Το εκχύλισμα σπόρων Phoenix Dactylifera L. Επιδεικνύει αντιοξειδωτικά αποτελέσματα και εξασθενεί τη μελανογένεση

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang-Ping Ko3 και Τσονγκ-Μιν Τσανγκ2,*

Αφηρημένη:Ιστορικό: Ο τρόπος δράσης του εκχυλίσματος σπόρων Phoenix dactylifera στην περιποίηση της επιδερμίδας δεν έχει διερευνηθεί ποτέ. Μέθοδοι: Οι σπόροι P. dactylifera L. εκχυλίστηκαν με εκχύλιση με υπερήχους. Τα αντιοξειδωτικά χαρακτηριστικά του εκχυλίσματος προσδιορίστηκαν με 2,2-διφαινυλ-1-πικρυυλυδραζυλ (DPPH) και 2,2'-αζινο-δι-(3-αιθυλβενζοθειαζολινο σουλφονικό οξύ) (ABTS plus) δοκιμασίες και μέθοδοι καθαρισμού. Διερευνήθηκαν επίσης η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικό περιεχόμενο, η αναγωγική ικανότητα, η χηλοποίηση ιόντων σιδήρου (II) και οι ικανότητες σάρωσης ειδών ενδοκυτταρικής αντίδρασης οξυγόνου (ROS). Τα αποτελέσματα του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στη μελανογένεση αξιολογήθηκαν φασματοφωτομετρικά με μια δοκιμασία δραστικότητας τυροσινάσης μανιταριού, προσδιορισμό της ενδοκυτταρικής δραστικότητας τυροσινάσης και της περιεκτικότητας σε μελανίνη. Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μελανογένεση αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το Π.dactylifera L.Το εκχύλισμα σπόρων άσκησε εμφανή αντιοξειδωτική ικανότητα και μείωσε σημαντικά την ενδοκυτταρική περιεκτικότητα σε ROS σε συγκεντρώσεις {{0}}, 245 και 0,49 (mg/mL). Επιπλέον, το εκχύλισμα μείωσε την έκφραση του υποδοχέα μελανοκορτίνης 1 (MC1R), του μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF), της τυροσινάσης, της πρωτεΐνης που σχετίζεται με τυροσινάση-1 (TRP1) και της πρωτεΐνης που σχετίζεται με την τυροσινάση-2 ( TRP2) και ανέστειλε τη μελανογένεση σε κύτταρα B16F10. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. εξασθένησε τη μελανογένεση στα κύτταρα B16F10 με τη μείωση της ρύθμισης των οδών σηματοδότησης της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA). Ως εκ τούτου, το εκχύλισμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένας τύπος παράγοντα λεύκανσης του δέρματος σε προϊόντα περιποίησης δέρματος.

Λέξεις-κλειδιά: Phoenix dactylifera;τυροσινάση; μελανίνη; ROS; PKA

cistanche pharma specialείναι ένας τύπος παράγοντα λεύκανσης του δέρματος.

1. Εισαγωγή

Τα αντιοξειδωτικά έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την πρόληψη ή τη θεραπεία διαταραχών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες σε καλλυντικά και δερματολογικά πεδία. Τις τελευταίες δεκαετίες, τα αντιοξειδωτικά έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί στη βιομηχανία καλλυντικών για την πρόληψη ή την καθυστέρηση της γήρανσης του δέρματος. Αναφέρεται ότι οι ελεύθερες ρίζες και τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σχετίζονται με διάφορες ασθένειες, όπως η γήρανση και οι ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία [1]. Είναι ενδιαφέρον ότι η βλάβη από τις ελεύθερες ρίζες στο δέρμα που προκαλείται από το στρες από την υπεριώδη ακτινοβολία και τα ROS παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της φωτογήρανσης του δέρματος [2,3]. Αναφέρεται ότι τα αντιοξειδωτικά παρεμβαίνουν στη διαδικασία οξείδωσης με τη δέσμευση των ελεύθερων ριζών και των ROS ή με τη χηλοποίηση των οξειδωτικών-καταλυτικών μετάλλων [4]. Ως εκ τούτου, υπήρξε μια δραματική αύξηση στον αριθμό των εφαρμογών αντιοξειδωτικών ή αντιοξειδωτικών συμπληρωμάτων διατροφής για τη μείωση του οξειδωτικού στρες ή της βλάβης που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες στο σώμα [5,6]. Ωστόσο, ορισμένα χημικά αντιοξειδωτικά, όπως το ασκορβικό νάτριο, η τριτ-βουτυλ υδροξυανισόλη (BHA), το ερυθορβικό νάτριο και το τριτ-βουτυλ υδροξυτολουόλιο (BHT), έχει αποδειχθεί ότι προάγουν τις καρκινογόνες επιδράσεις στην ανθρώπινη υγεία [7]. Ως εκ τούτου, η ταχεία ανάπτυξη των μελετών για φυσικά αντιοξειδωτικά φυτικής προέλευσης έχει συμβεί τις τελευταίες δεκαετίες. Είναι σημαντικό ότι διαπιστώθηκε ότι οι αυξήσεις στο επίπεδο των ROS μπορούν να επιταχύνουν τη μελάγχρωση του δέρματος. Μεταξύ των ROS που προέρχονται από μελανοκύτταρα και κερατινοκύτταρα, το μονοξείδιο του αζώτου, το ΝΟ, διεγείρει τη σύνθεση μελανίνης ενισχύοντας τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης της τυροσινάσης και της πρωτεΐνης 1 που σχετίζεται με την τυροσινάση (TRP1) [8,9]. Η επίδραση του ROS στην παραγωγή μελανίνης έχει μελετηθεί χρησιμοποιώντας διάφορα αντιοξειδωτικά, όπως η Ν-ακετυλοκυστεΐνη, για την εξάλειψη της δράσης της διεγερτικής από την UVB ορμόνης διεγέρσεως μελανοκυττάρων (-MSH) [10].

