Μέρος 2: Κεραμίδιο-1-Φωσφορικό ως δυνητικός ρυθμιστής της δεύτερης αντλίας νατρίου από τα εγγύς σωληνάρια των νεφρών με την ενεργοποίηση διακριτών οδών πρωτεϊνικής κινάσης με ιεραρχικό τρόπο

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

4. Συζήτηση

Η μεταφορά υγρού μέσω του σωληναριακού επιθηλίου είναι ένα από τα βασικά συμβάντα που σχετίζονται άμεσα με την πλειοψηφία των διαφορετικώννεφρικές λειτουργίες[49]. Μεταξύ των διαφορετικών διαλυμένων ουσιών που χειρίζονται στονεφρό, το Nat είναι ιδιαίτερα σημαντικό. Λόγω της αφθονίας του στο εξωκυττάριο υγρό, είναι επιτακτική ανάγκη να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς με τους οποίους το Nat επαναρροφάται ή απεκκρίνεται στα ούρα, επειδή οι μεταβολές στη διάμεση και ενδοαγγειακή συγκέντρωση Na συν οδηγούν σε αλλαγές στον όγκο και μπορεί να προκαλέσουν διαταραχές στην αρτηριακή πίεση[50] . Η ρύθμιση των επιπέδων Nat στα διαμερίσματα υγρών του σώματος καθοδηγείται κυρίως από πρωτεύοντες ενεργούς μεταφορείς με την κλασική Nat συν Kt-ATPase [51] να εμπλέκεται στη μαζική μεταφορά, ενώ η "δεύτερη" αντλία Nat ή Nat-ATPase εμπλέκεται στη λεπτή συντονισμένη ρύθμιση της επαναρρόφησης Nat [52,53] Υπάρχουν πολλές αναφορές στη βιβλιογραφία σχετικά με τη ρύθμιση της Nat συν K συν -ATPase από ορμόνες και αυτοακοειδή[50,54] καθώς και με τον ρόλο της ρυθμιστικής φωσφορυλίωσης [50,55]. Αντίθετα, λιγότερες ομάδες αναφέρουν τη ρύθμιση του Nat-ATPase καθώς υπάρχει ακόμα κάποια διαμάχη σχετικά με την ταυτότητά του, παρόλο που οι αναφορές έδειχναν μια ευαίσθητη στη φουροσεμίδη δραστηριότητα Nat-ATPase από θηλαστικά[41,56,57] έως πρωτόζωα [58,59 ] καθώς και την κλωνοποίηση της αντλίας από διαφορετικούς οργανισμούς [60-63]. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ, η ομάδα μας έδειξε ότι όχι μόνο οι ορμόνες και τα αυτακοειδή είναι ικανά να ενεργοποιήσουν μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης που ρυθμίζουν τη Nat-ATPase, αλλά η επίδραση του ClP που προστίθεται εξωγενώς στα κλάσματα BLM δείχνει είτε μια πιθανή αλληλεπίδραση του βιοδραστικού λιπιδίου με τις υδρόφοβες περιοχές των ρυθμιστών ή την ίδια την αντλία. ή, πρέπει να υπάρχει ένα είδος υποδοχέα C1P στο BLM, που δεν έχει ταυτοποιηθεί ακόμη [20,22,23]. Το Σχήμα 6 δείχνει ένα προτεινόμενο σχήμα για να συνοψίσει αυτούς τους πιθανούς τρόπους δράσης του ClP. Η ικανότητα των κεραμιδίων να πυροδοτούν κινάσες και να προκαλούν διαφορετική φυσιολογική απόκριση αναφέρθηκε στα ηπατικά κύτταρα [24]. Οι συγγραφείς όχι μόνο έδειξαν την ικανότητα εξαρτώμενης από κεραμίδιο διαμόρφωσης της ρύθμισης Nat/K συν -ATPase και κινάσης, αλλά ανέφεραν επίσης διφασικές αποκρίσεις λαμβάνοντας υπόψη τη χρονικά εξαρτώμενη διέγερση αυτών των κυτταρικών γραμμών, γεγονός που δείχνει ότι πρέπει να υπάρχει πολύπλοκη διαφωνία μεταξύ κεραμιδίου -εξαρτώμενα συστήματα σηματοδότησης και άλλα συστήματα σηματοδότησης που υπάρχουν στις κυτταρικές μεμβράνες. μεμβράνες (Εικόνα 2). Επιπλέον, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ σε συνδυασμό με προηγούμενα αποτελέσματα από την ομάδα μας δείχνουν ξεκάθαρα ότι το Cer [33] και το ClP ρυθμίζουν τα συνδεδεμένα με BLM PKA και PKC, τα οποία φάνηκε να μεσολαβούν στις επιδράσεις που προκαλούνται από τα κεραμίδια στη Nat-ATPase όταν τα κλάσματα BLM ήταν με αγωγή με 100 nM C1P, η αναστολή της αντλίας δεν μπορούσε να αποδοθεί στο PKA (Εικόνα 4) καθώς η προεπώαση με το PKAi δεν επηρέασε την ανασταλτική δράση του C1P. Από την άλλη πλευρά, η σημαντική αναστολή της δραστηριότητας Nat-ATPase κατά τη θεραπεία με ClP αποτρέπεται πλήρως από την καλφωστίνη C (Εικόνα 3). Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η PKA διεγείρει τη δραστηριότητα της νεφρικής Nat-ATPase σε μια οδό που συνδέει τους συζευγμένους με Gs υποδοχείς με τη δραστηριότητα της αντλίας [41]. Τα συστήματα σηματοδότησης που αναφέρονται εδώ στο χειρόγραφό μας - PKA και PKC - έχουν μελετηθεί καλά, επομένως υπάρχουν πολλές πληροφορίες στη βιβλιογραφία που δείχνουν τις συγκεντρώσεις για θετικούς μάρτυρες όπως χρησιμοποιούνται εδώ (cAMP και μυριστικό οξύ της φορβόλης PMA, αντίστοιχα). Καθώς η εστίασή μας δεν ήταν μια μελέτη δόσης-απόκρισης είτε με κλασικούς ενεργοποιητές είτε αναστολείς για τα διαφορετικά συστήματα σηματοδότησης, χρησιμοποιήσαμε μόνο τις συγκεντρώσεις ενεργοποιητών ή αναστολέων που χρησιμοποιούνται ήδη αποτελεσματικά σε άλλες μελέτες από εμάς ή άλλες ομάδες.

Εικόνα 6. Προτεινόμενος μηχανισμός για τη δράση ClP στη δραστηριότητα Na συν -ATPase από BLM. (1) Το C1P (κόκκινο λιπίδιο) αναστέλλει την PKC μέσω ενός ακόμη άγνωστου υποδοχέα συζευγμένου με πρωτεΐνη G, με αποτέλεσμα την αναστολή της Na συν -ΑΤΡάσης (μπλε πρωτεΐνη). Η ίδια διαδρομή θα μπορούσε να ενεργοποιήσει το BLM PKA (κόκκινο βέλος) χωρίς καμία επίδραση στην αντλία. (2) Το CIP θα μπορούσε να συνδεθεί απευθείας με τελεστές που υπάρχουν στο BLM, όπως το PKC, οδηγώντας στην ανασταλτική δράση στη δράση Na συν -ΑΤΡάσης που περιγράφεται. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι παρόλο που το PKA υπάρχει στο BLM και είναι έτοιμο να διαμορφώσει την αντλία με cAMP (πράσινοι κύκλοι και πράσινο βέλος), η ενεργοποίησή του από το CIP δεν επηρέασε την αντλία (κόκκινο διακεκομμένο βέλος). (3) Το CIP συνδέεται απευθείας με τη Nat-ATPase ή εμπλουτίζεται στο μικροπεριβάλλον της λιπιδικής μεμβράνης που περιβάλλει τη Nat-ATPase, διαμορφώνοντάς την έτσι. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ, δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουμε καμία ρυθμιστική δράση του ClP στη Nat/K συν -ΑΤΡάση (μωβ πρωτεΐνη) που υπάρχει στα κλάσματα BLM.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε το τυποποιημένο cistanche για παράταση ζωής

Η ανίχνευση μιας ιεραρχίας στη φωσφορυλίωση της Nat-ATPase προτάθηκε όταν διεγείραμε το BLM με Cer [33] και παρατηρήσαμε ότι η απόφραξη του BLM-PKCZ, αμβλύνει την ανασταλτική δράση του Cer στην αντλία και επέτρεψε το cAMP- ενεργοποιημένο PKA για να το διεγείρει. Παρά τον αυξανόμενο αριθμό αναφορών που δείχνουν διαφορετικούς ρόλους για τις ενεργοποιημένες κινάσες Cer [44,64-66], αυτή είναι η πρώτη αναφορά της φυσιολογικής δράσης της C1P σε κινάσες που κατοικούν στο BLM, η οποία σίγουρα παίζει ρόλο στη ρύθμιση του Nat χειρισμός στο νεφρό. Δεν μπορούμε να επιβεβαιώσουμε οριστικά ότι η Nat-ATPase φωσφορυλιώνεται άμεσα από τις μελετημένες κινάσες, καθώς δεν υπάρχουν διαθέσιμα πειραματικά εργαλεία για αυτό, κυρίως επειδή η πλήρης δομή της δεύτερης αντλίας νατρίου δεν έχει ακόμη αναγνωριστεί. Ωστόσο, είναι ευρέως γνωστό ότι η Nat-ATPase είναι μια ΑΤΡάση τύπου Ρ, και αυτό το γεγονός μας επιτρέπει να υποθέσουμε ότι μπορεί να διαμορφωθεί άμεσα με φωσφορυλίωση σε πιθανές ρυθμιστικές θέσεις [46,55] Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι η ενεργοποίηση Οι αντίστοιχες κινάσες θα οδηγούσαν στη φωσφορυλίωση μιας άλλης πρωτεΐνης σε αυτό το ρυθμιστικό δίκτυο, η οποία θα ήταν υπεύθυνη για την αναστολή της ΑΤΡάσης.

Μεταξύ των διαφορετικών βιοενεργών σφιγγολιπιδίων, το C1P είναι λιγότερο τεκμηριωμένο στα διαφορετικά φυσιολογικά συστήματα. Από την άλλη πλευρά, η-1-φωσφορική σφιγγοσίνη, η οποία μπορεί να είναι το πιο σημαντικό βιοδραστικό λιπίδιο, έχει μελετηθεί πολύ καλά στη φυσιολογία και την παθοφυσιολογία των νεφρών [2,6,7,67]. Καθώς τα μέλη S1P και ClP είναι ένας τύπος οικογένειας μορίων σηματοδότησης με κοινούς πρόδρομους και μοιράζονται αμοιβαία στάδια αλληλομετατροπής, είναι δυνατό να φανταστούμε ότι το ClP θα υπήρχε επίσης σε ολόκληρο τον νεφρώνα. Η εργασία των Sugiura et al., 2002[11], χαρακτηριστικό στο πεδίο, έδειξε ότι το CerK εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους νεφρούς. Παρά τα ισχυρά δεδομένα στη βιβλιογραφία που δείχνουν το ρόλο του ClP στα ποδοκύτταρα και τη σπειραματική νόσο[68,69], δεν έχει υπάρξει εργασία που να δείχνει μεμονωμένα την έκφραση του CerK και τη δράση του ClP σε κανένα από τα τμήματα του νεφρώνα. Διαφορετικά, το ClP είναι πιθανό να υπάρχει σε όλα τα νεφρικά κύτταρα είτε λόγω της παρουσίας σφιγγομυελίνης, η οποία θα επέτρεπε τη οδό διάσωσης για τη σύνθεση του ClP, είτε λόγω του γεγονότος ότι το ClP μπορεί να παρέχεται στον νεφρικό ιστό μέσω της κυκλοφορίας του αίματος. Αυτοί είναι πολύ εύλογοι τρόποι να σκεφτούμε ότι αυτό το λιπίδιο σηματοδότησης θα έπαιζε διαφορετικούς ρόλους στα άλλα τμήματα νεφρώνων, αν και δεν το εξερευνήσαμε εδώ.

Αποδείχθηκε ουσιαστικά ότι τα επίπεδα Cer ήταν σημαντικά αυξημένα κατά τη διάρκειανεφρική βλάβηλόγω μιας ήδη αναφερόμενης αύξησης στη δραστηριότητα της σφιγγομυελινάσης που διεγείρεται από το Ca2t μετά τη διακοπή της κυτταρικής ομοιόστασης του Ca2t [2,4,24,70]. Αυτή η παρατήρηση μας επιτρέπει να υποθέσουμε ότι η μεσολαβούμενη από κινάση ρύθμιση της δραστηριότητας BLM Nat-ATPase από Cer και C1P θα μπορούσε να είναι ιδιαίτερα σημαντική στον τραυματισμένο νεφρικό ιστό, γεγονός που θα μπορούσε να ανοίξει έναν νέο ρόλο για τα κεραμίδια στην εγκατάσταση και την εξέλιξη των νεφροπαθειών. Παρουσία C1P, οι BLMκινάσες που μελετήθηκαν διαμορφώθηκαν διαφορικά (Εικόνα 5). Ενώ το ClP ανέστειλε την PKC, οδηγώντας σε σημαντική αναστολή της δραστηριότητας Nat-ATPase, η εξαρτώμενη από το C1P ενεργοποίηση της PKA δεν επηρέασε τη δραστηριότητα Nat-ATPase. Αυτό μας επιτρέπει να υποθέσουμε ότι υπάρχει μια ιεραρχία που περιλαμβάνει διαφορετικές κινάσες, η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια σύνθετη εναλλαγή in/off στη Nat-ATPase. Αυτός ο διακόπτης μπορεί να περιλαμβάνει διαφορετικές ισομορφές PKC και PKA, ή πρέπει να υπάρχει αλληλεπίδραση με την πιθανή μετατροπή του C1P σε Cer και άλλα βιοενεργά λιπίδια που ενεργοποιούν άλλες οδούς σηματοδότησης που φιλοξενούνται στο BLM, το οποίο έχει ήδη περιγραφεί στα ηπατικά κύτταρα [24].

Η ισορροπία μεταξύ Cer και ClP θα μπορούσε να είναι ένας νέος πολλά υποσχόμενος στόχος για την ανάπτυξη νέων κατηγοριών φαρμάκων με πιο αποτελεσματική δράση για να σταματήσει η πρόοδος τουΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ, ή τουλάχιστον, να βελτιώσει την ποιότητα ζωής των νεφροπαθών.

5. Συμπεράσματα

Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ, ένας καταρράκτης σηματοδότησης που ξεκινά με την παραγωγή Cer και περαιτέρω φωσφορυλίωση σε ClP είναι μια αποτελεσματική οδός για την αναστολή της Nat-ATPase στηνκύτταρα εγγύς νεφρικών σωληναρίωνμέσω PKA και PKC που σχετίζονται με BLM ως τελεστές[17]. Αυτές οι παρατηρήσεις αποκαλύπτουν τη σημασία των πρωτεϊνικών κινασών στον λεπτό έλεγχο των ροών Nat σε ένα τμήμα νεφρώνα όπου περισσότερα από τα δύο τρίτα του σπειραματικού υπερδιηθήματος επαναρροφάται, το εγγύς σωληνάριο. Από όσο γνωρίζουμε, η παρούσα εργασία δείχνει για πρώτη φορά ότι το ClP μπορεί να τροποποιήσει την BLM-Nat-ATPase από κύτταρα εγγύς νεφρικών σωληναρίων πυροδοτώντας κινάσες που σχετίζονται με τη μεμβράνη (PKA και PKC). Έτσι, τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν την άποψη ότι το Cer και το ClP συμμετέχουν στο ρυθμιστικό δίκτυο βιοδραστικών σφιγγολιπιδίων και γλυκερολιπιδίων που βρίσκονται σε αυτό το τμήμα νεφρώνων, κάτι που θα πρέπει να ισχύει για το συνολικό νεφρώνα. Αυτή η υπόθεση μπορεί να υποστηριχθεί από την άποψη ότι το Cer είναι ένα λιπίδιο ουσιαστικά παρόν σε όλα τα τμήματα του νεφρώνα καθώς και ότι η διαθεσιμότητα του Cer θα επέτρεπε τον σχηματισμό του C1P.