ΜΕΡΟΣ 1 Το κλάσμα Cistanches Herba/𝛽-Σιτοστερόλη προκαλεί μια ευαίσθητη στην οξειδοαναγωγή επαγωγή μιτοχονδριακής αποσύνδεσης και ενεργοποίησης της εξαρτώμενης από μονοφωσφορική πρωτεΐνη αδενοσίνης κινάσης/ενεργοποιημένου από πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος υποδοχέα Αποτέλεσμα μείωσης

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan και Kam Ming Ko

Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology, Kowloon, Hong Kong

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

Λήψη 29 Αυγούστου 2014. Αποδεκτό στις 14 Ιανουαρίου 2015 Ακαδημαϊκός συντάκτης: Man Li Πνευματικά δικαιώματα © 2015

Hoi Shan Wong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται υπό την άδεια Creative Commons Attribution License, η οποία επιτρέπει την απεριόριστη χρήση, διανομή και αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​υπό την προϋπόθεση ότι το πρωτότυπο έργο αναφέρεται σωστά. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το HCF1, ένα ημικαθαρισμένο κλάσμα τουCistanches Herba, προκαλεί μείωση βάρους στα ποντίκια που τρέφονται με κανονική δίαιτα και δίαιτα πλούσια σε λιπαρά. Η μείωση του βάρους συσχετίστηκε με την επαγωγή μιτοχονδριακής αποσύνδεσης και αλλαγές στις δραστηριότητες μεταβολικών ενζύμων στους σκελετικούς μυς ποντικού. Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο βιοχημικός μηχανισμός που βρίσκεται κάτω από την επαγόμενη από HCF1- μείωση βάρους, εξετάστηκε η επίδραση του HCF1 και του δραστικού συστατικού του, 𝛽-σιτοστερόλης (BSS), σε μυοσωληνάρια C2C12. Η επώαση με HCF1/BSS προκάλεσε μια παροδική αύξηση στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP), πιθανώς με ρευστοποίηση της μιτοχονδριακής εσωτερικής μεμβράνης. Η αύξηση της MMP ήταν παράλληλη με την αύξηση της παραγωγής μιτοχονδριακών δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Το μιτοχονδριακό ROS, με τη σειρά του, πυροδότησε μια ευαίσθητη στην οξειδοαναγωγή επαγωγή μιτοχονδριακής αποσύνδεσης με την αποσύνδεση της πρωτεΐνης 3 (UCP3). Η βιοχημική ανάλυση έδειξε ότι ο HCF1 ήταν ικανός να ενεργοποιήσει μια οδό εξαρτώμενης από μονοφωσφορική αδενοσίνη πρωτεϊνικής κινάσης/υποδοχέα συνενεργοποιητή{14}} που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος και συνεπώς αύξησε την έκφραση της οξειδάσης του κυτοχρώματος c και της UCP3. Μελέτες σε ζώα με χρήση μιτοχονδριακού συζεύκτη επιβεβαίωσαν επίσης το ρόλο της αποσύνδεσης των μιτοχονδρίων στην επαγόμενη από HCF1- μείωση βάρους. Συμπερασματικά, ένα HCF1/BSS προκαλεί την ευαίσθητη στην οξειδοαναγωγή επαγωγή μιτοχονδριακής αποσύνδεσης και ενεργοποίηση του AMPK/PGC-1 στους μυοσωληνάρια C2C12, με επακόλουθες μειώσεις στο σωματικό βάρος και τη παχυσαρκία λόγω αυξημένης κατανάλωσης ενέργειας.

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com

Το Cistanche deserticola έχει πολλά αποτελέσματα, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

