Μέρος 2: Αλληλεπιδράσεις ασκορβικού οξέος, 5-καφεοϋλκινικού οξέος και κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης παρουσία και απουσία σιδήρου κατά τη διάρκεια της θερμικής επεξεργασίας και η επίδραση στην αντιοξειδωτική δράση

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνία:tina.xiang@wecistanche.com

Κάντε κλικ στον σύνδεσμο για να μάθετε λεπτομέρειες για το μέρος 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Συζήτηση

3.1. Σχέση δομής-δραστηριότητας ασκορβικού οξέος,5-καφεοϋλκινικού οξέος και κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης

Ένας πρώτος δείκτης του AOA, που μετρήθηκε για διαφορετικές ουσίες ανάλογα με τη σχέση δομής-δραστικότητας, προέκυψε από τον αριθμό των λειτουργικών ομάδων. Συγκρίνοντας και τις τρεις ουσίες που αναλύθηκαν, το ασκορβικό οξύ είχε το χαμηλότερο AOA, ακολουθούμενο από το 5-καφεοϋλκινικό οξύ, ενώκουερσετίνη-3-ρουτινοσίδηέφτασε στο υψηλότερο ΑΟΑ. Οι Csepregi et al. [14] βρήκε την ίδια σειρά κατά τη σύγκριση του AOA αυτών των τριών ενώσεων. Αυτή η κατάταξη μπορεί να εξηγηθεί από τη συνολική ποσότητα υδροξυ ομάδων: η κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη έχει δέκα, το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ έχει πέντε καιασκορβικό οξύέχει τέσσερα. Γιαφλαβονοειδή, η συνολική ποσότητα των ομάδων υδροξυλίου και η επίδρασή τους στους μηχανισμούς της ΑΟΑ είχε προηγουμένως αποδειχθεί από τους Burda και Oleszek[15]. Οι υδροξυ ομάδες είναι ιδιαίτερα πολύτιμες στις δομές της ενδιόλης, καθώς μπορούν εύκολα να οξειδωθούν σε δικετόνες [8]. Στις αναλυόμενες ουσίες η δομή της ενδοόλης είναι επίσης σημαντική για την ικανότητα σχηματισμού συμπλεγμάτων με μεταλλικά ιόντα [16-18]. Η δομή της ενδοόλης εμφανίζεται στα μόρια κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης και 5-καφεοϋλκινικού οξέος στον δακτύλιο φαινυλίου, τα οποία μπορεί επίσης να επηρεάσουν την ισχυρότερη ΑΟΑ αυτών των ενώσεων. Περαιτέρω μελέτες διαπίστωσαν ότι το AOA μπορεί επίσης να επηρεαστεί από άλλες δομές μορίων. Τα φαινολικά οξέα πιθανώς επηρεάζονται από τις ομάδες καρβοξυλικού οξέος, π.χ. ως καφεϊκό οξύ σε 5-καφεοϋλοκινικό οξύ [19]. Στα φλαβονοειδή, οι αγλυκόνες είχαν υψηλότερο AOA από τις αντίστοιχες γλυκοσίδες [20,21], στην περίπτωση της κουερσετίνης-3-ρουτινοσίδης, ενός γλυκοσιδίου, του AOA της αγλυκόνηςκερσετίνηείναι κατά συνέπεια υψηλότερο [14]. Υπάρχουν πολλές διαφορετικές λειτουργικές ομάδες που μπορούν να επηρεάσουν το AOA και, κατά συνέπεια, είναι σημαντικό να χρησιμοποιηθούν διαφορετικές δοκιμασίες με διαφορετικούς μηχανισμούς, όπως μεταφορά ενός ηλεκτρονίου (SET), μεταφορά ατόμου υδρογόνου (HAT) και διαδοχική απώλεια πρωτονίων. μεταφορά (SPLET) για ανίχνευση. Κάθε μηχανισμός και ακόμη και το χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο ανάλυσης μπορεί να ανιχνεύσει διαφορετικές δομές βιοδραστικών ενώσεων [22].

3.2.Επίδραση της θερμικής επεξεργασίας και της αλληλεπίδρασης δομικά διαφορετικών αντιοξειδωτικών στην αντιοξειδωτική δράση απουσία ορυκτού σιδήρου

