσης για το TGCD. Τα δεδομένα επικύρωσης για τον έλεγχο και την ταυτοποίηση των φυσικών ενώσεων από το TGCD ήταν ικανοποιητικά. Είκοσι μία βιοδραστικές ενώσεις από το TGCD εικάζονται ως εξής: σαλιδροσίδη, κιστανοσίδη G, γενιποσιδικό οξύ, δεκαφεοϋλακτεοσίδη, καμπνεοσίδη 1, 8-επιλογανικό οξύ, 2'-ακετυλολακτεοσίδη, κιστανοσίδη Α, συστανοσίδη{93' Β, }}L-ραμνοπυρανοσίδη, εχινακοσίδη, κιστανοσίδη F, κισταντουβουλοσίδη Β1, ισοακτεοσίδη, ακτεοσίδη, τουμπουλοσίδη Α, cis-ακτεοσίδη, κανκανοσίδη Ε, οσμανθουσίδη Β, κιστανοσίδη C και τουμπουλοσίδη Β. Ο δομικός χαρακτηρισμός αυτών των ενώσεων μπορεί να προσφέρει τον ποιοτικό τους έλεγχο και την περαιτέρω κλινική εφαρμογή τους λόγω της οιστρογονικής τους δράσης. Αυτό μπορεί να προσφέρει μια νέα και βελτιωμένη θεραπευτική επιλογή για τη θεραπεία του μετεμμηνοπαυσιακού συνδρόμου, αποφεύγοντας έτσι τις παρενέργειες και τις ανεπιθύμητες ενέργειες της θεραπείας με οιστρογόνα.

Συντομογραφίες

TGCDCistanche deserticolaολικές γλυκοσίδες LC/Q-TOF-MS υγρή χρωματογραφία/τετραπολική φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης

Μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης RSM

Κεντρικό σύνθετο σχέδιο CCD

Φασματομετρία μάζας MS HPLC/Q-TOF-MS Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης/ Φασματομετρία μάζας τετραπολικού χρόνου πτήσης

ACN Ακετονιτρίλιο

Όγκος κρεβατιού BV

OD συνολική επιθυμία

LC-MS υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας

Q-TOF-MS τετραπολική φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης

Παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα TCM

Σχετική τυπική απόκλιση RSD

Ευχαριστίες

Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ. 81073015), το Επιστημονικό Ίδρυμα Φύσης της επαρχίας Heilongjiang (ZD2017014), το σχέδιο κατάρτισης νέων καινοτόμων ταλέντων του Κολλεγίου στην επαρχία Heilongjiang (UNPYSCT- 2017209). Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων σχετικά με τη δημοσίευση της παρούσας εργασίας.

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δεν δηλώνουν σύγκρουση συμφερόντων.

βιβλιογραφικές αναφορές

[1] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Phenylethanoid glycosides with anti-ifefλεγμονώδεις δράσεις από τους μίσχους του Cistanche deserticola καλλιεργημένο στην έρημο Tarim, Fitoterapia, 2013, 89, {{4} }.

[2] Guo Y., Cao L., Zhao Q., Zhang L., Chen J., Liu B., Zhao B., Preliminary χαρακτηρισμοί, η αντιοξειδωτική και ηπατοπροστατευτική δραστηριότητα του πολυσακχαρίτη από Cistanche deserticola, International Journal of Biological Macromolecules , 2016, 293, 678-685.

[3] Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y., Tu PF, Αντιφλεγμονώδη ιριδοειδή από τους μίσχους του Cistanche deserticola καλλιεργημένο στην έρημο Tarim, Chinese Journal of Natural Medicines, 2016, 14, 61-65.

[4] Peng F., Chen J., Wang X., Xu C., Liu T., Xu R., Changes in Levels of Phenylethanoid Glycosides, Antioxidant Activity, and Other Quality Traits in Cistanche deserticola Slices by Steam Processing, Chemical και Pharmaceutical Bulletin (Τόκιο), 2016, 64, 1024-1030.

[5] Wang T., Zhang X., Xie W., Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": a review, The American Journal of Chinese Medicine, 2012, 40, 1123-1141.

[6] Song Y., Song Q., Li J., Zhang N., Zhao Y., Liu X., Jiang Y., Tu P., Μια ολοκληρωμένη στρατηγική για την ποσοτική διαφοροποίηση του χαμομηλιού μεταξύCistanche deserticolaκαι C. tubulosa χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία-υβριδική φασματομετρία μάζας τριπλής τετραπολικής γραμμικής παγίδας ιόντων, Journal of Chromatography A, 2016, 1429, 238-247.

[7] Li Y., Peng Y., Wang M., Zhou G., Zhang Y., Li X., Ταχεία εξέταση και ταυτοποίηση των διαφορών μεταξύ μεταβολιτών τουCistanche deserticolaκαι εκχύλισμα νερού C. tubulosa σε αρουραίους με ανάλυση συνδυασμένης αναγνώρισης προτύπων UPLC-Q-TOF-MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2016, 131, 364-372.

[8] Li WL, Sun XM, Song H., Ding JX, Bai J., Chen Q., HPLC/Q-TOF-MS-Based Identification of Absorbed Constituents and Their Metabolites in Rat Serum and Urine after Lauring of Cistanche deserticola Extract, Journal of Food Science, 2015, 80, H2079-2087.

[9] Almasi A., Dargahi A., Mohamadi M., Biglari H., Amirian F., Raei M., Removal of Penicillin G by the combination of sonolysis and Photocatalytic (sono-photocatalytic) διεργασία από υδατικό διάλυμα: βελτιστοποίηση διαδικασίας χρησιμοποιώντας RSM (Μεθοδολογία Επιφανείας Απόκρισης), Electron Physician, 2016, 8,

[10] 2878-2887. Hou W., Zhang W., Chen G., Luo Y., Optimization of Extraction Conditation for Maximal Phenolic, Flavonoid and Antioxidant Activity from Melaleuca bract Leaves Using the Response Surface Methodology, PloS One, 2016, 11,

[11] e0162139. Pooralhossini J., Ghaedi M., Zanjanchi MA, Asfaram A., Η επιλογή της υποβοηθούμενης από υπερήχους εκχύλισης σε συνδυασμό με φασματοφωτομετρία για τον γρήγορο προσδιορισμό του γαλλικού οξέος σε δείγματα νερού: Κεντρικός σύνθετος σχεδιασμός για βελτιστοποίηση μεταβλητών διεργασίας, Ultrasonics Sonochemistry, 2407 , 692- 699.

[12] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Structural characterization and identification of phenylethanoid glycosides fromCistanches deserticola YC Maαπό UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochemical Analysis, 2012, 23, 668-676.

[13] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Quantitative analysis of Cistanches Herba χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με ανίχνευση διάταξης διόδων και υψηλής φασματομετρία μάζας ανάλυσης σε συνδυασμό με χημειομετρικές μεθόδους. Journal of Separation Science, 2013, 36, 1945-1952.

[14] Li WL, Chen Q., Yang B., Gao S., Zhang JJ, Screening of phyto-estrogenic αποτελεσματικά εκχυλίσματα και δόσηCistanche deserticola, Chinese Herbal Medicines, 2013, 5, 292-296.

[15] Li YP, Huang FR, Dong J., Xiao C., Xian RY, Ma ZG, Zhao J., Rapid Identification of Cistanche via Fluorescence Spectrum Imaging Technology Combined with Principal Components Analysis and Fisher Distinction, Guang Pu Xue Yuang Pu Fen Xi, 2015, 35, 689-694.