Μέρος Ⅰ Ο χηλικός παράγοντας σιδήρου, PBT434, ρυθμίζει την διακυττάρια διακίνηση σιδήρου στα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου

Αφηρημένη

Ο σίδηρος και άλλα μέταλλα μετάπτωσης, όπως ο χαλκός και το μαγγάνιο, είναι απαραίτητα για την υποστήριξη της εγκεφαλικής λειτουργίας, ωστόσο η υπερσυσσώρευση είναι κυτταροτοξική. Αυτή η υπερσυσσώρευση μετάλλων, ιδιαίτερα σιδήρου, είναι κοινή σε πολλές νευρολογικές διαταραχές. Αυτές περιλαμβάνουν τη νόσο του Αλτσχάιμερ, τη νόσο του Πάρκινσον, την αταξία του Friedrich και άλλες διαταραχές που παρουσιάζουν νευροεκφυλισμό και συσχετισμένη συσσώρευση σιδήρου στον εγκέφαλο. Η διαχείριση της ροής σιδήρου από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό παρέχει την πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στην υπερσυσσώρευση σιδήρου σε φυσιολογική φυσιολογία και σε αυτές τις παθολογικές καταστάσεις. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε ότι ο χηλικός παράγοντας σιδήρου PBT434, ο οποίος αναπτύσσεται επί του παρόντος για τη θεραπεία της νόσου του Πάρκινσον και της ατροφίας πολλαπλών συστημάτων, ρυθμίζει την πρόσληψη σιδήρου από τα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του ανθρώπινου εγκεφάλου (hBMVEC) μέσω χηλίωσης του εξωκυτταρικού Fe^{2 συν}. Η θεραπεία του hBMVEC με PBT434 οδηγεί σε αύξηση της αφθονίας των μεταγραφών για τον υποδοχέα τρανσφερίνης (TfR) και την σερουλοπλασμίνη (Cp). Οι αναλύσεις Western blot και ELISA αποκαλύπτουν αντίστοιχη αύξηση και στις πρωτεΐνες. Μέσα στο κύτταρο, το PBT434 αυξάνει το ανιχνεύσιμο επίπεδο του φιλανθρωπικού, ασταθούς Fe^{2 συν}; δεδομένα δείχνουν ότι αυτός ο Fe^{2 συν}απελευθερώνεται από τη φερριτίνη. Επιπλέον, το PBT434 ενισχύει την εκροή σιδήρου πιθανώς λόγω της αύξησης του κυτοσολικού δισθενούς σιδήρου, του υποστρώματος για τον εξαγωγέα σιδήρου, τη φερροπορτίνη. Το PBT434 ισορροπεί γρήγορα και αμφίδρομα σε έναν αιματοεγκεφαλικό φραγμό hBMVEC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το σύμπλεγμα σιδήρου PBT434-δεν είναι υπόστρωμα για την πρόσληψη hBMVEC και επομένως υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο το PBT434 θα χηλικοποιούσε τον διάμεσο σίδηρο και θα ανέστειλε την επαναπρόσληψη του σιδήρου από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, όπως καθώς επίσης αναστέλλουν την πρόσληψή του από τα άλλα κύτταρα της νευροαγγειακής μονάδας. Συνολικά, αυτό παρουσιάζει έναν νέο και πολλά υποσχόμενο μηχανισμό για τη θεραπευτική χηλίωση του σιδήρου.

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετεποια είναι τα οφέλη του Cistanche

Εισαγωγή

Η θεραπεία χηλίωσης μετάλλων (MCT) έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό ως θεραπεία για δηλητηρίαση από μέταλλα μεταπτώσεως και για γενετικές διαταραχές στο μεταβολισμό ενός βασικού ιόντος μετάλλου που οδηγεί στην υπερσυσσώρευση του μετάλλου [1-3]. Δύο παραδείγματα του τελευταίου είναι η υπερσυσσώρευση χαλκού στη νόσο του Wilson [4] και σιδήρου στην κληρονομική αιμοχρωμάτωση [5]. Τόσο ο χαλκός όσο και ο σίδηρος είναι καταλύτες οξειδωτικού στρες και επομένως είναι κυτταροτοξικοί σε συγκεντρώσεις που υπερβαίνουν την ικανότητα του κυττάρου και του οργανισμού να «συνοδεύουν» αυτά τα οξειδοαναγωγικά ενεργά μέταλλα μετάπτωσης [6, 7]. Η συσσώρευση σιδήρου, ειδικότερα, είναι σε γενικές γραμμές ιδιοπαθής. Πράγματι, η αύξηση του σιδήρου είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα ενός γερασμένου εγκεφάλου [8-10]. Παθολογικά, αυτή η συσσώρευση σιδήρου στον εγκέφαλο είναι χαρακτηριστικό μεταλλάξεων σε γονίδια που δεν σχετίζονται με τον μεταβολισμό του σιδήρου [11-15] καθώς και μιας ποικιλίας άλλων νευροεκφυλιστικών ασθενειών, μερικές από τις οποίες δεν έχουν συγκεκριμένη γενετική σχέση όπως η γήρανση [16], η νόσος του Αλτσχάιμερ [16]. 17], η αταξία του Friedreich [18] και η νόσος του Πάρκινσον [19]. Ως ομάδα, τέτοιες διαταραχές μπορούν να θεωρηθούν ως νευροεκφυλισμός με συσσώρευση σιδήρου στον εγκέφαλο (NBIA) αν και αυτό το αρκτικόλεξο συνήθως περιορίζεται σε εκείνες για τις οποίες έχει εντοπιστεί μια γενετική σύνδεση [11, 13, 14].

