Μέρος 1 Διαφορές πρωτεώματος ούρων στον διαβήτη σκύλων με και χωρίς την παρουσία μικρολευκωματινουρίας

Απλή Περίληψη

Ο διαβήτης των σκύλων είναι μια σοβαρή ασθένεια, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε πολυάριθμες επιπλοκές. Υπάρχουν περιορισμένα δεδομένα για την πρωτεϊνική των ούρων σε σκύλους και καμία από την επίδραση του σακχαρώδους διαβήτη στο πρωτεϊνικό των ούρων. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να αναλύσουμε τη σύνθεση πρωτεϊνών των ούρων που συλλέγονται από υγιή ζώα και να τη συγκρίνουμε με δύο διαβητικές ομάδες (νοορμολευκωματινουρικά και μικρολευκωματινουρικά). Υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ αυτών των τριών ομάδων και πιστεύουμε ότι οι προσδιοριζόμενες πρωτεΐνες υπόσχονται ως πιθανό διαγνωστικό εργαλείο, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί αργότερα στην κλινική πράξη και για καλύτερη κατανόηση της νόσου.

Αφηρημένη

Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να αναλύσουμε τη σύνθεση πρωτεϊνών των ούρων που συλλέγονται από τα υγιή ζώα και να τη συγκρίνουμε με τις δύο διαβητικές ομάδες (διαβητικούς σκύλους με φυσιολογικό αλβουμινουρικό DM, διαβητικούς σκύλους με μικρολευκωματινουρία DM II). Προσπαθήσαμε να εντοπίσουμε πιθανές πρωτεΐνες των ούρων που θα μπορούσαν να ρυθμιστούν προς τα πάνω ή προς τα κάτω σε διαβητικούς ασθενείς ακόμη και πριν από την εμφάνιση μικρολευκωματινουρίας. Μέθοδοι: Μετά τη λήψη ούρων, πραγματοποιήσαμε δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, ακολουθούμενη από ανάλυση λογισμικού Delta2D, η οποία επέτρεψε την επιλογή και την ταυτοποίηση με φασματομετρία MALDI-TOF, στατιστικά σημαντικές διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες. Η μελέτη μας αποκάλυψε 286 κοινές πρωτεϊνικές κηλίδες σε 2D τζελ από την ομάδα των διαβητικών και της ομάδας ελέγχου. Από αυτές τις πρωτεΐνες, πέντε ταυτοποιήθηκαν θετικά από το MALDI-TOF MS. Για την περαιτέρω αξιολόγηση των πέντε διαφοροποιητικών πρωτεϊνών, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Panther για να αντιστοιχιστούν σε κατάλληλες βιολογικές διεργασίες. Συμπέρασμα: Σημαντικός αριθμός αναγνωρισμένων πρωτεϊνών παίζει ρόλο στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση - σχηματισμό κυστιδίων, δεσμούς και μεταφορά μέσω μεμβρανών. Αυτό μπορεί να υποδηλώνει ότι τα πρώτα σημάδια διαβητικής κυτταρικής δυσλειτουργίας των νεφρών μπορεί να παρατηρηθούν στη σύνθεση των ούρων πριν εμφανιστούν οποιαδήποτε κλινικά σημεία.

Λέξεις-κλειδιά

νεφρική βλάβη? διαβητική νεφροπάθεια? σκύλος σακχαρώδης διαβήτης? δείκτες ούρων? πρωτεομική.