1. Εισαγωγή

Η παχυσαρκία, η οποία ορίζεται ως μη φυσιολογική συσσώρευση σωματικού λίπους, έχει αναδειχθεί ως απειλή για τη δημόσια υγεία. Ανεξάρτητα από μεταβολικά υγιείς ή μεταβολικά διαταραγμένες καταστάσεις, η παχυσαρκία έχει βρεθεί ότι σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο συννοσηροτήτων και θνησιμότητας [1]. Η κεντρική παχυσαρκία, οι ανωμαλίες στα προφίλ χοληστερόλης και οι αυξήσεις στα επίπεδα των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα, τα οποία είναι κοινά χαρακτηριστικά των παχύσαρκων ατόμων, συμβάλλουν στην υψηλή συχνότητα εμφάνισης διαβήτη τύπου 2, καρδιαγγειακών παθήσεων, μη καρδιαγγειακών θανάτων και καρκίνων που σχετίζονται με την παχυσαρκία σε παχύσαρκα άτομα. 2]. Ως εκ τούτου, η μείωση του σωματικού βάρους και της παχυσαρκίας έχει θεωρηθεί ως κλειδί για την πρόληψη των συνεπειών στην υγεία που σχετίζονται με την παχυσαρκία. Η διαχείριση της παχυσαρκίας δίνει έμφαση κυρίως στη δημιουργία βέλτιστου ενεργειακού ισοζυγίου με την αύξηση της ενεργειακής δαπάνης ή/και τη μείωση της ενεργειακής πρόσληψης. Οι τροποποιήσεις του τρόπου ζωής, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης της φυσικής δραστηριότητας και της ανάπτυξης υγιεινών διατροφικών προτύπων, θεωρούνται γενικά ασφαλείς προσεγγίσεις για την πρόκληση απώλειας βάρους. Ωστόσο, τέτοιες προσεγγίσεις έχει γενικά βρεθεί ότι είναι αναποτελεσματικές Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2015, Article ID 142059, 12 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420-Basedary and Complementary Εναλλακτική ιατρική για την αύξηση της ενεργειακής δαπάνης ή τη μείωση της ενεργειακής πρόσληψης [3]. Επομένως, στρατηγικές που βασίζονται στη χρήση φαρμακολογικών παραγόντων βρίσκονται επί του παρόντος υπό ενεργό διερεύνηση. Σε σχέση με αυτό, το προηγούμενο εύρημα μας έδειξε ότι το HCF1, ένα ημικαθαρισμένο κλάσμα τουΚιστάνουςHerba(ένα αποξηραμένο ολόκληρο φυτό απόCistanche deserticolaΤο YC Ma χαρακτηρίζεται ως τονωτικό βότανο «Γιανγκ-αναζωογονητικό» στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική), αποδείχθηκε αποτελεσματικό στην πρόληψη της παχυσαρκίας που προκαλείται από τη διατροφή και των σχετικών μεταβολικών ανωμαλιών [4]. Η από του στόματος χορήγηση του HCF1 προκάλεσε μείωση βάρους στα ποντίκια που τρέφονταν με κανονική δίαιτα (ND-) και δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD-), πιθανώς με την επαγωγή μιτοχονδριακής αποσύνδεσης στους σκελετικούς μυς, με επακόλουθη αύξηση της ενεργειακής δαπάνης [4. ]. Ωστόσο, ο μηχανισμός που κρύβεται πίσω από αυτήν την επαγόμενη από HCF{10}}αποσύνδεση των μιτοχονδρίων (και ως εκ τούτου η μείωση του βάρους) παραμένει ασαφής. Η μιτοχονδριακή αποσύνδεση διαχέει τις βαθμίδες πρωτονίων εισάγοντας μια εναλλακτική οδό αγωγιμότητας πρωτονίων κατά μήκος της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης (IMM), με επακόλουθη μείωση στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και τη δημιουργία μιτοχονδριακού ATP. Αυτός ο μάταιος κύκλος μεταφοράς πρωτονίων καταναλώνει μεγάλο ποσοστό μεταβολικής ενέργειας σε διάφορους ιστούς και είναι υπεύθυνος για ένα σημαντικό μέρος της ημερήσιας ενεργειακής δαπάνης, με επακόλουθη αύξηση στη χρήση μορίων καυσίμου (όπως λιπαρά οξέα), προκαλώντας έτσι απώλεια βάρους και μείωση της παχυσαρκίας [5, 6]. Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα της μιτοχονδριακής αποσύνδεσης που παράγεται από το HCF1, οι επιδράσεις του HCF1 στην έκφραση MMP και UCP3 εξετάστηκαν σε μυοσωληνάρια C2C12, τα οποία είναι διαφοροποιημένα μυϊκά κύτταρα που προέρχονται από τον μηριαίο μυ ποντικών C3H. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τον βιοχημικό μηχανισμό στον οποίο βασίζεται η μείωση του βάρους που παρέχεται από το HCF1. Η 𝛽-σιτοστερόλη (BSS), ένα δραστικό συστατικό του HCF1, μελετήθηκε επίσης για σύγκριση. Η πιθανή εμπλοκή της μιτοχονδριακής αποσύνδεσης σε μείωση βάρους που προκαλείται από HCF1- σε παχύσαρκα ποντίκια που τρέφονταν με HFD διερευνήθηκε περαιτέρω με τη συγχορήγηση του HCF1 με έναν χημικό συζεύκτη, 6-κετοχολεστανόλη (kCh). Η εξαρτώμενη από τη μονοφωσφορική αδενοσίνη πρωτεϊνική κινάση (AMPK), μια πανταχού παρούσα κινάση σερίνης/θρεονίνης-πρωτεΐνης, αποτελεί σημαντικό κόμβο για τον έλεγχο του μεταβολισμού της κυτταρικής ενέργειας. Κατά την ενεργοποίηση, το AMPK ενσωματώνει ενδο/εξωκυτταρικά σήματα και προκαλεί κυτταρικές αποκρίσεις μέσω της διαμεσολάβησης διαφόρων κυτταρικών καταρράξεων σηματοδότησης [7, 8]. Το AMPK είναι ικανό να ρυθμίζει τον κυτταρικό μεταβολισμό ρυθμίζοντας τις μεταβολικές ενζυμικές δραστηριότητες μέσω άμεσης φωσφορυλίωσης. Το AMPK παράγει επίσης μακροπρόθεσμα αποτελέσματα σε μεταγραφικό επίπεδο μέσω της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος 𝛾coactivator-1 (PGC-1), που οδηγεί σε προσαρμοστικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που σχετίζονται με τον ενεργειακό μεταβολισμό και τη μιτοχονδριακή λειτουργία [9, 10]. Από αυτή την άποψη, εξετάσαμε επίσης την επίδραση του HCF1/BSS στο μονοπάτι σηματοδότησης AMPK/PGC-1 στους μυοσωλήνες C2C12.