Στην περίπτωση υπερφόρτωσης σιδήρου, ο στόχος είναι να «καθαριστεί» το σώμα από την περίσσεια σιδήρου λόγω ελαττώματος στην πρόσληψη ή εκροή σιδήρου από τα κύτταρα. Εδώ, ο στόχος είναι να υπερνικήσουμε τους φυσιολογικούς χηλικούς παράγοντες σιδήρου με το φάρμακο. Μια ένωση που έχει καλή φαρμακοκινητική και υψηλή συγγένεια για το σίδηρο είναι το φάρμακο-στόχος. Δεδομένου ότι το σώμα είναι υπερβολικά γεμάτο με το βασικό μέταλλο, υπάρχει μικρή ανησυχία για την πρόκληση ανεπάρκειας κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Η θεραπεία της εγκεφαλικής νόσου με θεραπεία χηλίωσης σιδήρου απαιτεί διαφορετική στρατηγική. Δεν πρόκειται για πρόβλημα συστηματικής υπερφόρτωσης σιδήρου, αλλά συσσώρευσης σιδήρου σε περιοχές παθολογίας με καταστροφικά κατάντη επακόλουθα. Η συσσώρευση σιδήρου που σχετίζεται με την ηλικία στη νόσο του Πάρκινσον (PD), για παράδειγμα, συμβάλλει δυνητικά σε κυτταρική βλάβη που σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες [20]. Ο υπερβολικός ασταθής σίδηρος προάγει την εσφαλμένη αναδίπλωση της συνουκλεΐνης στους νευρώνες της μέλαινας ουσίας. Η χρήση ενός χηλικού παράγοντα υψηλής συγγένειας μπορεί να οδηγήσει σε κάποια μείωση του φορτίου σιδήρου του εγκεφάλου, αλλά σίγουρα θα προκαλέσει ανεπάρκεια σιδήρου που στον ηλικιωμένο πληθυσμό, τουλάχιστον, αντενδείκνυται δεδομένης της συστηματικής ανεπάρκειας σιδήρου που είναι κοινή σε αυτήν την ηλικιακή ομάδα [21] . Ένας χηλικός παράγοντας με βέλτιστη συγγένεια έχει τη δυνατότητα να μειώσει τη συσσώρευση σιδήρου καθώς και το συνακόλουθο οξειδωτικό στρες λόγω της περίσσειας ασταθούς σιδήρου και των διεργασιών της υποκείμενης νόσου.

Cistanche tubulosaκαιΤα αποτελέσματα του Cistanche

Ένας χηλικός παράγοντας που έχει εγκριθεί για χρήση στη θεραπεία υπερφόρτωσης σιδήρου που προκαλείται από μετάγγιση σε ασθενείς με θαλασσαιμία είναι η δεφεριπρόνη (DFP, εμπορική ονομασία Ferriprox) [5, 22]. Το DFP έχει επίσης χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία της αταξίας του Friedreich [23] και της νόσου του Πάρκινσον [24, 25]. Σε μια μετα-ανάλυση, το DFP έχει αποδειχθεί ότι παρέχει σημαντικές μειώσεις στην περιεκτικότητα σε σίδηρο του μυοκαρδίου καθώς και μεγαλύτερη καρδιακή προστασία σε ασθενείς με θαλασσαιμία από τη δεφεροξαμίνη, τον κλασικό χηλικό παράγοντα σιδήρου [5]. Από την άλλη πλευρά, το DFP μεταβολίζεται ταχέως από το ήπαρ [26] και πιο πρόσφατη εργασία έδειξε ότι χηλοποιεί το Fe2 plus στη δραστική θέση των εξαρτώμενων από το σίδηρο απομεθυλασών ιστόνης λυσίνης, μια δραστηριότητα που συσχετίζεται με μια προηγουμένως μη αναγνωρισμένη κυτταροτοξικότητα [27]. Αυτό το εύρημα υπογραμμίζει έναν βασικό περιορισμό στη χρήση της θεραπείας χηλίωσης σιδήρου, δηλαδή τον ανταγωνισμό από το φάρμακο για φυσιολογικά απαραίτητο σίδηρο, είτε σε αποθήκη σιδήρου είτε σε πρωτεΐνη που φιλοξενεί ένα προσθετικό είδος σιδήρου. Ωστόσο, το DFP, για παράδειγμα, έχει δείξει αποτελεσματικότητα σε μια δοκιμαστική θεραπεία Φάσης 2 της νόσου του Πάρκινσον, όπως υποδεικνύεται τόσο από αναλυτικούς (μειωμένο φορτίο σιδήρου εγκεφάλου με Τ{14}} σταθμισμένη μαγνητική τομογραφία) όσο και από δείκτες συμπεριφοράς (λειτουργία γνωστικών και κινητικών νευρώνων) [ 24, 25].

Ωστόσο, η συγγένεια του DFP για το Fe3 plus παραμένει ανησυχητική. Το σταθερό είδος σιδήρου DFP είναι το τρις-σύμπλεγμα, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Ενώ η ουδετερότητα αυτού του συμπλέγματος είναι ιδανική για την κινητοποίηση του σιδήρου έξω από την κυψέλη, η σταθερά σταθερότητας για αυτό, ~1037, κάνει το DFP έναν πραγματικό καθαριστή σιδήρου. Σε αυτό το πλαίσιο, η αναστολή ενός ενζύμου σιδήρου όπως η απομεθυλάση της λυσίνης είναι προβλέψιμη [27]. Αυτή η ανησυχία αντανακλά την ανάγκη να αναπτυχθούν χηλικοί παράγοντες σιδήρου που έχουν τη διαπερατότητα της μεμβράνης του DFP αλλά μια σημαντικά ασθενέστερη συγγένεια τόσο για το Fe2 plus όσο και για το Fe3 plus. Αυτό το τελευταίο χαρακτηριστικό περιορίζει τη σάρωση φαρμάκων του προσθετικού μετάλλου και το θερμοδυναμικό δυναμικό του χηλικού παράγοντα να καταλύει την αυτοοξείδωση του σιδήρου που οδηγεί στην παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου. Στην ουσία, ισχυροί χηλικοί παράγοντες σιδήρου σιδήρου καταλύουν την προοξειδωτική ιδιότητα του Fe2 plus [29]. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε πώς ένας τέτοιος χηλικός παράγοντας σιδήρου με μέτριες συγγένειες σιδήρου και σιδήρου ρυθμίζει τη ροή του σιδήρου στα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου που σχηματίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB).

Χάπια Cistanche

Αυτό το φάρμακο, PBT434 [5,7-διχλωρο-2-((μεθυλαμινο)μεθυλ)-8-υδροξυ-3-μεθυλκιναζολίνη-4 (3Η)-όνη, Σχήμα 1Α] , σχηματίζει ένα σύμπλοκο δις-σιδήρου με σταθερές log σταθερότητας ~11 και ~15 για Fe^{2 συν}και Fe^{3 συν}, αντίστοιχα [30]. Το PBT434 απέτρεψε την απώλεια των νευρώνων της ουσίας nigra pars compacta (SNpc), μείωσε τη συσσώρευση nigral-συνουκλεΐνης, μειωμένη περιεκτικότητα σε σίδηρο που σχετίζεται με το μοντέλο της νόσου PD στον μεσεγκέφαλο και διέσωσε την απόδοση του κινητήρα σε δύο μοντέλα ποντικών με νόσο του Parkinson χωρίς εμφανή εξάντληση συστηματικού σιδήρου [30]. Το PBT434 είναι επίσης αποτελεσματικό σε μοντέλα ποντικού της Πολλαπλής Ατροφίας Συστήματος (MSA) [30, 31], μιας κινητικής διαταραχής παρόμοιας εμφάνισης με τη νόσο του Πάρκινσον αλλά που χαρακτηρίζεται από κακή αναδίπλωση -συνουκλεΐνης και επακόλουθη συσσώρευση που προκαλεί το σχηματισμό γλοιακών κυτταροπλασματικών εγκλεισμών που είναι το χαρακτηριστικό παθολογία της νόσου [32]. Σημαντικά, το PBT434 μείωσε τους δείκτες οξειδωτικού στρες σε μοντέλα PD σε ποντίκια [30] υποδεικνύοντας ότι 1) το PBT434 στόχευε τα αποθέματα σιδήρου που διαφορετικά λειτουργούσαν ως προοξειδωτικά και 2) το PBT434 δεν ενίσχυσε αυτήν την εκκολαπτόμενη κυτταροτοξικότητα με βάση την οξείδωση. Το PBT434 έχει ολοκληρώσει μια μελέτη Φάσης 1 ικανοποιητικά [33].