Η μελανίνη παράγεται και εκκρίνεται από μελανοκύτταρα που κατανέμονται στο βασικό στρώμα της επιδερμίδας του δέρματος [11]. Τα δύο πρώτα στάδια της οδού μελανογένεσης στους ανθρώπους είναι η υδροξυλίωση της L-τυροσίνης σε 3-4-διυδροξυ φαινυλαλανίνη (L-DOPA) και η οξείδωση της L-DOPA σε ο-ντοπακινόνη. Η τυροσινάση (EC 1.14.18.1) είναι ένα ένζυμο περιορισμού του ρυθμού που καταλύει και τις δύο πρώτες αντιδράσεις κατά τη διάρκεια της μελανογένεσης [12]. Η μελανίνη παίζει ζωτικό ρόλο στην προστασία του δέρματος από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) και είναι επίσης υπεύθυνη για το χρωματισμό των μαλλιών, του δέρματος και των ματιών. Έχει αναφερθεί ότι διάφορες δερματολογικές διαταραχές, όπως κηλίδες ηλικίας, μέλασμα, μεταφλεγμονώδη μελανόδερμα, πανάδες και σημεία ακτινικής βλάβης, που προκύπτουν από τη συσσώρευση υπερβολικού επιπέδου μελανίνης της επιδερμίδας [13]. Οι αναστολείς της σύνθεσης μελανίνης έχουν εφαρμοστεί ολοένα και περισσότερο σε προϊόντα περιποίησης δέρματος για τη θεραπεία ή την πρόληψη υπερμελάγχρωσης του δέρματος [14,15]. Επιπλέον, αντιοξειδωτικά, όπως η αρβουτίνη ή το κοτζικό οξύ [16], έχουν χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία της υπερμελάγχρωσης [17]. Πρόσφατα, τα καλλυντικά λεύκανσης του δέρματος αντιπροσωπεύουν ένα μεγάλο ποσοστό των καλλυντικών προϊόντων. Όχι μόνο οι γυναίκες με σκούρο δέρμα, αλλά και εκείνες που προσπαθούν να αντιμετωπίσουν τις σκούρες κηλίδες στο δέρμα τους που προκύπτουν από την υπεριώδη ακτινοβολία, την εγκυμοσύνη ή την αυξημένη ηλικία χρησιμοποιούν ευρέως αυτά τα προϊόντα λεύκανσης του δέρματος.

Η μελανογένεση ρυθμίζεται από πολλούς παράγοντες. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη που σχετίζεται με τυροσινάση-1 (TRP1), ο μεταγραφικός παράγοντας που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF) και η πρωτεΐνη που σχετίζεται με την τυροσινάση-2 (TRP2) αναφέρθηκε ότι ρυθμίζει την παραγωγή μελανίνης [18-20 ]. Ο υποδοχέας μελανοκορτίνης 1 (MC1R) έχει επίσης εμφανή χαρακτηριστικά στην επαγόμενη από -MSH σύνθεση μελανίνης [21]. Υπάρχουν πολλά μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην παραγωγή μελανίνης. Μεταξύ των διαφορετικών οδών σηματοδότησης που ρυθμίζουν την παραγωγή μελανίνης, η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA) με τη μεσολάβηση της κυκλικής AMP (cAMP) διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της μελανογένεσης [22]. Στην οδό σηματοδότησης cAM-PKA, η cAMP επάγει την ενεργοποίηση της PKA [23], η οποία ακολουθείται από φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης που δεσμεύει το στοιχείο απόκρισης cAMP (CREB). Το CREB είναι ένας παράγοντας ενδοκυτταρικής μεταγραφής που διεγείρει την έκφραση του γονιδίου του παράγοντα μικροφθαλμίας (MITF), το οποίο είναι σημαντικό στη μελανογένεση. Το MITF είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που συνδέεται με τις περιοχές προαγωγέα των μελανογόνων γονιδίων τυροσινάση, TRP1 και TRP2, ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφρασή τους [24,25]. Στη συνέχεια, η περιεκτικότητα σε ενδοκυτταρική μελανίνη αυξάνεται [26]. Έχει αναφερθεί ότι το -MSH αυξάνει τα επίπεδα cAMP και συνήθως εφαρμόζεται για να ενεργοποιήσει τη φωσφορυλίωση του CREB και στη συνέχεια να ενισχύσει τα επίπεδα πρωτεΐνης MITF [27].

Η έκφραση του MITF ρυθμίζεται από διάφορα μονοπάτια σηματοδότησης. Η N-τερματική κινάση c-Jun (JNK) και η ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (MAPK) ρ38 εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της έκφρασης MITF και στην επακόλουθη αυξημένη έκφραση τυροσινάσης. Τα σήματα ενεργοποίησης της εξωκυτταρικής απόκρισης κινάσης (ERK) αυξάνουν επίσης τη φωσφορυλίωση CREB και την επακόλουθη έκφραση MITF, η οποία ρυθμίζει τη σύνθεση μελανίνης [28,29]. Ως εκ τούτου, αναφέρθηκε ότι αρκετοί παράγοντες λεύκανσης του δέρματος αναστέλλουν τη μεταγραφική δραστηριότητα του MITF μειώνοντας τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης της τυροσινάσης, TRP1 και TRP2 μέσω μείωσης της ρύθμισης της φωσφορυλίωσης MITF με τη μεσολάβηση p38MAPK. Επιπλέον, η οδός ERK έχει περιγραφεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση του MITF κατά τη διάρκεια της μελανογένεσης [30,31]. Η ενεργοποίηση του ERK φωσφορυλιώνει το MITF, οδηγώντας σε αποικοδόμηση του MITF, με αποτέλεσμα τη μείωση της περιεκτικότητας σε μελανίνη [32,33].

Το οξειδωτικό στρες μπορεί να είναι αποτέλεσμα είτε υπερπαραγωγής ROS είτε μειωμένης αντιοξειδωτικής άμυνας [1]. Η αναζήτηση και οι εφαρμογές των φυσικών αντιοξειδωτικών παραμένουν στο επίκεντρο πολλών ερευνητικών ομάδων σε όλο τον κόσμο. Πρόσφατα, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για την έρευνα και την ανάπτυξη φυτοχημικών ουσιών, όπως φυσικά αντιοξειδωτικά και φαινολικές ενώσεις από διάφορες φυσικές πηγές, που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως διατροφικά, αντιγηραντικά καλλυντικά και φαρμακευτικά προϊόντα [34]. Το Phoenix dactylifera L. είναι μία από τις σημαντικότερες καλλιέργειες φρούτων που παράγονται στη Μέση Ανατολή και τη Βόρεια Αφρική [35,36]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα φρούτα P. dactylifera L. παρουσιάζουν αντιοξειδωτική, δέσμευση ελεύθερων ριζών, αντιμικροβιακή και αντιφλεγμονώδη δράση [37,38]. Οι λειτουργικές επιδράσεις του P. dactylifera L. δεν περιορίζονται μόνο στους ίδιους τους καρπούς αλλά και στους σπόρους τους, οι οποίοι είναι ένα είδος υποπροϊόντος των καρπών [39,40]. Λόγω των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων του, τα εκχυλίσματα σπόρων P. dactylifera L. θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πηγή αντιοξειδωτικών ουσιών που δρουν κατά του οξειδωτικού στρες [41-43]. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν διεξαχθεί σχετικά με τις εφαρμογές των σπόρων P. dactylifera L. για την ανάπτυξη καλλυντικών προϊόντων. Αυτοί οι σπόροι συνήθως απορρίπτονται ως απόβλητα, αλλά η σημασία τους ως λειτουργικό καλλυντικό συστατικό τονίζεται εδώ. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν υπάρξει αναφορές σχετικά με τον μηχανισμό δράσης του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στον τομέα των καλλυντικών περιποίησης του δέρματος ή τις επιδράσεις του εκχυλίσματος σπόρων στην παραγωγή μελανίνης. Το επίκεντρο της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η δυνατότητα του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. ως αναστολέα μελανογένεσης για τη βιομηχανία καλλυντικών.

