Μέρος 1: Ανανεωτικές επιδράσεις ανόργανων νιτρικών μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση του νεφρού

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Ιστορικό: Κάκωση νεφρικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (IR).είναι μια κοινή αιτία τηςοξεία νεφρική βλάβη(AKI), το οποίο σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες και τη μειωμένη βιοδραστικότητα του μονοξειδίου του αζώτου (NO) και τον αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξηςχρόνια νεφρική νόσος(ΧΝΝ) και καρδιαγγειακές παθήσεις (CVD). Νέες στρατηγικές που αποκαθιστούν την ισορροπία της οξειδοαναγωγής μπορεί να έχουν θεραπευτικές επιπτώσεις κατά τη διάρκεια του AKI και των σχετικών επιπλοκών.

Σκοπός: Διερεύνηση της θεραπευτικής αξίας της ενίσχυσης της οδού νιτρικών-νιτρωδών-ΝΟ κατά την ανάπτυξη νεφρικής και καρδιαγγειακής δυσλειτουργίας που προκαλείται από το IR.

Μέθοδοι: Αρσενικά ποντίκια C57BL/6 J έλαβαν νιτρικό νάτριο (10 mg/kg, ip) ή όχημα 2 ώρες πριν από τη θερμή ισχαιμία του αριστερού νεφρού (45 λεπτά) ακολουθούμενη από συμπλήρωμα νιτρικού νατρίου στο πόσιμο νερό (1 mmol/kg/ ημέρα) για τις επόμενες 2 εβδομάδες. Η αρτηριακή πίεση και ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης μετρήθηκαν και συλλέχθηκαν αίμα και νεφροί και χρησιμοποιήθηκαν για βιοχημικές και ιστολογικές αναλύσεις καθώς και για μελέτες αντιδραστικότητας νεφρικών αγγείων. Τα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα που εκτέθηκαν σε υποξία-επαναοξυγόνωση, με ή χωρίς αγγειοτενσίνη Ⅱ, χρησιμοποιήθηκαν για μηχανιστικές μελέτες.

Αποτελέσματα: Το IR συσχετίστηκε με μειωμένη νεφρική λειτουργία και ελαφρώς αυξημένη αρτηριακή πίεση, σε συνδυασμό με νεφρικές βλάβες, φλεγμονή, ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, αυξημένα επίπεδα Ang Ⅱ και αγγειοαντιδραστικότητα με τη μεσολάβηση Ang II, τα οποία όλα βελτιώθηκαν από τα νιτρικά. Επιπλέον, η θεραπεία με νιτρικά (in vivo) και νιτρώδη (in vitro) αποκατέστησε τη βιοδραστικότητα του ΝΟ και μείωσε το οξειδωτικό στρες και τους τραυματισμούς των μιτοχονδρίων.

συμπεράσματα: Η οξεία θεραπεία με ανόργανα νιτρικά άλατα πριν από τη νεφρική ισχαιμία μπορεί να χρησιμεύσει ως μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την πρόληψη της ΑΚΙ και της ΧΝΝ και του σχετικού κινδύνου ανάπτυξηςκαρδιαγγειακή δυσλειτουργία.

Κάντε κλικ για να επικοινωνήσετε με τον προμηθευτή για εμπειρία cistanche

1. Εισαγωγή

Η ισχαιμία-επαναιμάτωση (IR) του νεφρού, που σχετίζεται με μεταμόσχευση, εγχείρηση καρδιακής παράκαμψης και σοκ, αποτελεί σημαντικό κίνδυνο για την ανάπτυξη οξείας νεφρικής βλάβης (ΑΚΙ) και επακόλουθης χρόνιας νεφρικής νόσου (ΧΝΝ) [1]. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί είναι περίπλοκοι και περιλαμβάνουν οξειδωτικό στρες που σχετίζεται με την επαναιμάτωση, ανεπάρκεια μονοξειδίου του αζώτου και ενεργοποίηση ανοσοκυττάρων, τα οποία μαζί οδηγούν σε ενδοθηλιακή δυσλειτουργία [2, 3]. Η συνεχιζόμενη έρευνα έχει επικεντρωθεί στην εύρεση νέων και αποτελεσματικών θεραπειών για την πρόληψη και τη θεραπεία της ΑΚΙ και της εξέλιξης της σε ΧΝΝ, όπως η εξ αποστάσεως ισχαιμική προετοιμασία, η προσωρινή τοπική υποθερμία καθώς και νέες φαρμακολογικές παρεμβάσεις [3,4].