Το σταθερό AOA για παρατεταμένο χρόνο θερμικής επεξεργασίας 40 λεπτών υποδεικνύει ότι η θερμική αποικοδόμηση είναι μικρότερης σημασίας από ό,τι είχε αρχικά υποτεθεί. Επιπλέον, τα δεδομένα HPLC έδειξαν ότι το καθαρό 5-καφεοϋλοκινικό οξύ και η κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη ήταν σταθερά, με μέγιστη αποικοδόμηση 20 τοις εκατό, κατά τη θερμική επεξεργασία. Προηγούμενες μελέτες απέδειξαν τη σταθερότητα του5-καφεοϋλκινικού οξέος μέχρι το κανονικό σημείο βρασμού του νερού [23], ενώ οι Dawidowicz και Typek[24] βρήκαν εννέα παράγωγες ενώσεις, μετά από θέρμανση του 5-καφεοϋλκινικού οξέος για 5 ώρες κάτω από άμπωτη. Για τη συγκέντρωση ασκορβικού οξέος, βρέθηκε αποικοδόμηση μετά από 40 λεπτά μαγειρέματος. Παράγοντες που επηρεάζουν, με αποτέλεσμα την αποικοδόμηση του ασκορβικού οξέος χωρίς σίδηρο σε ένα υδατικό διάλυμα, θα μπορούσαν να είναι οι τιμές του pH, η έκθεση στο φως, η οξείδωση, η θερμοκρασία και οι διαφορετικές συγκεντρώσεις [25,26]. Σε αυτή τη μελέτη, οι παράγοντες θερμοκρασίας και συγκέντρωσης έπαιξαν πιθανότατα τον κύριο ρόλο, καθώς οι οξειδωτικές διεργασίες μειώθηκαν στο ελάχιστο λόγω του ελάχιστου χώρου αερίου στους μικροσωλήνες. Είναι πιθανό ότι η υπόλοιπη αέρια φάση είναι ακόμα αρκετή για αποικοδόμηση υπό αερόβιες συνθήκες. Οι διαφορετικές συνθήκες οδηγούν σε διαφορετικά προϊόντα [27,28], επομένως σε αυτή τη μελέτη, μετά από 40 λεπτά μαγειρέματος, μπορούσαν να βρεθούν προϊόντα και των δύο συνθηκών. Οι Yuan και Chen [28] ανέφεραν ότι η φουρφουράλη, το 2-φουροϊκό οξύ, η 3-υδροξυ-2-πυρρόνη και μια άγνωστη ουσία είναι κύρια προϊόντα αποδόμησης του ασκορβικού οξέος σε ένα υδατικό διάλυμα ανάλογα με την τιμή του pH . Shinoda et al. [29,30] βρέθηκαν στον χυμό πορτοκαλιού τα προϊόντα αποδόμησης φουρφουράλη, 2-φουροϊκό οξύ, 5-υδροξυμαλτόλη, 3-υδροξυ-2-πυρρόνη και 5-(υδροξυμεθυλ )φουρφουράλ. Οι Hsu et al. [31] ανέλυσε το ασκορβικό οξύ σε αιθανολικά διαλύματα και ανίχνευσε 2-φουροϊκό οξύ και 3-υδροξυ-2-πυρρόνη. Ανάλογα με τις αερόβιες ή αναερόβιες συνθήκες, τα ανιχνευμένα παράγωγα ασκορβικού οξέος (κορυφές 3 και 4) μπορεί να είναι φουρφουράλη, 2-φουροϊκό οξύ ή 3-υδροξυ-2-πυρρόνη ή ενδιάμεσα. Το ασκορβικό οξύ μειώθηκε σε σχέση δόσης-απόκρισης και υψηλότερες συγκεντρώσεις ασκορβικού οξέος έδειξαν χαμηλότερους λόγους αποικοδόμησης κατά το μαγείρεμα. Το ασκορβικό οξύ φαίνεται να σταθεροποιείται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, πιθανώς λόγω των δεσμών υδρογόνου και της ενέργειας van de Waals [32].

Σε δυαδικά και τριμερή μείγματα, βρέθηκαν κυρίως πρόσθετες επιδράσεις στην ΑΟΑ. Στα δυαδικά μείγματα, εάν η ουσία με υψηλότερο ΑΟΑ αυξάνει τη συγκέντρωσή της, αυξάνεται και η ΑΟΑ του συνδυασμού τους. Άλλες μελέτες βρήκαν επίσης αθροιστικά αποτελέσματα μεταξύ (συν )-κατεχίνης (200 um) με ασκορβικό οξύ (50-200 mg/L)[33] και μεταξύ δυαδικών μιγμάτων διαφορετικών μονοτερπενίων[34]. Μόνο στον προσδιορισμό DPPH, βρέθηκαν ανταγωνιστικές επιδράσεις στο 5-καφεοϋλοκινικό οξύ σε συνδυασμό με κουερσετίνη-3-ρουτινοσίδη και σε τριμερή μίγματα με διπλασιασμένες συγκεντρώσεις κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης. Αυτό θα μπορούσε να προκληθεί από τον προσανατολισμό των μορίων στο διάστημα, ιδιαίτερα τη ρουτινοσίδη της κερκετίνης, ως ένα αρκετά μεγάλο μόριο, και τη στερική προσβασιμότητα του μορίου της ρίζας DPPH [35]. Στη δοκιμασία TPC, ο συνδυασμός ασκορβικού οξέος και 5-καφεοϋλκινικού οξέος είχε ως αποτέλεσμα ισχυρά ανταγωνιστικά αποτελέσματα σε αναλογία 1:2, ενώ τα αντίστροφα μείγματα με αναλογία 2:1 είχαν ισχυρά συνεργιστικά αποτελέσματα, που υπερέβαιναν το άθροισμα των αντίστοιχες ΑΟΑ. Το ασκορβικό οξύ διπλής συγκέντρωσης μπορεί να δώσει, κάτω από αυτές τις συνθήκες, μια πρόσθετη ώθηση στην ΑΟΑ, λόγω της αυτοσταθεροποίησης που ακολουθείται από τη σταθεροποίηση άλλων μορίων, που αποδείχθηκε από το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ σε αυτό το πείραμα. Στον χυμό ροδιού-νεκταρίνι, μεταξύ των φυσικών φαινολών και του ασκορβικού οξέος, διαπιστώθηκε η ίδια αλληλεπίδραση, ενώ στον χυμό σταφυλιού παρατηρήθηκαν αυξανόμενες ανταγωνιστικές επιδράσεις αυξάνοντας τη συγκέντρωση ασκορβικού οξέος [36]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μείγματα ασκορβικού οξέος, 5-καφεοϋλκινικής και κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης επιτυγχάνουν το υψηλότερο δυναμικό AOA όταν το πιο ισχυρόαντιοξειδωτικάείναι άφθονα διαθέσιμα.

Κάντε κλικ για να μάθετε περισσότερα για τα προϊόντα

3.3. Επιρροή του ορυκτού σιδήρου

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>ασκορβικό οξύ. Ωστόσο, η προσθήκη σιδήρου στα μείγματα είχε επίδραση στα αποτελέσματα της ανάλυσης TEAC και DPPH, ενώ οι προσδιορισμοί TPC δεν επηρεάστηκαν ευρέως. Για το λόγο αυτό, είναι σημαντικό να χρησιμοποιείτε διαφορετικές δοκιμασίες με διαφορετικούς μηχανισμούς εργασίας όταν εργάζεστε με δείγματα πλούσια σε σίδηρο.

Μόνο στον προσδιορισμό DPPH το AOA καθαρής ρουτινοσίδης κερκετίνης{{0} και σε συνδυασμό με ασκορβικό οξύ, ισομοριακές ή μη ισομοριακές με διπλασιασμένες συγκεντρώσεις κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης, είχε χαμηλότερες τιμές παρουσία σιδήρου. Οι Boligon et al. [351 εξήγησε ότι η ανάλυση DPPH ανιχνεύει καλύτερα μικρότερα αντιοξειδωτικά, λόγω της στερικής προσβασιμότητας αυτών των ριζών. Πιθανώς, η κουερσετίνη-3-ρουτινοσίδη με τις δύο πλευρές σύνδεσης μπορεί να δημιουργήσει αρκετά μεγάλα σύμπλοκα με σίδηρο και επομένως να είναι απρόσιτη για την ανάλυση. Όπως αναφέρεται από τους Kejic et al. [8], αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το σχηματισμό υπερμοριακών συμπλεγμάτων μέσω του συντονισμού μεταλλικών ιόντων. Σε συνδυασμό με το ασκορβικό οξύ, το οποίο είναι ικανό να δημιουργήσει σύμπλοκα μικτού σθένους σε αναλογία 1:2 [12], πιθανώς, αυτά τα μεγαλύτερα μικτά σύμπλοκα δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τη ρίζα DPPH. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης, άλλες μελέτες [18,37,38] διαπίστωσαν, χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό DPPH, ότι τα σύμπλοκα κουερκετίνης-3-ρουτινοσίδης είναι πιο αποτελεσματικά αντιοξειδωτικά από την καθαρή κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη. Είναι γνωστό ότι τα χηλικά σύμπλοκα φλαβονοειδών και ιόντων μετάλλων μπορούν να αναιρέσουν τη ριζική δραστηριότητα των συμπλοκοποιημένων μεταλλικών ιόντων [39]. Η μόνη διαφορά ήταν ότι σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε θειικό αμμώνιο σίδηρο (II), αντί για χλωριούχο ή θειικό σίδηρο (ⅡI), που χρησιμοποιήθηκε στην εργασία των Symonowics και Kolandek [39].

Βρέθηκαν συνεργικές επιδράσεις μεταξύ ασκορβικού οξέος και 5-καφεοϋλκινικού οξέος παρουσία σιδήρου σε αναλογία 2:1 και ανταγωνιστικές επιδράσεις στην αναλογία 1:2. Ο συνδυασμός 5-καφεοϋλκινικού οξέος με σίδηρο δεν συνιστάται in vivo [6]. Ωστόσο, αυτή η μελέτη έδειξε ότι, in vitro, η διπλασιασμένη ποσότητα ασκορβικού οξέος σε σύγκριση με το 5-καφεοϋλκινικό οξύ μπορεί να έχει ακόμη και συνεργικές επιδράσεις στην ΑΟΑ. Περαιτέρω έρευνες σχετικά με τις αναλογίες θα μπορούσαν να δείξουν εάν μπορούν επίσης να επιτευχθούν θετικά αποτελέσματα in vivo.

Σύμφωνα με τα δεδομένα HPLC, η προσθήκη σιδήρου στο δείγμα θα έχει ελάχιστη επίδραση στην καταλυτική του δράση, καθώς μόνο η συγκέντρωση ασκορβικού οξέος σε 0 λεπτά μαγειρεμένα δείγματα μειώθηκε. Στα μαγειρεμένα δείγματα ασκορβικού οξέος, σε αντίθεση με τα δείγματα χωρίς σίδηρο, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις ασκορβικού οξέος οδήγησαν σε υψηλότερη αναλογία αποικοδόμησης. αλληλεπιδράσεις σε μείγματα, για να λειτουργήσει η καταλυτική δραστηριότητα του σιδήρου. Η κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη, παρουσία σιδήρου, μειώθηκε μόνο σε δυαδικά μείγματα με ασκορβικό οξύ μετά από θερμική επεξεργασία. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι το φλαβονοειδές δρα ως πρωταρχικό αντιοξειδωτικό και στη συνέχεια η προκύπτουσα ρίζα ένωσης αντιδρά με το ασκορβικό οξύ, αναγεννώντας την αρχική ένωση [18]. 5-Το καφεοϋλοκινικό οξύ φαίνεται να είναι ιδιαίτερο, γιατί προστατεύει την κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη, ενώ το ασκορβικό οξύ δεν μπορεί να προστατεύσει την κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη. Ως εκ τούτου, το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ μπορεί να είναι το βασικό μόριο για τη σταθεροποίηση του συστήματος σε συνδυασμό με τον σίδηρο και τη θερμική επεξεργασία. Αυτή η υπόθεση του 5-καφεοϋλκινικού οξέος ως σταθεροποιητικού μορίου επιβεβαιώθηκε περαιτέρω στα τριμερή μείγματα. Εδώ, η ρουτινοσίδη της κερκετίνης σταθεροποιούνταν πάντα με 5-καφεοϋλοκινικό οξύ, έτσι ώστε ακόμη και παρουσία ασκορβικού οξέος δεν παρατηρήθηκε μείωση στη συγκέντρωση της κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης. Σε μια άλλη μελέτη, το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ έδειξε προστατευτικές ιδιότητες έναντι της αποδόμησης των ανθοκυανινών μέσω ενός μηχανισμού συν-χρωματισμού [40]. Νέα προϊόντα αποικοδόμησης, με πιθανώς υψηλότερο AOA, εμφανίστηκαν και από τις τρεις ουσίες παρουσία σιδήρου. Το καφεϊκό οξύ (αιχμή 6) αναγνωρίστηκε ως προϊόν διάσπασης του 5-καφεοϋλοκινικού οξέος (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι η άλλη ουσία μπορεί να είναι το κινικό οξύ ή ένα από τα εννέα πιθανά παράγωγα που περιγράφονται από τους Dawidowicz και Typek [24]: κινικό οξύ;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-διυδροξυφαινυλ)-2-υδροξυπροπανοϋλ]-1,4,5-τριυδροξυ-κυκλοεξανοκαρβοξυλικό οξύ· (1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-διυδροξυφαινυλ)-3-υδροξυπροπανοϋλ]-1,4,5 τριυδροξυκυκλοεξ-ανεκαρβοξυλικό οξύ. trans 3-Ο-καφεοϋλκινικό οξύ; trans 5-Ο-καφεοϋλκινικό οξύ; trans 4-Ο-καφεοϋλκινικό οξύ; καφεϊκό οξύ? cis-5-Ο-καφεοϋλκινικό οξύ·4,5-δικαφεοϋλκινικό οξύ. Για την κουερσετίνη-3-ρουτινοσίδη, εμφανίζεται ένα προϊόν αποικοδόμησης στο χρωματογράφημα, το οποίο δεν ήταν δυνατό να αναγνωριστεί.

3.4. Δυνατότητα σχηματισμού χηλικών ενώσεων με σίδηρο (Fe3 plus) και σίδηρο (Fe2 plus)

Σε όλα τα δείγματα που περιείχαν ασκορβικό οξύ, ο σίδηρος σιδήρου ανάγεται σε δισθενή σίδηρο. Σε αυτή τη διαδικασία,ασκορβικό οξύπαίρνει ένα ηλεκτρόνιο από τον τρισθενή σίδηρο και το ανάγει σε δισθενή σίδηρο και γίνεται η ίδια ρίζα. Η ασταθής ρίζα μετατρέπεται γρήγορα σε αφυδροασκορβικό οξύ και περαιτέρω προϊόντα αποικοδόμησης [12]. Λόγω έλλειψης υπεροξειδίου του υδροξυλίου, δεν είναι δυνατή η επιστροφή στον σίδηρο σιδήρου μέσω του κύκλου Fenton. Σε 0 λεπτά μαγειρεμένα δυαδικά μείγματα, περισσότερο από το 20 τοις εκατό του σιδήρου δεσμεύτηκε παρουσία ασκορβικού οξέος. Είναι γνωστό ότι το ασκορβικό οξύ σχηματίζει σύμπλοκα με είδη σιδήρου και άλλα μεταλλικά ιόντα μέσω χηλίωσης μέσω των πυρήνων 3-Ο και 2-Ο μετά από μετατόπιση υδρογόνου από το 3-ΟΗ και 2- Ομάδες ΟΗ [16,17,41. Μπορεί επίσης να σχηματίσει σύμπλοκα σιδήρου-ασκορβικού μικτού σθένους [42]. Ωστόσο, το ασκορβικό οξύ είναι ένας ασθενής χηλικός παράγοντας και, μετά το μαγείρεμα, μόνο ίχνη δεσμευμένου σιδήρου ανιχνεύθηκαν σε καθαρά και μικτά δείγματα όταν υπήρχε ασκορβικό οξύ. Επιπλέον, λόγω της διαδικασίας μαγειρέματος, το ασκορβικό οξύ διασπάται σε προϊόντα αποικοδόμησης, τα οποία φαίνεται ότι δεν μπορούν να χηλωθούν με τον σίδηρο.

5-Το καφεοϋλοκινικό οξύ είναι σχετικά φτωχό αναγωγικό. Ο σίδηρος σιδήρου μειώθηκε κατά 5-καφεοϋλκινικό οξύ και με παρατεταμένο μαγείρεμα, η μείωση αυξήθηκε.5-Χηλικές ενώσεις του καφεοϋλκινικού οξέος με σίδηρο σιδήρου σε ένα πρόσδεμα σε μεταφορά φορτίου μετάλλου [17].5-Καφεοϋλκινικό οξύ φέρει μια πιθανή πλευρά σύνδεσης στη δομή της 3,4 ενδοόλης του καφεϊκού οξέος. Αυτό θα μπορούσε να είναι ένας δείκτης για το γιατί το καφεϊκό οξύ είναι το βιοδραστικό μέρος του 5-καφεοϋλκινικού οξέος, ενώ το κινικό οξύ δεν έχει σχεδόν καθόλου AOA [43]. Οι ενδοόλες ανέστειλαν το σχηματισμό ΟΗ λόγω του σχηματισμού ενός συμπλόκου σιδήρου[41] σε αναλογία ένα προς ένα [44,45]. Οι Lamy et al.[46] καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ σχηματίζει μονομερή σύμπλοκα, ενώ οι Kiss et al. [47] βρέθηκαν ολιγομερή είδη. Σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες [17,48], βρέθηκαν μόνο ίχνη δεσμευμένου σιδήρου παρουσία 5-καφεοϋλκινικού οξέος πριν και μετά τη θερμική επεξεργασία. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από τις συνθήκες ουδέτερου pH σε αυτήν τη μελέτη, ενώ άλλες μελέτες λειτούργησαν σε όξινο μέσο, ​​με βάση μια τιμή pH από 1-2.5 στο ανθρώπινο στομάχι [48]. Ένα μαύρο ίζημα βρέθηκε σε αποθηκευμένα δείγματα μετά από αρκετές ώρες, το οποίο είναι δείκτης συμπλοκών 5-καφεοϋλικινικού οξέος-σιδηρούχου σιδήρου. Πρόσφατα αναμεμειγμένα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση, επομένως ο σχηματισμός αυτών των συμπλεγμάτων σε ουδέτερο pH απαιτεί μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Τα σύμπλοκα σιδήρου με καφεϊκό οξύ εμφάνισαν μικρή δράση σάρωσης [49]. Επιπλέον, δεν υπάρχουν φασματοφωτομετρικές ενδείξεις για αντίδραση μεταξύ κινικού οξέος και τρισθενούς σιδήρου [48]. Σε αντίθεση με το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ, στο δείγμα ρουτινοσίδης της κερκετίνης-3-, βρέθηκε δεσμευμένος σίδηρος, ακόμη και μετά από θερμική επεξεργασία.

Η κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη μείωσε το σίδηρο σιδήρου σε σίδηρο με ελάχιστη αύξηση κατά παρατεταμένο χρόνο μαγειρέματος. Αυτή η μέτρια αναγωγική δραστηριότητα της ρουτινοσίδης της κερκετίνης-3-περιγράφηκε προηγουμένως από τους Mira et al. [50]. Η αναγωγική δραστηριότητα του σιδήρου της κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης ανιχνεύθηκε στη 3-ρουτινοσίδη, 5,7,3',4'-OH [50]. Η μέτρια αλληλεπίδραση με τον σίδηρο σιδήρου μπορεί να εξηγηθεί από έναν μικρότερο αριθμό ομάδων -ΟΗ, που οδήγησε σε χαμηλότερη πυκνότητα αρνητικού φορτίου στην πλευρά της χηλίωσης [50]. Τα φλαβονοειδή μπορούν να χηλικοποιηθούν με μεταλλικά ιόντα σε τρεις πιθανές πλευρές συντονισμού: (i) μεταξύ 5-υδροξυ και 4-καρβονυλικών ομάδων, (ii) μεταξύ 3-υδροξυ και 4-καρβονυλικών ομάδων, και (ii) μεταξύ 3', Α'-υδροξυ ομάδες στο Bring [39]. Η κουερσετίνη-3-ρουτινοσίδη χρησιμοποιεί τις πλευρές σύνδεσης (i) και (i)[9], και στην ομάδα 3-υδροξυλίου, η ρουτινοσίδη είναι προσκολλημένη. Τα φασματικά δεδομένα έδειξαν ακόμη ότι τα μεταλλικά ιόντα συνδέονται μόνο με την 3', Α'-υδροξυ ομάδα [18]. Τα χηλικά είναι πιο αποτελεσματικά με τον σίδηρο στη δισθενή του μορφή [50]. Σε δυαδικά μείγματα, η ρουτινοσίδη της κερκετίνης-3-δεν είναι ικανή να σχηματίσει σύμπλοκα όταν υπάρχει ασκορβικό οξύ, αντίθετα στα τριμερή μείγματα. Εάν υπάρχει 5-καφεοϋλκινικό οξύ, ανευρίσκονται μικρές ποσότητες δεσμευμένου σιδήρου. Αυτό υποδηλώνει ότι η 5-καφεοϋλοκινική προστατεύει τα μόρια της κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης παρουσία ασκορβικού οξέος, επομένως η κερκετίνη-3-ρουτινοσίδη μπορεί να σχηματίσει σύμπλοκα με τον σίδηρο.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1.Χημικά

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 τοις εκατό), δωδεκαένυδρος θειικός αμμώνιος σίδηρος και εξαένυδρος θειικός σίδηρος αμμώνιο αγοράστηκαν από τον Carl Roth (Καρλσρούη, Γερμανία).

4.2.Δείγματα

Υδατικά διαλύματα και μείγματα αυθεντικών προτύπων ασκορβικού οξέος, {0}}καφεοϋλκινικού οξέος και κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης παρασκευάστηκαν ως καθαρά διαλύματα και μίγματα σε διαφορετικές αναλογίες. Όλα τα πιθανά δυαδικά μείγματα έγιναν σε ισομοριακές αναλογίες και οι μη ισομοριακές αναλογίες με μία ένωση διπλασιάστηκαν. Τριμερή μίγματα παρασκευάστηκαν επίσης σε ισομοριακές αναλογίες, καθώς και σε μη ισομοριακές αναλογίες με μία ή δύο ενώσεις διπλασιασμένες, αντίστοιχα. Οι τελικές συγκεντρώσεις των αντιοξειδωτικών ήταν 0.3 mM για κάθε διάλυμα δοκιμής. Επιπλέον, όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν μετά την προσθήκη 0.3 mM σιδήρου ({{10}}.15 mM δισθενούς σιδήρου και 0.15 mM σιδήρου σιδήρου) συνολικά ανά μείγμα. Οι επιλεγμένες ποσότητες αντιοξειδωτικών και σιδήρου δεν βασίζονται σε φυσιολογικά ή τροφικά επίπεδα, βασίζονται σε μοριακές μάζες για τη μελέτη της επίδρασης της μοριακής αλληλεπίδρασης. Κατά συνέπεια, καθιερώθηκε μια ισομοριακή αναλογία μεταξύ των συνολικών αντιοξειδωτικών και του σιδήρου. Όλα τα μείγματα μαγειρεύτηκαν για 0, 10, 20 και 40 λεπτά σε βραστό νερό και στη συνέχεια ψύχθηκαν σε πάγο για να σταματήσει η διαδικασία θέρμανσης. Αυτό έγινε για τρία ανεξάρτητα αντίγραφα.

4.3.Φωτομετρικές μετρήσεις

Αντιοξειδωτικά(καθαρό ή μεικτό) απουσία και παρουσία σιδήρου μετρήθηκαν για τη συνολική αναγωγική και αντιοξειδωτική τους δράση σε τρία ανεξάρτητα τεχνικά αντίγραφα χρησιμοποιώντας μια μέθοδο υψηλής απόδοσης σε 96-πλάκες φρεατίων (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, ΗΠΑ). Χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές δοκιμασίες, λόγω των διαφορετικών μηχανισμών αντίδρασης: μεταφορά ενός ηλεκτρονίου (SET) και μεταφορά ατόμου υδρογόνου (HAT). Ενώ η ανάλυση TEAC και TPC βασίζεται στο SET [17,18], για τη δοκιμασία DPPH, η βιβλιογραφία δεν είναι αρκετά σαφής εάν βασίζεται σε SET, HAT ή ακόμα και σε συνδυασμό αυτών των δύο μηχανισμών [{{6} }]. Μια πρόσφατη μελέτη από τον Φώτη[51] ανακάλυψε ότι οι φαινόλες μπορούν να αντιδράσουν με την DPPH μέσω διαδοχικής μεταφοράς ηλεκτρονίων με απώλεια πρωτονίων (SPLET), ένας συνδυασμός των δύο μηχανισμών. Παράγοντες, όπως η μέση πολικότητα και το δυναμικό ιονισμού, επηρεάζουν τον κυρίαρχο μηχανισμό.

4.3.1. Ολικό φαινολικό περιεχόμενο (TPC)

Η ολική περιεκτικότητα σε φαινόλη (TPC) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Folin-Ciocalteu σε μια 96-πλάκα φρεατίου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τους Bobo-Garcia et al.[52] με κάποιες τροποποιήσεις.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Η κοινή ονομασία αυτής της δοκιμής είναι παραπλανητική επειδή το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu αντιδρά επίσης σε μη φαινολικά, όπως βιταμίνες και μέταλλα [22]. Περιγράφει καλύτερα την «ολική αναγωγική δράση» των βιοδραστικών ενώσεων.

4.3.2. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)

Η αντιοξειδωτική δράση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TEAC σε μια πλάκα 96-πηγαδιού με ορισμένες τροποποιήσεις. Παρασκευάστηκε ένα μητρικό διάλυμα με 9,6 mg ABTS και 1,66 mg υπερθειικού καλίου γεμάτο με Η2Ο έως 25 mL και επωάστηκε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 12-16 h. Από αυτό το μητρικό διάλυμα, παρασκευάστηκε ένα διάλυμα εργασίας TEAC, που περιείχε ένα μητρικό διάλυμα 5 mL γεμάτο έως 25 mL με 100 τοις εκατό MeOH.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Radical Scavenging

οαντιοξειδωτικόactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Συνέργεια και Ανταγωνισμός

Για την ανάλυση των συνεργιστικών και ανταγωνιστικών επιδράσεων της αντιοξειδωτικής δράσης, έγινε σύγκριση των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν πειραματικά με τις θεωρητικές τιμές που υπολογίστηκαν από το άθροισμα των επιδράσεων μεμονωμένων συστατικών στην αντίστοιχη συγκέντρωση [53]. Ο συνέργεια περιγράφει μια αλληλεπίδραση δύο ή περισσότερων ουσιών έτσι ώστε η συνδυασμένη δράση να είναι μεγαλύτερη από το άθροισμα κάθε δράσης χωριστά. Σε αντίθεση με αυτό, ο ανταγωνισμός είναι ένα φαινόμενο όπου η αλληλεπίδραση δύο ή περισσότερων ουσιών σε συνδυασμό έχει μια συνολική επίδραση που είναι μικρότερη από το άθροισμα των επιμέρους επιδράσεών τους.

4.5.Προσδιορισμός Ιονικού Σιδήρου

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Η διαφορά μεταξύ του συνολικού και του ιοντικού σιδήρου, το άθροισμα του σιδήρου και του σιδήρου, είναι ο δεσμευμένος σίδηρος.

4.6.HPLC-DAD

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αντιοξειδωτικών ασκορβικού οξέος, 5-καφεοϋλοκινικού οξέος και κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης και προϊόντων αποδόμησής τους στα ίδια εκχυλίσματα που χρησιμοποιούνται για τη φωτομετρική

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99) προετοιμάστηκαν. Οι παράγωγες ενώσεις αναγνωρίστηκαν δοκιμαστικά με ανάλυση των καθαρών προτύπων παρουσία και απουσία προ- και μετα-θερμικής επεξεργασίας σιδήρου. Επομένως, η νέα κορυφή πρέπει να προέρχεται από το πρότυπο ένθετου. Επιπλέον, επιλεγμένα μείγματα μετρήθηκαν μέσω HPLC-MS για να επαληθευτεί η προτεινόμενη δομή.

4.7. Στατιστική ανάλυση

Το Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, ΗΠΑ) και το R Statistics (έκδοση 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμές βιοστατιστικής και παρουσίαση και κατάρτιση αποτελεσμάτων δεδομένων. Συμπερασματικές στατιστικές για την αξιολόγηση και τη σύνδεση των θεραπειών πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τριμερή ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ένα post hoc τεστ HSD του Tukey και τη συσχέτιση Pearson. Τα πακέτα R που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το ggplot2 [55], το μέσο [56] και το multicomp [57].