Η εργασία που παρουσιάζεται εδώ σχεδιάστηκε για να διερευνήσει την επίδραση που έχει το PBT434 στη διακίνηση σιδήρου στα κύτταρα φραγμού του εγκεφάλου, τα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που μαζί με τα υποκείμενα γλοία σχηματίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Αυτές οι μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει μια καλά επικυρωμένη αθανατοποιημένη ενδοθηλιακή κυτταρική σειρά τόσο σε μορφές καλλιέργειας μονοστοιβάδας όσο και σε μορφές διακοιλιακής καλλιέργειας [34-37]. Ο πρωταρχικός στόχος αυτών των μελετών ήταν ο προσδιορισμός της κινητικής της πρόσληψης και της εκροής σιδήρου από αυτά τα κύτταρα και η διαμόρφωσή τους από το PBT434. Το μοντέλο transwell BBB χρησιμοποιήθηκε επίσης για την επίδειξη της αμφίδρομης διακυτταρικής ροής PBT434 κατά μήκος του φραγμού των ενδοθηλιακών κυττάρων. Το μοντέλο έδειξε με μοριακούς όρους ότι το PBT434 αναστέλλει την πρόσληψη σιδήρου μέσω χηλίωσης ενώ διεγείρει την εκροή σιδήρου. Μελέτες κυτταρικής απεικόνισης δείχνουν ότι το PBT434 έχει πρόσβαση στην ίδια δεξαμενή ασταθούς σιδήρου που ανιχνεύεται από ένα κλασικό Fe^{2 συν}χηλικός παράγοντας, 2,2'-διπυριδίνη ή διπυριδύλιο, και ένας ανιχνευτής φθορισμού για δισθενή σίδηρο. Τα αποτελέσματα προτείνουν έναν πιθανό μηχανισμό δράσης για το PBT434 που περιλαμβάνει την αναστολή της πρόσληψης συστηματικού σιδήρου στο BBB και την επακόλουθη δέσμευση του σιδήρου του εγκεφάλου στον διάμεσο χώρο.

Αποτελέσματα

1. Το PBT434 δεν έχει κυτταροτοξικές επιδράσεις στα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου

Για να προσδιορίσουμε ένα κατάλληλο εύρος συγκεντρώσεων εργασίας για το PBT434 στην in vitro κυτταρική μας καλλιέργεια, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία MTT για να παρακολουθήσουμε τη μιτοχονδριακή λειτουργία του hBMVEC σε απόκριση στο PBT434. Με βάση προηγούμενες αναφορές [30], υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα εύρος συγκεντρώσεων PBT434 έως και 100 μM για 24 ώρες. Δεν παρατηρήσαμε σημαντικές αλλαγές στη βιωσιμότητα του hBMVEC με οποιαδήποτε συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (Εικ. 2).

2. Το PBT434 παραλαμβάνεται και διακινείται γρήγορα μέσω του φράγματος hBMVEC

Το PBT434 είναι ένα από του στόματος βιοδιαθέσιμο φάρμακο που μπορεί εύκολα να διεισδύσει στο BBB, όπως φαίνεται σε μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια και ανθρώπους [30, 38, 39]. Παρακολουθήσαμε τη συσσώρευση PBT434 σε hBMVEC που αναπτύχθηκε σε μονοστιβάδες χρησιμοποιώντας PBT434 σημασμένο με 14C ως ραδιοϊχνηλάτη. Τα δεδομένα έδειξαν ότι στην πρώτη φάση, το 14C-PBT434 εξισορροπήθηκε γρήγορα μεταξύ του μέσου πρόσληψης και της κυψέλης. Αυτή η αρχική πρόσληψη ακολουθήθηκε από μια πρόσθετη αργή συσσώρευση σε διάστημα 3 ωρών, η οποία εμφάνισε ρυθμό 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (Σχήμα 3Α). Στο πρωτόκολλο πρόσληψης, η πρόσληψη σβήνει και τα κύτταρα πλένονται στους 4˚C πριν από την επεξεργασία για συσσώρευση 14C-PBT434 (Μέθοδοι). Σε ένα ξεχωριστό πείραμα, εξετάσαμε την εκροή του 14C-PBT434 από το hBMVEC μετά από μια περίοδο φόρτωσης 30 λεπτών. Στο πρωτόκολλο εκροής, τα κύτταρα πλένονται στους 25°C. Τα δεδομένα στο Σχήμα 3Β δείχνουν ότι στην πλύση στους 25°C, χάθηκε περίπου το 92 τοις εκατό του συσσωρευμένου σε κύτταρα 14C-PBT434 (βλ. 550 pmol 14C-PBT434/mg πρωτεΐνης σε 3Α στα 30 λεπτά έως 43 pmol 14C-PBT434 πρωτεΐνη στο t=0 στο 3B). Υπήρξε μια περαιτέρω αργή απώλεια του υπόλοιπου 14C-PBT434 (Εικ. 3Β). Τα δεδομένα υποδηλώνουν δύο πτυχές της συσσώρευσης και της εκροής του PBT434 από το hBMVEC. Η ροή κατά μήκος της πλασματικής μεμβράνης φθάνει γρήγορα σε αυτό που φαίνεται να είναι μια ισορροπία είτε κατά τη διάρκεια της πρόσληψης είτε κατά την εκροή. Ωστόσο, και στις δύο διαδικασίες, εμφανίζεται μια άλλη πιο αργή διαδικασία. Αυτό υποδηλώνει ότι εντός του κυττάρου, κάποιο κλάσμα του κυττάρου PBT434 βρίσκεται σε μια τοποθεσία/κατάσταση που βρίσκεται σε σχέση κινητικής σταθερής κατάστασης με το κλάσμα σε ισορροπία με το εξωκυτταρικό περιβάλλον. Η κινητική ανάλυση που σημειώνεται στο Σχήμα 3Β υπολόγισε ότι αυτή η δεξαμενή PBT434 αντιπροσωπεύεται από 27±4 pmol/mg πρωτεΐνης στο κυτταρόλυμα όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντιδραστήριο 20 μΜ.