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετε τα οφέλη του Cistanche

Εισαγωγή

Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) είναι μια σχετικά συχνή ενδοκρινοπάθεια που εμφανίζεται κυρίως σε μεσήλικες και ηλικιωμένους σκύλους [1,2]. Μπορεί να οδηγήσει σε πολυάριθμες επιπλοκές όπως αγγειοπάθεια, συστηματική υπέρταση και νεφροπάθεια [1]. Λόγω της μικρής διάρκειας ζωής τους, αυτές οι επιπλοκές εμφανίζονται σπάνια σε μικρά ζώα, αλλά είναι ικανές να προκαλέσουν σημαντική ασθένεια [3,4]. Υπάρχει επίσης έλλειψη πληροφοριών σχετικά με τη συγκέντρωση λευκωματίνης στα ούρα σε σκύλους με αυθόρμητο ΣΔ. Σε μια προηγούμενη μελέτη, το 20 τοις εκατό των διαβητικών σκύλων βρέθηκε να είναι πρωτεϊνουρικά με βάση την αναλογία πρωτεΐνης ούρων προς κρεατινίνη (UPC) > 1 και το 46 τοις εκατό ήταν υπερτασικοί [5]. Οι Mazzi et al. ανέφεραν αυξημένη συγκέντρωση λευκωματίνης στο 55 τοις εκατό των διαβητικών σκύλων, με πάνω από τους μισούς από αυτούς να έχουν ταυτόχρονη αύξηση της αναλογίας πρωτεΐνης ούρων προς κρεατινίνη (UPC) [6]. Σε μια άλλη μελέτη, ο επιπολασμός της μικρολευκωματινουρίας σε διαβητικούς ασθενείς ήταν στο ίδιο επίπεδο, επιπλέον, δύο από τους τρεις σκύλους με μικρολευκωματινουρία και φυσιολογικό UPC στην αρχική αξιολόγηση ανέπτυξαν αυξημένο UPC κατά τη διάρκεια της διαχρονικής μελέτης [4].

Urinary proteins are a promising target for detecting kidney injury. Only a minimal amount of proteins is present in normal urine, due to the mechanical barrier of the glomerulus, and the reabsorption in the proximal tubules. Urinary total protein (UTP) contains proteins originating from filtered plasma, lower urinary tract, and kidney-derived proteins. High urinary protein concentration can be a result of nephron dysfunction, as a healthy glomerular filtration barrier excludes proteins larger than 69 kDa, the molecular weight of albumin. Also, it is worth noticing that positively charged proteins pass the glomerular barrier easier than negatively charged ones. In conditions of disease, the glomerular barrier gradually collapses, allowing large amounts of proteins of high, or intermediate weight to pass into the ultrafiltrate. Proteins of small molecular weight (>69 kDa) φιλτράρονται ελεύθερα στο σπείραμα, αλλά αργότερα επαναρροφούνται από τα εγγύς σωληνάρια των νεφρών, επομένως τόσο η πρωτογενής όσο και η δευτερογενής σωληναριακή δυσλειτουργία μπορεί να οδηγήσει σε πρωτεϊνουρία [7].

Οι πρόοδοι στην πρωτεομική και μεταβολομική μελέτη έχουν ενισχύσει την ικανότητά μας να αναγνωρίζουμε χιλιάδες πρωτεΐνες και πεπτίδια στα ούρα σε μία μόνο ανάλυση—μερικοί από τους οποίους μπορεί να χρησιμεύσουν ως νέοι δείκτες. Αυτή η μεγάλης κλίμακας μελέτη πρωτεϊνών ονομάζεται πρωτεϊνομική, ενώ η μελέτη των φυσικών πεπτιδίων που παράγονται από ενδογενή δραστηριότητα πρωτεάσης ονομάζεται πεπτιδομική. Η πρωτεομική ανάλυση έχει γίνει επίσης ένα σημαντικό εργαλείο στην κτηνιατρική έρευνα [8-12]. Ο χαρακτηρισμός του πρωτεώματος των ούρων του σκύλου σε υγιείς σκύλους έχει ήδη διερευνηθεί [13]. Η πρωτεομική και η πεπτιδομική των ούρων προσθέτουν διαφορετικές διαστάσεις στη διερεύνηση της υποκείμενης βιολογίας [14]. Η εφαρμογή τους στα ούρα έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις για τη διαβητική νεφρική νόσο, δεδομένου ότι τα ούρα μπορούν να συλλεχθούν μη επεμβατικά με σχετική ευκολία και παράγονται άμεσα από τα νεφρά. Ως εκ τούτου, οι αλλαγές στη σχετική αφθονία των πρωτεϊνών και των πεπτιδίων των ούρων μπορεί να αντικατοπτρίζουν αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης, την εναπόθεση ή τον κύκλο εργασιών στο διαβητικό νεφρό [15]. Παρά την καλά ανεπτυγμένη κτηνιατρική έρευνα σχετικά με τους διαβητικούς σκύλους, οι αναφορές για μοριακές μελέτες των ούρων παραμένουν αραιές [11,13,14,16,17].