Το αέριο μόριο σηματοδότησης οξείδιο του αζώτου (ΝΟ) συμβάλλει σημαντικά στη ρύθμιση της καρδιαγγειακής και νεφρικής ομοιόστασης και έχει αποδειχθεί ότι παίζει προστατευτικό ρόλο κατά τη διάρκεια τραυματισμών IR [5,6]. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια του ισχαιμικού επεισοδίου, η έλλειψη οξυγόνου θέτει σε κίνδυνο τη λειτουργία της ενδοθηλιακής ΝΟ συνθάσης (eNOS), η οποία μπορεί να συμβάλει στο «φαινόμενο μη επαναρροής» στον ισχαιμικό ιστό κατά τη φάση της επαναιμάτωσης. Αυτό με τη σειρά του διαδίδει τραυματισμούς των ενδοθηλιακών και σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων [7], που συμβάλλουν στην ανάπτυξη μειωμένης νεφρικής λειτουργίας. Εκτός από την υποξία κατά την ισχαιμική περίοδο, η υπερβολική παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) που δημιουργείται σε περίσσεια από τη νικοτιναμιδική αδενινο δινουκλεοτιδική φωσφορική οξειδάση (NADPH) και τα μιτοχόνδρια κατά τη φάση επαναιμάτωσης σαρώνει το ΝΟ [8]. Νέες προσεγγίσεις που μειώνουν το οξειδωτικό στρες και διατηρούν τη βιοδραστικότητα του ΝΟ μπορεί να έχουν θεραπευτική αξία στη μάχη κατά της νεφρικής ανεπάρκειας που προκαλείται από το IR.

Τα ανόργανα νιτρικά (NO3) και νιτρώδη (NOZ) θεωρούνταν προηγουμένως ως σχετικά αδρανή προϊόντα που προέρχονται από το μεταβολισμό του ΝΟ. Ωστόσο, έρευνα που διεξήχθη για περισσότερες από δύο δεκαετίες έχει δείξει ότι αυτά τα ανιόντα μπορούν να υποστούν βιομετατροπή, μέσω σειριακών αναγωγών, και να σχηματίσουν ξανά ΝΟ και άλλα βιοενεργά είδη οξειδίου του αζώτου [9]. Η δραστηριότητα αυτής της εναλλακτικής οδού νιτρικών-νιτρωδών-ΝΟ ενισχύεται σε συνθήκες με υποξία και χαμηλό pH όταν το κλασικό σύστημα NOS μπορεί να γίνει δυσλειτουργικό [10].

