Αντι-μελανογένεση και αντι-τυροσινάση ιδιότητες των εκχυλισμάτων Pistacia atlantica subsp. mutica σε κύτταρα μελανώματος ποντικών B16F10

Επικοινωνία: ali.ma@wecistanche.com

Σαμίρα Εγκμπαλί-Φερίζ1 , Άκραμ Ταλεγκάνι2 , Χαντί Αλ-Νατζάρ3 , Σεγιέντ Αχμάντ Εμάμι1 , Χόμα Ραχίμι4 , Τζαβάντ Ασίλι1 , Σαμίρα Χασανζαντέχ1 , και Ζάχρα Ταγιαρανί-Νατζαράν5,*

Αφηρημένος:Το pistacia atlantica (P. atlantica) subsp. mutica έχει χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ιατρική και είναι διάσημο για την φαρμακευτικές ιδιότητες. Στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η επίδραση της μεθανόλης (MeOH), του n-εξανίου, διχλωρομεθάνιο (CH2Cl2), n-βουτανόλη (BuOH), οξικός αιθυλεστέρας (EtOAc), εκχυλίσματα νερού και αιθέριο έλαιο P. atlantica subsp. mutica για τη σύνθεση μελανίνης και το οξειδωτικό στρες στην κυτταρική σειρά μελανώματος B16F10. Ο Βιωσιμότητα κυττάρων B16F10 μετά από επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις διαφορετικών εκχυλισμάτων του φυτού (0,2-200 μg/mL) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ρεσαζουρίνη. Η σύνθεση του αιθέριου ελαίου αναγνωρίστηκε από ανάλυση αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC-MS) και ανασταλτική επίδραση στη σύνθεση της μελανίνης, μανιτάριτυροσινάσηη δραστηριότητα, η κυτταρική τυροσινάση και το οξειδωτικό στρες αξιολογήθηκαν από τη χρωματομετρική και φθορομετρικές μεθόδους. Τα δεδομένα έδειξαν εκχυλίσματα σε συγκεντρώσεις 0,2-200 μg/mL, δεν έδειξαν σημαντική τοξικότητα στα κύτταρα του μελανώματος, αλλά συγκεντρώσεις 200 μg/ml αιθέριου ελαίου είχαν κυτταροτοξική δράση. Το υποείδος pistacia atlantica mutica θα μπορούσε να αναστείλει το μανιτάριτυροσινάσηδραστηριότητα. Επίσης, η ποσότητα της μελανίνης σε κύτταρα B16F10 μειώθηκαν. Επιπλέον, η ικανότητα των εκχυλισμάτων P. atlantica subsp. mutica να μειώνουν τη μείωση της ποσότητα αντιδραστικών ειδών οξυγόνου στα κύτταρα μελανώματος αποκαλύφθηκε αξιοσημείωτηΑντιοξειδωτικόδραστηριότητα. Επιπλέον όλες οι συγκεντρώσεις αιθέριου ελαίου δεν είχαν σημαντική επίδραση σε αυτή τη μελέτη. Ομελανογένεσηανασταλτική καιΑντιοξειδωτικόοι επιδράσεις του P. atlantica subsp. mutica στα κύτταρα B16F10 μπορεί να υποδηλώνουν πιθανή λεύκανση δραστηριότητα του φυτού για χρήση σε δερματολογικά προϊόντα περιποίησης της επιδερμίδας και για την πρόληψη της γήρανσης του δέρματος σε βιομηχανία καλλυντικών.Λέξεις κλειδιά:Αντι-τυροσινάση;Μελανογένεση; P. atlantica subsp. mutica.

Κάντε κλικ για ναcistanche οφέλη για το αντι-οξειδωτικό

ΕΙΣΑΓΩΓΉ

Η μελανίνη είναι μια χρωστική ουσία του δέρματος που είναι συντίθεται σε μελανοσώματα και μεταφέρεται σε κερατινοκύτταρα καθ 'όλη τη διάρκεια της φυσιολογικής διαδικασία που ονομάζεταιμελανογένεση. Η μελανίνη παίζει ένας σημαντικός ρόλος στην προστασία από την υπεριώδη ακτινοβολία βλάβη και καθορίζει το χρώμα του δέρματος, των μαλλιών και τα μάτια. Η υπερβολική παραγωγή μελανίνης είναι αποδίδεται σε μελάνωμα και μη φυσιολογικό χρώση του δέρματος (1-3). Το βασικό ένζυμο στη βιοσύνθεση της μελανίνης είναι η τυροσινάση που καταλύει δύο ξεχωριστές αντιδράσεις, την οξείδωση της 3,4-διυδροξυ-φαινυλαλανίνης (DOPA) έως ντοπακινόνη και υδροξυλίωση της L-τυροσίνης στο DOPA (4).Τυροσινάσηή πολυφαινόλη Η οξειδάση είναι ένας χαλκός που περιέχει μικτή λειτουργία ένζυμο που βρίσκεται σε μικροοργανισμούς, ζώα, και φυτά (5). Η τυροσινάση είναι η πιο παράγοντας που επηρεάζει το καφέ των φρούτων και λαχανικά. Υπερπαραγωγή και η συσσώρευση μελανίνης μπορεί να οδηγήσει σε μεγάλη αριθμός δερματικών διαταραχών, συμπεριλαμβανομένου του μελάσματος, φακίδες, ηλιακή μελάνωση και κηλίδες ηλικίας (6). Επομένωςτυροσινάσηοι αναστολείς έχουν προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον για τις βιομηχανίες τροφίμων και καλλυντικών. Σε πολλούς ζωντανούς οργανισμούς, η οξείδωση είναι απαραίτητα για την παραγωγή ενέργειας σε καύσιμα βιολογικές διεργασίες.

