Χημειοπροληπτικές και ηπατοπροστατευτικές επιδράσεις της γενιστεΐνης μέσω της αναστολής του οξειδωτικού στρες και της οδού σηματοδότησης Versican/PDGF/PKC σε πειραματικά επαγόμενο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα σε αρουραίους από θειοακεταμίδη

Για περισσότερες λεπτομέρειες, παρακαλώ επικοινωνήστεtina.xiang@wecistanche.com

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Σκοπός: Η γενιστεΐνη είναι μια αναγνωρισμένη ισοφλαβόνη που υπάρχει στη σόγια με αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, αντιαγγειογενετική και αντικαρκινική δράση. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να ελέγξει την ικανότητα τουγενιστεΐνηστη διαμόρφωση του άξονα versican/αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF) στο HCC.

Μέθοδοι: Το HCC προκλήθηκε πειραματικά σε αρσενικούς αρουραίους Sprague-Dawley και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 ή 75 mg/kg γενιστεΐνης. Οι αντιοξειδωτικές δραστηριότητες της γενιστεΐνης αξιολογήθηκαν με μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης του Nrf2 και των ηπατικών επιπέδων μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD) και ανηγμένης γλουταθειόνης. Η έκφραση της πρωτεΐνης versican, PDGF, κινάσης πρωτεΐνης C (PKC) και ERK-1 αξιολογήθηκε με στύπωμα Western και ανοσοχρώση.

Αποτελέσματα: Το HCC προκάλεσε αύξηση των επιπέδων έκφρασης οξειδωτικού στρες, PDGF, versican, PKC και ERK. Η γενιστεΐνη μείωσε σημαντικά την επαγόμενη από το HCC αύξηση του οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, η δοσοεξαρτώμενη γενιστεΐνη μείωσε την επαγόμενη από HCC αύξηση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης PDGF, versican, PKC και ERK. Επιπλέον, η γενιστεΐνη βοήθησε στη διατήρηση μιας φυσιολογικής δομής ηπατοκυττάρων και μείωσε την εναπόθεση ινώδους ιστού, ειδικά σε υψηλές δόσεις.

συμπεράσματα: Genistein άσκησε κατά του όγκου καιαντιοξειδωτικόεπιδράσεις και επομένως καταστέλλουν την ανάπτυξη HCC μέσω αναστολής του αμφίδρομου άξονα PDGF/versican, καταστέλλοντας τόσο το ERK1 όσο και το PKC ως ρυθμιστές κατάντη. Επομένως, η γενιστεΐνη είναι ένας πιθανός νέος θεραπευτικός υποψήφιος για τη βελτίωση της έκβασης των ασθενών με HCC.

Λέξεις-κλειδιά: ERK; γενιστεΐνη; ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα; Nrf2; αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από αιμοπετάλια. πρωτεϊνική κινάση C; versican

Κάντε κλικ για να μάθετε περισσότερες πληροφορίες

Εισαγωγή

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς με κίρρωση. Το HCC είναι η πέμπτη πιο διαδεδομένη ηπατική νόσος και χαρακτηρίζεται από κακή πρόγνωση, αποτελώντας τη δεύτερη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας που σχετίζεται με τον καρκίνο [1]. Το HCC μπορεί να προκύψει από την έκθεση σε πολλούς παράγοντες, όπως η χρόνια ηπατίτιδα C ή η ιογενής λοίμωξη από ηπατίτιδα Β, η υψηλή κατανάλωση αλκοόλ και ο διαβήτης [2]. Το HCC είναι μια φλεγμονώδης νόσος, με περισσότερο από το 90 τοις εκατό των ασθενών με HCC να αναπτύσσουν χρόνια ηπατική βλάβη [3,4]. Η πρόγνωση του HCC είναι κακή λόγω του υψηλού ποσοστού μετάστασης και υποτροπής της νόσου [5]. Τα μοριακά μονοπάτια που αποτελούν τη βάση της εισβολής HCC παραμένουν άπιαστα, γεγονός που εμποδίζει την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών μεθόδων. Αρκετοί ασθενείς υποκύπτουν στο HCC λόγω της έλλειψης αποτελεσματικών θεραπειών. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να βρεθούν πιο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων του HCC.

Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι ο αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF), ως μέλος της οικογένειας προφλεγμονωδών αυξητικών παραγόντων, παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της σύνθεσης του versican. Επιπλέον, ο PDGF ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση mRNA του versican. Τα επίπεδα έκφρασης του PDGF συσχετίζονται ισχυρά με τον βαθμό και τη διήθηση του HCC, υποδεικνύοντας τον σημαντικό ρόλο του PDGF στην έναρξη, την εξέλιξη, την εισβολή και τη μετάσταση του HCC [6]. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνικής κινάσης C(PKC) συσχετίζονται ισχυρά με τα επίπεδα έκφρασης του PDGF. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς PKC μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως νέα αντικαρκινικά φάρμακα [7]. Επιπλέον, η οδός σηματοδότησης ERK/PDGF συμβάλλει στην καρκινογένεση του HCC και θεωρείται κατάλληλος υποψήφιος για την ανίχνευση ασθενών υψηλού κινδύνου ως στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του πόνου [8-10].

Genisteinείναι ένα προϊόν ισοφλαβόνης σόγιας που χρησιμεύει ως αναστολέας αγγειογένεσης και φυτοοιστρογόνο. Παρουσιάζει ένα ευρύ φάσμα σημαντικών ιδιοτήτων, όπωςαντιφλεγμονώδη, αντιοξειδωτικό, αντιπολλαπλασιαστικές και αντιαγγειογενετικές επιδράσεις, οι οποίες προσδίδουν χημειοπροληπτική δυνατότητα γενιστεΐνης [11]. Επιπλέον, η γενιστεΐνη έχει αναφερθεί ότι παρεμβαίνει στους υποδοχείς οιστρογόνων σε ζώα και ανθρώπους, παράγοντας αποτελέσματα παρόμοια με τα οιστρογόνα [12], καθώς και ότι δρα στους ανδρογόνους υποδοχείς [13]. Η γενιστεΐνη έχει επίσης προσδιοριστεί ότι εμφανίζει αντιική δράση έναντι της μόλυνσης από ροταϊό [14].

Η γενιστεΐνη αναφέρεται ότι είναι λιγότερο επιβλαβής για τα υγιή κύτταρα από τα κύτταρα HCC προκαλώντας διακοπή και απόπτωση G2/M [15]. Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε, δεν έχουν υπάρξει προηγούμενες μελέτες που να διερευνούν την επίδραση της αναστολής της οδού σηματοδότησης versican/PDGF/PKC από τη γενιστεΐνη στο HCC. Ως εκ τούτου, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει τα χημειοπροληπτικά και ηπατοπροστατευτικά αποτελέσματα της γενιστεΐνης στο HCC μέσω της διερεύνησης της επίδρασής της στα μονοπάτια σηματοδότησης versican/PDGF/PKC και ERK. Για την επαγωγή HCC σε αρουραίους, χρησιμοποιήθηκε θειοακεταμίδιο [3,4,16,17].

Υλικά και μέθοδοι

Πειράματα σε ζώα. Συνολικά, 50 αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley τεσσάρων εβδομάδων (βάρος, 180-200 g) χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Τα πειραματικά πρωτόκολλα και όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από τη Φαρμακευτική Σχολή, Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Mansoura (Μανσούρα, Αίγυπτος, αρ. έγκρισης 2020-181). Οι αρουραίοι διατηρήθηκαν σε κύκλο 12 ωρών φωτός / 12 ωρών σκότους Οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες με 10 ζώα ανά ομάδα. Τα ζώα διατηρήθηκαν ως 5 αρουραίοι ανά κλουβί στην αρχή της μελέτης. Οι πέντε ομάδες ήταν οι εξής: (i) Ομάδα ελέγχου, στους αρουραίους έγινε ενδοπεριτοναϊκή (ip) ένεση PBS, 10 mM, ρΗ 7,4· (i) ομάδα ελέγχου που έλαβε αγωγή με γενιστεΐνη, οι αρουραίοι έλαβαν 75 mg/kg γενιστεΐνης (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ημερησίως για 16 εβδομάδες με καθετηριασμό από το στόμα· (il)ομάδα HCC, οι αρουραίοι έλαβαν 200 mg/kg θειοακεταμίδης (TAA, Tocris Bioscience), ενδοπεριτοναϊκή ένεση δύο φορές την εβδομάδα για 16 εβδομάδες· (iv) HCC υποβλήθηκαν σε αγωγή με γενιστεΐνη, οι αρουραίοι έλαβαν 25 mg/kg γενιστεΐνης από του στόματος καθετήρα ημερησίως για 16 εβδομάδες. και (ν) HCC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με γενιστεΐνη, οι αρουραίοι έλαβαν 75 mg/kg γενιστεΐνης με καθετηριασμό από το στόμα καθημερινά για 16 εβδομάδες. Από την πρώτη ημέρα, τα ζώα και στις δύο ομάδες HCC που έλαβαν γενιστεΐνη ενέθηκαν με 200 mg/kg ΤΑΑ ενδοπεριτοναϊκώς, δύο φορές την εβδομάδα για 16 εβδομάδες, μαζί με καθημερινή από του στόματος θεραπεία με γενιστεΐνη. Οι συγκεντρώσεις της γενιστεΐνης και ο τρόπος χορήγησης που χρησιμοποιήθηκαν επιλέχθηκαν σύμφωνα με αυτές που χρησιμοποιήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες για τη θεραπεία του καρκίνου σε αρουραίους [18,19]. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικές μελέτες για να διασφαλιστεί η αποτελεσματικότητα των επιλεγμένων δόσεων στη θεραπεία του καρκίνου.