Οι μηχανισμοί που διέπουν τις ανασταλτικές επιδράσεις του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στη μελανογένεση δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τα αντιοξειδωτικά χαρακτηριστικά και τους πιθανούς μηχανισμούς δράσης του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στη μελανογένεση, εξετάζοντας τους ρυθμιστές μεταγραφής MITF και τη φωσφορυλίωση των ρυθμιστών των μονοπατιών σηματοδότησης MAPK και PKA.

φρέσκο ​​κιστάνι

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Χημικά και Αντιδραστήρια

Τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, ΗΠΑ). Τα αντισώματα ήταν από την Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA) και το αντιδραστήριο ECL ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ).

2.2. Παρασκευή και εκχύλιση εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera

Οι αποξηραμένοι καρποί P. dactylifera L. συγκομίστηκαν το 2019 από παραδοσιακά καταστήματα που βρίσκονται στην πόλη Medina της Σαουδικής Αραβίας. Οι σπόροι P. dactylifera L. πλύθηκαν πλήρως, εκτέθηκαν στο φως του ήλιου, ξηράνθηκαν στον αέρα για μία ημέρα και στη συνέχεια ξηράνθηκαν στους 80 ◦C για 2 ώρες σε φούρνο. Οι αφυδατωμένοι σπόροι κονιοποιήθηκαν σε λεπτή σκόνη (#50 mesh) με ένα δεσμευμένο μύλο (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, Type ZM1, Haan, Γερμανία). Η σκόνη συλλέχθηκε σε σφραγισμένη γυάλινη φιάλη και αποθηκεύτηκε στους 25 ◦C μέχρι τη χρήση. Η κονιοποιημένη αποξηραμένη σκόνη σπόρων P. dactylifera L. (2 g) τοποθετήθηκε σε ένα ποτήρι εκχύλισης που περιείχε 10 mL απεσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε εξαγωγή υπερήχων με το μοντέλο ULTRAsonikTM 57H (250 W, C, and A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA). Η συχνότητα εργασίας ήταν 45 kHz για 30 λεπτά. Μετά την εκχύλιση, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 4500 rpm για 50 λεπτά στους 25 ◦C με φυγόκεντρο Eppendorf 5810 R (Αμβούργο, Γερμανία). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και διηθήθηκαν με νάιλον φίλτρο (μέγεθος πόρων: 0,45 μm) και το διήθημα συμπυκνώθηκε στα 9,8 mg/mL.

2.3. Υγρή χρωματογραφία υπεραπόδοσης (UPLC) Ανάλυση εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera και φερουλικού οξέος

Το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ACQUITY UPLC Η τάξης με ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδου (Waters, Milford, ΜΑ, ΗΠΑ). Η στήλη ήταν στήλη ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm. Η κινητή φάση Α ήταν 0,5 τοις εκατό οξικό οξύ και η κινητή φάση Β ήταν ακετονιτρίλιο. Για τα χρονικά σημεία 0 και 5 λεπτά, η ποσοστιαία αναλογία A/B ήταν 95/5. για 20 λεπτά, η ποσοστιαία αναλογία Α/Β ήταν 5/95. για τα χρονικά σημεία 21 και 25 λεπτά, η ποσοστιαία αναλογία Α/Β ήταν 95/5. Ως θετικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε φερουλικό οξύ (1 ppm).

2.4. Δοκιμασία δραστηριότητας σάρωσης DPPH

Σε αυτή τη δοκιμασία, η βιταμίνη C ({0}},5 mg/mL) και το BHA (0,1 mg/mL) χρησιμοποιήθηκαν ως αντιοξειδωτικά πρότυπα. Το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. σε διάφορες συγκεντρώσεις (0.0049, 0,0245 και 0,049 mg/mL) προστέθηκε σε 2,9 mL διαλύματος DPPH (60 μΜ). Τα αντιοξειδωτικά συστατικά στο εκχύλισμα σπόρων θα μπορούσαν να δωρίσουν υδρογόνο στο DPPH και να μετατρέψουν το DPPH στην ανηγμένη μορφή. Η προκύπτουσα μείωση στην απορρόφηση στα 517 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV-Vis [44].

2.5. ABTS plus Scavenging Capacity Assay

Η ικανότητα σάρωσης ABTS συν του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. συγκρίθηκε με εκείνες της βιταμίνης C ({0}},9 mg/mL) και του BHA ({{10}}). 9 mg/mL). Για αυτόν τον προσδιορισμό χρησιμοποιήθηκε το ABTS plus. Κατιόν παρήχθη πρώτα με αντίδραση του διαλύματος ABTS (7 mM) με υπερθειικό κάλιο (2,45 mM) και το μίγμα αφέθηκε να παραμείνει στο σκοτάδι για τουλάχιστον 6 ώρες πριν από τη χρήση. Η απορρόφηση στα 734 nm μετρήθηκε 10 λεπτό μετά την ανάμειξη διαφορετικών συγκεντρώσεων του εκχυλίσματος σπόρων (0,0098, 0,049 και 0,098 mg/mL) με 1 mL διαλύματος ABTS συν [45].

2.6. Προσδιορισμός Ολικής Φαινολικής Περιεκτικότητας

Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu [46] και ως θετικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε γαλλικό οξύ (2 ug/mL). Διαφορετικές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. (0.0196, 0.{10}}98 και 0,196 mg/mL) παρασκευάστηκαν σε 80 τοις εκατό μεθανόλη. 100 μL εκχυλίσματος μεταφέρθηκαν σε δοκιμαστικό σωλήνα και προστέθηκαν 0,5 mL αντιδραστηρίου Folin–Ciocalteu (προηγουμένως αραιωμένο 10-πάσο με απιονισμένο νερό) και αναμίχθηκαν. Το μίγμα αφέθηκε να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Προστέθηκε 1,5 mL ανθρακικού νατρίου 20 τοις εκατό. Μετά από παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, η απορρόφηση διαβάστηκε στα 760 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV-Vis.