Η διατροφή, εκτός από το σύστημα NOS, είναι μια σημαντική πηγή κυκλοφορίας νιτρικών και νιτρωδών, λόγω των υψηλών επιπέδων νιτρικών αλάτων, για παράδειγμα στα πράσινα φυλλώδη λαχανικά. Η συμπλήρωση με ανόργανα νιτρικά και νιτρώδη έχει συσχετιστεί με ευνοϊκές καρδιαγγειακές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης της αρτηριακής πίεσης, τόσο σε πειραματικές όσο και σε κλινικές μελέτες [11]. Προστατευτικά αποτελέσματα οργάνων έχουν επίσης αποδειχθεί σε πειραματικά μοντέλα IR τραυματισμού του ήπατος [12], του εγκεφάλου [13], του πνεύμονα [14] και της καρδιάς [12,15]. Ωστόσο, η πιθανή θεραπευτική αξία των ανόργανων νιτρικών και νιτρωδών σε τραυματισμό νεφρού IR παραμένει αμφιλεγόμενη. Όπως αναθεωρήθηκε πρόσφατα [5], τα μεταβλητά αποτελέσματα σε μοντέλα IR, με χρήση θεραπείας με νιτρώδη, ίσως λόγω διαφορών στη χρησιμοποιούμενη δόση, οδό χορήγησης, διάρκεια θεραπείας, καθώς και στο ίδιο το πειραματικό μοντέλο [16,17]. Αρκετές πειραματικές μελέτες έχουν δείξει τις προστατευτικές επιδράσεις της διατροφικής συμπλήρωσης νιτρικών αλάτων σε μοντέλα καρδιονεφρικής νόσου, μέσω μηχανισμών που περιλαμβάνουν την άμβλυνση του οξειδωτικού στρες και τη βελτίωση της βιοδραστικότητας του ΝΟ καθώς και τη ρύθμιση τηςφλεγμονώδεις αποκρίσεις[5]. Μέχρι σήμερα, υπάρχει περιορισμένη γνώση σχετικά με τις επιδράσεις της θεραπείας με ανόργανα νιτρικά άλατα σε νεφρική IR βλάβη. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι η χρόνια διατροφική προεπεξεργασία με νιτρικά άλατα εξασθένησε επακόλουθες νεφρικές βλάβες που προκαλούνται από IR [18]. Ωστόσο, υπάρχει λιγότερη γνώση σχετικά με την πιθανή αξία της ενίσχυσης της οδού νιτρικών-νιτρωδών-ΝΟ κατά την έναρξη του IR για τη μείωση του κινδύνου ανάπτυξης ΑΚΙ και ΧΝΝ. Εάν είναι προστατευτικό, αυτό θα μπορούσε να έχει ευρείες κλινικές εφαρμογές σε ασθενείς που κινδυνεύουν να αναπτύξουν AKI, για παράδειγμα σε αυτούς που υποβάλλονται σε σοβαρή χειρουργική επέμβαση.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο νεφρικής IR βλάβης σε ποντίκια για να διερευνήσουμε τα πιθανά οφέλη της οξείας θεραπείας με νιτρικά άλατα αμέσως πριν από το ισχαιμικό συμβάν. Αυτό συνδυάστηκε με μηχανιστικές ex vivo μελέτες αγγείων και in vitro πειράματα κυτταροκαλλιέργειας με επεξεργασία νιτρωδών. Υποθέσαμε ότι η ενίσχυση της οδού νιτρικών-νιτρωδών-ΝΟ θα προάγει την προστασία των νεφρών έναντι του τραυματισμού IR μέσω της ρύθμισης του οξειδωτικού στρες και της βιοδραστικότητας του ΝΟ καθώς και της μιτοχονδριακής λειτουργίας.

2. Μέθοδοι

2.1. Αντιδραστήρια

Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, όλα τα αντιδραστήρια ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich, Σουηδία.

2.2. Ζώα και μοντέλο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης νεφρών

Τα ποντίκια C57BL/6 J (αρσενικά, 10 εβδομάδων) ελήφθησαν από τα εργαστήρια Janvier Lab-oratories (Γαλλία) και στεγάστηκαν στις εγκαταστάσεις ζώων μας στο Karolinska Institutet υπό ελεγχόμενες κλιματικές συνθήκες με κύκλο φωτός/σκότους 12- ωρών και παρέχονται με τυπική τροφή τρωκτικών και νερό βρύσης. Όλες οι διαδικασίες με ζώα εγκρίθηκαν από την Περιφερειακή Επιτροπή Δεοντολογίας για Πειράματα σε Ζώα (Αριθμός Πρωτοκόλλου: N139/15) και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH) και με την Οδηγία της ΕΕ 2010/63/ΕΕ για τη διεξαγωγή πειράματα σε ζώα.