κιστανάκιοφέλη deserticola

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Φυτική Εκχύλιση.

Cistanches Herba, το αποξηραμένο ολόκληρο φυτό τουCistanche deserticolaΤο YC Ma (Orobanchaceae), αγοράστηκε από έναν τοπικό έμπορο βοτάνων (Lee Hoong Kee). Το βότανο επικυρώθηκε από τον προμηθευτή και ένα δείγμα κουπονιού (HKUST00301) κατατέθηκε στο Τμήμα Επιστήμης της Ζωής, στο Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας του Χονγκ Κονγκ (HKUST). ΕΝΑΚιστάνουςΤο εκχύλισμα Herba ελήφθη με εκχύλιση αιθανόλης αλεσμένου φυτικού υλικού με θέρμανση υπό αναρροή στους 78∘ C για 2 ώρες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11], με την απόδοση να είναι 14 τοις εκατό (w/w). Το εκχύλισμα κλασματοποιήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας χρωματογραφία πυριτικής πηκτής [12]. Το HCF1 ελήφθη με απόδοση 1,14 τοις εκατό (β/β). Το εκχύλισμα ξηράνθηκε με εξάτμιση του διαλύτη υπό μειωμένη πίεση στους 50∘ C και το αποξηραμένο εκχύλισμα αποθηκεύτηκε στους -20∘ C πριν από τη χρήση.

2.2. Χημικά.

Αντίσωμα κατά της ακτίνης, BSS (CAS 83-46- 5), κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης 3 αγοράστηκαν από τη Sigma (St Louis, MO). Anti-AMPK𝛼1/2 αντίσωμα, anti-p-AMPK [4- (2-πιπεριδίνη-1-υλ-αιθοξυ)-φαινυλ)]-3-πυριδίνη-4-υλ-πυραζόλο[1,5-a Η ]-πυριμιδίνη (CC) και η 6-κετοχολοστανόλη (kCh) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Το αντίσωμα αντι-COX αγοράστηκε από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). Ένα αντίσωμα αντι-λαμίνης Β1 αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ). Το αντιδραστήριο προσδιορισμού Bio-Rad αγοράστηκε από την Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA). Όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, MO, ΗΠΑ).

2.3. Κυτταρικής καλλιέργειας.

Το C2C12, μια καλλιέργεια μυοβλαστών που προέρχεται από σκελετικούς μυς ποντικού C3H [13] από την American Type Culture Collection (ATCC), παρασχέθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Zhenguo Wu (Division of Life Science, HKUST). Η κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό (v/v) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 100 IU/mL πενικιλίνη και 100 𝜇g /mL στρεπτομυκίνης και 17 mM NaHC03. Η διαφοροποίηση των μυοβλαστών C2C12 σε μυοσωλήνες C2C12 προκλήθηκε με υποκατάσταση ενός πλήρους μέσου καλλιέργειας με ένα μέσο διαφοροποίησης που περιέχει 2 τοις εκατό (ν/ν) ορό αλόγου (HS) αντί για 10 τοις εκατό (ο/ο) FBS. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό (v/v) CO2 στον αέρα στους 37 C.

Cistancheέχει ένααποτέλεσμα απώλειας βάρους

2.4. Βιοχημικές αναλύσεις σε μυοσωλήνες C2C12

2.4.1. MMP.

Το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας φθορίζουσα κατιονική χρωστική, 5,5 ,6,6 -τετραχλωρό- 1,1,3,3 -τετρααιθυλοβενζιμιδαζολυλ-καρβοκυανινο ιωδίδιο (JC- 1) [14]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1.0 × 104 κύτταρα σε τρυβλία μικροτιτλοδότησης 96-πηγαδιών. Μετά από σταθερή προσκόλληση, τα κύτταρα προχρωματίστηκαν με 20 𝜇M JC-1 (διαλυμένα σε μέσο καλλιέργειας) στους 37∘ C για 10 λεπτά. Μετά την προχρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank (HBSS), συμπληρωμένο με 0,1 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). Η μέτρηση της ΜΜΡ ξεκίνησε με την προσθήκη ενός μέσου που περιέχει HCF1/BSS. Η ποσότητα του συσσωματώματος J των μορίων JC-1, που σχηματίζεται στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων υψηλού δυναμικού μεμβράνης, προσδιορίστηκε με παρακολούθηση του ερυθρού φθορισμού JC-1 (Ex 485 nm/Em 580 nm) Αποδεικτικά στοιχεία -Βασισμένη Συμπληρωματική και Εναλλακτική Ιατρική 3 στους 37∘ C για 1 ώρα. Η MMP υπολογίστηκε αφαιρώντας τις εντάσεις φθορισμού των τυφλων δειγμάτων (δηλαδή, που περιέχουν μόνο μέσο) από τις εντάσεις φθορισμού των ελεγμένων δειγμάτων. Οι τιμές MMP των κυττάρων που επωάστηκαν με HCF1/BSS κανονικοποιήθηκαν με τις αντίστοιχες τιμές ελέγχου που δεν επωάστηκαν με HCF1/BSS και εκφράστηκαν ως ποσοστό ελέγχου.