2.7. Προσδιορισμός Μειωτικής Ικανότητας

Βιταμίνη C ({{0}}.008 mg/mL) ή BHA (4,8 mg/mL) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικά πρότυπα σε αυτή τη δοκιμασία. Η αναγωγική ικανότητα του εκχυλίσματος σπόρων προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Oyaizu [47]. Διάφορες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. (0.0073, 0,036, 0,073 mg/mL) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (2,5 mL, 0,2 Μ, ρΗ 6,6 ) και σιδηροκυανιούχο κάλιο [K3Fe (CN)6] (2,5 mL, 1 τοις εκατό w/v). Το μίγμα επωάστηκε στους 50°C για 20 λεπτά. Τριχλωροξικό οξύ (2,5 mL, 10 τοις εκατό w/v) προστέθηκε στο μίγμα, το οποίο στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 1000 χ g για 10 λεπτά. Το ανώτερο στρώμα του διαλύματος (2,5 mL) αναμίχθηκε με απεσταγμένο νερό (2,5 mL) και FeCl3 (0,5 mL, 0,1 τοις εκατό w/v) και μετρήθηκε η απορρόφηση στα 700 nm.

2.8. Μέτρηση ικανότητας χηλοποίησης ιόντων σιδήρου (II).

Για τη μέτρηση της ικανότητας χηλικοποίησης Fe2 συν -ιόντων του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L., EDTA (0.02, 0.04 και { {10}}.08 mg/mL) χρησιμοποιήθηκε ως θετικό πρότυπο. Διαφορετικές συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος σπόρων (0.0196, 0.098 και 0.196 mg/mL) προστέθηκαν σε διάλυμα FeCl2 (0.05 mL, 1 mM). Το μίγμα της αντίδρασης αντέδρασε με φερροζίνη (0,1 mL, 1 mM), στη συνέχεια το μίγμα προσδιορίστηκε ποσοτικά σε 1 mL με μεθανόλη και επωάστηκε στους 25°C για 10 λεπτά. Η απορρόφηση του μίγματος της αντίδρασης μετρήθηκε στα 562 nm [48].

2.9. Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Ο προσδιορισμός βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΜΤΤ [49]. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. (0.049, 0.245 και 0,49 mg/mL) για 24 ώρες στους 37 ◦C και 5 τοις εκατό CO2 σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα και το διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε στα φρεάτια. Το αδιάλυτο παράγωγο του ΜΤΤ διαλυτοποιήθηκε με αιθανόλη-DMSO (διάλυμα μίγματος 1:1). Η απορρόφηση των φρεατίων στα 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Τα κύτταρα B16F10 (BCRC60031) ελήφθησαν από το Bioresource Collection and Research Center (BCRC), πόλη Hsinchu, Ταϊβάν. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό και 1 τοις εκατό αντιβιοτικά. Επιπλέον, η επίδραση του σπόρου P. dactylifera L. στη βιωσιμότητα των κυττάρων B16F10 αξιολογήθηκε επίσης με τη μέθοδο προσδιορισμού αποκλεισμού μπλε του τρυπανίου. Μετά την επεξεργασία με το εκχύλισμα σπόρων, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θρυψίνη και φυγοκεντρήθηκαν για να συλλεχθεί το ίζημα. Το σφαιρίδιο κυττάρων επαναιωρήθηκε σε 300 μL μέσου κυτταροκαλλιέργειας DMEM. Ένα μικρό δείγμα εναιωρήματος κυττάρων (20 μL) αναμείχθηκε απαλά με 10 μL μπλε τρυπάνης (4 τοις εκατό σε PBS). Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε (τα μη βιώσιμα κύτταρα ήταν μπλε και τα βιώσιμα κύτταρα χωρίς χρώση) χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο κάτω από το μικροσκόπιο.

2.10. Μέτρηση Δραστικότητας Τυροσινάσης Μανιταριού

Το διάλυμα τυροσινάσης μανιταριού (10 μL, 200 μονάδες) προστέθηκε σε μια μικροπλάκα 96-πηγαδιού. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 5 mM L-DOPA διαλυμένο σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) (50 mM, ρΗ 6,8) και εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. (0.049, 0,245 και 0,49 mg/mL), κοζικό οξύ (200 mM, 0,03 mg/mL), ή αρβουτίνη (2 mM, 0,54 mg/mL). Το μίγμα της δοκιμασίας επωάστηκε στους 37◦C για 30 λεπτά και η απορρόφηση του παραγόμενου ντόπαχρωμου μετρήθηκε στα 490 nm. Η μέτρηση της δραστηριότητας της τυροσινάσης μανιταριού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [50].

2.11. Προσδιορισμός Περιεκτικότητας Μελανίνης

Τα κύτταρα B16F10 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με -MSH (100 nM) για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. (0,0245–0,147 mg/mL) ή αρμπουτίνη (0,54 mg/mL) για επιπλέον 24 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κυτταρικά σφαιρίδια διαλυτοποιήθηκαν σε διάλυμα NaOH (1 Ν) στους 60°C για 60 λεπτά. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη ανιχνεύθηκε στα 405 nm, όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τον Tsuboi [51].

Το Cistanche αναστέλλει την παραγωγή μελανίνης.

2.12. Μέτρηση Ενδοκυττάριας Δραστικότητας Τυροσινάσης

Η ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [52]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με -MSH (100 nM) για 24 ώρες και στη συνέχεια με εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. (0.0245–0,147 mg). /mL) ή αρβουτίνη (0,54 mg/mL) για 24 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κυτταρικά εκχυλίσματα (100 μL) αναμίχθηκαν με πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα L-DOPA (0,1 τοις εκατό σε PBS) και επωάστηκαν στους 37 ◦C και μετρήθηκε η απορρόφηση στα 490 nm.

