ΜΕΡΟΣⅠ: Νέες προστατευτικές επιδράσεις του εκχυλίσματος Cistanche Tubulosa ενάντια στην εκφυλιστική αμφιβληστροειδοπάθεια που προκαλείται από χαμηλή φωτεινότητα
Mar 04, 2022
Επικοινωνία: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
School of Pharmacy, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Department of Ophthalmology, Taipei Medical University, Taipei, Department of Pharmacology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, Taipei, Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University, Taipei, Ph.D. Πρόγραμμα Έρευνας και Ανάπτυξης Βιοτεχνολογίας, Κολλέγιο Φαρμακευτικής, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Ταϊπέι, Ταϊπέι, Ταϊβάν
Αφηρημένη
Ιστορικό/Στόχοι:Η φωτοτοξικότητα που προκαλείται από το μπλε φως με δίοδο εκπομπής φωτός (BLL) παίζει σημαντικό ρόλο στις οφθαλμικές ασθένειες και προκαλεί εκφυλισμό του αμφιβληστροειδούς και απόπτωση σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα με χρωστική αμφιβληστροειδούς (RPE).Εκχύλισμα Cistanche tubulosa (CTE)είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο με πολλές ευεργετικές προστατευτικές ιδιότητες. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν εξετάσει τους οφθαλμικούς προστατευτικούς ρόλους της CTE. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν τις επιδράσεις της CTE στην απόπτωση που προκαλείται από BLL in vitro και in vivo. Μέθοδοι: Τα κύτταρα RPE εφαρμόστηκαν στην τρέχουσα in vitro μελέτη και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με ένα 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ- 2-υλ)-2,{{6} } προσδιορισμός βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου. Η έκφραση πρωτεΐνης που σχετίζεται με την απόπτωση προσδιορίστηκε με ανάλυση στυπώματος western και χρώση ανοσοφθορισμού. Καφέ αρουραίοι Νορβηγίας χρησιμοποιήθηκαν για να εξετάσουν την έκθεση σε εμπορικά διαθέσιμη BLL in vivo. Η χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, η τελική επισήμανση άκρων της δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης dUTP (TUNEL) και οι δοκιμασίες στυπώματος western χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση της μορφολογικής παραμόρφωσης του αμφιβληστροειδούς. Αποτελέσματα: Η CTE ανέστειλε σημαντικά τη βλάβη RPE που προκαλείται από υπεροξείδιο του υδρογόνου, υδροϋπεροξείδιο τριτβουτυλίου, αζίδιο του νατρίου και BLL. Περαιτέρω, η CTE μείωσε την έκφραση αποπτωτικών δεικτών όπως η διασπασμένη κασπάση-3 και η χρώση TUNEL μετά την έκθεση σε BLL αδρανοποιώντας τις αποπτωτικές οδούς, όπως φαίνεται μέσω της χρώσης ανοσοφθορισμού. Επιπλέον, το CTE ανέστειλε την επαγόμενη από BLL φωσφορυλίωση της N-τερματικής κινάσης c-Jun, των επιπλέον κινασών 1/2 που σχετίζονται με το σήμα και της ρ38 σε κύτταρα RPE. In vivo, η από του στόματος χορήγηση CTE διέσωσε 60-ημερήσιες μειώσεις του πάχους του αμφιβληστροειδούς που προκλήθηκαν από την περιοδική έκθεση BLL και μείωσε τον αριθμό των θετικών στο TUNEL κυττάρων στο μοντέλο καφέ αρουραίων Νορβηγίας. Συμπέρασμα: Το CTE είναι ένας πιθανός προφυλακτικός παράγοντας έναντι της φωτοτοξικότητας που προκαλείται από BLL