Ωστόσο, υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και άλλα -αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)- προκαλούν κύτταρα θάνατος και βλάβη των ιστών σε πολλές φυσιολογικές και παθολογοανατομικά φαινόμενα, συμπεριλαμβανομένου του ROS αύξηση μετά από ακτινοβόληση με υπεριώδη ακτινοβολία κατά τη διάρκεια διαδικασία μελανογένεσης. Επίσης, είναι γνωστό ότι η παραγωγή ROS που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία είναι που εμπλέκονται στην παθογένεση πολλών δερμάτων καταστάσεις συμπεριλαμβανομένης της γήρανσης, των ρυτίδων, φωτοευαισθησία και κακοήθεια (7). Έτσι βρίσκοντας φυσικές πηγέςΑντιοξειδωτικάμε ένα αντι-τυροσινάσηη δραστηριότητα βοηθά στην τροποποίηση του δέρματος ζημιές που σχετίζονται με την απαλλαγήμελανογένεση(4).

Το γένος Pistacia είναι μέλος του Οικογένεια Anacardiaceae που αποτελείται από περίπου 9 είδη και διανέμεται ως επί το πλείστον σε Περιοχή της Μεσογείου, Ευρώπη και ορισμένα μέρη της Ασίας (8,9). Φιστίκι atlantica (P. atlantica) Ντεσφ. έχει 3 υποείδη και συγκεκριμένα: P. atlantica υποείδος kurdica (Zohary) Rech. f., P. atlantica υποείδος mutica (Φίσερ &C. A. Meyer) Rech. f. και P. atlantica subsp. cabulica (Αποθέματα) Ἀρχιμ. f. Τα τρία αναφερόμενα υποείδη του Π. atlantica, P. khinjuk Αποθέματα, και P. vera L. είναι που καλλιεργούνται στο Ιράν (10). Οι καρποί του P. atlantica υποείδος mutica δηλαδή Baneh είναι στρογγυλό προς ωοειδές με διάμετρο 0,5-0,7 cm. Το αντιοξειδωτικό και αντικαρκινική δραστηριότητα του κύτους του P. Atlantica έχει συσχετιστεί με το υψηλό σύνολο φαινολική περιεκτικότητα του φυτού. P. atlantica έχει παραδοσιακά χρησιμοποιείται για την ανακούφιση του άνω μέρους κοιλιακή δυσφορία και πόνο, δυσπεψία, και πεπτικό έλκος (11-13). Ωστόσο, δεν υπάρχουν μελέτες σχετικά με την ανασταλτική δράση της μελανογένεσης της P. atlantica subsp. mutica. Έτσι, σε αυτό το έργο, επιλέγουμε κύτταρα μελανώματος B16F10 για μελετώντας το αντιοξειδωτικό και το αντι-μελανογόνο ιδιότητες του P. atlantica υποείδος mutica Εκχυλίσματα. Στόχος της μελέτης αυτής ήταν η να διερευνήσουν την ανασταλτική δράση της μεθανόλης (MeOH), n-εξάνιο, διχλωρομεθάνιο (CH2Cl2), n-βουτανόλη (BuOH), οξικός αιθυλεστέρας (EtOAc), νερό (H2O) εκχυλίσματα και αιθέριο έλαιο του P. atlantica υποείδος φρούτων mutica σεμελανογένεσηκαι να αξιολογήστε τις δυνατότητεςΑντιοξειδωτικόχωρητικότητας το φυτό σε κύτταρα μελανώματος B16F10.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Χημικές ουσίες

Μανιτάριτυροσινάσηαπό τον Αγκαρίκο bisporus, κοτζικό οξύ, ρεσαζουρίνη, L-3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνη (L-DOPA), διχλωροδιϋδρο-φθοροορεσκεΐνη διακετική (DCFH-DA), εγταζικό οξύ (EGTA), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθοριούχο, βγλυκεροφωσφορικό, β-μερκαπτοαιθανόλη, ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS), νάτριο ορθοβαναδάτη, τρις-buffered φυσιολογικό ορό μεταξύ 20 (TBST) που αγοράστηκε από τη Sigma (ΗΠΑ). Εμβρυϊκός ορός βοοειδών (FBS), πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη, και θρυψίνη-EDTA ελήφθησαν από GibcoBRL (Γκραντ Άιλαντ, ΗΠΑ). Μελάνωμα κυτταρική σειρά (B16F10, Κατ. No C540) ήταν αγοράστηκε από το Ινστιτούτο Παστέρ του Ιράν (Τεχεράνη, Ι.Δ. Ιράν). Όλες οι άλλες χημικές ουσίες και διαλύτες ήταν από τη Merck (Γερμανία).