2.13. Πείραμα Western Blotting

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49, και 0.147 mg/mL) ή αρβουτίνη (0,54 mg/mL) και στη συνέχεια λύθηκε σε PBS που περιέχει μη διαιτητικό P-40 (1 τοις εκατό), δεοξυχολικό νάτριο (0,5 τοις εκατό), δωδεκυλικό νάτριο θειικό (SDS, 0,1 τοις εκατό), απρωτινίνη (5 ug/mL), φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (100 ug/mL), πεπστατίνη Α (1 ug/mL) και EDTA (1 mM) στους 4°C για 20 λεπτά. Τα συνολικά προϊόντα λύσης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Οι πρωτεΐνες (30 ug) διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 5 τοις εκατό γάλα χωρίς λιπαρά σε PBST (PBS με 0,05 τοις εκατό Tween-20) και επωάστηκε στους 4 ◦C όλη τη νύχτα με τα ακόλουθα κύρια αντισώματα αραιωμένα σε PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), τυροσινάση Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) και CERB Ab (1:200), όλα από τη Santa Cruz Biotech (Ντάλας, Τέξας, ΗΠΑ)). Τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου δευτερεύον αντίσωμα (Amersham Corp.) που ακολουθείται από σύστημα ανίχνευσης ECL (Amersham) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.14. Δοκιμασία αναστολέα PKA

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με -MSH (100 nM) για 24 ώρες και ακολούθησε 1 ώρα προσθήκη 10 μΜ PKA ρυθμιστή H89. Μετά την επεξεργασία, εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. (0,147 mg/mL) και Η89 προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν για επιπλέον 23 ώρες. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

2.15. Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το post hoc τεστ Tukey, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μετρούμενων δεδομένων, χρησιμοποιώντας το στατιστικό λογισμικό Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) έκδοση 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ΗΠΑ). * p < 0.05="" θεωρήθηκε="" σημαντικό,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. Αποτελέσματα

3.1. Ανάλυση UPLC του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L.

Τα αποτελέσματα της ανάλυσης UPLC φαίνονται στο Σχήμα 1Α, Β. Το Σχήμα 1Α απεικονίζει την επικαλυπτόμενη κορυφή του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. και του φερουλικού οξέος στα 330 nm. Το Σχήμα 1Β δείχνει παρόμοια φάσματα σάρωσης μεταξύ 220 και 500 nm για εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. και φερουλικό οξύ.

3.2. Αντιοξειδωτικά Χαρακτηριστικά του P. dactylifera L. Εκχύλισμα σπόρων

Η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. in vitro αποκάλυψε την παρουσία αντιοξειδωτικού δυναμικού. Στον προσδιορισμό DPPH, βιταμίνη C ({{0}}.05 mM; 0.53 mg/mL) και τριτ-βουτυλ υδροξυανισόλη (BHA) (0 0,1 mg/mL) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικά αντιοξειδωτικά πρότυπα. Η ικανότητα σάρωσης DPPH του εκχυλίσματος ήταν 49,97 ± 2,9 τοις εκατό , 81,36 ± 0,56 τοις εκατό και 78,53 ± 3,83 τοις εκατό του μάρτυρα για τις συγκεντρώσεις εκχυλίσματος του 0.0{{ 31}}49, 0,0245 και 0,049 (mg/mL), αντίστοιχα. Συγκριτικά, οι ικανότητες σάρωσης της βιταμίνης C και BHA ήταν 90,12 ± 0,31 τοις εκατό και 90,44 ± 0,49 τοις εκατό, αντίστοιχα (Εικόνα 2Α).

Αυτό το κατιόν της ρίζας ABTS έχει μπλε χρώμα και αντιδρά στα περισσότερα αντιοξειδωτικά. Κατά τη διάρκεια αυτής της αντίδρασης, το μπλε ριζικό κατιόν ABTS μετατρέπεται ξανά στην άχρωμη ουδέτερη μορφή του. Η αντίδραση παρακολουθήθηκε φασματοφωτομετρικά. Η ικανότητα σάρωσης ABTS plus του εκχυλίσματος ήταν 5,69 ± 1,36 τοις εκατό , 18,81 ± 0,68 τοις εκατό και 66,82 ± 8,51 τοις εκατό του μάρτυρα σε συγκεντρώσεις 0.0{{16 }}98, 0.{{2{0}}49 και 0,098 mg/mL, αντίστοιχα. Αντίθετα, οι ABTS συν ικανότητα σάρωσης της βιταμίνης C (0,9 mg/mL) και του BHA (0,9 mg/mL) ήταν 95,52 ± 0,12 τοις εκατό και 40,3 ± 0,83 τοις εκατό, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2Β δείχνουν ότι το εκχύλισμα σπόρων καθαρίζει μια σημαντική ποσότητα της ρίζας ABTS συν.

Για τον προσδιορισμό της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινολικό περιεχόμενο του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L., χρησιμοποιήθηκε γαλλικό οξύ (2 ug/mL) ως θετικό πρότυπο. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2Γ υποδεικνύουν ότι η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικά σε 0.0196, 0.{{20}}98 και 0. 196 (mg/mL) του εκχυλίσματος ήταν 33,43 ± 2,33 τοις εκατό, 117,22 ± 7,81 τοις εκατό, και 195,4 ± 10,91 τοις εκατό, αντίστοιχα. Τα ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) των προαναφερθέντων συγκεντρώσεων εκχυλισμάτων σπόρων ήταν 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 και 0,642 ± 0,03, αντίστοιχα (Εικόνα 2C).

3.3. Ανασταλτικές Επιδράσεις του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στη μελανογένεση

Τα αποτελέσματα που φαίνονται στο σχήμα 4Α δείχνουν ότι 0.049 mg/mL εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L.δεν άσκησε ανασταλτική επίδραση στη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών. Από την άλλη πλευρά, τα ποσοστά αναστολής του ενζύμου ήταν 8,34 ± 2,67 τοις εκατό και 33 ± 2,36 τοις εκατό του ελέγχου για τα 0.245 και 0.49 mg/mLΕπεξεργασίες εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L., αντίστοιχα. Επιπλέον, τα ποσοστά αναστολής της τυροσινάσης του κοτζικού οξέος (200 μΜ; 0.03 mg/mL) και της αρβουτίνης (2 mM, 0,54 mg/mL ) ήταν 56,26 ± 5,06 τοις εκατό και 64,56 ± 2,88 τοις εκατό του ελέγχου, αντίστοιχα (Εικόνα 4Α). Έτσι, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. (0,245 και 0,49 mg/mL) θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν ανασταλτικά επίπεδα τυροσινάσης μανιταριού.