Εισαγωγή
Μελέτες για την ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας (AMD) ανέφεραν ότι το 8,7 τοις εκατό του παγκόσμιου πληθυσμού πάσχει από αυτή την ασθένεια [1]. Η AMD είναι μια νευροεκφυλιστική ασθένεια που προκαλεί παραμόρφωση των φωτοϋποδοχέων, ατροφία του επιθηλιακού χρωστικού αμφιβληστροειδούς (RPE), απόπτωση γαγγλιακών κυττάρων και απώλεια κεντρικής όρασης στον ηλικιωμένο πληθυσμό και γίνεται παγκόσμιο κοινωνικό βάρος. Η AMD ταξινομείται είτε σε ξηρή είτε σε υγρή μορφή [2, 3]. Οι βελτιώσεις στην τεχνολογία είχαν ως αποτέλεσμα οι άνθρωποι να ξοδεύουν περισσότερο χρόνο χρησιμοποιώντας σύγχρονες ψηφιακές συσκευές και, κατά συνέπεια, οι άνθρωποι εκτίθενται σε εκπομπές μπλε φωτός (BL) για μεγάλες περιόδους. Ωστόσο, το ζήτημα της φωτοτοξικότητας που προκαλείται από το BL στον αμφιβληστροειδή δεν έχει διερευνηθεί καλά. Η υπερβολική έκθεση σε μικρού μήκους κύματος BL (450–495 nm) έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS), όπως οι ρίζες υπεροξειδίου και υδροξυλίου, που προκαλούν αυξήσεις στην κατανάλωση οξυγόνου και προκαλούν βλάβη στο μιτοχονδριακό DNA. Η συσσώρευση ROS έχει ως αποτέλεσμα το οξειδωτικό στρες και την εκτεταμένη συσσώρευση ρητινοειδών προσαγωγών, που βλάπτουν περαιτέρω τον αμφιβληστροειδή [4]. Έρευνες έχουν δείξει ότι το οξειδωτικό στρες είναι ο κύριος παράγοντας στην παθογένεση της ξηρής AMD [5]. Επιπλέον, η ακτινοβολία BL μειώνει την έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων του αμφιβληστροειδούς, όπως η υπεροξειδική δισμουτάση και η καταλάση, με τη μεσολάβηση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Bax/Bcl-2 και την προώθηση της ενδογενούς παραγωγής ROS. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα RPE και τα μιτοχόνδρια του εξωτερικού τμήματος των φωτοϋποδοχέων υποφέρουν από τραυματισμό που προκαλείται από την ακτινοβολία BL [6, 7]. Εκτός από τη δημιουργία ROS, η ακτινοβολία BL ενεργοποιεί τις ενεργοποιημένες από μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες (MAPKs), οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική επιβίωση και απόπτωση. Οι εξαρτώμενες από τα μιτοχόνδρια προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση, όπως το Bax και η κασπάση-3, ενεργοποιούνται με ακτινοβολία φωτός από διόδου εκπομπής BL (BLL) μέσω της οδού C-Jun N-τερματική κινάση (JNK) και p38 στο RPE και γαγγλιακά κύτταρα αμφιβληστροειδούς [8]. Επιπλέον, τα αντιοξειδωτικά μονοπάτια που εξαρτώνται από τον παράγοντα 2 (Nrf2) 3-κινάση (PI3K)/Akt και πυρηνικός παράγοντας ερυθροειδής 2- είναι συστατικά του αμυντικού συστήματος των κυττάρων RPE [{{34} }].