Μετά από 1 εβδομάδα εγκλιματισμού, στα ποντίκια χορηγήθηκε εικονικό φάρμακο (NaCl) ή νιτρικό νάτριο (NaNO3) ενδοπεριτοναϊκά (10 mg/kg) 2 ώρες πριν από τη μονόπλευρη ισχαιμία του αριστερού νεφρού. Ο δεξιός νεφρός επιθεωρήθηκε αλλά κατά τα άλλα έμεινε ανέπαφος. Οι εικονικές επεμβάσεις έγιναν με τον ίδιο τρόπο, αλλά χωρίς σύσφιξη του αριστερού νεφρού. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο και η θερμοκρασία του σώματος διατηρήθηκε στους 37 ± 0,5 βαθμούς χρησιμοποιώντας μια λάμπα θέρμανσης και ένα αυτοεπιτηρούμενο θερμαντικό επίθεμα καθ' όλη τη διάρκεια της επέμβασης. Μετά τη χειρουργική επέμβαση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με νιτρικό νάτριο (1 mmol/kg/ημέρα) είτε με εικονικό φάρμακο για 2 εβδομάδες μέχρι τον τερματισμό.

2.3. Μέτρηση αρτηριακής πίεσης

Η αρτηριακή πίεση μετρήθηκε σε ποντίκια χρησιμοποιώντας μια μη επεμβατική μέθοδο ουράς-μανσέτας πριν από τον τερματισμό. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε θερμή πλάκα στους 35 βαθμούς C για 10 λεπτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε πλαστικούς συγκρατητές. Μια περιχειρίδα με έναν πνευματικό αισθητήρα παλμών προσαρτήθηκε στην ουρά και οι τιμές της αρτηριακής πίεσης καταγράφηκαν με το σύστημα CODA (Kent Scientific, Torrington, CT, ΗΠΑ). Τα ζώα εκπαιδεύτηκαν με τους συγκρατητές στη θερμαντική πλάκα τουλάχιστον τρεις ημέρες πριν από τις καταγραφές της αρτηριακής πίεσης. Η συστολική, η διαστολική και η μέση αρτηριακή πίεση συλλέχθηκαν για 3 διαδοχικές ημέρες και η μεμονωμένη διάμεση τιμή όλων των αποδεκτών τιμών συντάχθηκε για αξιολόγηση.

2.4.Συγκομιδή ιστού

Πριν από τον τερματισμό, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε μεταβολικούς κλωβούς για τη συλλογή ούρων για τον υπολογισμό του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR). Τα ζώα στη συνέχεια αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο και συλλέχθηκαν δείγματα αίματος μέσω της κάτω κοίλης φλέβας. Όλα τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν αμέσως στα 6000×g, στους 4 βαθμούς C για 5 λεπτά παρουσία EDTA (Sigma-Aldrich, Στοκχόλμη, Σουηδία), με τελική συγκέντρωση 2 mM. Τα δείγματα πλάσματος μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες και καταψύχθηκαν αμέσως σε ξηρό πάγο και τελικά αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό. Τα νεφρά εκχυλίστηκαν και κόπηκαν σε διάφορα μέρη για ex vivo πειράματα αγγειακής λειτουργίας (μεσλοβιακές αρτηρίες και προσαγωγά αρτηρίδια), ιστολογία ( Χρώση HE και PAS) και ποσοτικοποίηση της απόπτωσης και της φλεγμονής (ενσωμάτωση ένωσης βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής (OCT) Tissue-Tek και παγωμένη για χρώση TUNEL και F4/80).

2.5. Μετρήσεις νιτρικών, νιτρωδών, cGMP, κρεατινίνης, αζώτου ουρίας αίματος (BUN) και αγγειοτενσίνης II