Παρασκευή εκχυλισμάτων

P. atlantica υποείδος mutica συλλέχθηκε σε Μάιος 2014 από τα βουνά Bardaskan, Επαρχία Χορασάν Ραζαβί, βορειοανατολικά του Ιράν και ταυτοποιήθηκε από την κ. Μ. Σουζάνη. Ένα κουπόνι το δείγμα (Αρ.:13069) κατατέθηκε στο herbarium της Φαρμακευτικής Σχολής, Μασάντ Πανεπιστήμιο Ιατρικών Επιστημών, Μασάντ, I.R. Ιράν. Άγουρος καρπός του P. atlantica subsp. mutica (200 g) αλέθονταν από μπλέντερ (Toos) chekan Co, I.R. Iran) και στη συνέχεια διεισδύει με MeOH σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες σύμφωνα με στο πρωτόκολλο που αναφέρθηκε προηγουμένως (14). Μετά εκχύλιση, ο διαλύτης εξατμίστηκε χρησιμοποιώντας περιστροφικός εξατμιστήρας και στη συνέχεια λυοφιλιωμένος. Το εκχύλισμα μεθανόλης (94 g) ήταν περαιτέρω κλασματοποιημένο με κατανομή διαλύτη-διαλύτη σε να δοθούν πέντε διαφορετικά κλάσματα, συμπεριλαμβανομένου του MeOH, n-εξάνιο, CH2Cl2, BuOH, EtOAc και H2O.

Απομόνωση του αιθέριου ελαίου

Ο άγουρος καρπός του P. atlantica subsp. το mutica (150 g) υποβλήθηκε σε υδροδιαστολή χρησιμοποιώντας μια συσκευή τύπου Clevenger για 3 ώρες. Το άχρωμο λάδι λήφθηκε με ένα απόδοση 0,8% (v/w). Το λαμβανόμενο αιθέριο έλαιο ξηράθηκε πάνω από άνυδρο θειικό νάτριο και να αποθηκεύονται στους 4 °C στο σκοτάδι μέχρι την περαιτέρω δοκιμή.

Αέρια χρωματογραφία και αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας

Η ανάλυση της αέριας χρωματογραφίας (GC) ήταν εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα εξοπλισμένο Varian CP-3800 με ανιχνευτή FID, διασυνδεόμενη με στήλη συντηγμένου διοξειδίου του πυριτίου (CP-Sil 8CB, 50 m × 0,25 mm, πάχος μεμβράνης 0,12 μm) κάτω από τα ακόλουθα κατάσταση: θερμοκρασία φούρνου 50-250 °C με ο ρυθμός των 3 °C/min· θερμοκρασία εγχυτήρα 260 °C, λόγος διαίρεσης 1:5, με φέρον αέριο, ροή N2 ρυθμός 2 ml/min· θερμοκρασία ανιχνευτή 280 °C.

Αέρια χρωματογραφία-μάζα (GC-MS) πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις χρησιμοποιώντας ένα Agilent 5975 συσκευή εξοπλισμένη με HP-5 MS στήλη (30 m × 0,25 mm i.d., 0,25 μm φιλμ πάχη) διασυνδεόμενη με τετραπλή μάζα ανιχνευτή και έναν υπολογιστή εξοπλισμένο με Wiley 7ιδ. L βιβλιοθήκη. Θερμοκρασία φούρνου 50-250 °C με ο ρυθμός των 3 °C/min, η θερμοκρασία του μπεκ ψεκασμού 250 °C, όγκος έγχυσης: 0,1 μL, με διαίρεση ένεση με αναλογία διαχωρισμού 1:50, με το ρυθμός ροής φέροντος αερίου (ήλιο) 1 mL/min, ιόντων πηγή: 70 eV, ρεύμα ιονισμού: 150 μA, και εύρος σάρωσης: 35-465. Προσδιορισμός του συστατικά του αιθέριου ελαίου βασίστηκε σε αέρια χρωματογραφία κατακράτησης που λαμβάνεται με αναφορά στη σειρά n-αλκανίων (C6-C20) στις Στήλη HP-5MS, σύγκριση της μάζας τους φάσματα και μοτίβα κατακερματισμού που αναφέρονται στη βιβλιογραφία, και η αντιστοίχιση του υπολογιστή με το Γουίλι 7ν. Βιβλιοθήκη L (15). Ποσοτικοποίηση του σχετική ποσότητα των επιμέρους συνιστωσών των άγουρων καρπών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το μέθοδος ποσοστού εμβαδού χωρίς εξέταση του συντελεστή βαθμονόμησης.

Κυτταροκαλλιέργεια

Κυτταρική σειρά μελανώματος, B16F10, που διατηρείται σε 37 °C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα (90%) που περιέχουν 5% CO2. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Bioidea, Ιράν) με 10% (v/v) FBS, 100 IU/mL πενικιλλίνης και 100 μg/mL Στρεπτομυκίνη. Το αρχικό διάλυμα του P. atlantica υποείδος mutica προετοιμάστηκε σε 50 μg/mL σε DMSO και διατηρούνται στους -40 °C. Κόιτς οξύ (2 και 4 mM) χρησιμοποιήθηκε ως θετικό έλεγχο σε όλα τα πειράματα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 κοιλοτήτων σε πυκνότητα 105 κύτταρα/mL. Η δραστηριότητα του εκχυλίσματος σε κάθε πείραμα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: ݈݁

݁percent of activity=Απορρόφηση του δείγματος/Απορρόφηση του οργάνου χειρισμού*100

Δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

Η ρεσαζουρίνη είναι ένας δείκτης υγείας των κυττάρων που χρησιμοποιεί το μειώνοντας την ισχύ του ζωντανού κυττάρου και μετατρέπεται σε ρεσορουφίνη. Η ρεσαζουρίνη είναι μια μπλε, μη τοξική, μη φθορίζουσα και διαπερατή από κύτταρα ένωση που μετατρέπεται σε κόκκινο χρώμα και εξαιρετικά φθορίζον ρεσορουφίνη σε ζώντα κύτταρα (16). Σχετικά με το 104 Β16F10 κύτταρα μελανώματος σπέρνονταν σε κάθε φρεάτιο Πλάκα 96-microwell και επεξεργασμένη με διάφορα συγκεντρώσεις εκχυλισμάτων και αιθέριων ελαίων P. atlantica subsp. mutica (0,2-200 μg/mL). Μετά από 4 ώρες επώασης, η απορρόφηση του Η ρεσαζουρίνη και η ρεσορουφίνη μετρήθηκαν σε 570 nm και 600 nm με υβριδική συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας πολλαπλών λειτουργιών H4 (BioTek, Winooski, ΗΠΑ). Κάθε πείραμα γινόταν εις τριπλούν. Η μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad από την καμπύλη συγκέντρωσης-επίδρασης: log συγκέντρωση έναντι απόκρισης.

Δοκιμασία δραστηριότητας τυροσινάσης μανιταριών

Η δραστηριότητα του μανιταριούτυροσινάσηστην οξείδωση του L-DOPA μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως (17), με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, 160 μL των 5 mM L-DOPA (σε 100 mM νατρίου φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 6,8) και 20 μL του ίδιο ρυθμιστικό με και χωρίς P. atlantica υποείδος εκχυλίσματα mutica και αιθέριο έλαιο (10-1000 μg/mL) αναμίχθηκαν με 20 μL τυροσινάση μανιταριών (200 μονάδες/mL) και στη συνέχεια επωάζεται στους 37 °C επί 30 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 475 nm με το Synergy H4 Υβριδική συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας πολλαπλών λειτουργιών (BioTek, Γουινόσκι, ΗΠΑ).

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε μελανίνη σε κύτταρα μελανώματος

Τα κύτταρα μελανώματος, B16F10, σπέρνονταν σε ένα πυκνότητα 105 κύτταρα ανά φρεάτιο σε καλλιέργεια 96-well πλάκες και επωάζονται για 24 ώρες. Ήταν τότε επωάζεται με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,2-200 μg/mL) του P. atlantica υποείδος mutica εκχυλίσματα και αιθέριο έλαιο για 24 ώρες. Η μελανίνη το περιεχόμενο μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (18). Μετά τη θεραπεία, συλλέχθηκαν τα κύτταρα χρησιμοποιώντας θρυψίνη. Πλύθηκαν με PBS. Το κελί τα σφαιρίδια διαλυτοποιήθηκαν σε διάλυμα των 50 μL υδροξείδιο του νατρίου (2 M) επί 60 λεπτά στους 60 °C. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη μετρήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 405 nm με Υβριδική μικροπλάκα πολλαπλών λειτουργιών Synergy H4 αναγνώστης (BioTek, Winooski, ΗΠΑ).

Δοκιμασία κυτταρικής τυροσινάσης

Η οξείδωση του DOPA σε DOPA χρώμιο αναλύθηκε με φασματοφωτομετρία ως δείκτης τουτυροσινάσηδραστηριότητα (18). 106 Κύτταρα του μελανώματος B16F10 επιμεταλλώθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλάκα 96 φρεατίων κατά τη διάρκεια της νύχτας. Μετά τη θεραπεία της κύτταρο με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,2-200 μg/mL) εκχυλισμάτων P. atlantica υποείδος mutica και αιθέριο έλαιο για 24 ώρες, Τα κύτταρα ήταν αποκολλήθηκε χρησιμοποιώντας θρυψίνη. πλένονται με PBS, και με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 50 μL (pH 6,8, 100 mM) που περιέχει 1% τρίτωνο X-100 και 0,1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθοριούχου. Τα λυρικά άλατα φυγοκεντρούνταν στις 10.000 σ.α.λ. για 20 λεπτά στους 4 °C. 100 μL από κάθε λύση (το καθένα που περιέχει 100 mg πρωτεΐνης) αναμειγνύεται με 30 μL 5 mM DOPA σε 96 τρυβλίο φρεατίων και επωασμένη στους 37 °C για 2 ώρες, η απορρόφηση ήταν μετρήθηκε στα 475 nm με το Synergy H4 Hybrid Συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας πολλαπλών λειτουργιών (BioTek, Winooski, ΗΠΑ).

Προσδιορισμός του κυτταρικού αντιδραστικού επίπεδο είδους οξυγόνου

Το επίπεδο του αντιδραστικού είδους οξυγόνου ήταν μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονα τροποποιήσεις (19). Κύτταρα μελανώματος, B16F10, (2 × 104 ) είχαν σπαρθεί σε τρυβλία 96 φρεατίων εν μία νυκτί και στη συνέχεια αντιμετωπίστηκαν με διαφορετικά συγκεντρώσεις (0,2-200 μg/mL) του P. atlantica υποείδος εκχυλίσματα mutica και αιθέριο έλαιο για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάζονται με 50 μL H2O2 (24 mM) στους 37 °C επί 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 50 μL DCFH-DA προστέθηκαν στα κύτταρα και το Η ένταση φθορισμού της DCF μετρήθηκε σε Εκπομπή 504 nm και διέγερση 524 nm με χρήση Συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας Synergy H4 (BioTek, ΗΠΑ).