Για να εξετάσουμε τη διακυτταρική ροή του PBT434, χρησιμοποιήσαμε ένα καλά επικυρωμένο in vitro μοντέλο BBB χρησιμοποιώντας το έχουν αναπτυχθεί στην κορυφαία πλευρά μιας μεμβράνης διακυψελίδων [35, 36, 40, 41]. Οι ιδιότητες φραγμού αυτών των καλλιεργειών διακυψελίδων επαληθεύτηκαν με ποσοτικό προσδιορισμό της διαενδοθηλιακής ηλεκτρικής αντίστασής τους (TEER) και της αδιαπερατότητάς τους στη δεξτράνη σημασμένη με FITC (Σχήμα S1). Συγκρίναμε την πρόσληψη του 14C-PBT434 στην αυλή (ή στην κορυφή, στην πλευρά του αίματος) (Εικ. 4Α) με την πρόσληψη στην κοιλιακή (ή στη βασοπλευρική, πλευρά του εγκεφάλου) (Εικ. 4C). Στο ίδιο πείραμα, η αντίστοιχη εκροή (διακυτταρική ροή) ποσοτικοποιήθηκε με την εμφάνιση του 14C-PBT434 στον θάλαμο εκροής (Σχ. 4 πίνακες Β και Δ). Οι ρυθμοί αυτών των διεργασιών παρέχονται στον Πίνακα 1. Τα δεδομένα μάζας που απεικονίζονται στο Σχήμα 4 (πίνακες Β και Δ) δείχνουν ότι η καθαρή ροή του PBT434 σε αυτό το μοντέλο αιματοεγκεφαλικού φραγμού ήταν η ίδια στις δύο κατευθύνσεις. Υπήρχαν 976±185 pmol 14C-PBT434 συσσωρευμένα στον βασικό θάλαμο (Σχήμα 4Β) και 1033±210 pmol ποσοτικοποιήθηκαν στον βασικό θάλαμο (Σχήμα 4D). Αυτή η σχεδόν ισοδυναμία αντικατοπτρίστηκε επίσης στους πολύ παρόμοιους ρυθμούς εκροής PBT434 στις δύο μεμβράνες φραγμού (Πίνακας 1). Ωστόσο, υπήρξε σημαντικά μεγαλύτερη πρόσληψη του PBT434 στη βασοπλευρική μεμβράνη σε αυτό το μοντέλο φραγμού, όπως φαίνεται από την ~50 τοις εκατό μεγαλύτερη απώλεια ένωσης από τον βασικό θάλαμο (Εικ. 4C) που αντιστοιχούσε σε ~40 τοις εκατό μεγαλύτερο ρυθμό φαινομενικής πρόσληψης κυττάρων (Τραπέζι 1). Μια πιο ισχυρή πρόσληψη θα προβλεπόταν ότι θα είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερη συσσώρευση. Η ανάλυση των κυττάρων στις 3 ώρες έδειξε ότι διατήρησαν ~ 6 μM PBT434 ανεξάρτητα από την κατεύθυνση ροής. Οι τιμές ήταν 8,1± 1,3 μM (κορυφαία προς βασική) και 4,7±1,2 μΜ (βασική έως κορυφαία). Όπως σημειώθηκε παραπάνω, αυτή η ανάλυση ακολουθεί την πλύση των κυττάρων πριν από τη λύση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης και του 14C-PBT434. Επιπλέον, το μέσο στον κορυφαίο θάλαμο περιείχε RPMI συν 10 τοις εκατό FBS και 10 τοις εκατό NuSerum ενώ ο βασικός θάλαμος «εγκεφάλου» περιείχε μόνο RPMI (Μέθοδοι). Ένα εύλογο συμπέρασμα ήταν ότι η μεγαλύτερη «πρόσληψη» στη βασική μεμβράνη αντανακλούσε μια προσρόφηση στην κυτταρική επιφάνεια του PBT434 που περιοριζόταν στον κορυφαίο θάλαμο από την παρουσία πρωτεϊνικών συστατικών στον ορό. Κατά το πλύσιμο των κυττάρων για συσσώρευση PBT434, αυτό το προσροφημένο υλικό (που καταχωρήθηκε ως «πρόσληψη») αφαιρέθηκε. Η επανάληψη αυτού του πειράματος ροής αλλά με ορό στον βασικό θάλαμο έδειξε ότι, πράγματι, ο ορός κατέστειλε αυτή την πιθανή προσρόφηση PBT434 στην επιφάνεια του κυττάρου (Σχήμα S2).

3. Το PBT434, σε αντίθεση με το διπυριδύλιο, δεν περιορίζει την ενδοκυτταρική διαθεσιμότητα ασταθούς σιδήρου

Δεδομένου ότι το PBT434 έχει μια πιο μέτρια συγγένεια για τον σίδηρο σε σύγκριση με τους κλασικούς χηλικούς παράγοντες σιδήρου όπως η δεφεριπρόνη ή το διπυριδύλιο, εξετάσαμε πώς αυτή η διαφορά αντικατοπτρίστηκε στην επίδραση PBT434 στο κυτταρικό ασταθές δεξαμενή σιδήρου (LIP) του hBMVEC. Για να το κάνουμε αυτό, εκμεταλλευτήκαμε το διαπερατό, Fe^{2 συν}-ειδική φθορίζουσα χρωστική FerroOrange, η οποία αντιδρά με τον φιλανθρωπικό κυτταροπλασματικό σίδηρο. Είδαμε μια σημαντική κατάλυση φθορισμού στα κύτταρα όταν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διπυριδύλιο, σύμφωνο με τη χηλοποίηση του LIP από αυτόν τον υψηλής συγγένειας χηλικό σίδηρο και εμποδίζοντας έτσι τη δράση του δείκτη φθορίζοντος σιδήρου (Εικ. 5Α). Αντίθετα, το PBT434 δεν ανταγωνίστηκε τη FerroOrange για τον Fe^{2 συν}, μια συμπεριφορά που συνάδει με την πιο μέτρια συγγένειά της [30]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το PBT434, αλλά όχι το PBT434-met ανενεργό παράγωγο, προκάλεσε αύξηση 34 ± 9 τοις εκατό στον προσβάσιμο σε FerroOrange Fe^{2 συν}υποδηλώνοντας ότι αυτός ο χηλικός παράγοντας κινητοποίησε τον σίδηρο μέσα στο κύτταρο χωρίς ταυτόχρονη τοξικότητα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται παρακάτω υποδηλώνουν ότι αυτός ο σίδηρος προήλθε από τη φερριτίνη.