Συλλογή δειγμάτωνΔείγματα αίματος (2 ml συλλέχθηκαν από το οπισθο-κογχικό πλέγμα κάθε αρουραίου που αναισθητοποιήθηκε με θειοπεντάλη νάτριο (40 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκώς) μέσω παρακέντησης του οπισθοκογχικού πλέγματος. Το αίμα από τους αρουραίους φυγοκεντρήθηκε σε 3000 rpm για 5 λεπτά και ο ορός στη συνέχεια αποθηκεύτηκε στους-80C πριν από την ανάλυση της ηπατικής λειτουργίας. Ολόκληρα ήπατα αρουραίου εκχυλίστηκαν πρόσφατα, ξεπλύθηκαν με φυσιολογικό ορό και διαχωρίστηκαν σε δύο μέρη. Ένα μέρος στερεώθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 τοις εκατό φορμαλδεΰδη για μορφολογική και ιστοπαθολογική διερεύνηση. Η δεύτερη ομογενοποιήθηκε σε 10-πλάσιο όγκο 0,01 Μ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου-καλίου, pH 7,4 και αποθηκεύτηκε στους -80C για βιοχημική ανάλυση.

Μορφολογική ανάλυση. Δείγματα ήπατος που είχαν μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη κόπηκαν σε τομές 5-μm και χρωματίστηκαν με χρώσεις τριχρωμίου Masson και Περιοδικού οξέος Schiff(PAS). Τα τμήματα κωδικοποιήθηκαν ανώνυμα και εξετάστηκαν με καλυμμένο τρόπο χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπολογιστή με τη βοήθεια ψηφιακής κάμερας (Nikon Corporation).

Ανοσοϊστοχημεία. Πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας 5-τομές παραφίνης um επωασμένες με μονοκλωνικά αντισώματα για versican, PDGF, PKC και ERK-1(Abcam) σε αραίωση 1:500 στους 4C όλη τη νύχτα. Οι τομές στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δευτερεύοντα αντισώματα (Abcam) συζευγμένα με HRP. Στη συνέχεια, 2 τοις εκατό DAB σε 50 mM Tris-ρυθμιστικό, ρΗ 7,6, προστέθηκε ως χρωμογόνο. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και εξετάστηκαν με καλυμμένο τρόπο χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπολογιστή με τη βοήθεια ψηφιακής κάμερας (Nikon Corporation) [20].

Αξιολόγηση ηπατοπροστατευτικών επιδράσεων. Η δραστικότητα ορού της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT), της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST, αλκαλική φωσφατάση, γ-γλουταμυλ τρανσφεράση (GGT) και της αλβουμίνης (BioDiagnostic Co.) ποσοτικοποιήθηκε φασματοφωτομετρικά για την αξιολόγηση των ηπατοπροστατευτικών επιδράσεων.

Αντιοξειδωτική δράση. Τα επίπεδα μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), υπεροξειδίου του υδρογόνου, υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) και ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH) στον ηπατικό ιστό ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα κιτ που αγοράστηκαν από την BioDiagnostic Co.

Τα επίπεδα EL/SA.a-φετοπρωτεΐνης (AFP) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα κιτ ELISA (Wuhan USCN Business Co, Ltd.).

Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR). Η ανάλυση PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως από την ομάδα μας [4]. Η αλληλουχία του Nrf2 ο εμπρόσθιος εκκινητής 5'-GAGACGGCCATGACTGAT-3' και ο αντίστροφος εκκινητής, 5'-GTGAGGGGATCGATGAGTAA-3'και για το GAPDH, ο εμπρόσθιος εκκινητής 5'-CCATCAACGACCCCTTCATT{12}'και αντίστροφη αστάρι 5'- CACGACATACTCAGCACCAGC-3'.