2.4.2. Ενεργοποίηση πρωτεϊνικής κινάσης εξαρτώμενης από μονοφωσφορική αδενοσίνη (AMPK).

Οι μυοσωλήνες C2C12 σπάρθηκαν (1,5 χ 105 κύτταρα) σε τρυβλία μικροτιτλοδότησης 6- φρεατίων. Μετά από σταθερή σύνδεση, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με μέσο που περιέχει HCF1/BSS για 8 ώρες. Τα προεπωασμένα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με 300 𝜇L ρυθμιστικού διαλύματος λύσης δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-) (20 mM Tris-Cl, 2 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), 3 mM αιθυλενογλυκόλη τετραοξικό οξύ (EGTA), 1 τοις εκατό (EGTA) v) Triton X- 100, 10 τοις εκατό (w/v) γλυκερόλη, 5 τοις εκατό SDS, 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης 3, pH 7,5). Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε περαιτέρω στα 12000 xg στους 4°C για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Η έκταση της ενεργοποίησης AMPK εκτιμήθηκε από τη σχετική αναλογία φωσφόρου-AMPK𝛼 (p-AMPK) και AMPK𝛼 με ανάλυση Western blot χρησιμοποιώντας αντίσωμα anti-p-AMPK𝛼1/2 και αντίσωμα αντι-AMPK𝛼1/2 μετά από ανάλυση SDS-PAGE, με διαχωριστικό πήκτωμα ακρυλαμιδίου 10 τοις εκατό (ο/ο). Φορτώθηκε κυτταρόλυμα (20 𝜇g) και χρησιμοποιήθηκε η ακτίνη - ακτίνη ως δείκτης αναφοράς. Οι χρωματισμένες με ανοσολογικές ζώνες πρωτεΐνης αναλύθηκαν με πυκνομετρία (Quantiscan, Biosoft) και οι ποσότητες (αυθαίρετες μονάδες) των p-AMPK𝛼 και AMPK𝛼 κανονικοποιήθηκαν με αναφορά στο επίπεδο 𝛽-ακτίνης (αυθαίρετες μονάδες) στο δείγμα.

2.4.3. Πυρηνική μετατόπιση PGC-1.

Οι μυοσωλήνες C2C12 καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 2.0×106 κύτταρα σε πλάκες καλλιέργειας 100 mm. Μετά από 8 ώρες προεπώασης HCF1/BSS κύτταρα τρυψινίστηκαν και επωάστηκαν με 1 mL παγωμένο υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM HEPES, 1,5 mM KCl και 1,5 mM MgCl2, pH 7,9) στους 4∘C για 11 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 500 xg στους 4°C για 10 λεπτά. Τα συλλεχθέντα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 300 𝜇L υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα, συμπληρωμένο με 0,5 mM DTT, 0,1 τοις εκατό (w/v) εννεϋλοφαινοξυ-πολυαιθοξυαιθανόλη (NP-40) και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, για να διευκολυνθεί η εκχύλιση διαλυτών πρωτεϊνών σε διαλυτές πρωτεΐνες . Το προϊόν λύσης που προέκυψε φυγοκεντρήθηκε στα 12000 xg στους 4°C για 1 λεπτό για να δώσει κυτοσολικά (υπερκείμενο) και πυρηνικό (σφαιρίδιο) κλάσματα. Η απομόνωση των πυρηνικών πρωτεϊνών επιτεύχθηκε επωάζοντας το ίζημα με 25 𝜇L παγωμένο υπερτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (20 mM HEPES, 25 τοις εκατό (β/ο) γλυκερόλη, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, DTT5, και DTT0. κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, ρΗ 7,9) στους 4∘ C για 30 λεπτά που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 12000 xg στους 4∘ C για 5 λεπτά. Η έκταση της πυρηνικής μετατόπισης PGC-1 υπολογίστηκε από τη σχετική αναλογία του επιπέδου PGC-1 σε κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα χρησιμοποιώντας ανάλυση στυπώματος Western μετά από ανάλυση SDS-PAGE, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τόσο το κυτοσολικό όσο και το πυρηνικό κλάσμα (20 𝜇g) φορτώθηκαν, με -ακτίνη και λαμίνη Β1 να χρησιμοποιούνται ως κυτοσολικοί και πυρηνικοί δείκτες αναφοράς, αντίστοιχα. Οι ποσότητες (αυθαίρετες μονάδες) PGC-1 κανονικοποιήθηκαν με αναφορά στα επίπεδα ακτίνης και λαμίνης Β1, αντίστοιχα, (αυθαίρετες μονάδες) στο δείγμα.

2.4.4. Έκφραση Μιτοχονδριακής Πρωτεΐνης Αποσύνδεσης 3 (UCP3) και Οξειδάσης Κυτοχρώματος c (COX).