Το PBT434 είχε αποδειχθεί προηγουμένως ότι αποκαθιστά την έκφραση της εξαντλημένης πρωτεΐνης φερροπορτίνης σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MPTP σε επίπεδο παρόμοιο με αυτό των μη αλλοιωμένων ποντικών [30]. Αυτό το αποτέλεσμα, μαζί με την αύξηση της ενδοκυτταρικής χρώσης με σιδηρούχο σίδηρο σε απόκριση στο PBT434, πρότεινε μια πιθανή επίδραση στο κυτταρικό σύστημα απόκρισης σιδήρου και στη λειτουργία των κατάντη πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον σίδηρο. Για να εκτιμηθεί αυτό, πραγματοποιήσαμε πρώτα ποσοτική ανάλυση PCR (qPCR) της επίδρασης PBT434 στην αφθονία των μεταγραφών για αρκετές πρωτεΐνες που χειρίζονται σίδηρο (Εικ. 6). Ενώ οι μεταγραφές για την πρωτεΐνη εκροής σιδήρου, τη φερροπορτίνη (Fpn) και τους δύο κυτταροπλασματικούς συνοδούς σιδήρου, PCBP1 και 2 δεν επηρεάστηκαν, η αφθονία των mRNAs για τον υποδοχέα τρανσφερίνης (TfR) και τη φερροοξειδάση, σερουλοπλασμίνη (Cp), δεν επηρεάστηκε. αλλαγή. Οι μεταγραφές TfR και Cp αυξήθηκαν κατά 2,8 και 3.{13}}φορές, αντίστοιχα. Η έκφραση του υποδοχέα τρανσφερρίνης (TfR) συνδέεται με το σύστημα που ανταποκρίνεται στο σίδηρο (IRE)/ρυθμιστική πρωτεΐνη σιδήρου (IRP) [42-44]. Η αύξηση στο TfR mRNA υποδηλώνει ότι το PBT434 ανταγωνίζεται την εξαρτώμενη από το PCBP{18}}παροχή σιδήρου για τη συναρμολόγηση του συμπλέγματος Fe, S που μετατρέπει το ρυθμιστικό IREBP από πρωτεΐνη που δεσμεύει RNA σε κυτοσολική ακονιτάση [45]. Έτσι, το PBT434 μετατοπίζει αυτή τη ρυθμιστική διαμόρφωση προς τη δέσμευση RNA και την αντίστοιχη αναστολή της αποικοδόμησης του TfR mRNA. Σε ανεπάρκεια κυτταρικού σιδήρου, η έκφραση της Cp, εν μέρει, ρυθμίζεται από το HIF-1 [46]. Μια αύξηση στη λειτουργία του HIF-1 προκύπτει από την εξουδετέρωση της υδροξυλίωσής του από τη δραστηριότητα της προλυλ υδροξυλάσης σε μια αντίδραση που εξαρτάται από τον σίδηρο [47]. Όπως και στην περίπτωση του IREBP, το PBT434 φαίνεται να μειώνει τη δεξαμενή σιδήρου που χρησιμεύει ως συμπαράγοντας στην υδροξυλίωση και αποικοδόμηση του HIF{31}}. Σε αυτό το μοντέλο, η αύξηση στο επίπεδο σταθερής κατάστασης αυτού του μεταγραφικού ενεργοποιητή αυξάνει τη μεταγραφή Cp.

Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό ανάλυσης ELISA και western blotting, διερευνήσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών που χειρίζονται τον σίδηρο σε PBT434 ή PBT434-met hBMVEC. Παραδείγματα των αναλύσεων WB δίνονται στο Σχήμα 7Α. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η αφθονία του μονομερούς και του διμερούς TfR αυξήθηκε σημαντικά κατά 24 ώρες όπως και η Cp (Σχήμα 7Β και 7C). Και οι δύο αυξήσεις ήταν παράλληλες με την εξαρτώμενη από PBT434-αύξηση στις αντίστοιχες μεταγραφές (Εικ. 6), Αντίθετα, η έκφραση της πρωτεΐνης εκροής σιδήρου, Fpn, δεν ήταν ευαίσθητη στη θεραπεία με PBT434 (Εικ. 7D).

Χρησιμοποιήσαμε την ELISA ως πρόσθετη μέθοδο για να ποσοτικοποιήσουμε τις αλλαγές αναδίπλωσης που υποδεικνύονται από τα δεδομένα western blot. Έτσι, τα hBMVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PBT434 για 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης κυττάρων προσδιορίστηκαν με ELISA για TfR (Σχήμα 8Α). Η πολλαπλάσια αύξηση στο TfR σε απόκριση στη θεραπεία με PBT434 που ποσοτικοποιήθηκε με ELISA ήταν ισοδύναμη με εκείνη που παρέχεται από την ανάλυση των κηλίδων western (Σχήμα 7Β). Η ELISA χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αξιολόγηση της αφθονίας της εκκρινόμενης και της συνδεδεμένης με GPI πρωτεΐνης Cp, χρησιμοποιώντας κύτταρα HepG2 ως θετικό έλεγχο. Όσον αφορά το Cp που εκκρίνεται σε μέσα ανάπτυξης, αυτή η προσέγγιση ήταν περιορισμένη στο ότι η αφθονία sCp και στα ρυθμισμένα μέσα HepG2 και hBMVEC ήταν στο ή κάτω από το χαμηλότερο όριο ευαισθησίας αυτής της ανάλυσης (Σχήμα S3). Ωστόσο, επέτρεψε την αξιολόγηση της αφθονίας του GPI-Cp. Σε αυτή τη μέθοδο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ειδική για τη φωσφατιδυλινοσιτόλη φωσφολιπάση C (PI-PLC), η οποία διασπά την άγκυρα GPI. το μέσο που ρυθμίστηκε έτσι συγκεντρώθηκε και αναλύθηκε με το Cp-ELISA. Ενώ αυτή η προσέγγιση έδειξε ότι το PBT434 αύξησε την ποσότητα του GPI-Cp στα κύτταρα HepG2, και πάλι απέτυχε να ανιχνεύσει οποιοδήποτε Cp που απελευθερώθηκε από το PI-PLC (Σχήμα 8Β). Η ELISA έδωσε επίσης μια άμεση μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της φερριτίνης. Για να γίνει αυτό, τα hBMVEC φορτώθηκαν με 1 uM κιτρικό σίδηρο για 24 ώρες, ακολουθούμενη από επεξεργασία απουσία ή παρουσία PBT434 για επιπλέον 1 ώρα. Τα προκύπτοντα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ELISA για φερριτίνη (Σχήμα 8C). Σε αντίθεση με την αύξηση του TfR, η θεραπεία με PBT434 κατέρριψε την πρωτεΐνη φερριτίνης (Ft) κατά ~18 τοις εκατό. Πράγματι, αυτή η απώλεια πρωτεΐνης Ft ήταν εμφανής μετά από μόνο 1 ώρα θεραπείας με το αντιδραστήριο. Η χρονική φύση αυτού του αποτελέσματος μπορεί να συσχετιστεί με την αύξηση του φιλανθρωπικού Fe2 plus που σημειώθηκε παραπάνω μετά από θεραπεία 30 λεπτών με PBT434. Όπως συζητήθηκε αργότερα, η καταστροφή της φερριτίνης έχει αποδειχθεί μετά από θεραπεία με άλλους κυτταροδιαπερατούς Fe2 συν χηλικούς παράγοντες [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 συν}Η πρόσληψη αναστέλλεται από τη συμπλοκοποίηση με PBT434