Western blotting. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης των PDGF, versican, PKC και ERK σε δείγματα ήπατος προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως[21]. Εν συντομία, η ολική πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία πρωτεΐνης (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Η ολική πρωτεΐνη διαχωρίστηκε (20 μg/λωρίδα) χρησιμοποιώντας SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Τα πρωτογενή αντισώματα (1:500) αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (Merck KGaA) και επωάστηκαν με τις μεμβράνες στους 4°C όλη τη νύχτα. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν ξανά με 1:2000 -ακτίνη σε θερμοκρασία δωματίου (Sigma-Aldrich, Merck KGaA) σε PBST που περιείχε 5 τοις εκατό γάλα χωρίς λιπαρά Μετά την αρχική επώαση, οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένα με HRP δευτερεύοντα αντισώματα προβάτου κατά κουνελιού ( 1:5000). Οι πρωτεϊνικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Αυτά τα δεδομένα εκφράζονται ως η σχετική οπτική πυκνότητα.

Στατιστική ανάλυση. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος± SEM. Η κανονικότητα της κατανομής του δείγματος εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Kolmogorov-Smirnov. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της επιβίωσης των αρουραίων. Για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των ομάδων, χρησιμοποιήθηκε μια μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από Bonferroni post hoc test. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS έκδοση 20 (IBM Corp.).<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Αποτελέσματα

Επίδραση της από του στόματος θεραπείας με γενιστεΐνη σε επαγόμενο από HCCοξειδωτικό στρες. Οι αρουραίοι HCC εμφάνισαν 2,51 και 2,{3}}πλάσιες αυξήσεις στα επίπεδα ηπατικής MDA και υπεροξειδίου του υδρογόνου, αντίστοιχα. Επιπλέον, οι αρουραίοι HCC παρουσίασαν μείωση 57 τοις εκατό , 60 τοις εκατό και 63 τοις εκατό στα ηπατικά επίπεδα Nrf2, GSH και SOD, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, η θεραπεία αρουραίων HCC με γενιστεΐνη είχε ως αποτέλεσμα μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στα επίπεδα MDA και υπεροξειδίου του υδρογόνου, καθώς και σε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα επίπεδα GSH, SOD και Nrf2 σε σύγκριση με την ομάδα HCC (Εικόνα 1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η γενιστεΐνη μπορεί να έχει αντιοξειδωτική δράση σε αρουραίους HCC.

Επίδραση της γενιστεΐνης στη θνησιμότητα που προκαλείται από HCC και στην αύξηση της AFP. Εικόνες ήπατος από αρουραίους HCC έδειξαν αυξημένο αριθμό οζιδίων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η θεραπεία αρουραίων HCC με γενιστεΐνη οδηγεί σε δοσοεξαρτώμενη μείωση του αριθμού των οζιδίων στο ήπαρ των αρουραίων (Εικόνα 2). Επιπλέον, η θεραπεία αρουραίων HCC με 25 mg/kg γενιστεΐνης αύξησε το ποσοστό επιβίωσης αρουραίων από 30 τοις εκατό σε η ομάδα HCC στο 50 τοις εκατό. Επιπλέον, οι αρουραίοι HCC που έλαβαν θεραπεία με 75 mg/kg γενιστεΐνης εμφάνισαν αυξημένο ποσοστό επιβίωσης 90 τοις εκατό. Στο τέλος του πειράματος, οι αρουραίοι ελέγχου και οι αρουραίοι ελέγχου που έλαβαν αγωγή με γενιστεΐνη 75 mg/kg εμφάνισαν 100 τοις εκατό επιβίωση. Η επιβίωση αρουραίου συσχετίστηκε επίσης με σημαντική μείωση των επιπέδων AFP στον ορό σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 3). Αυτά τα αποτελέσματα, επομένως, έδειξαν ότι η γενιστεΐνη μπορεί να παράγει θεραπευτικά αποτελέσματα κατά του HCC μειώνοντας το ποσοστό θνησιμότητας και τα επίπεδα AFP στον ορό.

Επίδραση της γενιστεΐνης σε δοκιμασίες ηπατικής λειτουργίας. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τα επίπεδα ορού ALT, AST, αλκαλικής φωσφατάσης και GGT ήταν σημαντικά αυξημένα στην ομάδα HCC, ενώ υπήρξε σημαντική μείωση στα επίπεδα λευκωματίνης ορού. Η θεραπεία αρουραίων HCC με γενιστεΐνη είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση των επιπέδων ορού ALT, AST, αλκαλικής φωσφατάσης και GGT και αυξημένα επίπεδα λευκωματίνης ορού σε σύγκριση με την ομάδα HCC, ειδικά στην ομάδα που έλαβε αγωγή με 75 mg/kg γενιστεΐνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ηπατοπροστατευτικά αποτελέσματα που παράγονται από γενιστεΐνη έναντι αρουραίων HCC.