Ανάλυση δυτικής στυπώματος

Τα κύτταρα του μελανώματος, B16F10, καλλιεργήθηκαν σε 75 εκ3 φιάλες με και χωρίς μεθανόλη εκχύλισμα (0,5-100 μg/mL) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM tris-HCl, pH 7,4, 2 mM EGTA, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθοριούχο, 10 mM βγλυκεροφωσφορικού, 10 mM β-μερκαπτοαιθανόλης, 10 mM β-μερκαπτοαιθανόλης mM ορθοβαναδικού νατρίου, 0,1% δεοξυχολικό όξινο άλας νατρίου). Μια ίση ποσότητα πρωτεϊνών (50 μg) φορτώθηκαν σε 12% νάτριο θειικό δωδεκυλο (SDS)-πολυακρυλαμιδικό πήκτωμα ηλεκτροφόρηση και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για 2 ώρες σε 10% αποβουτυρωμένη γάλα σε TBST (20 mM tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, και 0,1% t μεταξύ 20) ρυθμιστικό σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο με TBST buffer, η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε κατά τη διάρκεια της νύχτας με ένα κύριο αντίσωμα: 1:300 (κουνέλι αντι-τυροσινάσηαντίσωμα (Άγιος Βασίλης Κρουζ Βιοτεχνολογία, Καλιφόρνια)). Μετά το ξέπλυμα 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα TBST, οι μεμβράνες ήταν τότε επωάζεται για 2 ώρες με αντι-κουνέλι IgG (1:2000) ως το δευτερεύον αντίσωμα (κυτταρική σηματοδότηση). Ξέπλυμα 3 φορές με TBST buffer επαναλήφθηκε και οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το ενισχυμένος πρώτος άξονας χημειοφωταύγειας (ECL) δυτικό σύστημα ανίχνευσης στυπώματος (BioRaD, ΗΠΑ) (20). Το αντίσωμα κατά της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως τον έλεγχο φόρτωσης.

Στατιστική ανάλυση

Τα σχετικά αποτελέσματα των πειραμάτων ήταν παρουσιάζεται ως ο μέσος ± SD των τριών ανεξάρτητες μετρήσεις. Ανάλυση της διακύμανσης και ο υπολογισμός IC50 πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism 6.0 χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA δοκιμή και τα μέσα συγκρίθηκαν από την Dunnett Δοκιμές. P< 0.05="" stands="" for="" a="" statistically="" significant="" difference="" between="" extract-treated="" cells="" and="" control.="" a="" two-way="" anova="" test="" and="" bonferroni="" comparison="" post-test="" was="" used="" to="" compare="" the="" effect="" of="" different="" extracts="" in="" each="">

ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ

Σύνθεση αιθέριου ελαίου

Η αέρια χρωματογραφία έχει χρησιμοποιηθεί για ποσοτικός προσδιορισμός και Gc-Μάζα για ταυτοποίηση των ενώσεων. Τα αποτελέσματα τόσο του GC όσο και του GC Η ανάλυση GC-MS παρουσιάζεται στο ποσοτικός και ποιοτικός πίνακας αναγνώρισης των ενώσεων. Στην περίπτωση του P. atlantica υποείδος mutica, εντοπίστηκαν 68 συστατικά στο αιθέριο έλαιο και αντιπροσώπευε το 99,8% των τη συνολική σύνθεση του ελαίου (Πίνακας 1). Ο ομαδοποιημένες ενώσεις του αιθέριου ελαίου ήταν προσδιοριζόμενοι ως μονοτερπένιοι υδρογονάνθρακες 86,5%, οξυγονωμένα μονοτερπένια 3,7%, σεσκιτερπένιοι υδρογονάνθρακες 8,7%, οξυγονωμένοι σεσκιτερπένια 0,1%, και τα διάφορα 0.8%. Οι κύριες συνιστώσες των βασικών το πετρέλαιο ήταν β-Ε-οξιμενικό 29,7%, το μυρσένιο 17,1%, β-Z-ocimene 17,0%, α-πινένιο 10,2% και Ε-καρυοφυλλένιο 7,1%.

Επίδραση των εκχυλισμάτων στην επιβίωση των κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρακολουθήθηκε με ρεσαζουρίνη. Τα κύτταρα μελανώματος, B16F10, ήταν σπέρνεται σε μια πλάκα 96 πηγαδιών. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,2-200 μg/mL) του P. atlantica υποείδος mutica εκχυλίσματα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα εκχυλίσματα είχαν καμία σημαντική κυτταροτοξική επίδραση στα κύτταρα B16F10 στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη (Εικ. 1). Η δοξορουβικίνη ως θετικός μάρτυρας σημαντικά επαγόμενος κυτταρικός θάνατος (P<>

Επίδραση των εκχυλισμάτων στην τυροσινάση μανιταριών δραστηριότητα

Η επίδραση του P. atlantica στην αναστολή της η τυροσινάση των μανιταριών στην οξείδωση του Το L-DOPA αξιολογήθηκε. Τα αποτελέσματα που υποδεικνύονται αυτό το μανιτάριτυροσινάσηδραστηριότητα ήταν αναστέλλεται από όλα τα διαφορετικά εκχυλίσματα, αλλά το συγκέντρωση 1000 μg/mL n-εξανίου το εκχύλισμα δεν είχε σημαντική επίδραση σε αυτή τη δοκιμή. Το κοζικό οξύ (2 και 4 mM) χρησιμοποιήθηκε ως θετικό έλεγχος (P< 0.05)="" (fig.="">