Οι μυοσωλήνες C2C12 σπάρθηκαν (2.0 × 106 κύτταρα) σε πλάκες καλλιέργειας 100 mm. Μετά από σταθερή σύνδεση, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με μέσο που περιέχει HCF1/BSS στους 37 C για 48 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του μέσου που περιέχει HCF1/BSS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θρυψίνη και λύθηκαν με την προσθήκη 300 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης SDS. Το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε στα 12000 xg στους 4°C για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Τα επίπεδα UCP3 και COX στο υπερκείμενο προσδιορίστηκαν με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-UCP3 (Ε- 18) και αντίσωμα αντι-COX μετά από ανάλυση SDS-PAGE όπως περιγράφεται παραπάνω. Φορτώθηκε κυτταρόλυμα (50 𝜇g) και χρησιμοποιήθηκε η ακτίνη 𝛽 ως δείκτης αναφοράς. Οι ποσότητες (αυθαίρετες μονάδες) UCP3 και COX κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με το επίπεδο 𝛽-ακτίνης (αυθαίρετες μονάδες) στο δείγμα.

2.5. Φροντίδα ζώων.

Τα ποντίκια ICR (8 εβδομάδες, 30 έως 35 g για τα αρσενικά και 25 έως τα 30 g για τα θηλυκά) διατηρήθηκαν σε κύκλο σκότους/φωτός 12 ωρών σε περιβάλλον ελεγχόμενο από αέρα/υγρασία στους περίπου 22∘ C και επέτρεψαν τροφή και νερό κατά βούληση στις εγκαταστάσεις φροντίδας ζώων και φυτών (APCF) στο Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας του Χονγκ Κονγκ (HKUST). Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ερευνητικής Πρακτικής (HKUST) (αριθμός έγκρισης πρωτοκόλλου ζώων 2013049, ημερομηνία έγκρισης: 25 Σεπτεμβρίου 2013, διάρκεια πειράματος: 3 χρόνια).

2.6. Πρωτόκολλο θεραπείας.

Για να εξεταστεί η επίδραση της 6-κετο-χοληστανόλης (kCh) στη μείωση βάρους που προκαλείται από HCF1- σε ποντικούς που τρέφονταν με HFD, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε 6 ομάδες, με 10-15 ποντίκια σε κάθε μία: (1 ) κανονική δίαιτα (ND, 13 τοις εκατό ενέργεια που προέρχεται από λίπος, αγοράστηκε από τη LabDiet, αριθμός προϊόντος 5010) έλεγχος. (2) ND συν kCh (σε ημερήσια δόση 9 mg/kg). (3) HFD (60 τοις εκατό ενέργεια που προέρχεται από λίπος, αγοράστηκε από την Research Diet Inc., αριθμός προϊόντος D12492) έλεγχος. (4) HFD συν HCF1 (σε ημερήσια δόση 45 mg/kg). (5) HFD συν kCh. και (6) HFD συν HCF1 συν kCh. Το HCF1, σε ημερήσια δόση 45 mg/kg, αποδείχθηκε ότι προκαλεί σημαντική μείωση βάρους σε αρσενικά ποντίκια [4], ενώ το kCh, σε ημερήσια δόση 9 mg/kg, βρέθηκε ότι καταργεί τον HCF1- επαγόμενη επίδραση αποσύνδεσης σε μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από σκελετικό μυ ποντικού (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Στα ζώα χορηγήθηκε ενδογαστρικά kCh, HCF1, ή HCF1/kCh, 5 ημέρες την εβδομάδα, για 8 εβδομάδες (δηλ. για συνολικά 40 δόσεις). Τα ποντίκια ελέγχου έλαβαν μόνο το όχημα (ελαιόλαδο). Το σωματικό βάρος και η κατανάλωση τροφής των ποντικών παρακολουθούνταν εβδομαδιαία κατά τη διάρκεια του πειράματος. Οι αλλαγές στο σωματικό βάρος ποσοτικοποιήθηκαν με τον υπολογισμό της περιοχής κάτω από την καμπύλη (AUC) ενός γραφήματος που απεικονίζει το ποσοστό του αρχικού βάρους σώματος έναντι του χρόνου (εβδομάδα 1 έως 8) και εκφράζεται σε αυθαίρετες μονάδες. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας 24 ώρες μετά την τελευταία δόση (με kCh, HCF1 ή HCF1/kCh) μετά από ολονύκτια νηστεία. Δείγματα γαστροκνήμιου μυός αφαιρέθηκαν για τη μέτρηση της μιτοχονδριακής αναπνοής. Τα επιθέματα λίπους (γοναδικό, οπισθοπεριτοναϊκό και μεσεντερικό λίπος) ανατέμθηκαν και ζυγίστηκαν. Η αναλογία ενός συγκεκριμένου βάρους επιθέματος λίπους προς το σωματικό βάρος υπολογίστηκε και εκφράστηκε ως "δείκτης επιθέματος λίπους".

Cistancheείναι ένα φυσικό βότανο με αποτέλεσμα απώλειας βάρους

2.7. Βιοχημικές αναλύσεις σε ποντίκια

2.7.1. Παρασκευάσματα δειγμάτων.