Επίδραση της γενιστεΐνης στις μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από HCC. Η εξέταση των δειγμάτων ήπατος αρουραίου από τις ομάδες ελέγχου που χρωματίστηκαν με τρίχρωμο Masson αποκάλυψε την απουσία ίνωσης. Ωστόσο, εικόνες που καταγράφηκαν από τον ηπατικό ιστό στην ομάδα HCC έδειξαν πολύ χρωματισμένα ινώδη διαφράγματα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η θεραπεία αρουραίων HCC με γενιστεΐνη μείωσε την εναπόθεση ινώδους ιστού, ειδικά μετά από θεραπεία με 75 mg/kg γενιστεΐνης (Εικόνα 5). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, δείγματα που χρωματίστηκαν με PAS εμφάνισαν κανονική εμφάνιση στις ομάδες ελέγχου. Η χρώση PAS μειώθηκε στην ομάδα HCC σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και αυξήθηκε σημαντικά σε αρουραίους HCC που έλαβαν γενιστεΐνη. Επομένως, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η γενιστεΐνη μπορεί να βελτιώσει τη δομή των ηπατοκυττάρων.

Επίδραση της γενιστεΐνης στην επαγόμενη από HCC αύξηση του επιπέδου έκφρασης της πρωτεΐνης PDGF στον ηπατικό ιστό. Οι αρουραίοι HCC αποκάλυψαν σημαντική αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PDGF σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Ωστόσο, η από του στόματος χορήγηση γενιστεΐνης είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PDGF με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, ηπατικές τομές από την ομάδα HCC έδειξαν σημαντική αύξηση στις περιοχές που βάφτηκαν με αντισώματα κατά του PDGF σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, η θεραπεία σε αρουραίους HCC με την υψηλότερη δόση γενιστεΐνης μείωσε σημαντικά τη θετικά χρωματισμένη περιοχή σε σύγκριση με το HCC και ήταν παρόμοια επίπεδα με εκείνα που φαίνονται στην ομάδα φυσιολογικού ελέγχου (Εικόνα 7). Επομένως, η γενιστεΐνη εμπόδισε την επαγόμενη από HCC έκφραση του PDGF χωρίς να επηρεάσει την ομάδα ελέγχου.

Η επίδραση της γενιστεΐνης στο επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης versican που προκαλείται από HCC αυξάνεται. Η ένεση ΤΑΑ οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης versican σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Ωστόσο, η θεραπεία αρουραίων HCC με γενιστεΐνη οδήγησε σε μείωση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης versican με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, οι ηπατικές τομές από την ομάδα HCC εμφάνισαν σημαντική αύξηση σε περιοχές που βάφτηκαν με αντι-βερσικαναντισώματα. Ωστόσο, η θεραπεία με γενιστεΐνη μείωσε σημαντικά τις θετικά χρωματισμένες περιοχές σε επίπεδα παρόμοια με εκείνα της φυσιολογικής ομάδας ελέγχου σε αρουραίους που έλαβαν την υψηλότερη δόση γενιστεΐνης (Εικόνα 8).

Η επίδραση της γενιστεΐνης στο επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης PKC που προκαλείται από HCC αυξάνεται. Οι αρουραίοι HCC επέδειξαν σημαντική αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PKC σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Ηπατικές τομές που χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-PKC αποκάλυψαν αυξημένη περιοχή χρώσης στην ομάδα HCC σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Ωστόσο, η θεραπεία της ομάδας HCC με γενιστεΐνη είχε ως αποτέλεσμα μείωση του επιπέδου έκφρασης της πρωτεΐνης PKC με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PKC στην ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με 75 mg/kg γενιστεΐνης ήταν παρόμοια με αυτά της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 9).

Η επίδραση της γενιστεΐνης στο επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ERK-1 που προκαλείται από HCC αυξάνεται. Η ομάδα HCC έδειξε σημαντική αύξηση στα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ERK-1 σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Επιπλέον, ηπατικές τομές από αρουραίους HCC εμφάνισαν αύξηση στις περιοχές που βάφτηκαν με αντισώματα αντι-ERK-1 σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Ωστόσο, η θεραπεία της ομάδας HCC με γενιστεΐνη είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης ERK-1 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ERK-1 στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με 75 mg/kg γενιστεΐνης ήταν παρόμοια με εκείνα της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 10).