Στο Σχήμα 4Β, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μόνο 0,147 mg/mL εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε μελανίνη στα κύτταρα μελανώματος B16F10. Μετά τη θεραπεία, η περιεκτικότητα σε μελανίνη στα κύτταρα B16F10 ήταν 80,66 ± 5,43 τοις εκατό αυτής του ελέγχου. Για το θετικό πρότυπο, την αρβουτίνη (0,54 mg/mL), η εναπομένουσα περιεκτικότητα σε ενδοκυτταρική μελανίνη ήταν 61,19 ± 8,17 τοις εκατό αυτής του ελέγχου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 0,147 mg/mL εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. έδειξαν μικρότερα αποτελέσματα από την αρμπουτίνη. Οι υπόλοιπες τιμές δραστικότητας ενδοκυτταρικής τυροσινάσης ήταν 85,1 ± 8,1 τοις εκατό και 73,7 ± 11,9 τοις εκατό για τα 0,098 και 0,147 mg/mL εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L., αντίστοιχα. Η εναπομείνασα ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης ήταν 64,3 ± 14,9 τοις εκατό του μάρτυρα αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αρβουτίνη (Εικόνα 4C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υψηλότερες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. εξακολουθούσαν να παρουσιάζουν μικρότερη ανασταλτική δράση στη δραστηριότητα τυροσινάσης που προκαλείται από -MSH σε κύτταρα B16F10 από ότι η αρμπουτίνη.

3.4. Το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. αναστέλλει τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη μελανινογένεση

Οι κηλίδες Western χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση των επιπέδων έκφρασης πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μελανογένεση σε κύτταρα B16F10 (Εικόνα 5Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα MC1R, MITF, τυροσινάσης, TRP1 και TRP2. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα του εκχυλίσματος στην έκφραση πρωτεΐνης ήταν εμφανή σε συγκέντρωση {{10}},147 mg/mL. Η πολλαπλάσια αλλαγή στο επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης για το MC1R ήταν 0.74 ± 0.02; για το MITF ήταν {{20}}.51 ± 0.03; για την τυροσινάση ήταν 0.54 ± 0.26. για το TRP-1 ήταν 0,57 ± 0,15. και για το TRP-2 ήταν 0,49 ± 0,1 (Εικόνα 5Β).

Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών σηματοδότησης που σχετίζονται με τη μελανογένεση εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας στυπώματα Western (Εικόνα 5C). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επεξεργασία εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. με 0,147 mg/mL προφανώς οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα p-p38, p-JNK, p-ERK και p-CREB. Η πολλαπλάσια αλλαγή του επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης για το p-p38 ήταν 0.88 ± 0.15; για το p-JNK ήταν 0.68 ± 0.39; για το p-ERK ήταν 0.65 ± 0.23; και για το p-CREB ήταν 0.44 ± 0.07 (Εικόνα 5Δ).

3.5. P. dactylifera L. Το εκχύλισμα σπόρων δεν επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση της τυροσινάσης, TRP1, TRP2 ή MITF

Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μελανογένεση, όπως τυροσινάση, TRP1, TRP2 και MITF εξετάστηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR). Τα σχετικά κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης τυροσινάσης/GAPDH για 0.0367, 0.049 και 0.147 mg/mL P. Οι επεξεργασίες εκχυλίσματος σπόρων dactylifera L. ήταν 3,51 ± 0,52, 2,38 ± 0,24 και 1,64 ± 0,55, αντίστοιχα. Για το TRP-1/GAPDH, τα σχετικά κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης για 0.0367, 0.049 και {{4{{43} }}}.147 mg/mL εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. ήταν 1,64 ± 0.2, 1,15 ± 0.02 και 0. 89 ± 0.07, αντίστοιχα. Τα σχετικά κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης του TRP-2/GAPDH για 0.0367, 0.049 και 0.147 mg. /mL εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. ήταν 1.08 ± 0.13, 0.85 ± 0.01 και 0.7 ± 0.05, αντίστοιχα. Για το MITF/GAPDH, τα σχετικά κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης για 0,0367, 0,049 και 0,147 mg/mL εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. ήταν 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 και 0,74 ± 60, αντίστοιχα.

4. Συζήτηση

Έχει αναφερθεί ότι η μελανογένεση αυξάνει το κυτταρικό οξειδωτικό στρες. Επιπλέον, αρκετά αντιοξειδωτικά, σαρωτές ROS, σαρωτές αναστολέων και αναστολείς μπορεί να αναστείλουν τη σύνθεση μελανίνης που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία [54]. Ως εκ τούτου, αντιοξειδωτικά, σαρωτές ROS και αναστολείς της μελανογένεσης εφαρμόζονται όλο και περισσότερο σε καλλυντικά λεύκανσης του δέρματος για την πρόληψη ανεπιθύμητης υπερμελάγχρωσης του δέρματος [14]. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η διέγερση της μεταλλοθειονεΐνης, ενός ενδογενούς αντιοξειδωτικού θα μπορούσε να καταστείλει τη μελανογένεση στα μελανοκύτταρα [55]. Το ανθρώπινο δέρμα εκτίθεται συχνά σε περιβαλλοντικούς οξειδωτικούς ρύπους ή σε υπεριώδη ακτινοβολία και καταστρέφεται από εξωγενείς περιβαλλοντικούς παράγοντες. Συγκεκριμένα, η υπεριώδης ακτινοβολία έχει αναφερθεί ότι προκαλεί τη δημιουργία ROS στο δέρμα και προάγει την υπεροξείδωση των λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης [56]. Για την αντιμετώπιση του οξειδωτικού στρες, το δέρμα είναι εξοπλισμένο με συγκεκριμένα αντιοξειδωτικά συστήματα [57].