Δεδομένης της ταχείας εξισορρόπησης του PBT434 στο hBMVEC εντός 30 λεπτών, σε σύγκριση με την αργή, διφασική πρόσληψη και εξισορρόπηση του Fe2 συν για 24 ώρες [49], υποθέσαμε ότι το PBT434 και το Fe2 plus δεν μοιράζονταν τον ίδιο μηχανισμό πρόσληψης. Για να ελεγχθεί αυτό, οι μονοστοιβάδες επωάστηκαν με ραδιοσημασμένο 55Fe2 plus απουσία ή παρουσία PBT434 ή PBT{10}}met και παρακολουθήθηκε η πρόσληψη 55Fe2 συν σε διάστημα 3 ωρών (Εικ. 9Α). Το PBT434 μείωσε σημαντικά τον ρυθμό πρόσληψης 55Fe2 συν, καθώς και μείωσε τη συνολική συσσώρευση του 55Fe2 συν στα κυτταρολύματα (Εικ. 9C). Αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε με το PBT434-. Η σύγκριση των ρυθμών πρόσληψης PBT434 με 55Fe δείχνει ότι το PBT434 και το Fe2 plus απορροφώνται από ξεχωριστές οδούς μεταφοράς. Επιπλέον, η αναστολή της πρόσληψης 55Fe παρουσία PBT434 αλλά όχι PBT434-met υποδηλώνει ότι ένα εξωκυτταρικό σύμπλεγμα PBT434-σιδήρου δεν είναι πρόσδεμα για τους μεταφορείς σιδήρου στο hBMVEC, δηλαδή το ZIP8, και ZIP14.

Συμπληρώματα Cistanche

Για να εξετάσουμε περαιτέρω τον ρόλο του PBT434 στη συσσώρευση σιδήρου, δοκιμάσαμε την επίδραση που είχε η προέκθεσή του στην πρόσληψη 55Fe2 συν. Κύτταρα που είχαν υποβληθεί σε προεπεξεργασία με PBT434 τα οποία, μετά το πλύσιμο, εκτέθηκαν σε 55Fe2 plus εμφάνισαν αύξηση στον ρυθμό πρόσληψης και συσσώρευσης 55Fe2 συν μετά από 3 ώρες (Σχήμα 9, πλαίσια Β και Δ). Αυτή η αυξημένη συσσώρευση διατηρήθηκε για τουλάχιστον 24 ώρες. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η προέκθεση των κυττάρων στο PBT434 ενισχύει παροδικά την πρόσληψη σιδήρου. Απροσδόκητα, η προεπεξεργασία με PBT{14}}εμφάνισε επίσης αύξηση τόσο στην πρόσληψη όσο και στη συσσώρευση (Εικ. 9Β), αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν τόσο σημαντικό ή επίμονο όσο αυτό που δείχνει το PBT434.

Δείξαμε ότι η πρόσληψη σιδήρου από την 59Fe-τρανσφερρίνη υποστηρίζεται από τη μείωση του σιδήρου και τη διείσδυση σιδήρου στην πλασματική μεμβράνη του have [50, 51]. Ένα πειραματικό αποτέλεσμα για την υποστήριξη αυτού του μοντέλου πρόσληψης σιδήρου TBI ήταν η καταστολή αυτής της πρόσληψης μέσω αναστολής της εξωκυτταροπλασματικής δραστηριότητας φερριρεδουκτάσης. Ένα άλλο αποτέλεσμα ήταν μια αναστολή κατά 60 τοις εκατό της πρόσληψης σιδήρου TBI από τη φερροζίνη, έναν ισχυρό χηλικό παράγοντα σιδήρου [50]. Αυτή η τελευταία στρατηγική χρησιμοποιήθηκε για να αποδειχθεί ότι το PBT434, αλλά όχι το PBT{10}}ανέστειλε επίσης την πρόσληψη σιδήρου TBI (Εικ. 10).

5. Το PBT434 διεγείρει την εξαρτώμενη από το Fpn εκροή 55Fe2 συν

Το PBT434 έχει περίπου το 20 τοις εκατό της ικανότητας της δεφεριπρόνης να παράγει μια εμφανή διέγερση Fe2 συν εκροή από νευρωνικά κύτταρα [30]. Αξιολογήσαμε την εκροή 55Fe2 συν από hBMVEC απουσία ή παρουσία PBT434 σε κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με μια μίνι-εψιδίνη, PR73. Η εψιδίνη είναι μια πεπτιδική ορμόνη που βρίσκεται τόσο συστηματικά όσο και στο διάμεσο διάμεσο του εγκεφάλου που συνδέεται με το Fpn και στοχεύει τον μεταφορέα για αποικοδόμηση. Οι επιδράσεις της εψιδίνης στη λειτουργία εξαγωγής σιδήρου του Fpn έχουν μελετηθεί εκτενώς [52-54]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η εκροή Fe2 plus από το hBMVEC εξαρτάται από το Fpn [35, 49]. Το PR73 έχει EC50 ~4 nM για αποικοδόμηση Fpn σε μια δοκιμασία αναφοράς GFP [55]. Το hBMVEC σε μονοστιβάδες φορτώθηκε με 55Fe2 συν για 24 ώρες απουσία ή παρουσία PR73. Η εκροή 55Fe στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε σε μια περίοδο 5 ωρών με συνεχιζόμενη απουσία ή παρουσία PR73 σε συνδυασμό με την απουσία και την παρουσία PBT434 (Σχήμα 11). Ενώ το PR73 κατέστειλε την εκροή 55Fe τόσο από τις καλλιέργειες ελέγχου όσο και από τις καλλιέργειες που έλαβαν θεραπεία434-PBT, το PBT434 κατέστειλε εν μέρει την αναστολή λόγω της μίνι-εψιδίνης. Ελλείψει PBT434, η εκροή σιδήρου από τις καλλιέργειες που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PR{35} μειώθηκε κατά ~75 τοις εκατό ενώ το knockdown στις καλλιέργειες που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBT434- ήταν μόνο ~50 τοις εκατό (Εικόνα 11 και Πίνακας 2). Από αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να εξαχθούν δύο συμπεράσματα. Πρώτον, η πτώση του Fpn από το PR73 ρυθμίζει προς τα κάτω την εκροή 55Fe παρουσία καθώς και απουσία PBT434. Δεύτερον, υπό οποιαδήποτε από τις δύο συνθήκες, το PBT434 υποστηρίζει μια σημαντική αν και μικρή διέγερση της εκροής σιδήρου.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Συνθετικοί και φυσικοί χηλικοί παράγοντες σιδήρου: θεραπευτική δυνατότητα και κλινική χρήση. Future Med Chem. 2009; 1(9):1643–70.