Μυϊκοί ιστοί γαστροκνήμιου σε κιμά αναμίχθηκαν με 10 mL διαλύματος κολλαγενάσης (0.075 τοις εκατό (β/ο)) σε ρυθμιστικό διάλυμα (100 mM KCl, 50 mM MOPS, ρΗ 7,2) και τα μίγματα υπέστησαν επωάστηκε στους 4∘ C για 20 λεπτά. Τα χωνευθέντα μίγματα ιστού φυγοκεντρήθηκαν στα 600 xg στους 4°C για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε. οι χωνευμένοι ιστοί αναμίχθηκαν με 20 mL παγωμένου ρυθμιστικού ομογενοποιητικού διαλύματος (50 mM σακχαρόζη, 200 mM μαννιτόλη, 5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA, και 5 mM MOPS, ρΗ 7,2) και ομογενοποιήθηκαν σε πάγο με γυαλί Teflon-zer στις 4000 rpm για 25 έως 30 πλήρεις διαδρομές. Τα ομογενοποιήματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 600 xg στους 4°C για 10 λεπτά, αποδίδοντας ένα κλάσμα χωρίς πυρήνα (υπερκείμενο). Μιτοχονδριακά σφαιρίδια παρασκευάστηκαν από ομογενοποιήματα μυών με φυγοκέντρηση στα 9200 xg στους 4°C για 30 λεπτά. Τα μιτοχονδριακά κλάσματα ελήφθησαν με εναιώρηση των σφαιριδίων σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 125 mM KCl, 10 mM Tris-Base, 2 mM KH2PO4, 0,5 mM EGTA και 20 mM MOPS, pH 7,5 [15].

2.7.2. Μιτοχονδριακή Αναπνοή.

Οι ρυθμοί αναπνοής σε μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από σκελετικούς μυς ποντικού προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται από τους Wong και Ko [12]. Εν συντομία, η μιτοχονδριακή αναπνοή μετρήθηκε πολογραφικά χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρόδιο τύπου Clark (Hansatech Instruments, Norfolk) στους 30 C. Τα μιτοχονδριακά κλάσματα (1 mg πρωτεΐνης/mL) επωάστηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα αναπνοής (3{{17} } mM KCl, 6 mM MgCl2, 75 mM σακχαρόζη, 1 mM EDTA, και 20 mM KH2PO4, ρΗ 7,0). Προστέθηκε διάλυμα υποστρώματος που περιείχε 15 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 5 mM μηλικό νάτριο. Μετά την εξισορρόπηση, η αναπνοή κατάστασης 3 ξεκίνησε με την προσθήκη ADP (τελική συγκέντρωση 0,6 mM). Όταν όλο το προστιθέμενο ADP χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ΑΤΡ, προστέθηκε ολιγομυκίνη για να προκληθεί αναπνοή κατάστασης 4. Η αναλογία αναπνευστικού ελέγχου (RCR) υπολογίστηκε με τον υπολογισμό της αναλογίας των ρυθμών αναπνοής της κατάστασης 3 προς την κατάσταση 4 [16].

2.7.3. Μιτοχονδριακή έκφραση UCP3 σε σκελετικό μυ ποντικιού.

Τα επίπεδα μιτοχονδριακής UCP3 υπολογίστηκαν με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-UCP3 (Ε-18) μετά από ανάλυση SDS PAGE του μιτοχονδριακού κλάσματος, χρησιμοποιώντας διαχωριστική γέλη ακρυλαμιδίου 10 τοις εκατό. Μιτοχονδριακά κλάσματα που απομονώθηκαν από σκελετικό μυ ποντικού (∼60 𝜇g) εφαρμόστηκαν στο πήκτωμα και η οξειδάση του κυτοχρώματος c (COX) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης αναφοράς. Οι ανοσοχρωματισμένες πρωτεϊνικές ζώνες αναλύθηκαν με πυκνομετρία και οι ποσότητες (αυθαίρετες μονάδες) της UCP3 κανονικοποιήθηκαν με αναφορά στο επίπεδο COX (αυθαίρετες μονάδες) στο δείγμα.

2.8. Προσδιορισμός Πρωτεϊνών.

Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad. Ένα δείγμα (10 𝜇L) δείγματος μιτοχονδριακού/κυτταρικού λύματος αραιώθηκε με 40 𝜇L νερού. Ένα κλάσμα (10 𝜇L) αραιωμένου δείγματος προστέθηκε στη συνέχεια σε ένα φρεάτιο μιας πλάκας μικροτιτλοδότησης 96-πηγαδιού και ακολούθησε προσθήκη 200 𝜇L αραιωμένου αντιδραστηρίου ανάλυσης Bio-Rad (5-διπλάσια αραίωση). Το μίγμα αφέθηκε να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και στη συνέχεια μετρήθηκε η απορρόφηση του μίγματος αντίδρασης στα 570 nm. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε από μια καμπύλη βαθμονόμησης χρησιμοποιώντας αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) ως πρότυπο.