Επίδραση των εκχυλισμάτων και του αιθέριου ελαίου στο σύνθεση μελανίνης

Για να μελετήσετε την επίδραση διαφορετικών εκχυλισμάτων και αιθέριο έλαιο του P. atlantica υποείδος mutica on σύνθεση μελανίνης, η περιεκτικότητα σε μελανίνη του κύτταρα μελανώματος Β16F10 που έλαβαν θεραπεία με εκχύλισμα ήταν Αξιολογηθεί. Χρησιμοποιήθηκε κοζικό οξύ (2 και 4 mM) ως θετικό έλεγχο.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MeOH, CH2Cl2, και εκχυλίσματα EtOAc (0,2-200 μg/mL), n-εξάνιο (2-200 μg/mL) και εκχύλισμα H2O (20 και 200 μg/ml) είχε ανασταλτική δράση στη μελανίνη σύνθεση (P< 0.05)="" (fig.="" 3).="" however,="" all="" of="" the="" concentrations="" of="" essential="" oil="" and="" buoh="" extract="" had="" no="" significant="" inhibitory="" effect="" on="" melanin="" synthesis.="" the="" results="" of="" essential="" oil="" are="" not="" shown="" in="" the="">

Επίδραση των εκχυλισμάτων στην κυτταρική τυροσινάση δραστηριότητα

Για την αξιολόγηση του μηχανισμού του ανασταλτική επίδραση του P. atlantica υποείδος mutica απόσπασμα στιςμελανογένεσησυγκεκριμένα, εμείς αξιολόγησε το ενδοκυτταρικότυροσινάσηδραστηριότητα σε κύτταρα μελανώματος B16F10. Τα αποτελέσματα έδειξε ότι τα MeOH, EtOAc και BuOH εκχυλίσματα (0,2-200 μg/mL), n-εξάνιο (0,2 μg/mL), και CH2Cl2 (20 και 200 μg/mL) εκχυλίσματα του P. atlantica υποείδος mutica θα μπορούσε αναστέλλουν σημαντικά την κυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης (Π< 0.05)="" (fig.="" 4)="" but="" water="" extract="" had="" no="" inhibitory="" effect="" on="" cellular="" tyrosinase="">

Επίδραση των εκχυλισμάτων στο κυτταρικό αντιδραστικό οξυγόνο επίπεδο ειδών

Το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS ως ενδεικτικό τηςΑντιοξειδωτικόχωρητικότητα του P. atlantica υποείδος. το mutica μετρήθηκε σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 24 mM H2O2 μόνο του ή με διαφορετικά εκχυλίσματα σε B16F10 κύτταρα μελανώματος. Τα αποτελέσματα που υποδεικνύονται ότι όλα τα εκχυλίσματα συγκεντρώσεις του P. atlantica υποείδος mutica εκτός από το 0,2 μg/mL του Το εκχύλισμα CH2Cl2 θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το H2O2 (P< 0.05)="" (fig.="">

Επίδραση των εκχυλισμάτων στην κυτταρική τυροσινάση επίπεδο πρωτεΐνης

Η ενδοκυτταρική επίδραση του P. atlantica υποείδος mutica σε μελανογόνο συγγενείς πρωτεΐνες όπως η τυροσινάση ως δείκτης τηςμελανογένεσηαξιολογήθηκε από τη δυτική κηλίδα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6,τυροσινάσηπρωτεΐνη επίπεδα μειώθηκαν σημαντικά κατά P. atlantica υποείδος mutica επεξεργασία εκχύλισμα στο συγκέντρωση 0,5 και 10 μg/mL (P< 0.05).="" β-actin="" was="" used="" as="" internal="">

Επιδράσεις του αιθέριου ελαίου σε διαφορετικά Παραμέτρους

Το αιθέριο έλαιο στα 0,2-200 μg/mL αποκάλυψε όχι σημαντική επίδραση σε όλα τα προαναφερθέντα παραμέτρους, εκτός από τη συγκέντρωση 200 μg/mL, η οποία παρουσίασε κυτταροτοξική επίδραση στην κύτταρα μελανώματος. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα των βασικών το λάδι δεν περιλαμβάνεται στην ενότητα αποτελεσμάτων ως όχι παρατηρήθηκαν ανασταλτικές επιδράσεις.

ΣΥΖΉΤΗΣΗ

Τα καλλυντικά προϊόντα με φυσική βάση είναι ευρέως που διαφημίζονται από εμπορικά πρακτορεία για τους ασφάλεια και πολυλειτουργική δραστηριότητα. Εύρεση νέους αντι-μελανογόνους παράγοντες μεΑντιοξειδωτικόη δραστηριότητα από φυσικές πηγές είναι μία από τις συμφέροντα στη σύνθεση των χρησιμοποιούμενων προϊόντων για διαταραχές υπερμελάγχρωσης. Σε φαρμακευτικά και καλλυντικά προϊόντα που χρησιμοποιούνται ως λεύκανση του δέρματος παράγοντες, αναστολή του σχηματισμού μελανίνης, σαρώνοντας τις ελεύθερες ρίζες και αναστέλλοντας τηντυροσινάσηδραστηριότητα που είναι σημαντική για τη θεραπεία σχετιζόμενες δερματικές διαταραχές (21).

Σε αυτή τη μελέτη η αντιοξειδωτική δράση του διαφορετικά εκχυλίσματα του P. atlantica υποείδος mutica αξιολογήθηκαν και οι επιπτώσεις τους στην Η δραστηριότητα της τυροσινάσης και η σύνθεση μελανίνης ήταν Αναλύονται. Τα εκχυλίσματα MeOH και EtOAc του P. atlantica υποείδος mutica έδειξε σημαντικήΑντιοξειδωτικόη ραδιενέργεια είναι 2, 20 μg/mL και 20, 200 μg/mL που μπορούν να αποδοθούν στο πολυφαινόλες και φλαβονοειδή που απαντώνται ευρέως σε το φυτό. Τα αποτελέσματα έδειξαν όλα τα εκχυλίσματα ειδικά τα εκχυλίσματα MeOH, EtOAc και H2O θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά το μανιτάριτυροσινάσηδραστηριότητα. Επίσης, το Meoh, το EtoAc, και τα εκχυλίσματα BuOH ήταν σε θέση να μειώσουν το κυτταρική τυροσιανική δραστηριότητα που ήταν σε σύμφωνα με τη μείωση της μελανίνης παραγωγή σε κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, όλες οι συγκεντρώσεις αιθέριου ελαίου δεν είχαν σημαντική ανασταλτική δράση έναντι των κυτταρικών τυροσιάνες, σύνθεση μελανίνης καιΑντιοξειδωτικόδραστηριότητα. Λόγω της μεγαλύτερης δραστηριότητας του MeOH εξαγωγή σε διαφορετικά πειράματα σε σύγκριση με άλλα αποσπάσματα έχουμε επιλέξει το αναφερόμενο απόσπασμα για ανάλυση δυτικής κηλίδας. Προς συνοψίστε, το αντι-μελανογόνο αποτέλεσμα αυτού του το εκχύλισμα επιβεβαιώθηκε σε όλες τις δοκιμασίες σε B16F10 κύτταρα, που είναι συγκρίσιμα με τον θετικό μάρτυρα κοζικό οξύ (πίνακας 2).

Τα εκχυλίσματα MeOH, CH2Cl2 και EtOAc έχουν μειωμένη κυτταρικήτυροσινάσηδραστηριότητα περιεκτικότητα σε μελανίνη και ROS. Ημιπολική φύση τα κλάσματα μπορούν να εξαγάγουν φυτοχημικά που είναι υπεύθυνοι για την αντιμελανογόνο δραστηριότητα όπως πολυφαινόλες και φλαβονοειδή. Το κλάσμα n-εξανίου και το αιθέριο έλαιο ήταν λιγότερα ενεργός υποδεικνύοντας ότι τα φυτοχημικά των φυτών με μη πολική και πτητική φύση δεν έχουν σημαντικές επιπτώσεις στηνμελανογένεσηδιεργασία (22,23).

Οι πολυφαινόλες και τα φλαβονοειδή δρουν ως αναστολείς της παραγωγής ROS και θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τις αντι-μελανογόνες ιδιότητες του φυτού εκχυλίσματα (24-27). Οι κύριες ενώσεις στην εκχύλισμα του P. atlantica υποείδος mutica είναι κουερσετίνη, λουτεολίνη, ισοκερσετίνη, ρουτίνη, λουτεολίνη 7-γαλακτικό και φαινολικές ενώσεις όπως το p-κουμαρικό οξύ, το καφεϊκό οξύ και το γαλλικό οξύ που είναι υπεύθυνοι γιαΑντιοξειδωτικόδραστηριότητα (28). Έχει αναφερθεί ότι το Rutin αναστέλλει την δραστικότητα της τυροσινάσης και είναι ένας ισχυρός αντι-χρωστικός παράγοντας λόγω της παρουσίας υδροξυλίου ομάδες (29). Είναι ενδιαφέρον ότι η κουερσετίνη, η λουτεολίνη, και η ισοκερσετίνη έχουν επίσης πολλά υδροξυλίου ομάδες στη δομή τους, καθιστώντας τους κατάλληλους για την αλληλεπίδραση με τυροσινάση με αποτέλεσμα την αντι-τυροσινάση δράση (21,30). Πρόσφατα έχει έχει αποδειχθεί ότι οι επιδράσεις των φλαβονοειδών όπως Η λουτεολίνη και η κουερσετίνη διαμεσολαβούνται κυρίως μέσω τη διαμόρφωση του μεταγραφικού συντελεστή τουμελανογένεση-σχετικός παράγοντας μεταγραφής (MITF) και/ή τα ένζυμα μελανογένεσηςτυροσινάση, DCT ή πρωτεΐνη σχετιζόμενη με την τυροσινάση 1 (ΤΥΡΠ-1) (31). P-κουμαρικό οξύ και καφεϊκό το οξύ ανέστειλε την τυροσινάση των μανιταριών δραστηριότητα και ήταν 10- και 3-φορές πιο ισχυρή από το κοτζικό οξύ (32).

Το γαλλικό οξύ εμφανίζει ανασταλτική τυροσινάση δραστηριότητα και μειώνει την ντοπακινόνη πίσω σε L-DOPA μέσω της οξειδοαναγωγικής ποδηλασίας, παρόμοια με την ασκορβικό οξύ (33). Ομοίως, στο παρόν μελέτη P. atlantica υποείδος mutica μείωσε την επίπεδο πρωτεΐνης τυροσινάσης στα κύτταρα που είναι συσχετίζεται έντονα με την παρουσία κουερσετίνη, λουτεολίνη, ισοκερσετίνη, ρουτίνη και άλλες πολυφαινόλες στο φυτό.

Υπάρχουν πολλές αναφορές σχετικά με τα φυτά που έχουν αντι-μελανογόνο και αντιοξειδωτική δράση που μειώνει το οξειδωτικό στρες, το οποίο μπορεί να έχει υψηλό δυναμικό για τη θεραπεία του δέρματος Διαταραχές. Για παράδειγμα, τα διάφορα αποσπάσματα του εναέρια τμήματα του P. atlantica μειωμένα οξειδωτικά στρες, το οποίο μπορεί να αποδοθεί στο πολυφαινόλες, φλαβονοειδή και ανθοκυανίνη βρίσκεται ευρέως στο φυτό (34). Σε ένα άλλο μελέτη, το εκχύλισμα MeOH του P. vera μειώθηκε την έκκριση μελανίνης που αποδόθηκε στην μερικοίΑντιοξειδωτικόενώσεις σε αυτό το φυτό. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι το κοτζικό οξύ, ως θετικός μάρτυρας, έδειξε τιμή IC50 0,05 mg/ml και υψηλότερες συγκεντρώσεις Το P. vera μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αποτελεσματικός παράγοντας για θεραπεία δερματικών διαταραχών όπως το μελάνωμα καρκίνος (35). Ο Γκουρίνε, κ.ά. έδειξε την κεραία τμήματα του P. atlantica έχουν ισχυρή αντιοξειδωτικές ιδιότητες (36). Επίσης, MeOH και CH2Cl2 κλάσματα των satureioides της Nepeta υποδεικνύονται πιθανές επιδράσεις κατά της μελανίνης παραγωγή σε κύτταρα μελανώματος B16F10 και μπορεί να συμβάλει σε καλλυντικά σκευάσματα των προϊόντα περιποίησης της επιδερμίδας (37). Τα παράγωγα του το κοτζικό οξύ είχε ανασταλτική δράση στηντυροσινάση. Φαίνεται ότι η παρουσία ελεύθερου υδροξυλίου ομάδα και υποκατάστατο του μεθυλίου σε αυτή την ένωση επιβεβαιωμένη ανασταλτική δράση. Σε αυτή τη μελέτη το κοζικό οξύ (θετικός μάρτυρας) έδειξε IC50 τιμή 0,28 mM (38). Το φαινυλοπροπανοειδές γλυκοσίδες και φλαβονοειδή που απομονώνονται από Teucrium polium L. var. gnaphalodes έδειξε αντιοξειδωτικές και ανασταλτικές δραστηριότητες τυροσινάσης. Οι συγγραφείς που παρουσίασαν jaranol έδειξαν το υψηλότερη ανασταλτική δράση τυροσινάσης (IC50 0,041 mM) και η πολιομυζίδη ήταν η καλύτερη αντιοξειδωτικό μεταξύ των δοκιμασμένων ενώσεων. Κόιτς το οξύ έδειξε τιμή IC50 0,02 mM (39).

Μείωση του επιπέδου πρωτεΐνης τουτυροσινάσηαπό τον P. atlantica υποείδος mutica καιΑντιοξειδωτικόιδιότητες και μειωμένο ROS επιβεβαίωσαν τη χρήση αυτού του παράγοντα ως αντι-μελανογένεσης πράκτορας. Αυτή η μελέτη για πρώτη φορά έχει προσδιόρισε την ανασταλτική επίδραση του P. atlantica υποείδος mutica onμελανογένεσησε B16F10 κύτταρα μελανώματος. Προκειμένου να αποφευχθεί η συσσώρευση και η υπερπαραγωγή μελανίνης στο δέρμα, αναστολή τηςτυροσινάσηέχει ένα σημαντικό ρόλο. Ως εκ τούτου, όσον αφορά την αναφερόμενη αντι-οξειδωτικό αποτέλεσμα του P. atlantica υποείδος. mutica, φλαβονοειδή και φαινολικές ενώσεις είναι σημαντικά συστατικά στοιχεία της υπεύθυνης μονάδας για αντι-μελανογένεση και αντιτυροσινάση δραστηριότητες του P. atlantica υποείδος mutica. Αμφότεροι αντιοξειδωτική και αντι-μελανογόνος δράση της P. atlantica υποείδος mutica μπορεί να προσφέρει μια κατάλληλη παράγοντας για σκευάσματα λεύκανσης του δέρματος και θα μπορούσε να συμπεριληφθεί σε καλλυντικά προϊόντα για σκευάσματα φροντίδας του δέρματος.

ΣΥΜΠΈΡΑΣΜΑ

Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη για πρώτη φορά έδειξε ότι meOH και EtOAc εκχυλίσματα του P. atlantica υποείδος mutica έχει ισχυρήτυροσινάσηανασταλτική δράση που είναι σύμφωνη με μείωση της μελανίνης. Επιπλέον, ο P. atlantica υποείδος mutica έδειξε επίσης υψηλή δραστηριότητα καθαρισμού καιΑντιοξειδωτικόΚαταλύματα το οποίο θα μπορούσε να αποδοθεί κυρίως στο υψηλό του επίπεδα φλαβονοειδών και ολικών πολυφαινολών. Ο τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ικανότητα του P. atlantica υποείδος mutica για τη μείωση της παραγωγής μελανίνης μπορεί να συσχετιστεί με την εξάντληση των κυτταρικών ROS και η ανασταλτική του δράση στην οδό σηματοδότησης Ρύθμισητυροσινάσηδραστηριότητα. Δεδομένου ότι η το ημιπολικό εκχύλισμα είχε σημαντική αντι-τυροσινάση και αντι-μελανογόνοςεπιπτώσεις, επομένως, εμείς συμπεραίνουν τις ενώσεις που είναι υπεύθυνες για αυτές τις οι επιδράσεις συσσωρεύονται στο εκχύλισμα, όχι σε αιθέρια έλαια.