Συζήτηση

Το HCC θεωρείται η πρωτοπαθής ηπατική κακοήθεια και είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας που σχετίζεται με τον καρκίνο παγκοσμίως [22]. Το HCC είναι εξαιρετικά ανθεκτικό στην ακτινοθεραπεία και τη χειρουργική θεραπεία αφαίρεσης εκτομής [23]. Το μικροπεριβάλλον του ήπατος αποτελείται από διάφορα συστατικά, συμπεριλαμβανομένης της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), των ανοσοκυττάρων, των κυττάρων Kupffer, των ενδοθηλιακών κυττάρων, των ινοβλαστών, των κυτοκινών και διαφόρων αυξητικών παραγόντων, γεγονός που καθιστά το μικροπεριβάλλον του ηπατικού καρκινογόνου ιστού ευάλωτο στην υποτροπή καθώς και στην ανάπτυξη de novo όγκοι HCC [24]. Σε ένα μικροπεριβάλλον καρκινογόνου ιστού, η έκφραση πρωτεογλυκάνης μεταβάλλεται σημαντικά και, ως εκ τούτου, οι πρωτεογλυκάνες μπορούν να θεωρηθούν ως ελκυστικοί θεραπευτικοί στόχοι στο HCC [6]. Στην παρούσα μελέτη, το HCC αύξησε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης versican. που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε αλλαγές στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, στην αγγειογένεση και στη μετάσταση και να διευκολύνουν την εξέλιξη του όγκου [25]. Η στόχευση του versican, μιας από τις πρωτεογλυκάνες στο μικροπεριβάλλον του όγκου, μπορεί να προσφέρει μια νέα θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει την επίδραση του αποκλεισμού της διαμορφωμένης από PDGF έκφρασης versican στην παθογένεια του HCC in vivo.

Την τελευταία δεκαετία, υπήρξε αυξανόμενο ενδιαφέρον για πιθανούς χημειοπροληπτικούς παράγοντες για τον καρκίνο που λαμβάνονται από φυσικές πηγές [20]. Η γενιστεΐνη ως ισοφλαβόνη σόγιας έχει τραβήξει την προσοχή λόγω των πιθανών ευεργετικών της επιδράσεων σε εκφυλιστικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Μια μελέτη ανέφερε ότι η γενιστεΐνη μπορεί να στοχεύσει πολλούς κρίσιμους μοριακούς στόχους. Αυτές οι μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η γενιστεΐνη έχει επίσης προαποπτωτικές, διακοπής του κυτταρικού κύκλου, αντιαγγειογενετικές, αντιμεταστατικές, αντιπολλαπλασιαστικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες [11]. Ωστόσο, η γενιστεΐνη θεωρείται ότι είναι ένας κατασταλτικός καρκίνου του ήπατος in vitro [26]. Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι η χημειοπροστατευτική δράση της γενιστεΐνης μπορεί να αποδοθεί στις προ-αποπτωτικές και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις της μέσω μηχανισμών που περιλαμβάνουν ενεργοποιημένη από AMP πρωτεϊνική κινάση [27]. μονοπάτια που σχετίζονται με την ογκογένεση, τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή, τη μετανάστευση και τη μετάσταση και, ως εκ τούτου, έχουν αποτελέσει αντικείμενο εντατικής έρευνας για τον εντοπισμό νέων φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου [37].

Από όσο γνωρίζουμε, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη που αποκαλύπτει τον νέο και πολλά υποσχόμενο χημειοπροληπτικό μηχανισμό της γενιστεΐνης στο HCC in vivo. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν ότι η γενιστεΐνη, ως αναστολέας της κινάσης του υποδοχέα τυροσινίνης, όχι μόνο επηρεάζει τα καρκινικά κύτταρα αλλά επίσης επηρεάζει τα CAF στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Η γενιστεΐνη αποδείχθηκε ότι μειώνει την απελευθέρωση PDGF, η οποία με τη σειρά της μείωσε τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης versican, γεγονός που μπορεί να είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη απελευθέρωση του PDGF από τα CAF. Ως εκ τούτου, ο βρόχος θετικής ανάδρασης PDGF/versican μπορεί να θεωρηθεί ως ένας πολλά υποσχόμενος στόχος για την καταπολέμηση της ανάπτυξης, της εισβολής και της αγγειογένεσης HCC και για την υπέρβαση της αντίστασης στη θεραπεία του όγκου.

Έχει επίσης αναφερθεί ότι το δίκτυο σηματοδότησης Ras/Raf/MEK/ERK διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του HCC [38]. Από όσο γνωρίζουμε, η παρούσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά ότι η χορήγηση γενιστεΐνης πέτυχε δοσοεξαρτώμενη μείωση του ERK1, ως συστατικού της οδού σηματοδότησης MAPK, και των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης PKC, καθώς και σημαντική μείωση του PDGF και επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης versican, σε σύγκριση με την ομάδα HCC. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση των EGF, PDGF και VEGF ως ανοδικών αυξητικών παραγόντων, σε συνδυασμό με RTK, ενεργοποιεί το δίκτυο σηματοδότησης Ras/Raf/MEK/ERK στο HCC. Επιπλέον, έχει αποκαλυφθεί ότι η ενεργοποίηση ERK προάγει επίσης την έκφραση των προσδεμάτων EGFR, προάγοντας έναν αυτοκρινή βρόχο ανάπτυξης κρίσιμο για την ανάπτυξη του όγκου [39]. Μια προηγούμενη μελέτη προσδιόρισε επίσης ότι το versican έχει μοτίβα που μοιάζουν με EGF [35]. Μπορεί επομένως να υποτεθεί ότι τόσο το PDGF όσο και το versican θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν το ERK1, ως μεταγενέστερο ρυθμιστή της οδού σηματοδότησης MAPK, και το PKC. Αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου, καθώς προκαλούν έναν αριθμό κυτταρικών συμβάντων, όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η κυτταρική μετανάστευση και η κυτταρική επιβίωση.

Τα ισοένζυμα PKC βρίσκονται στο σταυροδρόμι πολλαπλών οδών σηματοδότησης που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, την εισβολή, την ογκογένεση και τη μετάσταση και, ως εκ τούτου, έχουν αποτελέσει αντικείμενο έντονης έρευνας για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών μεθόδων για τον καρκίνο [40]. Για παράδειγμα, τα ισοένζυμα PKC διεγείρουν το μονοπάτι σηματοδότησης Ras/Raf/MEK/ERK το οποίο διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [41].

Η σηματοδότηση μέσω των υποδοχέων PDGF στα καρκινικά κύτταρα ρυθμίζεται και ελέγχεται στενά. Ορισμένες μελέτες έχουν προτείνει ότι υπάρχουν δύο κύριοι μηχανισμοί που οδηγούν στην ενίσχυση των οδών σηματοδότησης κατάντη PDGF στα καρκινικά κύτταρα. Πρώτον, τα διεγερμένα από PDGF κύτταρα παράγουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), τα οποία αντιδρούν με υπολείμματα κυστεΐνης σε ενεργές θέσεις των φωσφατάσης τυροσίνης οδηγώντας στην αναστολή τους. Δεύτερον, η αποικοδόμηση της φωσφατάσης 3 της MAP-κινάσης ως αποτέλεσμα της διαδικασίας ουβικουϊτινοποίησης, είναι υπεύθυνη για την αποφωσφορυλίωση και την αδρανοποίηση της ERK, η οποία οδηγεί σε αυξημένο πολλαπλασιασμό και εξέλιξη του όγκου [33]. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν επίσης τα δεδομένα της παρούσας μελέτης, η οποία κατέδειξε ότι η ομάδα HCC εμφάνισε σημαντική ανοδική ρύθμιση στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PDGF συνοδευόμενη από σημαντική αύξηση στα ηπατικά επίπεδα MDA. Επιπλέον, τα δεδομένα western blotting κατέδειξαν σημαντική ανοδική ρύθμιση στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ERK1.

Οι οδοί σηματοδότησης που εμπλέκονται στις αυξήσεις που προκαλούνται από PDGF και οι θεραπείες με PDGF έχουν οδηγήσει σε αυξήσεις στη σύνθεση πρωτεϊνών πυρήνων versican. Οι επιδράσεις του PDGF στο mRNA του versican μπλοκάρονται από την αναστολή είτε των οδών σηματοδότησης PKC είτε ERK. Ωστόσο, η επίδραση του PDGF μπορεί να αποκλειστεί με αναστολή PKC, αλλά όχι με αναστολή ERK [42]. Τόσο η ενεργοποίηση PKC όσο και ERK απαιτείται για την έκφραση πρωτεΐνης πυρήνα mRNA versican. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικά μονοπάτια σηματοδότησης ελέγχουν διαφορετικές πτυχές της διεγειρόμενης από PDGF βιοσύνθεσης versican [43].

Κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες, τα ROS παράγονται συνεχώς και έχουν βλαβερές επιδράσεις σε όλα τα κύτταρα του σώματος. Έχει αναφερθεί ότι το οξειδωτικό στρες παίζει βασικό ρόλο στην εξέλιξη της χρόνιας ηπατικής νόσου και της ηπατοκαρκινογένεσης [44]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η από του στόματος χορήγηση γενιστεΐνης είχε ως αποτέλεσμα δοσοεξαρτώμενη αντιοξειδωτική δράση, η οποία αντικατοπτρίζεται από σημαντική αύξηση στα ηπατικά επίπεδα Nrf2, GSH και SOD και σημαντική καταστολή των επιπέδων MDA. Η γενιστεΐνη αναφέρθηκε ότι παράγει αντιοξειδωτική δράση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη in vitro μέσω της επαγωγής έκφρασης αντιοξειδωτικών ενζύμων, όπως η καταλάση και η υπεροξειδική δισμουτάση, τα οποία συλλογικά οδηγούν σε σημαντική μείωση των επιπέδων ROS [45].

Η παρούσα μελέτη έδειξε επίσης ότι η γενιστεΐνη, ειδικά σε δόση 75 mg/kg, αποκατέστησε τα επίπεδα GPT, αλκαλικής φωσφατάσης και λευκωματίνης ορού σε αυτά που παρατηρήθηκαν στην φυσιολογική ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, δείγματα ήπατος των ομάδων που έλαβαν γενιστεΐνη εμφάνισαν μείωση στον ινώδη ιστό και την εναπόθεση κολλαγόνου σε σύγκριση με την ομάδα HCC. Η γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι ασκεί ηπατοπροστατευτική δράση στη μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος [46]. Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη, η γενιστεΐνη αποδείχθηκε ότι μειώνει σημαντικά τα επίπεδα AFP και, ως εκ τούτου, αύξησε σημαντικά το ποσοστό επιβίωσης των αρουραίων έως και 90 τοις εκατό.

Συμπερασματικά, η γενιστεΐνη εμφάνισε αντικαρκινική δράση, η οποία δεν θα μπορούσε να αποδοθεί μόνο στην αντιοξειδωτική της δράση, αλλά και στην αναστολή της έκφρασης versican, PDGF, PKC και ERK. Η γενιστεΐνη θα μπορούσε επίσης να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός υποψήφιος, βελτιώνοντας τα αποτελέσματα των ασθενών με HCC.

βιβλιογραφικές αναφορές

[1] Foglia B, Parola M. Απόκριση συμπλόκου FACT και οξειδωτικού στρες: ένας νέος εξαρτώμενος από το KEAP1/NRF2- μηχανισμός που διατηρεί την εξέλιξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Εντερο. 2020; 69 (2): 195–196.

[2] McGlynn KA, Petrick JL, El-Serag HB. Επιδημιολογία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Ηπατολογία. 2020; 73 (Suppl. 1): 4–13.

[3] El-Far YM, Khodir AE, Noor AO, et al. Επιλεκτική κυτταροτοξική δράση και προστατευτικές επιδράσεις του ασκορβικού νατρίου έναντι του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος μέσω της επίδρασής του στο οξειδωτικό στρες και την απόπτωση in vivo και in vitro. Redox Rep. 2020; 25(1):17–25.

[4] El-Far YM, Khodir AE, Emarah ZA, et al. Το Fucoidan βελτιώνει το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα που προκαλείται σε αρουραίους: επίδραση στο miR143 και στη φλεγμονή. Nutr Καρκίνος. 2020; 28:1–13.

[5] Flynn MJ, Sayed AA, Sharma R, et al. Προκλήσεις και ευκαιρίες στην κλινική ανάπτυξη αναστολέων σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Ηπατολογία. 2019; 69 (5): 2258–2270.

[6] Tanaka Y, Tateishi R, Koike K. Οι πρωτεογλυκάνες είναι ελκυστικοί βιοδείκτες και θεραπευτικοί στόχοι στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Int J Mol Sci. 2018; 19(10):3070.

[7] Goekjian PG, Jirousek MR. Αναστολείς πρωτεϊνικής κινάσης C ως νέα αντικαρκινικά φάρμακα. Expert Opin Investig Drugs. 2001;10(12):2117–2140.

[8] Schmitz KJ, Wohlschlaeger J, Lang H, et al. Η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης ERK και AKT προβλέπει κακή πρόγνωση στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και η ενεργοποίηση της ERK στον καρκινικό ιστό σχετίζεται με μόλυνση από τον ιό της ηπατίτιδας C. J Hepatol. 2008; 48 (1): 83–90. doi: 10. 1016/j.jhep.2007.08.018.

[9] Kim ST, Hong JY, Park SH, et al. Πρώτη δοκιμή φάσης Ι σε άνθρωπο του αντισώματος κατά του αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (YYB101) σε ασθενείς με ανθεκτικό συμπαγή όγκο. Ther Adv Med Oncol. 2020; 12:1758835920926796. doi: 10.1177/1758835920926796.

[10] Wu XP, Yang YP, She RX, et al. Το microRNA-329 μειώνει τον πόνο του καρκίνου των οστών μέσω της οδού μεταγωγής σήματος LPAR1-εξαρτώμενης LPAR1/ERK σε ποντίκια. Ther Adv Med Oncol. 2019; 11:1758835919875319.