Για να αποσαφηνιστεί η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L., DPPH και ABTS συν δραστικότητα σάρωσης ριζών, ολική περιεκτικότητα σε φαινολικά, αναγωγική ικανότητα και ικανότητα χηλοποίησης μεταλλικών ιόντων του εκχυλίσματος προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [47,48]. Το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. άσκησε σημαντικές αντιοξειδωτικές δράσεις σε όλες τις προαναφερθείσες αναλυτικές μελέτες. Τα αποτελέσματα έδειξαν το αντιοξειδωτικό δυναμικό του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. σε διαφορετικά εύρη με διακριτές αποδόσεις. Η δράση σάρωσης DPPH του εκχυλίσματος σπόρων φαίνεται στο Σχήμα 2Α ήταν διαφορετική από αυτή του ABTS plus που φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η οποία μπορεί να προέκυψε από διαφορετικούς μηχανισμούς των αλληλεπιδράσεων αντιοξειδωτικών-ριζών. Επιπλέον, η στοιχειομετρία των αντιδράσεων μεταξύ των αντιοξειδωτικών συστατικών στο εκχύλισμα σπόρων μπορεί να ποικίλλει, γεγονός που οδηγεί σε διαφορά στην ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών [58]. Τα πιθανά αντιοξειδωτικά στο εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. θα μπορούσαν να μετατρέψουν ένα σύμπλοκο Fe3 συν/σιδηροκυανιούχου στη σιδηρούχα μορφή και η αναγωγική ικανότητα χρησίμευσε ως δείκτης της αντιοξειδωτικής δράσης του εκχυλίσματος σπόρων που φαίνεται στο Σχήμα 2D. Βρέθηκε ότι το kojic acid [59] δρα ως αναστολέας τυροσινάσης επειδή το kojic acid δρα ως χηλικός παράγοντας μετάλλου για τη χηλικοποίηση των ιόντων χαλκού και την αναστολή αυτών των ιόντων που εισέρχονται στην ενεργό θέση της τυροσινάσης. Ως εκ τούτου, τα αντιοξειδωτικά στο εκχύλισμα σπόρων μπορεί να σχηματίσουν αδιάλυτα μεταλλικά σύμπλοκα με ιόντα σιδήρου και στη συνέχεια να αναστείλουν την αλληλεπίδραση μεταξύ ιόντων μετάλλων και λιπιδίων. Η υψηλότερη ικανότητα χηλικοποίησης μεταλλικών ιόντων του εκχυλίσματος σπόρων έδειξε την πιθανή αντιοξειδωτική του δράση και πιθανές ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα της τυροσινάσης (Εικόνα 2Ε).

Η αρχή της ανάλυσης του ενδοκυτταρικού ROS είναι ότι το DCFH-DA διαχέεται μέσω της κυτταρικής μεμβράνης και υδρολύεται ενζυματικά σε DCFH από την εστεράση. τότε το DCFH αντιδρά με το ROS (όπως το H2O2) για να δώσει DCF. Οι γρήγορες αυξήσεις του DCF έδειξαν την οξείδωση του DCFH από τις ενδοκυτταρικές ρίζες [60]. Η ιδέα πίσω από την αναζήτηση νέων αντιοξειδωτικών για δραστηριότητες λεύκανσης του δέρματος βρίσκεται στην υπόθεση ότι το οξειδωτικό στρες που προκύπτει από την υπεριώδη ακτινοβολία μπορεί να συμβάλει στη διέγερση της σύνθεσης μελανίνης. Η υπεριώδης ακτινοβολία έχει αναφερθεί ότι παράγει ROS στους δερματικούς ιστούς που μπορεί να προκαλέσουν παραγωγή μελανίνης ενεργοποιώντας την τυροσινάση [61]. Επιπλέον, αναφέρθηκε ότι αρκετοί παράγοντες λεύκανσης του δέρματος μπορούν να αναστείλουν τη μελανογένεση αλληλεπιδρώντας με ιόντα χαλκού στην ενεργό θέση της τυροσινάσης ή με ο-κινόνες για να εμποδίσουν τον πολυμερισμό των ενδιαμέσων στη συνθετική οδό της μελανίνης [62]. Επιπλέον, η βιταμίνη C ή η βιταμίνη Ε μπορεί να μειώσει την οξείδωση των προϋπαρχόντων σωματιδίων μελανίνης. Ως εκ τούτου, αυτές οι βιταμίνες έχουν εφαρμοστεί ευρέως σε προϊόντα λεύκανσης δέρματος [63]. Είναι ενδιαφέρον ότι τα αποτελέσματά μας έδειξαν τα αντιοξειδωτικά χαρακτηριστικά του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L., υποδεικνύοντας ότι το εκχύλισμα σπόρων του P. dactylifera L. θα μπορούσε να δράσει ως συστατικό λεύκανσης του δέρματος στα καλλυντικά.

Ο προσδιορισμός MTT είναι ένας πολύ γνωστός χρωματομετρικός προσδιορισμός που μετρά τη δραστηριότητα των κυτταρικών ενζύμων οξειδοαναγωγάσης που εξαρτώνται από NADH/NADPH που ανάγουν το ΜΤΤ σε μοβ χρώματος βαφές φορμαζάνης. Αυτή η δοκιμασία θα μπορούσε να εφαρμοστεί για να εξεταστεί η πιθανή κυτταροτοξικότητα των φαρμακευτικών παραγόντων και των τοξικών υλικών, καθώς αυτοί οι παράγοντες ενισχύουν ή αναστέλλουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχήμα 3Α ήταν σύμφωνα με εκείνα της δοκιμασίας αποκλεισμού Trypan blue στο Σχήμα 3Β, που δείχνει ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. δεν είχε κυτταροτοξική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων μελανώματος B16F10.

Η τυροσινάση μανιταριού χρησιμοποιείται συνήθως ως ένζυμο στόχος για τον έλεγχο πιθανών αναστολέων της μελανογένεσης. Διαπιστώθηκε αρχικά ότι το εύρος δοσολογίας ({{0}}.049–0,49 mg/mL) του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. θα μπορούσε να αναστείλει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης μανιταριού. Τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχήμα 4Α υποδεικνύουν ότι το εκχύλισμα σπόρων εμφάνισε χαμηλότερες ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα τυροσινάσης μανιταριού από το κοζικό οξύ. Η τυροσινάση παίζει σημαντικό ρόλο στα δύο πρώτα στάδια της οδού μελανογένεσης. Για να αποσαφηνιστεί η πραγματική ανασταλτική επίδραση του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στην παραγωγή μελανίνης, προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα σε μελανίνη B16F10 και η ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 4Β υποδεικνύουν ότι μια υψηλότερη συγκέντρωση εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. άσκησε μια προφανή ανασταλτική επίδραση στο σχηματισμό μελανίνης. Τα δεδομένα έδειξαν ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. εμποδίζει πραγματικά τη μελανογένεση στα κύτταρα μελανώματος. Με αυτό, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 4Γ ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχήμα 4Β. Στα προαναφερθέντα κυτταρικά πειράματα, το -MSH χρησιμοποιήθηκε ως επαγωγέας για τη διέγερση της σύνθεσης μελανίνης. Η -MSH αναφέρθηκε ότι δεσμεύει τον υποδοχέα μελανοκορτίνης 1 (MC1R) και ενεργοποιεί την ενδοκυτταρική αδενυλική κυκλάση, η οποία με τη σειρά της καταλύει το ATP σε cAMP και ενεργοποιεί την PKA που εξαρτάται από το cAMP. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5Α αποκάλυψαν ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. ανέστειλε την έκφραση του MC1R, εμποδίζοντας έτσι την παραγωγή μελανίνης που προκαλείται από την προκαλούμενη από -MSH ενδοκυτταρική ανοδική ρύθμιση cAMP. Επιπλέον, η οδός σηματοδότησης PKA με τη μεσολάβηση cAMP απενεργοποιήθηκε και η μελανογένεση ανεστάλη. Για να επιβεβαιώσουμε το συμπέρασμα, πραγματοποιήσαμε τα πειράματα αναστολέα PKA και τα δεδομένα που φαίνονται στο Σχήμα 4D έδειξαν την ανασταλτική επίδραση του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. (0,147 mg/mL) στη μελανογένεση σε κύτταρα B16F10 καταστέλλεται από το H{{ 24}}θεραπεία. Το H89 (Ν-[2-ρ-βρωμοκινναμυλαμινο-αιθυλ]-5-ισοκινολινοσουλφοναμίδιο) είναι ένας εκλεκτικός και ισχυρός αναστολέας της PKA. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η προκαλούμενη από cAMP σηματοδότηση PKA επηρεάστηκε από το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L..