Εκχύλισμα Cistanche tubulosa (CTE)περιέχει παράγωγα φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων και χρησιμοποιείται ως παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο εδώ και δεκαετίες. Η εχινακοσίδη, η ακτεοσίδη και η ισοακτεοσίδη είναι τρεις κύριες δραστικές ενώσεις της CTE που χαρακτηρίζονται ως έχουν νευροπροστατευτικές, ενισχυτικές της μνήμης, ανοσορυθμιστικές και κατά της ηπατικής ίνωσης ιδιότητες [13, 14]. Η εχινακοσίδη είναι σαρωτής ROS και προστατεύει από την απόπτωση που προκαλείται από ιόντα 1-μεθυλ-4-φαινυλοπυριδινίου (MPP plus ) σε ζωικά μοντέλα της νόσου του Πάρκινσον [15, 16]. Η ακτεοσίδη προστατεύει από τη νευροτοξικότητα που προκαλείται από{10}αμυλοειδές και μειώνει τη φλεγμονή που διεγείρεται από λιποπολυσακχαρίτες, που αποδίδεται στη μετατόπιση του Nrf2 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και στη δέσμευση με στοιχεία αντιοξειδωτικής απόκρισης. Οι τρέχουσες διαθέσιμες θεραπείες για την υγρή AMD, όπως το pegaptanib, το ranibizumab, το bevacizumab και το aflibercept, χρησιμοποιούνται για την αναστολή της υπερβολικής αγγειογένεσης [17, 18]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπείες για την ξηρή AMD, λόγω των πολλαπλών παθολογικών επιπλοκών αυτής της νόσου.
Σε αυτή τη μελέτη, επιδεικνύουμε τα προστατευτικά αποτελέσματα του CTE σε κύτταρα RPE και αρουραίους Brown Norway (BN). Επιπλέον, εφαρμόσαμε μακροχρόνια έκθεση σε BLL χαμηλής φωτεινότητας τόσο σε μοντέλα in vitro όσο και in vivo για να αξιολογήσουμε τις προστατευτικές επιδράσεις του CTE. Βρήκαμε ότι το CTE μείωσε την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση μετά από έκθεση σε BLL. Επιπλέον, το CTE μείωσε τον αριθμό των τελικών θετικών κυττάρων δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης dUTP (TUNEL) στον αμφιβληστροειδή αρουραίων BN μετά από μακροχρόνια έκθεση σε χαμηλής φωτεινότητας BLL. Αυτή η μελέτη παρέχει περαιτέρω πληροφορίες για τις νέες αντι-αποπτωτικές επιδράσεις της CTE και πληροφορίες σχετικά με μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία της εκφύλισης του αμφιβληστροειδούς.
Εκχύλισμα Cistanche tubulosa (CTE): φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο
Υλικά και μέθοδοι
Χημικά και προϊόντα
Το CTE παρασχέθηκε γενναιόδωρα από την Sinphar Pharmaceutical Company (Yilan, Ταϊβάν). Τα κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου in situ (Αρ. Κατ. 11-684-817-910) αγοράστηκαν από τη Roche (Mannheim, Γερμανία).
Κυτταρική καλλιέργεια RPE
Κύτταρα RPE (ARPE{{0}} και ATCC® CRL-2302™) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν στο τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό σε υγρή ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς . Κύτταρα ARPE-19 στο πέρασμα 19-30 διατηρήθηκαν σε δίσκους κυτταροκαλλιέργειας 10-cm (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Βέλγιο). Κατά τη διέλευση με 0,05 τοις εκατό θρυψίνη-αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Gibco), τα κύτταρα επιστρώθηκαν εκ νέου σε αναλογία 1:4. Πριν από τη δοκιμή, κύτταρα ARPE-19 σπάρθηκαν σε 48-πλάκες φρεατίου (Orange Scientific) για αναλύσεις βιωσιμότητας κυττάρων σε πυκνότητα 1,0 × 105 κύτταρα/mL και σε τρυβλία 6-cm (Orange Scientific ) για αναλύσεις στύπωσης western σε πυκνότητα 2,0 × 105 κύτταρα/mL για 24 ώρες. Αφού τα κύτταρα ARPE-19 έφτασαν το 80 τοις εκατό συρροή, πραγματοποιήθηκαν τα ακόλουθα πειράματα.