Τα νιτρώδη και τα νιτρικά αναλύθηκαν με HPLC(ENO-20) όπως περιγράφηκε προηγουμένως 【19】. Δείγματα πλάσματος (10 ul) εγχύθηκαν στο σύστημα HPLC με σύριγγα Hamilton. Στη συνέχεια, τα νιτρώδη και τα νιτρικά διαχωρίστηκαν με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης/ιοντοανταλλαγής ακολουθούμενη από αναγωγή νιτρικών σε νιτρώδη με κάδμιο και ανηγμένο χαλκό. Τα νιτρώδη παραγοντοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Griess για να σχηματιστούν διαζω ενώσεις και ανιχνεύθηκαν στα 540 nm. Για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση του cGMP, το πλάσμα μεταφέρθηκε σε σωλήνες που περιείχαν έναν αναστολέα PDE, BMX(3-Ισοβουτυλ-1μεθυλξανθίνη· Sigma-Aldrich #I5879) για να δώσει μια τελική συγκέντρωση (10 μM). Τα δείγματα ήταν στη συνέχεια καταψύχεται και αποθηκεύεται σε{10}} βαθμό πριν αναλυθεί το cGMP με κιτ ELISA (GE Healthcare #RPN226), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Τα επίπεδα κρεατινίνης πλάσματος και ούρων ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ χρωματομετρικής δοκιμασίας κρεατινίνης (Cayman Chemical, #700460 και #500701). Ο τύπος κάθαρσης κρεατινίνης (CLcr =Urinecrx Ροή ούρων/Plasmacr) χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του GFR. Τα επίπεδα BUN στο πλάσμα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης χρώματος BUN (Invitrogen,#EIA-BUN). Τα επίπεδα Ang στο πλάσμα και στους ιστούς των νεφρών μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA Ang ⅡI (Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ωστόσο, η παρασκευή του εκχυλίσματος ιστού διέφερε ελαφρώς από τη σύσταση. Προστέθηκαν στον ιστό 10 όγκοι 50 mM HCl σε 50 τοις εκατό EtOH και θερμάνθηκαν για 10 λεπτά στους 100 βαθμούς, φυγοκεντρήθηκαν 10 000×g 10 λεπτά. Στη συνέχεια τα δείγματα καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε-80 βαθμό πριν αναλυθούν. Όλες οι μετρήσεις απορρόφησης έγιναν στο SpextraMax iD3 από την Molecular Devices.

2.6. Απομόνωση και αιμάτωση των μεσολοβιακών αρτηριών

Οι νεφροί συλλέχθηκαν μετά τη θυσία και διατηρήθηκαν σε παγωμένο διάλυμα φυσιολογικού άλατος (PSS) μέχρι την απομόνωση των μεσολοβιακών αρτηριών. Οι νεφρικές μεσολοβιακές αρτηρίες εκτέμθηκαν (μήκους 2 mm) και τοποθετήθηκαν σε α

θάλαμος μυογράφου (Model 620 M, Danish Myo Technology, Δανία) με PSs όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Η ισομετρική τάση καταγράφηκε με σύστημα Powerlab (Powerlab 4/30, AD Instruments, Αυστραλία). Αφού τοποθετήθηκαν, τα αγγεία εξισορροπήθηκαν για 20 λεπτά σε PS που αναβλύζουν με άνθρακα (95 τοις εκατό O2, 5 τοις εκατό CO2) στους 37 βαθμούς, pH 7,4. Στη συνέχεια, η τάση ηρεμίας των αρτηριών ορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], η οποία είναι σύμφωνα με τη διαδικασία κανονικοποίησης της Mulvany [22]. Μετά από μια δεύτερη εξισορρόπηση, εφαρμόστηκε 0,1 mol/L KCl για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας του αρτηριακού δακτυλίου.

2.7. Απομόνωση και μικροαιμάτωση προσαγωγών αρτηριδίων

Τα ποντίκια C57BL/6 J αναισθητοποιήθηκαν με εισπνεόμενο ισοφλουράνιο και τα νεφρά αφαιρέθηκαν και κόπηκαν γρήγορα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23-25]. Οι φέτες των νεφρών τοποθετήθηκαν σε παγωμένο Dulbecco's τροποποιημένο μέσο Eagle's (DMEM). Ένα μεμονωμένο προσαγωγό αρτηρίδιο με προσκολλημένο σπειράμα μικροτεμαχίστηκε κάτω από στερεομικροσκόπιο και μεταφέρθηκε σε

θάλαμος ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας στη σκηνή ενός ανεστραμμένου μικροσκοπίου. Το σπείραμα στερεώθηκε με μια μικροσιφώνια συγκράτησης και το προσαγωγό αρτηρίδιο διασωληνώθηκε και διαποτίστηκε με ένα σύνολο μικροσιφώνων. Η ενδοαυλική πίεση του διαχυθέντος προσαγωγού αρτηριολίου διατηρήθηκε στα 60 mmHg κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Ο χρόνος για την ανατομή και την ακόλουθη μικροδιάχυση περιορίστηκε στα 120 λεπτά μετά τη θυσία του ποντικού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Μετά από περίοδο εξισορρόπησης 30 λεπτών στους 37 βαθμούς, ελήφθησαν σωρευτικές καμπύλες δόσης-απόκρισης σε Ang II (10-12 έως 10-8 mol/L). Κάθε συγκέντρωση Ang II εγχύθηκε για 2 λεπτά, καταγράφηκε η συσταλτική απόκριση και στη συνέχεια μετρήθηκε η διάμετρος του προσαγωγού αρτηριολίου.

2.8. Ιστολογική εξέταση

Τα δείγματα νεφρών συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4 τοις εκατό. Οι σταθεροποιημένοι ιστοί νεφρών ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και στη συνέχεια κόπηκαν σε φέτες και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (H&E) ή περιοδικό οξύ Schiff (PAS) για ιστολογική αξιολόγηση. Τέσσερα τυχαία επιλεγμένα ζώα από κάθε πειραματική ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. Δέκα τυχαία επιλεγμένα πεδία από κάθε τμήμα καταγράφηκαν με μεγέθυνση 400×. Όλες οι μορφομετρικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τυφλό τρόπο.

2.9. Χρώση TUNEL

Δείγματα νεφρού ενσωματωμένα σε OCT χρησιμοποιήθηκαν για χρώση TUNEL. Τομές πάχους 6-μm επωάστηκαν με 20 ug/mL πρωτεϊνάση Κ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και οι αντιδράσεις TUNEL πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Click-iTTM Plus TUNEL Assay (Invitrogen C10618, ΗΠΑ) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στο τέλος του πρωτοκόλλου, πραγματοποιήθηκε η χρώση DAPI. Για ποσοτικοποίηση, τρία ζώα και τρεις περιοχές πεδίου της εικόνας (200 ×) επιλέχθηκαν τυχαία και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας το συνεστιακό μικροσκόπιο Zeiss800-, τα θετικά σήματα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ/Fiji και υπολογίστηκαν ως αναλογία των θετικών σημάτων προς το DAPI.

2.10. Χρώση ανοσοφθορισμού ιστού και ομοεστιακή μικροσκοπία (F4/80)

Τα νεφρά καταψύχθηκαν στις OCT (Tissue-Tek, Torrence, CA, ΗΠΑ) και οι τομές (6 μm) προετοιμάστηκαν και υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία. Οι κατεψυγμένες τομές πλύθηκαν με 1× PBS και μπλοκαρίστηκαν με 2 τοις εκατό BSA σε PBS για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με anti-F4/80 (1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) όλη τη νύχτα σε 4 βαθμούς ψυχρό δωμάτιο, και στη συνέχεια με ένα δευτερεύον αντίσωμα (1:200 Cell signaling Tech #4417) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, ακολουθούμενο από αντιχρώση με 300 nmol/L DAPI(4'6-διαμιδινο-2-φαινύλιο -ινδόλη, διυδροχλωρική, Invitrogen) για 3 λεπτά. Τα σήματα ανοσοφθορισμού οπτικοποιήθηκαν κάτω από το συνεστιακό μικροσκόπιο Zeiss LSM800-. Τρία ζώα και τρεις περιοχές πεδίου της εικόνας (200×) επιλέχθηκαν τυχαία. Τα θετικά σήματα F4/80 ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ/Fiji και υπολογίστηκαν ως ο λόγος των θετικών σημάτων προς το DAPI.

2.11. Κυτταρικής καλλιέργειας

Σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα αρουραίου (GECs) (DSMZ ACC262, Γερμανία) καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 (Gibco 21870-076) με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό και 2 m ML-Γλουταμίνη (Gibco 25030-082), πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (50 mg/L, Gibco 15140-122). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2. Σε πειράματα υποξίας, τα κύτταρα επωάστηκαν σε HBSS(Gibco 14025-092) αντί του μέσου χωρίς ορό σε θάλαμο με 1 τοις εκατό οξυγόνο στους 37 βαθμούς C για 2 ώρες. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν με νιτρώδες άλας (10 μΜ, με/χωρίς τον αναστολέα της ξανθινοξειδοαναγωγάσης (XOR) φεβουξοστάτη (100 nM), για 30 λεπτά πριν από την υπεροξία. Η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με ανάλυση PrestoBlue⑧ (Invitrogen, Α13261 και Α13262) και η κυτταρική θνησιμότητα εκτιμήθηκε με δοκιμασία αποκλεισμού Trypan Blue (Sigma, Τ8154-20 ML).

2.12. Ανίχνευση μιτοχονδριακών ROS

Τα επίπεδα μιτοχονδριακού υπεροξειδίου ανιχνεύθηκαν με μια φθορογόνο χρωστική (MitoSOXTM, Invitrogen M36008). Μετά την επεξεργασία, τα ενδοθηλιακά κύτταρα επωάστηκαν με 2 μmol/L MitoSox σε μέσο καλλιέργειας στους 37 βαθμούς για 10 λεπτά. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν με 1 × HBSS δύο φορές και το σήμα φθορισμού μετρήθηκε (SpectraMax iD3 reader, Molecular Devices, USA) και κανονικοποιήθηκε ως προς τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

2.13. Ανάλυση ανοσοστύπωσης

Κατεψυγμένα δείγματα νεφρού ή ενδοθηλιακά κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 10 mmol/L Tris-HCl pH 8, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 60 mmol/L Ν-οκτυλ-γλυκοζίτη, 1 τοις εκατό Triton X{{9 }}, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και αναστολείς πρωτεϊνικής φωσφατάσης. Τα προϊόντα λύσης κυττάρων ή ιστών φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στους 10,000×g στους 4 βαθμούς. Τα υπερκείμενα/πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Bio-Rad

δοκιμασία πρωτεΐνης. Εκχυλίσματα πρωτεϊνών που περιείχαν ισοδύναμη ποσότητα πρωτεϊνών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου {{{0} τοις εκατό (SDS-PAGE). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου immobilon για 1 ώρα στα 300 mA. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε 20 mM Tris-HCl (pH7,4), 150 mM NaCl και 0,1 τοις εκατό Tween 20 (TBS-T) που περιείχε 5 τοις εκατό χωρίς λιπαρά γάλα σε σκόνη για 1 ώρα και ανοσοανιχνευμένο με αντισώματα έναντι του anti-TFAM (1:2000, ab131607), του anti-OXPHOS (1:1000, ab110413), του αντι-βινκουλίνης (1:5000, του ab129002) (Abcam Cambridge, UK) και του αντι -Cleaved caspase-3 (1:1000,#9664)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ΗΠΑ). Όλα τα δευτερεύοντα αντισώματα για ανάλυση ανοσοστύπωσης προέρχονταν από την τεχνολογία Cell Signaling Technology. Για στυπώματα Western, στο Συμπληρωματικό Αρχείο εμφανίζονται εικόνες πλήρους μήκους χωρίς περικοπή, σχολιασμένες εικόνες με δείκτες MW.

2.14. Στατιστική ανάλυση

Οι πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA ακολουθούμενη από συνιστώμενη εκ των υστέρων δοκιμασία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Όλοι οι στατιστικοί υπολογισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας το Graphpad Prism 8.0. Η στατιστική σημασία ορίστηκε ως p<>