Αυτή η μελέτη στόχευε στον εντοπισμό πρωτεϊνών στα ούρα υγιών ζώων και τη σύγκρισή τους με τις δύο διαβητικές ομάδες (νοορμολευκωματινουρικοί σκύλοι και σκύλοι με μικρολευκωματινουρία). Προσπαθήσαμε να εντοπίσουμε πιθανές πρωτεΐνες των ούρων που θα μπορούσαν να ρυθμιστούν προς τα πάνω ή προς τα κάτω σε διαβητικούς ασθενείς ακόμη και πριν από την εμφάνιση μικρολευκωματινουρίας.

Συμπληρώματα Cistanche και εκχύλισμα Cistanche

Υλικά και μέθοδοι

Όλοι οι σκύλοι από έναν πληθυσμό εξωτερικών ασθενών εγγράφηκαν διαδοχικά κατά τη διετία 2018-2020 στο Καινοτόμο Κέντρο Ζωικής Παθολογίας και Θεραπείας, Σχολή Κτηνιατρικής στο Λούμπλιν. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διάρκεια τυπικών κτηνιατρικών διαγνωστικών διαδικασιών. Έτσι, σύμφωνα με την πολωνική νομοθεσία, η έγκριση από την Τοπική Επιτροπή για τη Δεοντολογία στα Πειράματα με Ζώα δεν απαιτείται, καθώς δεν υπήρχε θεραπεία, συμπεριλαμβανομένων ιατρικών, επεμβατικών διαγνωστικών ή διαδικασιών που προκαλούν ψυχολογική ή κοινωνική ενόχληση στους συμμετέχοντες. Τα πειράματα διεξήχθησαν με βάση τη νομοθεσία της Ευρωπαϊκής Ένωσης Οδηγία 2010/63/ΕΕ. Η μελέτη διεξήχθη σε συμμόρφωση με τις οδηγίες του ARRIVE. Οι ιδιοκτήτες σκύλων ενημερώθηκαν για τις μεθόδους και το σκοπό της μελέτης και έδωσαν τη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεσή τους. Η μελέτη διεξήχθη σε τρεις ομάδες σκύλων: Ομάδα ΣΔ Ι που αποτελείται από 7 φυσιολογικά λευκωματινουρικά διαβητικούς σκύλους (4 αρσενικά, 3 θηλυκά, μέση ηλικία: 7). Ομάδα DM II που αποτελείται από 7 διαβητικούς σκύλους με μικρολευκωματινουρία (3 αρσενικά, 4 θηλυκά, μέση ηλικία: 8). Η ομάδα Η αποτελείται από 7 υγιείς σκύλους (4 αρσενικά, 3 θηλυκά, μέση ηλικία: 7).

Η διάγνωση του ΣΔ διαγνώστηκε με την εύρεση επίμονης έντονης υπεργλυκαιμίας (γλυκόζη πλάσματος > 200 mg/dL, 11 mmol/L) και γλυκοζουρίας σε σκύλους με κλινικά σημεία σύμφωνα με τη νόσο (πολυουρία, πολυδιψία, απώλεια βάρους).

Επιπλέον, οι ιδιοκτήτες συμπλήρωσαν ένα τυποποιημένο ερωτηματολόγιο για να τεκμηριώσουν τις αλλαγές στην κατανάλωση νερού και τροφής, στη συχνότητα ούρησης και στη δραστηριότητα, σε σχέση με το φυσιολογικό για τα κατοικίδια ζώα τους.