2.9. Στατιστική ανάλυση.

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM), εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (μονόδρομη ANOVA), εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, και ανιχνεύθηκαν διαφορές μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας τη δοκιμή εύρους Tukey, με 𝑃<>

Cistanchedeserticola έχειπολλά αποτελέσματα

3. Αποτελέσματα

3.1. Επιδράσεις του HCF1/BSS σε MMP σε μυοσωλήνες C2C12.

Η επώαση του χημικού αποζεύκτη, καρβονυλοκυανίδιο {{0}} (τριφθορομεθοξυ) φαινυλυδραζόνη (FCCP), σε συγκέντρωση 1 𝜇M, προκάλεσε μια χρονικά εξαρτώμενη μείωση της MMP, με την έκταση της μείωσης να είναι 29 τοις εκατό σε το τέλος της μέτρησης (Εικόνες 1 και 2). Αντίθετα, τα HCF1 και BSS, σε συγκεντρώσεις 30 ng/mL και 10 𝜇M, αύξησαν το MMP κατά 5 και 4 τοις εκατό, αντίστοιχα, στα πρώτα 10 λεπτά της επώασης HCF1/BSS (Εικόνες 1 και 2) . Οι αρχικές αυξήσεις που προκλήθηκαν από HCF1/BSS ακολουθήθηκαν από σταδιακές μειώσεις της MMP στο 95 και 93 τοις εκατό, αντίστοιχα, της αντίστοιχης αρχικής τιμής στο τέλος της μέτρησης (60 λεπτά επώαση HCF1/BSS) (Εικόνες 1 και 2). Οι επαγόμενες από HCF1/BSS αλλαγές στη MMP χαρακτηρίστηκαν από τη χρήση ειδικών αναστολέων. Η ροτενόνη (0,1 nM), ένας αναστολέας του μιτοχονδριακού συμπλέγματος Ι, και η χοληστερόλη (0,3 𝜇M), ένας ενισχυτής της ακαμψίας της μεμβράνης, κατέστειλαν τις επαγόμενες από το HCF1/BSS αλλαγές στη MMP σε όλη τη διάρκεια της μέτρησης (Εικόνες 1 και 2). Από την άλλη πλευρά, η ταυτόχρονη επώαση με έναν συγκεκριμένο αναστολέα των UCPs, το GDP, έναν χημικό συζεύκτη, 6-κετοχολοστανόλη (kCh) ή ένα αντιοξειδωτικό, τη διμεθυλθειουρία (DMTU), μείωσε την επαγόμενη από το HCF{{34} μείωση MMP στον μεταγενέστερο χρόνο της επώασης του HCF1 (Εικόνα 1). Το GDP, το kCh και το DMTU μείωσαν επίσης την προκαλούμενη από το BSS μείωση της MMP στον μεταγενέστερο χρόνο της επώασης του BSS, με την τιμή MMP να είναι 110 τοις εκατό , σε σύγκριση με τον αντίστοιχο χρονικά αντιστοιχισμένο έλεγχο (Εικόνα 2)

3.2. Επίδραση του HCF1/BSS στην ενεργοποίηση AMPK σε μυοσωλήνες C2C12.

Η επίδραση του HCF1 στην AMPK εξετάστηκε μετρώντας την αναλογία φωσφορυλιωμένης AMPK𝛼 (p-AMPK𝛼) προς την ολική AMPK𝛼 (AMPK𝛼), η οποία υποδεικνύει την έκταση της ενεργοποίησης της AMPK. Η επώαση με HCF1, σε συγκεντρώσεις 30 και 100 ng/mL, παρήγαγε χρονικά εξαρτώμενες αυξήσεις στην ενεργοποίηση της AMPK, με την έκταση αυτών των αυξήσεων να είναι 32 και 43 τοις εκατό στις 8 ώρες επώασης HCF1, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αντίστοιχο χρόνο αντιστοιχισμένος έλεγχος (Εικόνα 3). Παράλληλα με το HCF1, η προεπώαση με BSS (10 𝜇M) αύξησε σημαντικά την έκταση της ενεργοποίησης της AMPK κατά 25 τοις εκατό, σε σύγκριση με τον μη προεπωασμένο μάρτυρα (Εικόνα 5). Η επαγόμενη από HCF1/BSS ενεργοποίηση AMPK σε μυοσωλήνες C2C12 καταργήθηκε πλήρως με ταυτόχρονη επώαση είτε με kCh (αποσύνδεση) είτε με DMTU (Εικόνες 4 και 5, Πίνακες 1 και 2 του Συμπληρωματικού Υλικού που διατίθεται στο διαδίκτυο

3.3. Επίδραση του HCF1/BSS στην πυρηνική μετατόπιση PGC-1 σε μυοσωλήνες C2C12.

Η ενεργοποίηση του PGC-1 μπορεί να μετρηθεί έμμεσα από την έκταση της πυρηνικής μετατόπισης PGC-1. Η προεπώαση με HCF1 και BSS αύξησε σημαντικά την πυρηνική μετατόπιση PGC-1 κατά 25 και 28 τοις εκατό, αντίστοιχα, όπως αποδεικνύεται από τις αυξημένες αναλογίες PGC-1 στον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα (Εικόνες 6 και 7). Ένας ειδικός αναστολέας της AMPK, 6-[{4-(2-πιπεριδίνη-1-υλ-αιθοξυ)-φαινυλ)]-3-πυριδίνη-4-υλοπυραζόλο[ 1,5-a]-πυριμιδίνη (CC), σε συγκέντρωση 10 𝜇M ανέστειλε την επαγόμενη από HCF1/BSS αύξηση στην πυρηνική μετατόπιση PGC{-1 κατά 156 και 235 τοις εκατό, αντίστοιχα, στους μυοσωλήνες C2C12 ( Πίνακες 1 και 2). Η επαγόμενη από HCF1/BSS πυρηνική μετατόπιση του PGC-1 αποφεύχθηκε επίσης με ταυτόχρονη επώαση είτε με kCh είτε με DMTU (Εικόνες 6 και 7, Πίνακες 1 και 2 του Συμπληρωματικού Υλικού).

3.4. Επίδραση του HCF1/BSS στην έκφραση του μιτοχονδριακού UCP3 και της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX) σε Μυοσωληνάρια C2C12.

Για να προσδιοριστεί η σημασία της επαγόμενης από HCF1/BSS ενεργοποίησης στο μονοπάτι AMPK/PGC-1, οι επιδράσεις του HCF1/BSS στην αποσύνδεση και τη βιογένεση των μιτοχονδρίων, όπως αξιολογούνται από τα επίπεδα UCP3 και COX (αξιόπιστος δείκτης μιτοχονδριακής μάζας σε κύτταρα), αντίστοιχα, διερευνήθηκαν. Η προεπώαση με HCF1/BSS αύξησε σημαντικά τα μιτοχονδριακά επίπεδα UCP3 και COX, με την έκταση αυτών των αυξήσεων να είναι 37 και 23 τοις εκατό (σε επωασμένους με HCF μυοσωληνάρια) (Εικόνα 8) και 52 και 24 τοις εκατό (σε επωασμένους με BSS μυοσωληνάρια ) (Εικόνα 9), αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αντίστοιχο μη προεπωασμένο μάρτυρα. Οι αυξήσεις που προκλήθηκαν από HCF1/BSS στα επίπεδα UCP3 και COX προλήφθηκαν πλήρως με ταυτόχρονη επώαση του HCF1 με kCh, DMTU ή

CC (Πίνακες 1 και 2 Συμπληρωματικού Υλικού). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι συγκεντρώσεις των kCh και CC που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα προσαρμόστηκαν σε 20 και 1 𝜇M, αντίστοιχα, για να αποφευχθούν οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των kCh και CC σε μυοσωληνάρια C2C12 (αδημοσίευτη παρατήρηση).

3.5. Ο ρόλος της μιτοχονδριακής αποσύνδεσης στην HCF1-Προκαλούμενη μείωση βάρους σε παχύσαρκα ποντίκια που προκαλούνται από HFD.

Ο πιθανός ρόλος της μιτοχονδριακής αποσύνδεσης στη μείωση βάρους που προκαλείται από HCF1-εξετάστηκε περαιτέρω με τη χρήση του χημικού συζεύκτη, kCh (Πίνακας 3 Συμπληρωματικού Υλικού). Ο HCF1 προκάλεσε μιτοχονδριακή αποσύνδεση σε σκελετικούς μυς ποντικού, όπως αποδεικνύεται από τη μείωση της αναλογίας ελέγχου της αναπνοής του μιτοχονδρίου (RCR) και την αύξηση της μιτοχονδριακής έκφρασης UCP3, τόσο σε ποντίκια που τρέφονταν με ND όσο και σε HFD. Το kCh per se (σε ημερήσια δόση 9 mg/kg) αύξησε σημαντικά τον μιτοχονδριακό RCR κατά 23 τοις εκατό σε ποντικούς που τρέφονταν με ND (αλλά όχι σε ποντικούς που τρέφονταν με HFD). Η επαγόμενη από HCF1-αποσύνδεση των μιτοχονδρίων σε ποντικούς που τρέφονταν με HFD αναστέλλεται πλήρως με τη συν-θεραπεία με kCh. Το HCF1 προκάλεσε μείωση βάρους και στα ποντίκια που τρέφονταν με ND και HFD. Αυτή η επίδραση συσχετίστηκε με την καταστολή της επαγόμενης από HFD αύξησης του δείκτη σπλαχνικού λίπους. Σε αντίθεση με το HCF1, το kCh δεν παρήγαγε καμία ανιχνεύσιμη επίδραση στην αύξηση βάρους σε ζώα ND- και HFD κατά τη διάρκεια της 8-εβδομαδιαίας πορείας του πειράματος. Η συγχορήγηση kCh με HCF1 κατήργησε τις κατασταλτικές επιδράσεις που προκάλεσε το HCF στην επαγόμενη από HFD αύξηση στο σωματικό βάρος και στον δείκτη σπλαχνικού λίπους σε ποντικούς (Πίνακας 3 Συμπληρωματικού Υλικού).