Η τυροσινάση, το TRP1 και το TRP2 είναι τα τρία κύρια ένζυμα που ρυθμίζουν τη σύνθεση μελανίνης στα κύτταρα των θηλαστικών [64]. Επιπλέον, το MITF είναι ο κύριος μεταγραφικός ρυθμιστής της τυροσινάσης, του TRP1 και του TRP2 και είναι ο πιο σημαντικός ρυθμιστής της μελάγχρωσης των μελανοκυττάρων [65]. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5Α δείχνουν ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. μείωσε τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης αυτών των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μελανογένεση, ανέστειλε τη δραστηριότητα τυροσινάσης και μείωσε την περιεκτικότητα σε μελανίνη στα κύτταρα B16F10.

Σε αυτή τη μελέτη, το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. κατέστειλε τη φωσφορυλίωση του CREB και την ενεργοποίηση της PKA. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η οδός cAMP-PKA μπορεί να είναι υπεύθυνη για την επαγόμενη από το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. αντι-μελανογένεση (Εικόνα 5C).

Τα MAPKs έχουν αναφερθεί ότι ρυθμίζουν τη μελανογένεση [66]. Η οικογένεια MAPK περιλαμβάνει τρεις τύπους πρωτεϊνικών κινασών, συμπεριλαμβανομένης της εξωκυτταρικής αποκρινόμενης κινάσης (ERK), της N-τερματικής κινάσης c-Jun (JNK) και της p38 MAPK. Το p38 MAPK μπορεί να ενεργοποιήσει την πρωτεΐνη που δεσμεύει το στοιχείο απόκρισης cAMP (το CREB και το CREB ενεργοποιεί την έκφραση MITF, η οποία συμβάλλει θετικά στη σύνθεση μελανίνης [67]. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5Γ παρέχουν στοιχεία ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. θα μπορούσε να απενεργοποιήσει το CREB. Το JNK και το p38 με τη σειρά τους αναστέλλουν την έκφραση MITF (Εικόνα 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αντιμελανογόνος δράση που προκαλείται από το εκχύλισμα σπόρων dactylifera L. μπορεί να προκαλείται από μείωση της ρύθμισης των οδών PKA. Επιπλέον, η ακτινοβολία UV έχει αναφερθεί ότι παίζει διαδραματίζουν εξέχοντα ρόλο στην έναρξη αρκετών δερματικών διαταραχών, συμπεριλαμβανομένης της απολέπισης, της ρυτίδωσης και της υπερμελάγχρωσης [68] Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. μείωσε την παραγωγή μελανίνης, η οποία μπορεί να αποδοθεί στην εξάντληση των ενδοκυτταρικών ROS.

Για να αξιολογήσουμε την επίδραση του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στην παραγωγή κυτταρικής μελανίνης, προσδιορίσαμε τα επίπεδα mRNA σε κύτταρα B16F10 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχύλισμα σπόρων -MSH και P. dactylifera L.. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με -MSH εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα MITF, τυροσινάσης, TRP-1 και TRP-2, όπως αναμενόταν. Είναι ενδιαφέρον ότι τα κύτταρα που υπέστησαν επεξεργασία με εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. έδειξαν μείωση στην έκφραση mRNA αυτών των γονιδίων που σχετίζονται με τη μελανογένεση. Ωστόσο, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των στηλών, γεγονός που έδειξε ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. δεν επηρεάζει τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης του MITF, της τυροσινάσης, του TRP1 και του TRP2.

Αυτό είναι το προϊόν μας.

Για περισσότερες πληροφορίες, παρακαλώ κάντε κλικ εδώ.

Έχει αναφερθεί ότι το κύριο φαινολικό οξύ που βρίσκεται στον σπόρο του P. dactylifera L. είναι το φερουλικό οξύ [69]. Το φερουλικό οξύ έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει αποτελεσματικά τη σύνθεση μελανίνης στα κύτταρα μελανώματος Β16 αναστέλλοντας τη φωσφορυλίωση της τυροσινάσης που προκαλείται από την κινάση της καζεΐνης 2- με δοσοεξαρτώμενο τρόπο [70]. Αυτές οι αναφορές υποστηρίζουν τα αποτελέσματά μας που φαίνονται στο Σχήμα 1 — το φερουλικό οξύ στο υδατικό εκχύλισμα του σπόρου P. dactylifera L. συνέβαλε στην αναστολή της μελανογένεσης στα κύτταρα B16F10. Σίγουρα, άλλα λειτουργικά συστατικά στο εκχύλισμα σπόρων θα πρέπει να διερευνηθούν στο εγγύς μέλλον.

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. ανέστειλε τη μελανογένεση στα κύτταρα B16F10 μειώνοντας τις οδούς σηματοδότησης PKA. Ως εκ τούτου, το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως αποτελεσματικός παράγοντας λεύκανσης του δέρματος.

5. Συμπεράσματα

Αυτή είναι η πρώτη αναφορά για τον μηχανισμό δράσης του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L. στη σύνθεση μελανίνης. Η παρούσα μελέτη έδειξε τη συμμετοχή της οδού cAMP/PKA/CREB στην αποχρωματιστική επίδραση του εκχυλίσματος σπόρων P. dactylifera L.. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. ανέστειλε τη μελανογένεση στα κύτταρα B16F10 ρυθμίζοντας προς τα κάτω τις οδούς σηματοδότησης PKA. Ως εκ τούτου, το εκχύλισμα σπόρων P. dactylifera L. θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένας νέος δερματολογικός παράγοντας κατά της μελανογένεσης και ένας αποτελεσματικός παράγοντας λεύκανσης του δέρματος.