Ως ομάδα μελέτης, 14 από το σύνολο των 30 διαβητικών σκύλων μικτής ράτσας που παρουσίασε ο ιδιοκτήτης ήταν επιλέξιμοι για ένταξη. Οι απαιτήσεις ένταξης ήταν: (1) προηγούμενη διάγνωση σακχαρώδους διαβήτη. (2) θεραπεία με ινσουλίνη που χορηγείται για τουλάχιστον τρεις μήνες. (3) κλινικά σταθερός διαβήτης. Κριτήρια αποκλεισμού ήταν: πρωτεϊνουρία (Αναλογία πρωτεΐνης ούρων προς κρεατινίνη > 0,5), ενεργό ίζημα ούρων, παγκρεατίτιδα, υπερδραστηριότητα των επινεφριδίων, πυώδης φλεγμονή της μήτρας και βακτηριακές φλεγμονές των νεφρών ή της ουροδόχου κύστης. Ως ομάδα ελέγχου συμπεριλήφθηκαν 7 υγιείς σκύλοι διαφορετικών φυλών. Θεωρήθηκαν υγιείς με βάση τη φυσική εξέταση, τον πλήρη αριθμό αιμοσφαιρίων, το βιοχημικό προφίλ πλάσματος και την ανάλυση ούρων. Η ομάδα ελέγχου επιλέχθηκε για να αντιστοιχιστεί ηλικιακά με την ομάδα μελέτης.

Πραγματοποιήθηκε κλινική εξέταση με μέτρηση αρτηριακής πίεσης, βιοχημικές και αιματολογικές εξετάσεις ρουτίνας και ανάλυση ούρων για κάθε σκύλο. Κάθε δείγμα αίματος συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας ένα κλειστό σύστημα κενού σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιείχε EDTA και υποβλήθηκε σε αιματολογική ανάλυση σε έναν αναλυτή Exigo Vet (Boule, Spånga, Σουηδία). Το πλάσμα που ελήφθη μετά από φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 15 λεπτά στους 4°C αναλύθηκε σε έναν αυτόματο βιοχημικό αναλυτή BS-130 (Mindray, Shenzhen, China). Το πάνελ χημείας περιελάμβανε τρανσφεράση αλανίνης, ασπαρτική αμινοτρανσφεράση, ολική χολερυθρίνη, ουρία, κρεατινίνη, αλκαλική φωσφατάση, γλυκόζη, λευκωματίνη, ολική πρωτεΐνη, αμυλάση, -γλουταμυλοτρανσφεράση. Προσδιορίστηκε επίσης η συγκέντρωση της κορτιζόλης του ορού χρησιμοποιώντας δοκιμασία χημειοφωταύγειας ενισχυμένη με ένζυμο (αναλυτής Immulite 1000). Για τους διαβητικούς σκύλους, ο γλυκαιμικός έλεγχος υπολογίστηκε με τη χρήση συγκέντρωσης φρουκτοζαμίνης ορού. Συλλέχθηκαν δείγματα ούρων με κενό ενδιάμεσο ρεύμα το πρωί και κάθε δείγμα φυγοκεντρήθηκε την ημέρα της συλλογής στα 500 × g για 10 λεπτά στους 4 ◦C. Τα υπερκείμενα αφαιρέθηκαν και προστέθηκαν αναστολείς πρωτεάσης (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, P8340, Spruce Street, Saint Louis, MO, USA.) Οι συνολικές πρωτεΐνες ούρων και η κρεατινίνη προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ σε έναν αυτόματο αναλυτή χημείας (Mindray BS{11 }}). Το UPC υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: UPC=πρωτεΐνη ούρων (mg/dL)/κρεατινίνη ούρων (mg/dL). Πραγματοποιήθηκε βασική ανάλυση ούρων με μικροσκοπική ανάλυση ιζημάτων σε νωπά δείγματα ούρων. Το ειδικό βάρος των ούρων (USG) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα διαθλασίμετρο. Η μικρολευκωματινουρία μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμής ELISA που διατίθεται στο εμπόριο (Canine Microalbuminuria Elisa Kit, My Biosource, San Diego, CA, USA). Η δοκιμή μικρολευκωματινουρίας πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η λευκωματουρία αξιολογήθηκε με την αναλογία λευκωματίνης ούρων προς κρεατινίνη (UACR) σε δείγμα ούρων φρέσκου σημείου. Τα υπόλοιπα ούρα καταψύχθηκαν στους -80 ◦C για περαιτέρω ανάλυση.

Τυποποιημένο Cistanche

Πρωτεομική Ανάλυση Ούρων

Για πρωτεομική ανάλυση, συλλέχθηκαν 7 μεμονωμένα δείγματα ούρων από την ομάδα Ι (DM I), 7 μεμονωμένα δείγματα ούρων από την ομάδα II (DM II) και 7 μεμονωμένα δείγματα ούρων από την υγιή ομάδα (Η).

Κάθε δείγμα ούρων καθαρίστηκε, αφαλατώθηκε και συμπυκνώθηκε με μονάδες φυγόκεντρου φίλτρου Amicon Ultra5 3 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με φασματοφωτόμετρο μικρο-όγκου (MaestroNano, Maestrogen, Xinzhu, Taiwan) και τα δείγματα ούρων στη συνέχεια παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση 2D. Μετά από γραφική και στατιστική ανάλυση, οι πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν κόπηκαν από το πήκτωμα για περαιτέρω ταυτοποίηση με φασματομετρία μάζας με την τεχνική MALDI-TOF MS (Ιοντισμός εκρόφησης λέιζερ με υποβοήθηση μήτρας – φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης).

1. Ηλεκτροφόρηση 2Δ

Η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση ήταν το πρώτο στάδιο της έρευνας που έχει ως αποτέλεσμα τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών των ούρων. Εν συντομία, ελήφθησαν 200 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα 17 cm μέσω κιτ καθίζησης (Ready-Prep™ 2-D Cleanup Kit, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) . Τα σφαιρίδια πρωτεΐνης διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα επανυδάτωσης (ReadyPrep 2-D Rehydration/Sample Buffer 1, BioRad, Hercules, CA, USA) και τα προκύπτοντα διαλύματα εφαρμόστηκαν σε μια πλάκα επανυδάτωσης, καλυμμένη με 17 cm ακινητοποιημένη βαθμίδα pH (IPG ) γραμμικές ταινίες για ισοηλεκτρική εστίαση (ReadyStrip IPG Strips, pH 3–10, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και ορυκτέλαιο (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Μετά από 12 ώρες επανυδάτωσης, λωρίδες με εμποτισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν στη συσκευή IEF-100 Hoefer (Hoefer IEF100, Hoefer, Inc., Holliston, MA, ΗΠΑ) για τη διεξαγωγή ηλεκτροφόρησης στην πρώτη διάσταση (συνθήκες διεργασίας: 250 V /30 λεπτά, 10,000 V/3 h, 60 kV/hr., με όριο ρεύματος 50 μΑ/λωρίδα). Στη συνέχεια, οι λωρίδες εξισορροπήθηκαν διαδοχικά σε διαλύματα 1,4-διθειοθρεϊτόλης και ιωδοακεταμιδίου ουρίας/TRIS/SDS. Κάθε βήμα εξισορρόπησης διήρκεσε 15 λεπτά. Οι ισορροπημένες λωρίδες υποβλήθηκαν στη συνέχεια στη δεύτερη διάσταση της ηλεκτροφόρησης για να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες με τις μοριακές τους μάζες σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 12,5 τοις εκατό με τις ακόλουθες παραμέτρους ρεύματος: 600 V/30 mA/100 W σε ηλεκτροφορητικό θάλαμο (PROTEAN® II xi, Bio-Rad , Hercules, CA, ΗΠΑ). Τα ληφθέντα πηκτώματα υποβλήθηκαν σε μια τυπική διαδικασία χρώσης με άργυρο με νιτρικό άργυρο παρουσία φορμαλδεΰδης. Μετά τη χρώση, οι γέλες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας το Image Scanner III (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από το λογισμικό Delta2D (έκδοση 4.7, DECODON, Greifswald, Γερμανία). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε αφού εξαιρέθηκαν χειροκίνητα τα ψευδώς θετικά και τα ψευδώς αρνητικά σημεία. Οι σαρωμένες εικόνες παραμορφώθηκαν με την τεχνολογία SmartVectors στο λογισμικό Delta2D, πράγμα που σημαίνει ότι οι κηλίδες της ίδιας πρωτεΐνης είχαν την ίδια θέση σε όλα τα τζελ του έργου. Η χρήση της παραμόρφωσης εικόνας gel επέτρεψε την εξάλειψη των διαφορών μεταξύ των εικόνων gel για την ευθυγράμμισή τους. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν παραμορφωμένες εικόνες για τη δημιουργία συγχωνευμένων εικόνων. Μια συγχωνευμένη εικόνα ανταποκρίνεται στον χάρτη πρωτεώματος που περιέχει κάθε κηλίδα πρωτεΐνης που ελήφθη σε ολόκληρο το πείραμα. Οι αναλογίες έκφρασης δημιουργήθηκαν και οι στατιστικές έγιναν σε κανονικοποιημένους όγκους με μονόδρομη ANOVA (p-value Μικρότερη από ή ίση με 0,05) και ένα post hoc συγκριτικό τεστ Tukey. Οι καθορισμένες πρωτεϊνικές κηλίδες αποκόπηκαν από τα πηκτώματα, αποχρωματίστηκαν, ανήχθησαν και αλκυλιώθηκαν χρησιμοποιώντας διαλύματα διθειοθρεϊτόλης και ιωδοακεταμιδίου. Κομμάτια γέλης που περιείχαν πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε θρυπτική πέψη για να ληφθούν πεπτιδικά θραύσματα. Η πέψη θρυψίνης έλαβε χώρα σε ρυθμιστικό διάλυμα διττανθρακικού αμμωνίου 50 mM στους 37 ◦C για 12 ώρες (Promega, Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Technical Bulletin). Τα πεπτίδια στη συνέχεια εκλούστηκαν από τα τεμάχια γέλης με διάλυμα νερού/ακετονιτριλίου/TFA (ν:ν 45:50:5) με τριπλή εκχύλιση και τα ληφθέντα εκχυλίσματα συμπυκνώθηκαν σε συνθήκες κενού (Labconco, Kansas City, ΜΟ, ΗΠΑ). Τα ληφθέντα σφαιρίδια πεπτιδίου διαλύθηκαν σε 0,1 τοις εκατό τριφθοροξικό οξύ και καθαρίστηκαν με άκρα πιπέτας C18 Zip-TIP σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Merck Chemicals, Billerica, MA, USA, PR 02358, Technical Note) και προετοιμάστηκαν για ανάλυση φασματομετρίας μάζας.

Χάπια Cistanche

2. Φασματομετρία Μάζας

Ένα μL παρασκευασμένων πεπτιδικών διαλυμάτων κηλιδώθηκε σε μια πλάκα Anchor Chip MALDI (Bruker, Bremen, Germany). Όταν τα δείγματα πρωτεΐνης στέγνωσαν, οι επιφάνειές τους καλύφθηκαν με 1 μL της μήτρας -κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέος (HCCA, Bruker, Βρέμη, Γερμανία). Πρότυπο διάλυμα πεπτιδίου (Peptide Calibration Standard II, Bruker, Bremen, Germany) επίσης κηλιδώθηκε και καλύφθηκε από τη μήτρα σε σημεία βαθμονόμησης. Τα φάσματα μάζας καταγράφηκαν σε λειτουργία ενεργού θετικού ανακλαστήρα εντός της περιοχής 700–4000 m/z χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο Ultraflextreme MALDI TOF/TOF (Bruker, Bremen, Germany) και το λογισμικό flexControl 3.3 (Bruker, Βρέμη, Γερμανία). Τα συλλεχθέντα φάσματα εξομαλύνθηκαν και η γραμμή βάσης διορθώθηκε. Δημιουργήθηκε σε λογισμικό flexAnalysis 3.0 (Bruker, Βρέμη, Γερμανία), η λίστα αιχμής για την αναλογία σήματος προς θόρυβο > 3 μεταφέρθηκε στο BioTools 3.2 (Bruker, Βρέμη, Γερμανία) και συγκρίθηκε με το λογισμικό Mascot 2.2 (Matrix Science, Boston, MA, USA) χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων Swiss-Prot περιορισμένη στην ταξινόμηση "θηλαστικών" με μέγιστο σφάλμα 0,3 Da και καρβαμιδομεθυλίωση της κυστεΐνης ως υποχρεωτική τροποποίηση. Τα αποτελέσματα με βαθμολογία Mascot πάνω από 61 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά (p Μικρότερο ή ίσο με 0,05). Διαφορετικά, τα φάσματα ιόντων θραυσμάτων των επιλεγμένων πεπτιδίων ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τον τρόπο LIFT και συνδυάστηκαν με τον στόχο της αναγνώρισης MALDI TOF/TOF.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Hoenig, M. Συγκριτικές όψεις του σακχαρώδους διαβήτη σε σκύλους και γάτες. ΜοΙ. Κύτταρο. Endocrinol. 2002, 197, 221–229.

2. Davison, LJ; Herrtage, ME; Catchpole, B. Μελέτη 253 σκύλων στο Ηνωμένο Βασίλειο με Σακχαρώδη Διαβήτη. Κτηνίατρος. Rec. 2005, 156, 467–471.

3. Ρέγγα, IP; Panciera, DL; Werre, SR Διαμήκης επιπολασμός υπέρτασης, πρωτεϊνουρίας και αμφιβληστροειδοπάθειας σε σκύλους με αυθόρμητο σακχαρώδη διαβήτη. J. Vet. Κρατώ. Med. 2014, 28, 488–495.

4. Muñana, KR Μακροχρόνιες Επιπλοκές του Σακχαρώδη Διαβήτη, Μέρος Ι: Αμφιβληστροειδοπάθεια, Νεφροπάθεια, Νευροπάθεια. Κτηνίατρος. Clin. Ν. Am. Small Anim. Πρακτική. 1995, 25, 715-730.

5. Struble, AL; Feldman, EC; Nelson, RW; Kass, PH συστηματική υπέρταση και πρωτεϊνουρία σε σκύλους με σακχαρώδη διαβήτη. Μαρμελάδα. Κτηνίατρος. Med. Αναπλ. 1998, 213, 822-825.

6. Mazzi, Α.; Fracassi, F.; Dondi, F.; Gentilini, F.; Famigli Bergamini, Π. Αναλογία Πρωτεϊνών Ουρών προς Κρεατινίνη και Λευκωματίνης προς Κρεατινίνη σε Σκύλους με Σακχαρώδη Διαβήτη και Υπεραδρενοκορτιτισμό. Κτηνίατρος. Res. Commun. 2008, 32 (Suppl. S1), S299–S301.

7. D'Amico, G.; Bazzi, C. Παθοφυσιολογία Πρωτεϊνουρίας. Kidney Int. 2003, 63, 809–825.

8. Banach, Τ.; Adaszek, Ł.; Wyłupek, D.; Winiarczyk, Μ.; Winiarczyk, S. Applicability of 2D Gel Electrophoresis and Liquid Chromatography in Proteomic Analysis of Urine Using Mass Spectrometry MALDI-TOF. Πολ. J. Vet. Sci. 2013, 16, 587–592.

9. de Freitas Campos, C.; Cole, Ν.; Dyk, DV; Walsh, BJ; Διάκος, Π.; Almeida, D.; Torrecilhas, Α.; Laus, JL; Willcox, MDP Proteomic Analysis of Dog Tears for Potential Cancer Markers. Res. Κτηνίατρος. Sci. 2008, 85, 349–352.

10. Winiarczyk, D.; Winiarczyk, Μ.; Winiarczyk, S.; Michalak, Κ.; Adaszek, Ł. Πρωτεομική Ανάλυση Δακρυϊκού Φιλμ που λήφθηκε από διαβητικούς σκύλους. Animals 2020, 10, 2416.

11. Winiarczyk, D.; Michalak, Κ.; Adaszek, L.; Winiarczyk, Μ.; Winiarczyk, S. Urinary Proteome of Dogs with Kidney Injury κατά τη διάρκεια της Babesiosis. BMC Vet. Res. 2019, 15, 439.

12. Franco-Martínez, L.; Gelemanovic', A.; Horvati'c, Α.; Contreras-Aguilar, MD; Mrljak, V.; Cerón, JJ; Martínez-Subiela, S.; Tvarijonaviciute, A. The Serum and Saliva Proteome of Dogs with Diabetes Diabetes. Anim. Open Access J. MDPI 2020, 10, 2261.

13. Brandt, LE; Ehrhart, EJ; Scherman, Η.; Olver, CS; Bohn, ΑΑ; Prenni, JE Χαρακτηρισμός του πρωτεώματος του ουροποιητικού σκύλου. Κτηνίατρος. Clin. Pathol. 2014, 43, 193–205. [CrossRef] [PubMed]

14. Ferlizza, Ε.; Isani, G.; Dondi, F.; Andreani, G.; Vasylyeva, Κ.; Bellei, Ε.; Almeida, AM; Matzapetakis, M. Urinary Proteome and Metabolome in Dogs (Canis Lupus Familiaris): The Effect of Chronic Kidney Disease. J. Proteom. 2020, 222, 103795.

15. Van, JAD; Scholey, JW; Konvalinka, A. Insights on Diabetic Kidney Disease Using Urinary Proteomics and Bioinformatics. Μαρμελάδα. Soc. Nephrol. 2017, 28, 1050–1061.

16. Nabity, MB; Lees, GE; Dangott, LJ; Cianciolo, R.; Suchodolski, JS; Steiner, JM Πρωτεομική Ανάλυση ούρων από αρσενικούς σκύλους κατά τη διάρκεια των πρώιμων σταδίων του σωληνοειδούς διάμεσου τραυματισμού σε ένα μοντέλο σκύλου προοδευτικής σπειραματικής νόσου. Κτηνίατρος. Clin. Pathol. 2011, 40, 222-236.

17. Pelander, L.; Brunchault, V.; Buffin-Meyer, Β.; Klein, J.; Breuil, Β.; Zürbig, Ρ.; Magalhães, Ρ.; Mullen, W.; Elliott, J.; Syme, Η.; et al. Αναλύσεις πεπτιδώματος ούρων για τη διάγνωση της χρόνιας νεφρικής νόσου σε σκύλους. Κτηνίατρος. J. 2019, 249, 73–79.

Dagmara Winiarczyk 1, Mateusz Winiarczyk 2, Katarzyna Michalak 3, Stanisław Winiarczyk 3 και Łukasz Adaszek 3

1 Τμήμα Εσωτερικών Παθήσεων Μικρών Ζώων, Πανεπιστήμιο Επιστημών Ζωής του Λούμπλιν, 20-400 Λούμπλιν, Πολωνία

2 Department of Vitreoretinal Surgery, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland; winiarm86@gmail.com

3 Τμήμα Επιζωοτιολογίας, University of Life Sciences of Lublin, 20-400 Lublin, Poland; artica@wp.pl (KM); genp53@interia.pl (SW); ukaszek0@wp.pl (Ł.A.)