Φαρμακευτική θεραπεία και δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων
Κύτταρα RPE στο πέρασμα 19-30 σπάρθηκαν σε 48-πλάκες φρεατίων και συνεπεξεργάστηκαν για 24 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις CTE, υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), υδροϋπεροξείδιο τριτ-βουτυλίου (t-BHP) και αζίδιο του νατρίου ( NaN3). Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με 3-(4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2, 5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT) σε τελική συγκέντρωση 1 mg /mL και επωάστηκαν για 30 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκε διμεθυλοσουλφοξείδιο (200 μL) σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν τα κύτταρα. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας φασματοφωτόμετρο Sunrise™ συνδεδεμένο με ένζυμο (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Οι τιμές διορθώθηκαν για την απορρόφηση υποβάθρου αφαιρώντας τα κατάλληλα κενά. Τα δεδομένα προέρχονται από πέντε ανεξάρτητες αναλύσεις.
Πρωτόκολλο έκθεσης σε BL in vitro
Η πηγή φωτός και οι πλάκες κυττάρων τοποθετήθηκαν σε απόσταση 25 cm, όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη μελέτη μας [19]. Η φωτεινότητα μετρήθηκε με φωτόμετρο (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Taiwan). Το BLL κορυφώθηκε στα 460 nm (60 lux) για τον υποδεικνυόμενο χρόνο (0–48 ώρες), ανάλογα με τον πειραματικό σχεδιασμό.
Western blotting
Μετά από 0–48-h ταυτόχρονη θεραπεία με έκθεση σε CTE και BLL, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης ανάλυσης ραδιοανοσοκαθίζησης (1 τοις εκατό Nonidet Ρ-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM αιθυλενογλυκόλη-δις (-αμινοαιθυλαιθέρας)-N,N,N',N'-τετραοξικό οξύ, 1 mM NaF και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης/φωσφατάσης). Το κυτταρόλυμα ελήφθη μέσω φυγοκέντρησης στους 12, 000 × g για 35 λεπτά, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για να προσδιοριστούν οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μέσω του αντιδραστηρίου Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ίσες ποσότητες δειγμάτων πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου 10-12 τοις εκατό και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Μετά την απόφραξη της μεμβράνης με 5 τοις εκατό άπαχο γάλα και επώαση σε αλατούχο διάλυμα Tris με ρυθμιστικό διάλυμα Tween 20 (TBST) για 1 ώρα, διεξήχθη ανοσοκηλίδωση με πρωτογενή αντισώματα ειδικά για διασπασμένη κασπάση-3, φωσφο-JNK, JNK , phospho-p38, p38, phospho-extracellular signal-related κινάση (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, Fas συνδεδεμένη πρωτεΐνη με τομέα θανάτου (FADD), κασπάση-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-συνδέτης (Abcam, Cambridge, UK) και β-ακτίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (1:6000 σε TBST, Cayman Chemical, Ann Arbor, ΜΙ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Χρησιμοποιώντας ένα κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Millipore, Billerica, ΜΑ), η ένταση των ζωνών σε κάθε στύπωμα αναλύθηκε με το λογισμικό Image J μετά την κανονικοποίηση σε β-ακτίνη.
Ανοσοφθορισμός
Τα κύτταρα RPE σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 15 λεπτά. Triton X-100 σε PBS (0.2 τοις εκατό) προστέθηκε στη συνέχεια στα κύτταρα για 15 λεπτά, ακολουθούμενο από 5 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό σε PBS για 30 λεπτά. τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα αντίσωμα αντι-διασπασμένης κασπάσης-3 σε αναλογία 1:250 για 24 ώρες (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Χρησιμοποιήθηκε δευτερεύον αντίσωμα IgG κατσίκας κατά κουνελιού (Dylight 594) σε αναλογία 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Οι κυτταρικοί πυρήνες χρωματίστηκαν με 4'-6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI, AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Παρατηρήθηκαν αλλαγές στον φθορισμό με ένα σύστημα ομοεστιακής φασματικής απεικόνισης μικροσκοπίου λέιζερ CS SP5 (Leica, Teban Gardens, Σιγκαπούρη).
Χρώση TUNEL
Τα θραύσματα DNA, τα οποία μπορούν να ανιχνευθούν με μια δοκιμασία TUNEL, είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της απόπτωσης. Χρησιμοποιήσαμε ένα κιτ επιτόπιας ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (Κατ. Αρ. 11-684-817-910; Roche) για τη μέτρηση του προγραμματισμένου αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου RPE σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, στερεώσαμε κύτταρα RPE με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και επισημάναμε τις θραύσεις του κλώνου του DNA σε μια ενζυματική αντίδραση για να ανιχνεύσουμε κύτταρα θετικά στο TUNEL, τα οποία εμφανίστηκαν με μια πράσινη φθορίζουσα χρώση. Τα χρωματισμένα κύτταρα στη συνέχεια σαρώθηκαν και αναλύθηκαν με σύστημα απεικόνισης Tissue FAXS-plus (TissueGnostics, Βιέννη, Αυστρία). Δέκα χιλιάδες συμβάντα μετρήθηκαν στην περιφραγμένη περιοχή RPE και αναλύσαμε τις εικόνες για τον αριθμό των θετικών κυττάρων TUNEL με το λογισμικό TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).
Πειράματα σε ζώα
Αρσενικοί αρουραίοι BN (300–350 g σωματικού βάρους) αγοράστηκαν από το Εθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν) και διατηρήθηκαν για 2–3 μήνες. Οι αρουραίοι διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 12-h/12-h στους 26 ± 1 βαθμό, 35–47 τοις εκατό σχετική υγρασία και πρόσβαση κατά βούληση σε νερό και τροφή. Οι αρουραίοι που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία διατηρήθηκαν στο σκοτάδι για να χρησιμεύσουν ως μάρτυρες. Τα πρωτόκολλα της μελέτης εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Χρήσης Ιδρυματικής Φροντίδας Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Ταϊπέι (αριθμός έγκρισης: LAC-2016-0442). Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που αφορούσαν τη χρήση ζώων συμμορφώνονταν με τις δηλώσεις του Association for Research in Vision and Ophthalmology για τη χρήση ζώων στην οφθαλμική και πειραματική έρευνα όρασης.
Μοντέλο εκφυλισμού αμφιβληστροειδούς που προκαλείται από BLL
Χρησιμοποιήσαμε ένα περιοδικό χαμηλής φωτεινότητας μακροπρόθεσμη επαγόμενη από έκθεση σε BLL μοντέλο εκφύλισης του αμφιβληστροειδούς, όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη μελέτη μας [19]. Εν συντομία, οι αρουραίοι ΒΝ χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: μια ομάδα ελέγχου, η οποία διατηρήθηκε σε σκοτεινές συνθήκες. μια ομάδα εκτεθειμένη σε BLL, η οποία εκτέθηκε σε περιοδική BLL στο σκοτάδι χωρίς διαστολή της κόρης (460 nm, 150 lux) για 3 ώρες την ημέρα για 60 ημέρες. και μια ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με CTE συν εκτεθειμένη σε BLL, η οποία υποβλήθηκε σε προ-αγωγή με CTE (100 mg/kg σωματικού βάρους) για 14 ημέρες και στη συνέχεια συν-θεραπεία με περιοδική έκθεση BLL για 3 ώρες την ημέρα για 60 ημέρες. Όλοι οι αρουραίοι επέστρεψαν στις ζωικές αποικίες και ο κανονικός κύκλος φωτός/σκότους (250 lux, 12 ώρες/12 ώρες) συνεχίστηκε στο τέλος της πειραματικής περιόδου.
Στατιστική ανάλυση
Οι σημαντικές διαφορές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης που ακολουθήθηκε από τη δοκιμασία post hoc του Tukey και τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με τιμές p του<>
Προϊόντα Cistanche tubulosa
Αποτελέσματα
Το CTE προστατεύει τα κύτταρα RPE από τη βλάβη του οξειδωτικού στρες
Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα του CTE μέσω της ανάλυσης MTT, εφαρμόστηκαν αρκετές συγκεντρώσεις CTE ({{{2{0}}}-500 ug/mL) σε κύτταρα RPE. Η θεραπεία με CTE δεν είχε εμφανείς τοξικές επιδράσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων RPE σε οποιαδήποτε από τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (Εικ. 1Α). Ως εκ τούτου, 50 και 100 ug/mL CTE χρησιμοποιήθηκαν στα επόμενα πειράματα. Για τη διερεύνηση των αντι-αποπτωτικών επιδράσεων του CTE, διαφορετικοί οξειδωτικοί επαγωγείς (H2O2, t-BHP και NaN3) συγχορηγήθηκαν με CTE σε κύτταρα RPE για 24 ώρες. Τα H2O2, NaN3 και t-BHP μείωσαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων και κατέστρεψαν τα κύτταρα RPE με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (κομμένες ράβδοι, Εικ. 1B, 1C και 1D). Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,03 mM H2O2, 0,3 mM NaN3 και 0,3 mM t-BHP από ό,τι στην ομάδα ελέγχου.
Ωστόσο, η ταυτόχρονη θεραπεία με 50 και 100 ug/mL CTE εξασθένησε τη βλάβη των κυττάρων RPE που προκάλεσε το H2O2-, το NaN3- και το t-BHP και ανέστρεψε τη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας (μαύρες ράβδοι, Εικ. 1B, 1C και 1D). Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι το CTE σώζει τα κύτταρα RPE από τη βλάβη του οξειδωτικού στρες.
Το CTE αναστέλλει τον επαγόμενο από BLL θάνατο των κυττάρων RPE
Στην προηγούμενη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι η BLL είναι κυτταροτοξική στα κύτταρα RPE, γεγονός που αποδόθηκε σε αλλαγές στην έκφραση του Bcl-2 και του Bax. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε περαιτέρω τις προστατευτικές επιδράσεις του CTE στη βλάβη των κυττάρων RPE που προκαλείται από BLL. Τοποθετήσαμε δύο μπλε ηλεκτρικές πλάκες LED σε επωαστήρα κυτταροκαλλιέργειας. Η απόσταση μεταξύ της πηγής φωτός και των πλακών κυψέλης ήταν 25 cm και η ένταση BLL ήταν 60 lux, όπως μετρήθηκε με ένα φωτόμετρο (Εικ. 2Α). Μια ανάλυση MTT έδειξε ότι η έκθεση σε BLL για διαφορετικές χρονικές περιόδους (6-48 ώρες) προκάλεσε θάνατο κυττάρων RPE με τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο (Εικ. 2Β). Οι προκαλούμενες από BLL μειώσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 24 και 48 ώρες μειώθηκαν σημαντικά όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε συν-επεξεργασία με CTE (100 ug/mL) (Εικ. 2C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το CTE προστατεύει τα κύτταρα RPE από φωτοτοξικότητα που προκαλείται από BLL.
Η CTE αναστέλλει την απόπτωση που προκαλείται από BLL σε κύτταρα RPE ρυθμίζοντας τις οδούς Bcl-2/Bax και Fas/FasL
Με βάση τις πιθανές προστατευτικές επιδράσεις του CTE σε κύτταρα RPE, διερευνήσαμε περαιτέρω την πιθανή εμπλοκή του CTE σε αυτή τη διαδικασία. Εξετάστηκαν δύο αποπτωτικά μονοπάτια σηματοδότησης, δηλαδή τα μονοπάτια Bax/Bcl{{{0}} και Fas/Fas συνδέτη (FasL) και σχετικές πρωτεΐνες (π.χ. προκασπάση-8 και προκασπάση -3· Εικ. 3Α και 3Β). Η έκθεση BILL (6–48 ώρες) βρέθηκε ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση της πρωτεΐνης των Bax/Bcl-2, FasL και FADD με τρόπο που εξαρτάται από το χρόνο (Εικ. 3Α). Επιπλέον, η BLL μείωσε την έκφραση της πρωτεΐνης της προκασπάσης-3 και της προκασπάσης-8, με αποτέλεσμα περισσότερες μορφές διάσπασης της κασπάσης-3 και της κασπάσης-8 μετά από έκθεση σε BLL, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενη μελέτη [19]. Για περαιτέρω αξιολόγηση των προστατευτικών επιδράσεων του CTE, διαφορετικές συγκεντρώσεις CTE εφαρμόστηκαν σε κύτταρα RPE που εκτέθηκαν σε BLL (Εικ. 3Β). Μετά από 48-ώρα έκθεσης σε BLL, η CTE (50 μg/mL) μείωσε την αναλογία Bax/Bcl-2. Περαιτέρω, το CTE (100 μg/mL) μείωσε την πρωτεϊνική έκφραση των FasL και FADD, αλλά αύξησε σημαντικά τα επίπεδα προκασπάσης-8 και προκασπάσης-3 (Εικ. 3C και 3D). Μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 είναι δείκτης απόπτωσης στα κύτταρα RPE [20]. Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω τις προστατευτικές επιδράσεις της CTE, πραγματοποιήσαμε ανοσοφθορισμό χρώση της διασπασμένης κασπάσης-3. Η έκθεση BILL για 48 ώρες βρέθηκε ότι επάγει τη διάσπαση της κασπάσης-3 και τη μετατόπιση στον πυρήνα, με αποτέλεσμα την απόπτωση των κυττάρων RPE (κίτρινα βέλη, Εικ. 4Α). Ωστόσο, όταν τα κύτταρα που εκτέθηκαν σε BLL συνεπεξεργάστηκαν με CTE (100 μg/mL), η προκαλούμενη από BLL έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3 αναστάλθηκε. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις αντι-αποπτωτικές επιδράσεις του CTE, χρησιμοποιήσαμε τη χρώση TUNEL για να ανιχνεύσουμε θραύσματα DNA σε κύτταρα RPE. Μετά από 48-ώρα έκθεσης σε BLL, τα θετικά στο TUNEL κύτταρα αυξήθηκαν από 1,78 ± 0,36 τοις εκατό σε 23,82 ± 0,33 τοις εκατό. αυτό το αποτέλεσμα μετριάστηκε με συν-θεραπεία με CTE (23,82 ± 0,33 τοις εκατό έως 2,22 ± 0,11 τοις εκατό, Σχήμα 4Β, 4C και 4D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία με CTE προστατεύει έντονα τα κύτταρα RPE από την επαγόμενη από BLL απόπτωση με τη μεσολάβηση των οδών Bax/Bcl-2 και FasL/FADD.
Το CTE αναστέλλει τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών απόκρισης στρες σε κύτταρα RPE που προκαλείται από BLL
Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα μονοπάτια MAPK, όπως τα ERK, JNK και p38 MAP, ενεργοποιούνται στα κύτταρα RPE και στον αμφιβληστροειδή μετά από έκθεση σε υπεριώδες φως ή BL [21, 22]. Ως εκ τούτου, για τη διερεύνηση των ρυθμιστικών επιδράσεων του CTE στο μονοπάτι απόκρισης στρες MAPK μετά την έκθεση σε BLL, 100 μg/mL CTE εφαρμόστηκαν σε κύτταρα RPE υπό διαφορετικούς χρόνους έκθεσης σε BLL (Εικ. 5Α). Η ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι τα φωσφορυλιωμένα ERK, JNK και ρ38 ενεργοποιήθηκαν κατά την έκθεση σε BLL, αλλά ανεστάλησαν σημαντικά κατά τη συν-θεραπεία με CTE σε κύτταρα RPE (Εικ. 5Β). Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η CTE αναστέλλει τη βλάβη των κυττάρων RPE που προκαλείται από BLL, η οποία μπορεί να σχετίζεται με την αναστολή της MAPK σε κύτταρα RPE.
Το CTE διασώζει βλάβη του αμφιβληστροειδούς που προκαλείται από BLL μετά από μακροχρόνια περιοδική έκθεση σε μοντέλο αρουραίου
Για να αξιολογήσουμε τις προστατευτικές επιδράσεις της CTE, εκθέσαμε αρουραίους BN σε μακροχρόνια έκθεση σε BLL για 60 ημέρες και αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της CTE. Όπως φαίνεται στο σχηματικό που παρουσιάζεται στο Σχ. 6Α, οι αρουραίοι ΒΝ χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: ομάδα ελέγχου, ομάδα εκτεθειμένη σε BLL και ομάδα CTE συν BLL (Εικ. 6Α). Στην ομάδα CTE συν BLL, οι αρουραίοι BN συμπληρώθηκαν συνεχώς με CTE (100 mg/kg σωματικού βάρους) με καθετήρα από του στόματος μία φορά την ημέρα για 14 ημέρες πριν από την έκθεση σε BLL. Την ημέρα 0, οι αρουραίοι ΒΝ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CTE (100 mg/kg σωματικού βάρους) και εκτέθηκαν σε BLL για 3 ώρες την ημέρα για 60 ημέρες. Μετά από 60 ημέρες έκθεσης σε BLL, τα ζώα θυσιάστηκαν για ανάλυση στυπώματος western και χρώση ανοσοϊστοχημείας. Στην ομάδα CTE συν BLL, η έκφραση της πρωτεΐνης προκασπάσης-3 σε ομογενοποιήματα ματιών αρουραίου ήταν υψηλότερη μετά τη θεραπεία με CTE από ό,τι στην ομάδα BLL (Εικ. 6Β και 6C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η CTE αποτρέπει τη μακροχρόνια φωτοτοξικότητα και απόπτωση του αμφιβληστροειδούς που προκαλείται από BLL χαμηλής φωτεινότητας, αναστέλλοντας την ενεργοποίηση της διασπασμένης κασπάσης-3. Η χρώση ανοσοϊστοχημείας παρείχε περισσότερες ενδείξεις σχετικά με τις προστατευτικές επιδράσεις του CTE στη δομή και τις φυσιολογικές οδούς του αμφιβληστροειδούς (Εικ. 7). Περαιτέρω, μετά την έκθεση BLL, διαπιστώσαμε ότι το εσωτερικό στρώμα νευρώνα μειώθηκε και παρατηρήθηκαν μορφολογικές παραμορφώσεις στο εξωτερικό στρώμα νευρώνων (ONL), συμπεριλαμβανομένου του εσωτερικού τμήματος/εξωτερικού τμήματος τόσο στον κεντρικό όσο και στον περιφερειακό αμφιβληστροειδή, κάτι που είναι σύμφωνο με την προηγούμενη μελέτη μας ( Εικ. 7Β). Είναι σημαντικό ότι το CTE απέτρεψε την παραμόρφωση των κυττάρων RPE, τη βλάβη των νευρωνικών κυττάρων και τη συνολική λέπτυνση του αμφιβληστροειδούς στην ομάδα CTE συν BLL (Εικ. 7C). Επιπλέον, δεν παρατηρήσαμε κύτταρα θετικά στο TUNEL στον κεντρικό και περιφερικό αμφιβληστροειδή φυσιολογικών αρουραίων (Εικ. 8Ab και 8Bb). Αντίθετα, μετά από έκθεση BLL για 60 ημέρες, ανιχνεύθηκαν συχνά θετικά στο TUNEL κύτταρα στο ONL του κεντρικού και περιφερικού αμφιβληστροειδούς (Εικ. 8Ae και 8Be). Η χρώση DAPI του ONL του κεντρικού αμφιβληστροειδούς μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα BLL (Εικ. 8 Ad). Ωστόσο, η παρουσία θετικών στο TUNEL κυττάρων μειώθηκε και η χρώση DAPI του κεντρικού και περιφερειακού αμφιβληστροειδούς ONL αυξήθηκε στην ομάδα CTE συν BLL (Εικ. 8Ai και 8Bi).
Προϊόντα Cistanche tubulosa