2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. New Perspectives in Iron Chelation Therapy for the Treatment of Neurodegenerative Diseases. Φαρμακευτικά (Βασιλεία). 2018; 11(4):109.

3. Tosato M, Di Marco V. Θεραπεία χηλίωσης μετάλλων και νόσος του Πάρκινσον: Κριτική ανασκόπηση σχετικά με τη θερμοδυναμική του σχηματισμού συμπλόκου μεταξύ των σχετικών ιόντων μετάλλων και των υποσχόμενων ή καθιερωμένων φαρμάκων. Βιομόρια. 2019; 9(7).

4. Hedera P. Ενημέρωση για την κλινική διαχείριση της νόσου του Wilson. Appl Clin Genet. 2017; 10:9–19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Συγκριτική αποτελεσματικότητα και ασφάλεια της δεφεροξαμίνης, της δεφεριπρόνης και της δεφερασιρόξ σε σοβαρή θαλασσαιμία: μια μετα-ανάλυση 16 τυχαιοποιημένων ελεγχόμενων δοκιμών. PLoS One. 2013; 8(12):e82662.

6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Καταλυτικά μέταλλα, ασκορβικό και ελεύθερες ρίζες: συνδυασμοί προς αποφυγή. Radiat Res. 1996; 145(5):532–41. PMID: 8619018

7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Μόρια. 2019; 24(8).

8. Ashraf A, Clark M, So PW. The Aging of Iron Man. Μπροστινοί Γηράνοντες Νευροσκοί. 2018; 10:65.

9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder Μ, et αϊ. Χαρτογράφηση R2* για σίδηρο εγκεφάλου: συσχετίσεις με τη γνωστική λειτουργία στην κανονική γήρανση. Neurobiol Aging. 2015; 36(2):925–32.

10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Σίδηρος, γήρανση του εγκεφάλου και νευροεκφυλιστικές διαταραχές. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.

11. Di Meo I, Tiranti V. Ταξινόμηση και μοριακή παθογένεση των συνδρόμων NBIA. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.

12. Levi S, Finazzi D. Νευροεκφυλισμός με συσσώρευση σιδήρου στον εγκέφαλο: ενημέρωση για παθογόνους μηχανισμούς. Front Pharmacol. 2014; 5:99–.

13. Levi S, Tiranti V. Νευροεκφυλισμός με Διαταραχές Συσσώρευσης Σιδήρου στον Εγκέφαλο: Πολύτιμα Μοντέλα Με στόχο την Κατανόηση της Παθογένεσης της Εναπόθεσης Σιδήρου. Φαρμακευτικά (Βασιλεία). 2019; 12(1).

14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Νευροεκφυλισμός με Συσσώρευση Σιδήρου στον Εγκέφαλο: Γενετική Ποικιλότητα και Παθοφυσιολογικοί Μηχανισμοί. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257–79.

15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Νευροεκφύλιση με συσσώρευση εγκεφάλου σιδήρου: μια επισκόπηση. Iran J Child Neurol. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi Α, Orellana DI, Santambrogio Ρ, Rubio Α, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Η μοντελοποίηση βλαστοκυττάρων της νευροφερριτινοπάθειας αποκαλύπτει τον σίδηρο ως καθοριστικό παράγοντα της γήρανσης και της φερρόπτωσης κατά τη γήρανση των νευρώνων. Αναφορές Βλαστοκυττάρων. 2019; 13(5):832–46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Iron and Alzheimer's Disease: From Pathogenesis to Therapeutic Implications. Μπροστινοί Νευροσκοί. 2018; 12:632.

18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Ο ρόλος του σιδήρου στην αταξία του Friedreich: Insights From Studies in Human Tissues and Cellular and Animal Models. Μπροστινοί Νευροσκοί. 2019; 13:75.

19. Puschmann A. Νέα γονίδια που προκαλούν κληρονομική νόσο του Πάρκινσον ή παρκινσονισμό. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Στοχεύοντας τον μεταβολισμό του σιδήρου στην ανακάλυψη και παράδοση φαρμάκων. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.

21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Επιπολασμός της αναιμίας σε άτομα 65 ετών και άνω στις Ηνωμένες Πολιτείες: στοιχεία για υψηλό ποσοστό ανεξήγητης αναιμίας. Αίμα. 2004; 104 (8):2263–8.

22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Θεραπεία Deferasirox, deferiprone και desferrioxamine σε μείζονες ασθενείς με θαλασσαιμία: καρδιακός σίδηρος και σύγκριση λειτουργίας που προσδιορίζεται με ποσοτική απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού. Αιματολογικά. 2011; 96(1):41–7.

23. Pandolfo Μ, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich Α, et αϊ. Δεφεριπρόνη στην αταξία Friedreich: μια 6-μηνιαία τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή. Ann Neurol. 2014; 76(4):509–21.

24. Martin-Bastida Α, Ward RJ, Newbould R, Piccini Ρ, Sharp D, Kabba C, et αϊ. Χηλίωση εγκεφάλου σιδήρου από δεφεριπρόνη σε τυχαιοποιημένη διπλά τυφλή ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική δοκιμή φάσης 2 στη νόσο του Πάρκινσον. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault Μ, Laloux C, et αϊ. Στόχευση χηλικού σιδήρου ως θεραπευτική μέθοδος στη νόσο του Πάρκινσον. Σήμα αντιοξειδωτικής οξειδοαναγωγής. 2014; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et αϊ. Μεταβολικά προφίλ ούρων σε ανθρώπους και αρουραίους με 1,2-διμεθυλ- και 1,2-διαιθυλ-υποκατεστημένη 3-υδροξυπυριδίνη-4-. Μεταβολισμός και διάθεση φαρμάκων. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges Α, et αϊ. Δεφεριπρόνη: Παν-εκλεκτική Μελέτη Σχέσεων Δραστικότητας και Δομικής Δραστηριότητας Αναστολής της Απομεθυλάσης Λυσίνης Λυσίνης Λυσίνης. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. Πρόσφατες εξελίξεις επικεντρώθηκαν στους από του στόματος ενεργούς χηλικούς παράγοντες σιδήρου. Αναφορές Θαλασσαιμίας. 2014; 4 (2).