5. Συμπεράσματα

Με βάση τα ευρήματα που περιγράφηκαν παραπάνω, η ΑΟΑ του ασκορβικού οξέος, του 5-καφεοϋλκινικού οξέος και της κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης επηρεάστηκε από τη μοριακή δομή, τη συγκέντρωση, την αναλογία και τις αλληλεπιδράσεις με άλλα αντιοξειδωτικά και σίδηρο. Η αλληλεπίδραση φαίνεται ιδιαίτερα να παίζει ρόλο στην ΑΟΑ όταν συνδυάζεται ασκορβικό οξύ και 5-καφεοϋλκινικό οξύ. Εδώ, ανιχνεύθηκαν συνεργιστικά και ανταγωνιστικά αποτελέσματα. Η θερμοκρασία είχε ελάχιστη επίδραση στο AOA, ενώ ταυτόχρονα η θερμοκρασία επηρέασε τη σταθερότητα όλων των αντιοξειδωτικών σε ορισμένα μείγματα, ιδιαίτερα παρουσία σιδήρου. Μόνο η συγκέντρωση ασκορβικού οξέος μειώθηκε απουσία σιδήρου με παρατεταμένο χρόνο μαγειρέματος και η συγκέντρωση του 5-καφεοϋλκινικού οξέος μειώθηκε μόνο παρουσία σιδήρου, ενώ η συγκέντρωση της κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης μειώθηκε μόνο σε συνδυασμό με το ασκορβικό οξύ στο παρουσία σιδήρου. Σε συνδυασμό με τον σίδηρο, το 5-καφεοϋλοκινικό οξύ ήταν σε θέση να προστατεύσει άλλα μόρια από τη μείωση της συγκέντρωσής τους με θερμική επεξεργασία.

Στα φυτά, οι συνδυασμοί ασκορβικού οξέος, 5-καφεοϋλκινικού οξέος και κερκετίνης-3-ρουτινοσίδης δεν είναι μόνο δυνατοί αλλά και συνηθισμένοι. Ως εκ τούτου, αυτά τα αποτελέσματα δίνουν βασικές γνώσεις σχετικά με τις διαδικασίες που συμβαίνουν κατά το μαγείρεμα των λαχανικών. Οι μήτρες τροφίμων είναι πιο σύνθετες και περιέχουν αμέτρητες βιοδραστικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων ενζύμων, άλλων μετάλλων ή οξέων, που αλλάζουν τις συνθήκες αντίδρασης ή είναι οι ίδιες αντιδρώντα. Αυτές οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις είναι πολύ πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής αυτής της μελέτης και οι ευεργετικές συγκεντρώσεις και αλληλεπιδράσειςαντιοξειδωτικάστα μαγειρεμένα λαχανικά πρέπει να αντιμετωπιστούν στο μέλλον.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Επίδραση του κακάο στον διαβήτη: Το δυναμικό του παγκρέατος και του ήπατος ως βασικών οργάνων-στόχων, περισσότερο από ένα αντιοξειδωτικό αποτέλεσμα; Int. J. Food Sci. Τεχνολ. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, Α.; Jaganath, IB; Clifford, MN Phenols, Polyphenols and Tannins: An Overview. Δευτερεύοντες μεταβολίτες εντός του φυτού: Εμφάνιση, δομή και ρόλος στην ανθρώπινη διατροφή. Crozier, Α., Clifford, ΜΝ, Ashihara, Η., Eds.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, ΗΠΑ, 2006; σελ. 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Μεταβατικά Μέταλλα ως Καταλύτες Αντιδράσεων «Αυτοξείδωσης». Free Radic. Biol. Med. 1990, 8, 95-108. [CrossRef]

4. Buchner, Ν.; Krumbein, Α.; Rohn, S.; Kroh, LW Επίδραση Θερμικής Επεξεργασίας στις Φλαβονόλες Ρουτίνη και Κερσετίνη. Rapid Commun. Φάσμα Μάζας. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, Μ.; García-Casal, MN; Solano, L.; Barón, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, Ι.; Tropper, E. Iron Bioavailability in Humans from Breakfasts Enriched with Iron Bis-Glycine Chelate, Phytates and Polyphenols. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, Μ.; Cook, JD Inhibition of Non-Haem Iron Absorption in Man από ποτά που περιέχουν πολυφαινολικά. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289-295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, AI Αντιριζικές και Χηλικές Επιδράσεις στην Προστασία των Φλαβονοειδών έναντι Κυτταρικού Τραυματισμού που προκαλείται από Πυρίτιο. Αψίδα. Biochem. Biophys. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejík, Ζ.; Kaplánek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, Ρ.; Matkowski, Α.; Filipenský, P.; Veselá, Κ.; Gburek, J.; Συκόρα, Δ.; Martásek, Ρ.; et al. Συμπλέγματα σιδήρου από φλαβονοειδή-αντιοξειδωτική ικανότητα και πέρα. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, Α. Σχέσεις Δομής-Δραστηριότητας Ανάλυση μονομερών και πολυμερών πολυφαινολών (κουερκετίνη, ρουτίνη και κατεχίνη) που λαμβάνεται με διάφορες μεθόδους πολυμερισμού. Chem. Βιοδύτες. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, Β.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: A Review on Extraction, Identification and Purification Methods, Biological Activities and Approaches to Enhance Its Bioavailability. Trends Food Sci. Τεχνολ. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]