Μέρος Πρώτο|Ένας αναστολέας του NF-κB και ένας αγωνιστής του AMPK: Πρόβλεψη δικτύου και ενσωμάτωση πολλαπλών ομικών για την εξαγωγή μονοπατιών σηματοδότησης για την ακτεοσίδη κατά της νόσου του Αλτσχάιμερ

Μέρος Πρώτο|Ακτεοσίδες: πώς να αντιμετωπίσετε τη νόσο του Αλτσχάιμερ ως ένα από τα αποτελεσματικά συστατικά του Cistanche;

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* και Fei Li1,2 * 1 Κλειδί κατάστασης Εργαστήριο Φυσικών Φαρμάκων, China Pharmaceutical University, Nanjing, China, 2 College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Κίνα

Η νόσος Alzheimer (AD) είναι ο πιο συχνός τύπος άνοιας.Ακτεοσίδη (ΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙ) είναι μια ένωση που απομονώνεται απόCistanche tubulosa, το οποίο διαθέτει εξαιρετικές νευροπροστατευτικές ιδιότητες. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός τουΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙστη ρύθμιση της μικρογλοίας, η πόλωση παραμένει ασαφής. Ως εκ τούτου, καθιερώθηκε ένα μοντέλο υπολογιστικού δικτύου για τον προσδιορισμό των οδηγών στόχωνΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙκαι προβλέψτε τον μηχανισμό του ενσωματώνοντας πολλαπλές διαθέσιμες βάσεις δεδομένων. Το μοντέλο AD που προκαλείται από AlCl3- σε προνύμφες ψαριών ζέβρα δημιουργήθηκε με επιτυχία για να καταδείξει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα του ACT. Στη συνέχεια, τα επαγόμενα από LPS κύτταρα BV-2 αποκάλυψαν τον θετικό ρόλο του ACT στην πόλωση M1/M2. Τα μονοπάτια NF-κB και AMPK επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με μεταγραφική ανάλυση, μεταβολομική ανάλυση, τεχνικές μοριακής βιολογίας και μοριακή σύνδεση. Η έρευνα παρείχε έναν μηχανισμό έγχυσης του ACT και αποκάλυψε τη σύνδεση μεταξύ μεταβολισμού και πόλωσης μικρογλοίας από την άποψη της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Το πιο σημαντικό, παρείχε μια συστηματική και ολοκληρωμένη προσέγγιση για την ανακάλυψη στόχων φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένων των αλλαγών στα γονίδια, τους μεταβολίτες και τις πρωτεΐνες.

Λέξεις-κλειδιά: ακτεοσίδη, BV-2 κύτταρα, μεταβολισμός, RNA-seq, μιτοχόνδρια, νευροφλεγμονή

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με: ali.ma@wecistanche.com

Κάντε κλικ στο Cistanche DHT για μνήμη

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Με τη γήρανση και τη ραγδαία αύξηση του πληθυσμού, ο αριθμός των περιπτώσεων άνοιας στον κόσμο παρουσιάζει ανοδική τάση.Η ασθένεια Αλτσχάϊμερ(AD) είναι μια κοινή νευροεκφυλιστική νόσος που συνοδεύεται από γνωστική εξασθένηση και δυσκινησία (Perea et al., 2020), που είναι ο πιο συχνός τύπος άνοιας. Χαρακτηρίζεται από σοβαρή νευρωνική απώλεια, γεροντικές πλάκες και νευροϊνιδικά μπερδέματα (Shiao et al., 2017). Η παθογένεια τουΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερείναι πολυδιάστατο και συνδέεται με τη νευροφλεγμονή. Η νευροφλεγμονή προκαλείται από την ενεργοποίηση των νευρογλοιακών κυττάρων, η οποία σχετίζεται στενά με την εμφάνιση και την ανάπτυξη της AD (Hanslik and Ulland, 2020· Linnerbauer and Rothhammer, 2020). Κατά την εξέλιξη και την έξαρση της νευροφλεγμονής, η μικρογλοία θεωρείται βασικός παράγοντας. Τα μικρογλοία είναι τα κύρια κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος στο κεντρικό νευρικό σύστημα, τα οποία συνδέονται στενά με μια σειρά διαδικασιών όπως η ανάπτυξη του εγκεφάλου, η διατήρηση του νευρικού περιβάλλοντος, καθώς και οι αποκρίσεις σε τραυματισμό και επιδιόρθωση (Perea et al., 2020). Επιπλέον, η μικρογλοία μπορεί να διεγερθεί σε φαινότυπο Μ1 και να αυξήσει την έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών όταν εμφανίζονται ασθένειες που σχετίζονται με νευροφλεγμονή όπως η ΝΑ (Tsukahara et al., 2020). Μελέτες δείχνουν επίσης ότι η πόλωση στον φαινότυπο Μ1 συνοδεύεται συχνά από μεταβολικές διαταραχές (Li L. et al., 2020), που οδηγούν σε ανισορροπία του ενεργειακού μεταβολισμού και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία (Agrawal and Jha, 2020). Αυτές οι ανεπιθύμητες αλλαγές προέρχονται από νευροεκφυλισμό, ακόμη και από τη νόσο του Αλτσχάιμερ.

Ακτεοσίδη (ACT), a φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο, προέρχεται κυρίως απόCistanche tubulosa. Όλο και περισσότερα στοιχεία υποδηλώνουν ότι το ACT διαθέτει πολυάριθμες φαρμακολογικές δραστηριότητες, μεταξύ των οποίωννευροπροστατευτικό(Wei et al., 2019),αντιφλεγμονώδη(Lai et al., 2019), καιαντιοξειδωτικό(Ji et al., 2019) επιδράσεις. Συγκεκριμένα, έχει αποδειχθεί ότι το Acteoside μπορείβελτίωση της μάθησης και της μνήμηςεξασθένηση καθώς και προς τα πάνω ρύθμιση του ενεργειακού μεταβολισμού σε αρουραίους που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη (Chen J. et al., 2020). Επιπλέον, μπορεί επίσης να αναστείλει τον θάνατο νευρωνικών αποπτωτικών κυττάρων και τη μιτοχονδριακή βλάβη στα πειραματικά ποντίκια με αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (Li W. et al., 2020). Ωστόσο, η επίδραση του ACT στην πόλωση των μικρογλοίων M1/M2 και ο μηχανισμός της σπάνια αναφέρονται. Μέχρι τώρα, οι μηχανισμοί όπως η επιδιόρθωση της λειτουργίας των μιτοχονδρίων και η ρύθμιση του μεταβολισμού των κυττάρων είναι ασαφείς και απαιτείται περαιτέρω επιστημονική έρευνα για να αποσαφηνιστεί ο ακριβής μηχανισμός.

Ο σκοπός της παρούσας έκθεσης είναι να διερευνήσει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα του ACT καθώς και τον υποκείμενο μοριακό μηχανισμό του ACT στην AD. Εδώ, καθιερώνεται μια συστηματική in silico μέθοδος αναγνώρισης στόχου φαρμάκου με βάση τις ενοποιημένες βάσεις δεδομένων. Διερευνούμε περαιτέρω τους πιθανούς μηχανισμούς του ACT σε μοριακό βιολογικό επίπεδο ενσωματώνοντας την αλληλουχία RNA (RNA-seq) με μεθόδους μεταβολομικής και τεχνικές μοριακής βιολογίας. Ο συνδυασμός στρατηγικών συστηματικού ελέγχου in silico, in vivo και in vitro παρέχει ένα νέο πρωτόκολλο για την αντικειμενική ανακάλυψη ενώσεων πολλαπλών στόχων της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Μοντελοποίηση Δικτύου

Τέσσερις διαδικτυακές πλατφόρμες συνδυάστηκαν για να προβλέψουν και να ανακαλύψουν τους στόχους τουΑκτεοσίδη, συγκεκριμένα, GeneCards1, προσέγγιση συνόλου ομοιότητας (SEA2 ), SwissTargetPrediction3 και PharmMapper4. Όλες οι συσχετίσεις γονιδίων της AD συλλέχθηκαν ανεξάρτητα από το DisGeNET5 και το GeneCards. Μετά την ανάλυση αλληλεπίδρασης στόχου-στόχου που διεξήχθη από τη βάση δεδομένων String6, το δίκτυο ενσωματώθηκε περαιτέρω από το λογισμικό Cytoscape (Έκδοση 3.8.2). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση εμπλουτισμού GO και KEGG στη βάση δεδομένων DAVID7 για τον σχολιασμό και την εξόρυξη του δικτύου.

Ομαδοποίηση ζώων και μοντέλων

Σε αυτή τη μελέτη επιλέχθηκαν άγριου τύπου ζέβρα (στέλεχος ΑΒ, ηλικίας 4 μηνών) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 14/10- ωρών στους 28◦C, ακολουθώντας την προηγούμενη μέθοδο (Li YQ et al., 2020). Όλα τα πειράματα με ζέβρα διεξήχθησαν υπό την επίβλεψη της Επιτροπής Δεοντολογίας των Ζώων του Φαρμακευτικού Πανεπιστημίου της Κίνας. Οι προνύμφες ψαριών ζέβρα χωρίστηκαν σε έξι ομάδες και υποβλήθηκαν σε θεραπεία από 3 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση (dpf) έως 7 dpf: ομάδα ελέγχου, ομάδα μοντέλου, ομάδα μοντέλο συν υδροχλωρική δονεπεζίλη (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) και μοντέλο συνΑκτεοσίδη(Καθαρότητα HPLC Μεγαλύτερη ή ίση με 98 τοις εκατό , Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.). Η ομάδα ελέγχου διατηρήθηκε στο μέσο με 0.2 τοις εκατό DMSO και η ομάδα μοντέλου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 150 μΜ AlCl3 (ρΗ 5,8). Το μοντέλο συν ομάδα DPZ υποβλήθηκε σε συν-κατεργασία με AlCl3 και 8 μΜ DPZ. Το μοντέλο συνΑκτεοσίδηομάδες υποβλήθηκαν σε συν-θεραπεία με AlCl3 και διαφορετικές συγκεντρώσεις ACT (200, 100 και 50 μΜ).

Ανάλυση Συμπεριφοράς

Οι κινήσεις των προνυμφών Zebrafish καταγράφηκαν από έναν αναλυτή συμπεριφοράς ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) στους 28◦C. Εν συντομία, οι παράμετροι συμπεριφοράς και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων ήταν συνεπείς με τη μέθοδο που καθορίσαμε νωρίτερα (Li YQ et al., 2020). Εδώ, η μέση ταχύτητα (AS), η αλλαγή ταχύτητας (1S), ο ρυθμός ανάκτησης δυσκινησίας (DRR) και η αποτελεσματικότητα απόκρισης (RE, τοις εκατό) επιλέχθηκαν για την αξιολόγηση της ανάκτησης δυσκινησίας σε ζέβρα.

Προσδιορισμός Δραστικότητας Ακετυλοχολινεστεράσης και Χολίνης Ακετυλοτρανσφεράσης

Μετά από επεξεργασία από 3 έως 7 dpf, συλλέχθηκαν προνύμφες ψαριών ζέβρα για να μετρηθούν οι δραστηριότητες της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) και της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης (ChAT). Με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, η δραστηριότητα ανιχνεύθηκε από τα κιτ ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμα (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Σαγκάη, Κίνα)

Κυτταρικές καλλιέργειες και θεραπείες

Η κυτταρική σειρά BV-2 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Ηνωμένες Πολιτείες). Καλλιεργήθηκαν σε DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Κίνα). Το μέσο συμπληρώθηκε με 10 τοις εκατό FBS (Gibco, Grand Island, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες), 100 U/ml πενικιλίνη και 100 mg/ml στρεπτομυκίνη, συνοδευόμενα με 95 τοις εκατό αέρα/5 τοις εκατό CO2 στους 37°C. Κύτταρα BV-2 επωάστηκαν με ACT (50, 25 και 12,5 μΜ) ή διεγέρθηκαν με λιποπολυσακχαρίτη (LPS, 1 μg/ml, Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ, Ηνωμένες Πολιτείες) για 24 ώρες. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon ECLIPSE Ti2, Japan).

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Η δοκιμασία Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Εν συντομία, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Ηνωμένες Πολιτείες).

Δοκιμασία Παραγωγής Νιτρικού Οξειδίου

Το μονοξείδιο του αζώτου (NO) προσδιορίστηκε με μέτρηση των επιπέδων νιτρωδών στο υπερκείμενο καλλιέργειας BV-2 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Griess. Εν συντομία, το μέσο (100 μl) μεταφέρθηκε σε μια νέα πλάκα 96-πηγαδιού, ο ίδιος όγκος αντιδραστηρίου Griess προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αντέδρασε για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Η απορρόφηση στα 540 nm προσδιορίστηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.

Επίπεδα φλεγμονωδών κυτοκινών στο υπερκείμενο

Οι συγκεντρώσεις των TNF-, IL-1 και IL-10 στο υπερκείμενο κυττάρων BV-2 προσδιορίστηκαν με κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Προσδιορισμός Κυτταρικού Μεταβολισμού με Ανάλυση HPLC-Q-TOF-MS

BV{{0}} κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο έξι φρεατίων χωριστά (n=6/ομάδα). Μετά την επεξεργασία, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS. Στη συνέχεια εκτέθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο για την καταστολή του μεταβολισμού των κυττάρων. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με 8{30}} τοις εκατό ψυχρή μεθανόλη. Για να διευκολυνθεί η καθίζηση πρωτεΐνης, τα κύτταρα στροβιλίστηκαν έντονα για 1 λεπτό και φυγοκεντρήθηκαν στις 13,000 rpm (15 λεπτά, 4◦C). Το κυτταρικό εναιώρημα ξηράνθηκε υπό ρεύμα αζώτου. Το ξηρό υπόλειμμα ανασυστάθηκε σε 150 μΙ προψυγμένου ακετονιτριλίου 25 τοις εκατό. Προκειμένου να διασφαλιστεί η σταθερότητα και η ακρίβεια της ανάλυσης αλληλουχίας, κάθε δείγμα κυττάρου με ίσο όγκο (1{0 μl) συνδυάστηκε ως δείγματα ποιοτικού ελέγχου. Κατά την ανίχνευση μεταβολίτη, αυτά τα δείγματα εγχύονταν μετά από κάθε έξι δείγματα για να επιβεβαιωθεί η σταθερότητά τους. Ένα κλάσμα 1-μl εγχύθηκε για HPLC-Q-TOF-MS. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε σύστημα Agilent 1290 HPLC συνδεδεμένο με το φασματόμετρο μάζας Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Ηνωμένες Πολιτείες). Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 min x 100 mm, 1,7 μm). Η κινητή φάση αποτελούνταν από 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ-νερό (v/v, A) και ακετονιτρίλιο (B). Ο ρυθμός συναδέλφου ορίστηκε στα 0,4 ml/min με την ακόλουθη βέλτιστη συνθήκη έκλουσης βαθμίδωσης: 0 έως 2 λεπτά, 5 τοις εκατό Β. 2 έως 20 λεπτά, 5 έως 95 τοις εκατό Β (λειτουργία θετικών ιόντων). 0 έως 2 λεπτά, 5 τοις εκατό B; 2 έως 20 λεπτά, 5 έως 95 τοις εκατό Β (λειτουργία αρνητικών ιόντων). Οι παράμετροι λειτουργίας του φασματόμετρου μάζας ορίστηκαν ως εξής: θερμοκρασία αερίου, 320◦C; αέριο ξήρανσης, 10 L/min; νεφελοποιητής, 35 psi; VCap, 4,000 V; θραύσμα, 120 V. Τα ακατέργαστα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν στην έκδοση Β.07.00 του λογισμικού MassHunter Workstation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Ηνωμένες Πολιτείες). Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία από την πλατφόρμα XCMS. Η ανάλυση βασικών συστατικών (PCA) και η ανάλυση μερικής διάκρισης ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) των κανονικοποιημένων δεδομένων διεξήχθησαν με το MetaboAnalyst8. Σε συνδυασμό με τη βιβλιογραφία, οι διαφορικοί μεταβολίτες (VIP > 1, t-test p < 0,05)="" αναγνωρίστηκαν="" στο="" hmdb9.="" τέλος,="" πραγματοποιήθηκε="" ανάλυση="" μονοπατιού="" με="" το="">

Μέτρηση Δυναμικού Μιτοχονδριακής Μεμβράνης

Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP) ανιχνεύθηκε με χρήση φθορισμού ανιχνευτή FL JC-1 (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα από διαφορετικές ομάδες ξεπλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με διάλυμα χρώσης JC-1 για 20 λεπτά στους 37°C. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης. Στη συνέχεια, τα σήματα φθορισμού FL ανιχνεύθηκαν με συναδέλφους κυτταρομετρία (BD Accuri C6).

Μέτρηση Μιτοχονδριακής Αδενοσίνης 50 -Τριφωσφορικής

Η συγκέντρωση 50 -τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) στα μιτοχόνδρια ανιχνεύθηκε από ένα κιτ ανάλυσης ATP (Beyotime, Κίνα). Εν συντομία, το μέσο καλλιέργειας των κυττάρων BV-2 από διαφορετικές ομάδες απορρίφθηκε και τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν με ρυθμιστικό λύσης σε πάγο. Το υπερκείμενο που ελήφθη μετά από φυγοκέντρηση (12,000 g, 5 λεπτά) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ΑΤΡ. Η φωταύγεια ανιχνεύθηκε με EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Μέτρηση Επιπέδου Ενδοκυτταρικού Αντιδραστικού Οξυγόνου

Για τη μέτρηση των επιπέδων ROS χρησιμοποιήθηκε κιτ δοκιμασίας ειδών αντιδραστικού οξυγόνου (ROS) (Beyotime, Κίνα). Τα κύτταρα από διαφορετικές ομάδες επωάστηκαν με DCFH-DA (10 μΜ) για 20 λεπτά στους 37°C. Μετά τη φόρτωση του ανιχνευτή, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με DMEM. Στη συνέχεια, τα σήματα φθορισμού FL ανιχνεύθηκαν με συναδέλφους κυτταρομετρία (BD Accuri C6).

Ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης

Κύτταρα BV-2 σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο έξι φρεατίων. Το μέσο απομακρύνθηκε και 1 ml γλουταραλδεΰδης 2,5 τοις εκατό προστέθηκε γρήγορα σε κάθε φρεάτιο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συγκεντρώθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με νέα 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη στους 4°C όλη τη νύχτα. Μετά τη στερέωση, την αφυδάτωση και την ενσωμάτωση, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης HT7800 (Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία).

RNA-Seq και Βιοπληροφορική Ανάλυση Δεδομένων

Ολικό RNA από κύτταρα BV-2 εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Trizol (Vazyme Biotech, Κίνα). Όλα τα αναλυτικά δείγματα στάλθηκαν στη Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) για τον προσδιορισμό αλληλουχίας RNA. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στην ηλεκτρονική πλατφόρμα του Majorbio Cloud Platform10. Το RSEM11 χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της αφθονίας των γονιδίων. Ουσιαστικά, διαφορική έκφραση

Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το DESeq2/DEGseq/EdgeR με τιμή Q μικρότερη ή ίση με 0.05; DEG με|log2FC| > 1 και τιμή Q Μικρότερο από ή ίσο με 0.05 (DESeq2 ή EdgeR)/Q τιμή Λιγότερο ή ίσο με 0,001 (DEGseq) θεωρήθηκαν ότι είναι σημαντικά διαφορετικά εκφρασμένα γονίδια. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις λειτουργικού εμπλουτισμού συμπεριλαμβανομένων των GO και KEGG για να προσδιοριστεί ποια DEG εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε όρους και μονοπάτια GO σε διορθωμένη με Bonferroni τιμή p Μικρότερη ή ίση με 0,05 σε σύγκριση με το υπόβαθρο ολόκληρου του μεταγραφώματος. Τα αρχικά δεδομένα ακολουθίας έχουν υποβληθεί στη βάση δεδομένων του NCBI Sequence Read Archive.

Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο

Το συνολικό RNA των κυττάρων BV-2 συλλέχτηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο απομόνωσης RNA-easyTM (Vazyme Biotech, Κίνα) και διεξήχθη αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής με FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Κίνα). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το cDNA υποβλήθηκε σε ποσοτικούς προσδιορισμούς αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) με ειδικούς εκκινητές και TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). Οι εκκινητές παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1 και η -ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η μέθοδος CT 22 1 1 χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική ανάλυση.

Ανάλυση Western Blot

Κύτταρα BV-2 λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Κίνα) που περιείχε 1 τοις εκατό Cocktail αναστολέα πρωτεάσης (Thermo Fisher) για να ληφθεί συνολική πρωτεΐνη. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 10 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες NC. Μετά τον αποκλεισμό με 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα/BSA, οι μεμβράνες επωάστηκαν με AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affifffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonal) ή GAPDH (ABclonal) αντισώματα σε 5 τοις εκατό TBST στους 4◦C όλη τη νύχτα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου (ABclonal) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Για οπτικοποίηση και ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκαν το υψηλής σημείωσης ECL υπόστρωμα Western blotting (Tanon, Κίνα), το σύστημα απεικόνισης γέλης (Tanon, China) και το λογισμικό ImageJ.

Molecular Docking

Η ανάλυση μοριακής σύνδεσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Autodock (έκδοση 4.2). Η συγγένεια μεταξύ ACT και πρωτεϊνών παρατηρήθηκε από το λογισμικό AutodockTools. Οι τρισδιάστατες (3D) πρωτεϊνικές δομές του AMPK (PDB ID: 5g5j) και του NF-κB (PDB ID: 4q3j) ανακτήθηκαν από την Protein Data Bank12.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση και αναλύονται από το GraphPad Prism Software (Έκδοση 8.0.1). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από τη δοκιμασία πολλαπλής σύγκρισης του Tukey. p < 0.05="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="">

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Δίκτυο αλληλεπίδρασης στόχων ACT-AD και Πρόβλεψη διαδρομής

Μέσω της ενοποίησης πολλαπλών βάσεων δεδομένων, αποκτήθηκαν 253 στόχοι ACT, ενώ συγκεντρώθηκαν συνολικά 1.697 στόχοι που σχετίζονται με την AD. Μετά τη χαρτογράφηση του δικτύου στόχου, συνολικά 70 στόχοι απορροφήθηκαν στο δίκτυο αλληλεπίδρασης στόχου ACT-AD (Εικόνα 1Α). Η ανάλυση εμπλουτισμού KEGG υπονοούσε ότι το ACT θα μπορούσε να έχει ευρέως φάσματος και πολλαπλούς στόχους (Εικόνα 1Β). Πρότεινε επίσης ότι το ACT έχει πολλαπλές οδούς, σημεία στόχους και στοιχεία στη θεραπεία της AD. Ταξινομήστε αυτές τις οδούς για να αποκτήσετε μια ακριβή ερμηνεία των μηχανισμών. Το ACT μπορεί κυρίως να συσχετιστεί με τη μεταγωγή σήματος, το ενδοκρινικό σύστημα, το ανοσοποιητικό σύστημα και την κυτταρική ανάπτυξη και θάνατο για να παίξει έναν αντιπαρατιθέμενο ρόλο κατά της AD (Εικόνα 1C). Αξίζει να σημειωθεί ότι η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των οδών σχετίζονται με φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Εικάζεται ότι η αντιφλεγμονώδης δράση του ACT μπορεί να είναι αναπόσπαστο μέρος του αντιπαρατιθέμενου ρόλου του κατά της AD.

Το ACT ανακούφισε τη δυσκινησία και βελτίωσε τη λειτουργία του χολινεργικού συστήματος σε προνύμφες AD Zebrafish

Για την επαλήθευση του μοντέλου δικτύου, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο AD που προκαλείται από AlCl3- σε προνύμφες ψαριών ζέβρα για να καταδειχθεί η επίδραση του ACT. Παρατηρήθηκε η κίνηση των προνυμφών ζέβρα σε κύκλους φωτός/σκότους και καταγράφηκαν τα ίχνη κολύμβησης (Εικόνα 1Δ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ACT αύξησε αποτελεσματικά το AS και 1S του ψαριού ζέβρα και το συνεργιστικό αποτέλεσμα αυξήθηκε με την αύξηση των δόσεων (Εικόνα 1Ε). Οι DRR και RE αποκάλυψαν μια πιο διαισθητική σύγκριση των ACT και DPZ (Εικόνα 1ΣΤ). Κατά συνέπεια, το ACT ανακούφισε τη δυσκινησία, εμφανίζοντας παρόμοια αποτελέσματα με την DPZ. Είναι γενικά αποδεκτό ότι το χολινεργικό σύστημα παίζει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Έτσι, οι δραστηριότητες των AChE και ChAT χρησιμοποιήθηκαν για να αποκαλυφθεί η επίδραση του ACT. Η έκθεση AlCl3 σε ζέβρα αποδόθηκε με εγκεφαλική χολινεργική αλλοίωση (Εικόνα 1G). Ήταν σημαντικό ότι η θεραπεία με ACT κατέστειλε τη δραστηριότητα της AChE. Επιπλέον, η δραστηριότητα του ChAT παρουσίασε μείωση μετά τη θεραπεία με ACT. Ως εκ τούτου, το ACT έδειξε μια βαθιά επίδραση στις προνύμφες AD zebrafish που προκαλούνται από AlCl3-.

Το ACT κατέστειλε την πόλωση M1 και προώθησε την πόλωση M2 σε κύτταρα BV{3}} που προκαλούνται από LPS

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το δίκτυο, η αντιφλεγμονώδης δράση του ACT μελετήθηκε in vitro χρησιμοποιώντας BV-2 μικρογλοιακά κύτταρα. Μετά από θεραπεία με LPS για 24 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων BV-2 μειώθηκε σημαντικά. Ευτυχώς, το ACT αύξησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων των επαγόμενων από LPS κυττάρων BV-2 (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, παρατηρήθηκε η μορφολογία των BV-2 κυττάρων. Μετά από 24 ώρες διέγερσης LPS, έδειξε ότι τα κύτταρα BV-2 υπέστησαν κατάσταση πόλωσης Μ1. Οι μορφολογικές αλλαγές προλήφθηκαν με συν-θεραπεία ACT (Εικόνα 2Β).

Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, σε αντίθεση με τα κύτταρα BV-2 που διεγείρονται από LPS, τα κύτταρα BV-2 που υποβλήθηκαν σε συν-επεξεργασία με ACT κατέστειλαν σημαντικά τις εκφράσεις TNF-, IL-1 και NO (Εικόνα 2C) σε υπερκείμενο κύτταρο. Αυτές είναι κλασικές προφλεγμονώδεις κυτοκίνες ως δείκτες πόλωσης της μικρογλοίας Μ1. Παρόμοια με τα αποτελέσματα της ELISA, τα αποτελέσματα της qPCR ανακάλυψαν ότι οι εκφράσεις mRNA TNF-, νιτρικού οξειδίου (iNOS), IL-1 και CD{10}} αναστέλλονταν σημαντικά από τη θεραπεία ACT σε σύγκριση με την ομάδα LPS (Εικόνα 2Δ). Επιπλέον, μετρήσαμε το επίπεδο πόλωσης μικρογλοίας Μ2 με ELISA (Εικόνα 2C) και qPCR (Εικόνα 2Ε) και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ACT αύξησε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης δεικτών που σχετίζονται με τη μικρογλοία (IL{17}}, CD206, TGF- και Arg-1). Με μια λέξη, αυτά τα αποτελέσματα το έδειξανΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙκατέστειλε την πόλωση της μικρογλοίας Μ1 και προώθησε τον φαινότυπο Μ2.

Πόλωση M1/M2 με ρύθμιση ACT μέσω της αναστολής της οδού NF-κB

Η μεταγραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με RNA-seq για να διερευνήσει τον μηχανισμό του ACT σε κύτταρα BV-2 από ένα συνολικό επίπεδο. Το PCA επέδειξε ότι οι ομάδες ελέγχου, LPS και ACT μπορούσαν να διακριθούν καλά (Εικόνα 3Α). Αποκάλυψε 899 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας LPS, και 49 DEGs μεταξύ της ομάδας LPS και της ομάδας ACT (Εικόνα 3Β). Με συνέπεια, η ανάλυση εμπλουτισμού GO (Εικόνα 3C) και KEGG (Εικόνα 3D) αποκάλυψε ότι η επίδραση του ACT εμπλέκεται στην οδό NF-κB. Το σύνολο των γονιδίων που σχετίζονται με το μονοπάτι NF-κB επιβεβαιώθηκε περαιτέρω και η ομοιόστασή τους σίγουρα επηρεάστηκε από το LPS. Όπως αναμενόταν, το ACT επηρέασε σημαντικά τις εκφράσεις τους (Εικόνα 3Ε). Η οδός NF-κB είναι μια κλασική οδός για τη ρύθμιση της εξέλιξης της φλεγμονής, με αποτέλεσμα τελικά την απελευθέρωση προφλεγμονωδών παραγόντων. Για να αποκτηθεί μηχανιστική υποστήριξη, η βασική πρωτεΐνη της οδού NF-κB αξιολογήθηκε με στύπωμα Western. Η διέγερση LPS οδήγησε στην ενεργοποίηση του NF-κB, που σχετίζεται με την προώθηση της πόλωσης Μ1. Σε συμφωνία με την ανάλυση αλληλουχίας RNA, το ACT ανέστειλε τη διεγερμένη από LPS φωσφορυλίωση NF-κB (Εικόνα 3F). Επομένως, το ACT μπορεί να ανακουφίσει την πόλωση M1 που προκαλείται από LPS μέσω της οδού NF-κB σε κύτταρα BV-2.

ACT Βλάβη στη βιοσύνθεση αργινίνης καθώς και στη βιοσύνθεση παντοθενικού και CoA

Η πρόβλεψη δικτύου του ACT αποκάλυψε ότι σχετιζόταν με το μεταβολισμό της αργινίνης (Arg) και της προλίνης (Εικόνα 1Β). Το RNA seq έδειξε ότι οι οδοί που επηρεάζονται από το ACT περιελάμβαναν επίσης τη βιοσύνθεση Arg καθώς και τη βιοσύνθεση παντοθενικού και CoA (Εικόνα 3D). Έχει προταθεί ότι οι διαταραχές του μεταβολισμού των κυττάρων BV-2 που προκαλούνται από τη διέγερση του LPS σχετίζονται με την πόλωση του Μ1 (Orihuela et al., 2016). Έτσι, ένα μη στοχευόμενο κυτταρικό μεταβολίωμα με HPLC-Q-TOF-MS χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση της επίδρασης του ACT στον κυτταρικό μεταβολισμό. Το PCA και το PLS-DA (Εικόνα 3G) επεξηγούν ότι οι ομάδες ελέγχου, LPS και ACT μπορούσαν να διακριθούν καλά με βάση τους ενδοκυτταρικούς μεταβολίτες. Τα επίπεδα διάφορων μεταβολιτών στα επαγόμενα από LPS κύτταρα BV-2 άλλαξαν μετά τη θεραπεία με ACT (Εικόνα 3Η). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, υπήρχαν 11 μεταβολίτες που άλλαξαν σημαντικά στην ομάδα LPS (Συμπληρωματικός Πίνακας 2), ενώ 14 μεταβολίτες άλλαξαν ευδιάκριτα μετά τη θεραπεία του ACT (Συμπληρωματικός Πίνακας 3), που περιελάμβανε 11 μεταβολικές οδούς (Εικόνα 3I). Η επίδραση του ACT συνίστατο κυρίως στη ρύθμιση του μεταβολισμού των αμινοξέων, του μεταβολισμού των νουκλεοτιδίων, του ενεργειακού μεταβολισμού και του μεταβολισμού των συμπαραγόντων και των βιταμινών. Είναι ενδιαφέρον ότι οι μεταβολικές οδοί που ελήφθησαν από το μεταβολίωμα ήταν σύμφωνες με την πρόβλεψη δικτύου και το RNA-seq, συμπεριλαμβανομένης της βιοσύνθεσης Arg καθώς και της βιοσύνθεσης παντοθενικού και CoA. Τα παραπάνω έδειξαν ότι το ACT μπορούσε να ρυθμίσει τη βιοσύνθεση Arg καθώς και τη βιοσύνθεση παντοθενικού και CoA σε κύτταρα BV- 2 που διεγείρονται από LPS.

ΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙΜετριασμένη Μιτοχονδριακή Δυσλειτουργία BV-2 που προκαλείται από LPS

Τα μιτοχόνδρια βρίσκονται στον πυρήνα των μεταβολικών οδών. Τα εξελισσόμενα στοιχεία δείχνουν ότι τα μιτοχόνδρια είναι βασικός παράγοντας στη μικρογλοιακή πόλωση M1/M2. Μια επισκόπηση της κατάστασης των μιτοχονδρίων στη μορφολογία και την κυτταρική κατανομή κρίθηκε από το TEM. Μετά τη διέγερση με LPS, η χρωματίνη των κυττάρων BV-2 συμπυκνώθηκε και το κυτταρόπλασμα και τα μιτοχόνδρια μειώθηκαν (Εικόνα 4Α). Επιπλέον, οι μιτοχονδριακοί κρύστες της ομάδας LPS διατάραξαν ή ακόμη και εξαφανίστηκαν, παρουσιάζοντας μερική κριστόλυση, μείωση μεγέθους και μορφολογία στρογγυλού σχήματος. Είναι ενδιαφέρον ότι η θεραπεία ACT θα μπορούσε να ανακουφίσει τις μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από το LPS στα μιτοχόνδρια. Με τη σειρά, εξετάσαμε τη λειτουργία των μιτοχονδρίων των κυττάρων BV-2 που έλαβαν θεραπεία με LPS, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής MMP και ATP. Η παραγωγή MMP (Εικόνα 4Β) και ATP στα μιτοχόνδρια (Εικόνα 4C) βελτιώθηκαν σημαντικά στην ομάδα ACT σε σύγκριση με εκείνες της ομάδας LPS. Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία μπορεί να σχετίζεται με το αυξημένο επίπεδο ROS στο κύτταρο. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής αποκάλυψε ότι το περιεχόμενο του ROS ήταν υπερφορτωμένο στην ομάδα LPS (Εικόνα 4D). Ευτυχώς, το ACT εξάλειψε τα υπερβολικά ROS. Υποδηλώνει ότι το ACT μπορεί να αποκαταστήσει τη λειτουργία των μιτοχονδρίων εκκαθαρίζοντας το ROS.

ACT αποκατέστησε τη λειτουργία των μιτοχονδρίων μέσω της ανοδικής ρύθμισης του PGC-1 και του UCP-2

Ο πολλαπλασιαστικός-ενεργοποιημένος υποδοχέας υπεροξισώματος-συνενεργοποιητής-1 (PGC-1) παίζει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση των μιτοχονδρίων (Bi et al., 2019). Η διέγερση του LPS μείωσε την έκφραση του PGC-1, εμφανίζοντας δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων. Αξιοσημείωτα, η έκφραση του mRNA του γονιδίου PGC-1 και της πρωτεΐνης αντιστράφηκε σημαντικά με την επεξεργασία ACT σε κύτταρα BV-2 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με LPS (Εικόνα 4Ε).

Η μιτοχονδριακή πρωτεΐνη αποσύνδεσης-2 (UCP-2) ήταν επίσης γνωστό ότι ρυθμίζει τη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Ως κατάντη πρωτεΐνη του PGC-1 , μπορεί να ελέγξει την αποπόλωση MMP που προκαλείται από LPS και την παραγωγή ROS. Πρόσφατες αναφορές δείχνουν ότι είναι κεντρικό στη διαδικασία της μικρογλοιακής ενεργοποίησης, με αντίθετη ρύθμιση της πόλωσης Μ1 και Μ2 (De Simone et al., 2015). Τα αποτελέσματα Western blot έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης UCP-2 μειώθηκε μετά από διέγερση LPS. Η ταυτόχρονη θεραπεία LPS και ACT θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της UCP-2 σε σύγκριση με τη θεραπεία LPS. Το επίπεδο έκφρασης mRNA του UCP-2 έδειξε επίσης παρόμοιες αλλαγές (Εικόνα 4F). Συνοψίζοντας, το ACT αποκατέστησε τη λειτουργία των μιτοχονδρίων μέσω της ανοδικής ρύθμισης του PGC-1 και του UCP-2.

ACT Repressed Microglia M1

Πόλωση μέσω ενεργοποίησης AMPK

Ως βασικός αισθητήρας κυτταρικής ενέργειας, η ενεργοποιημένη με AMP πρωτεϊνική κινάση (AMPK) παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ισορροπίας του κυτταρικού μεταβολισμού. Ταυτόχρονα, η PGC-1 είναι μια κατάντη πρωτεΐνη του AMPK. Όπως φαίνεται στην ανάλυση του μοντέλου δικτύου,ΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙμπορεί να ρυθμίσει την οδό AMPK (Εικόνα 1Β). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το LPS ανέστειλε την ενεργοποίηση της AMPK, με αποτέλεσμα διαταραχές του κυτταρικού μεταβολισμού και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Είναι αξιοσημείωτο ότι το ACT θα μπορούσε να αυξήσει δοσοεξαρτώμενα την έκφραση πρωτεΐνης του p-AMPK (Εικόνα 5Α). Προτείνεται ότι το ACT μπορεί να αυξήσει την έκφραση του PGC-1 και να αποκαταστήσει τη μιτοχονδριακή λειτουργία ενεργοποιώντας το μονοπάτι σηματοδότησης AMPK. Σε αυτή τη μελέτη, για να διερευνηθεί εάν η ενεργοποίηση της AMPK συνέβαλε στη ρύθμιση της επίδρασης τουΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙεπί της πόλωσης Μ1/Μ2, η ένωση C (CC) χρησιμοποιήθηκε για την αναστολή της επίδρασης της ΑΜΡΚ. Σε αντίθεση με το μειωμένο επίπεδο NO στην ομάδα θεραπείας ACT, το CC απέκλεισε εν μέρει την επίδραση του ACT στο επίπεδο NO (Εικόνα 5Β). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, το ACT θα μπορούσε να ρυθμίσει την πόλωση M1/M2 των BV-2 κυττάρων με την ενεργοποίηση του AMPK.

ΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙΣυνδέεται και αναστέλλεται NF-κB καθώς και ενεργοποιημένο AMPK

Εφαρμόστηκε μοριακή σύνδεση για να επιβεβαιωθεί εάν το ACT συνδέεται με τις πρωτεΐνες NF-κB και AMPK. Τα ευρήματα έδειξαν ότι η ενέργεια δέσμευσης τουΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙκαι το NF-κB ήταν -8.4 kcal/mol, ενώ αυτό τωνΥΠΟΚΡΙΝΟΜΑΙκαι το AMPK ήταν -10,8 kcal/mol. Σημαντικές συγγένειες επαλήθευσαν ότι το ACT συνδέεται απευθείας με το NF-κB και το AMPK (Εικόνες 5C, D, F, G). Στη συνέχεια, διερευνήθηκαν περαιτέρω οι πιθανοί τρόποι δέσμευσης και οι αλληλεπιδράσεις εντός των θυλάκων αμινοξέων, συμπεριλαμβανομένων 11 υπολειμμάτων αμινοξέων του NF-κB (Εικόνα 5Ε) καθώς και 12 υπολειμμάτων αμινοξέων του AMPK (Εικόνα 5Η). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ACT μπορεί να επηρεάσει άμεσα τα NF-κB και AMPK για την εξασθένιση της πόλωσης της μικρογλοίας Μ1 του BV{10}} και την προώθηση του φαινότυπου M2.