29. Kosman DJ. Μεταβολισμός σιδήρου στα αερόβια: διαχείριση της υδρόλυσης σιδήρου και της αυτοοξείδωσης του σιδήρου. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.

30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera Α, Masters CL, et al. Η νέα ένωση PBT434 αποτρέπει τον νευροεκφυλισμό που προκαλείται από σίδηρο και την τοξικότητα της άλφα-συνουκλεΐνης σε πολλαπλά μοντέλα της νόσου του Πάρκινσον. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.

31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, συντάκτες. Το PBT434 Διατηρεί τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, μειώνει τον ολιγομερισμό της άλφα-συνουκλεΐνης και βελτιώνει την κινητική λειτουργία σε ένα μοντέλο διαγονιδιακής ατροφίας πολλαπλού συστήματος ποντικού. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ ΗΠΑ.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Από τους βασικούς μηχανισμούς στην πειραματική θεραπευτική. Σχετική Διαταραχή Παρκινσονισμού. 2020; 73:94–104.

33. Dawson VL, Dawson ΤΜ. Υποσχόμενες θεραπείες τροποποίησης της νόσου για τη νόσο του Πάρκινσον. Science Translational Medicine. 2019; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Συγκριτική μελέτη τεσσάρων απαθανατισμένων ενδοθηλιακών κυτταρικών γραμμών τριχοειδούς εγκεφάλου, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 και BB19 και βελτιστοποίηση συνθηκών καλλιέργειας, για ένα in vitro μοντέλο αιματοεγκεφαλικού φραγμού για μελέτες διαπερατότητας φαρμάκων. Υγρά και Φραγμοί του ΚΝΣ. 2013; 10(1):33.

35. McCarthy RC, Kosman DJ. Η σερουλοπλασμίνη και η εψιδίνη των γλοιακών κυττάρων ρυθμίζουν διαφορικά την εκροή σιδήρου από τα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου. PLoS One. 2014; 9(2):e89003.

36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Οι φορείς διαλυμένης ουσίας ZIP8 και ZIP14 ρυθμίζουν τη συσσώρευση μαγγανίου στα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου και ελέγχουν τα επίπεδα μαγγανίου στον εγκέφαλο. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.

37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Βακτηριακή εισβολή και διακυττάρωση σε επιμολυσμένα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου εγκεφάλου. Μικρόβιο παθογόνο. 2001; 30(1):19–28.

38. Stamler D, Bradbury Μ, Wong C, Offman Ε. A First in Human Study of PBT434, a Novel Small Molecule Inhibitor of -Synuclein Aggregation (S4.001). Νευρολογία. 2019; 92(15 Συμπλήρωμα):S4.001.

39. Stamler D, Bradbury Μ, Wong C, Offman Ε. A Phase 1 Study of PBT434, a Novel Small Molecule Inhibitor of -Synuclein Aggregation, in Adult and Older Adult Volunteers (4871). Νευρολογία. 2020; 94(15 Συμπλήρωμα):4871.

40. McCarthy RC, Kosman DJ. Ενεργοποίηση της έκφρασης σερουλοπλασμίνης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος C6 από γειτονικές ιντερλευκίνες που προέρχονται από ενδοθήλιο ανθρώπινου εγκεφάλου σε ένα in vitro σύστημα μοντέλου αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Επικοινωνία κυψέλης και σηματοδότηση: CCS. 2014; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. Το sAPP ρυθμίζει την εκροή σιδήρου από τα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου σταθεροποιώντας τη φερροπορτίνη εξαγωγέα σιδήρου. Αναφορές EMBO. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Regulation of Mammalian Iron Metabolism. Κύτταρο. 2010; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Zhou ZD, Tan EK. Σηματοδοτική οδός ρυθμιστικής πρωτεΐνης σιδήρου (IRP) που ανταποκρίνεται στο σίδηρο (IRE) σε ανθρώπινες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Μοριακός Νευροεκφυλισμός. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s{10}} PMID: 29061112

44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Ο μεταβολισμός του εγκεφάλου σιδήρου και η διαταραχή του σε νευρολογικές παθήσεις. J Neural Transm. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Ένα σύμπλεγμα συνοδηγού PCBP1-BolA2 παρέχει σίδηρο για συγκρότημα συστάδων κυτταροπλασμάτων [2Fe-2S]. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Ο ρόλος του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα-1 στη μεταγραφική ενεργοποίηση της σερουλοπλασμίνης από έλλειψη σιδήρου. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.

47. Strowitzki MJ, Cummins ΕΡ, Taylor CT. Υδροξυλίωση πρωτεϊνών από υδροξυλάσες που προκαλείται από υποξία (HIF): Μοναδική ή Πανταχού παρούσα; Κύτταρα. 2019; 8(5).

48. De Domenico Ι, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et αϊ. Η κινητοποίηση του σιδήρου φερριτίνης που προκαλείται από τη φερροπορτίνη προηγείται της αποικοδόμησης της φερριτίνης από το πρωτεάσωμα. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.

49. McCarthy RC, Kosman DJ. Η δράση της φερροπορτίνης και της εξωκυτταροπλασματικής φερροοξειδάσης απαιτούνται για την εκροή σιδήρου από μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου. The Journal of Biological Chemistry. 2013; 288(24):17932–40.

50. McCarthy RC, Kosman DJ. Μηχανιστική ανάλυση συσσώρευσης σιδήρου από ενδοθηλιακά κύτταρα του ΒΒΒ. Βιομέταλλα. 2012; 25(4):665–75.

51. Kosman DJ. Το τέλος της αναγωγής και της μεταλλοοξείδωσης στη διακίνηση ευκαρυωτικού σιδήρου και χαλκού. Μεταλλικά. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Η ανάλυση δομής-λειτουργίας της φερροπορτίνης ορίζει τη θέση δέσμευσης και έναν εναλλακτικό μηχανισμό δράσης της εψιδίνης. Αίμα. 2018; 131(8):899–910.

53. Ganz T, Nemeth Ε. Hepcidin and iron homeostasis. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.

54. Qiao Β, Sugianto Ρ, Fung Ε, Del-Castillo-Rueda Α, Moran-Jimenez MJ, Ganz Τ, et αϊ. Η επαγόμενη από την εψιδίνη ενδοκυττάρωση της φερροπορτίνης εξαρτάται από την ουβικουιτίνη της φερροπορτίνης. Cell Metab. 2012; 15(6):918–24.

55. Fung Ε, Chua Κ, Ganz Τ, Nemeth Ε, Ruchala Ρ. Οι μινιεψιδίνες που παράγονται με θειόλη διατηρούν τη βιολογική δράση. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.

Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Τμήμα Βιοχημείας, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York at Buffalo, Buffalo, NY, Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής