ΜΕΡΟΣⅠ: Επιδράσεις και μοριακός μηχανισμός του παχυμικού οξέος σε τραυματισμό επαναιμάτωσης νεφρικής ισχαιμίας
Mar 25, 2022
Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG & XIAO-HUI LIAO
Εισαγωγή
Οξεία νεφρική βλάβη (AKI)είναι μια κοινή κλινική νόσος που προκαλείται από πολλαπλές αιτιολογίες και έχει μια πολύπλοκη παθοφυσιολογική διαδικασία(1). Τα ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας για ΑΚΙ είναι υψηλά μεταξύ των ενηλίκων και των παιδιών, με αποτέλεσμα σημαντικό κόστος νοσηλείας (2,3). Μια μετα-ανάλυση της παγκόσμιας επίπτωσης του AKI αποκάλυψε τα ποσοστά επίπτωσης του AKI ήταν 21,6 τοις εκατό στους ενήλικες και 33,7 τοις εκατό στα παιδιά και τα ποσοστά θνησιμότητας που σχετίζονται με το AKI ήταν 23,9 τοις εκατό στους ενήλικες και 13,8 τοις εκατό στα παιδιά (4). Το AKI εμφανίζεται στο ~20% των νοσηλευόμενων ασθενών, το 10% των οποίων χρειάζεται θεραπεία νεφρικής υποκατάστασης και σε ποσοστό έως και 50% των ασθενών σε μονάδες εντατικής θεραπείας, αυξάνοντας έτσι σημαντικά τη διάρκεια και το κόστος νοσηλείας (5). απότομη μείωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης βραχυπρόθεσμα, η οποία συνοδεύεται από αύξηση της κρεατινίνης ορού, ολιγουρία ή και τα δύο· Αυτές οι αλλαγές μπορεί να οδηγήσουν σε χρόνια νεφρική νόσο ή νεφρική νόσο τελικού σταδίου(6). Λόγω της μεταβλητότητας της νεφρικής βλάβης, της έλλειψης αξιόπιστων πρώιμων βιοδεικτών και της ετερογένειας των μονοπατιών που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία, δεν υπάρχουν επί του παρόντος αποτελεσματικά μέσα πρόληψης και παρέμβασης εκτός από τη συντηρητική θεραπεία και τη θεραπεία νεφρικής υποκατάστασης(7). Επομένως, ο εντοπισμός νέων θεραπευτικών σχημάτων και φαρμάκων για την ΑΚΙ είναι ιδιαίτερα σημαντικός. Την τελευταία δεκαετία παρατηρήθηκε μια πληθώρα ερευνών που επεκτείνουν την παραδοσιακή άποψη της νέκρωσης. Πρόσφατη έρευνα αμφισβήτησε τις παραδοσιακές απόψεις για τον κυτταρικό θάνατο εντοπίζοντας νέα μονοπάτια στα οποία τα κύτταρα πεθαίνουν με ρυθμισμένο τρόπο, αλλά εμφανίζουν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της νέκρωσης (7-9). Αυτή η ρυθμιζόμενη νέκρωση λαμβάνει διάφορες μορφές: Νέκρωση, φερρόπτωση, πυρόπτωση, νέκρωση λόγω μετάβασης στη διαπερατότητα μιτοχονδρίων και παρθανάτος(10). Η νεκρόπτωση και η φερρόπτωση είναι οι πιο μελετημένες μορφές ρυθμιζόμενης νέκρωσης που εμφανίζεται στο νεφρό(11). Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η αναστολή της φερρόπτωσης βελτιώνει αποτελεσματικά το AKI (12).
cistanche pharma specialΓιανεφρό
Η Ferroptosis είναι ένας νέος τύπος ρυθμιστικού κυτταρικού θανάτου, ο οποίος προτάθηκε για πρώτη φορά από τον Dixon et al το 2012(13). Αυτός ο τύπος κυτταρικού θανάτου είναι εξαρτώμενος από το σίδηρο και συνοδεύεται από μαζική συσσώρευση σιδήρου και υπεροξείδωση λιπιδίων κατά τον κυτταρικό θάνατο(13). Η Ferroptosis παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην εμφάνιση και την ανάπτυξη αρκετών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων όγκων, νευρολογικών παθήσεων και AKI(14). Σε μια in vivo μελέτη, η φερροστατίνη 1 ή 16-86 χορηγήθηκε 15 λεπτά πριν από την ισχαιμία σε ποντικούς με αυστηρόςτραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης(IRI)-AKI, και η βλάβη του νεφρικού ιστού, η κρεατινίνη ορού και η ουρία μειώθηκαν στα ποντίκια 48 ώρες μετά την ισχαιμία, υποδηλώνοντας έτσι ότι η φερρόπτωση έχει κρίσιμο ρόλο στην παθογένεση της IRI (τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)(15). Ως εκ τούτου, η ρύθμιση της ομοιόστασης του σιδήρου, η αντίσταση στην υπεροξείδωση των λιπιδίων και η αναστολή της φερρόπτωσης μπορεί να παρέχουν μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για το AKI.
Παχυδερμικό οξύ(PA), ένα τριτερπενοειδή τύπου lanostane από το Poria cocos, έχει αρκετές φαρμακολογικές επιδράσεις, όπως αντικαρκινικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές, υπογλυκαιμικές, ηρεμιστικές και υπνωτικές δραστηριότητες (16-20). Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η ΠΑ(Παχυμικό οξύ)μπορεί να βελτιώσει τη νεφρική βλάβη κατά τη σήψη σε αρουραίους αναστέλλοντας τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις και ενεργοποιώντας τον πυρηνικό παράγοντα που προέρχεται από ερυθροειδή 2 όπως η οδός 2(NRF2)/αιμικής οξυγενάσης 1(HO-1) μέσω του αντιοξειδωτικού στρες (21). Επιπλέον, το πορικοϊκό οξύ Α ενισχύει αποτελεσματικά την αναστολή της μελατονίνης κατά τη μετάβαση από το AKI στη χρόνια νεφρική νόσο μετά από τραυματισμό νεφρικής ισχαιμίας/επαναιμάτωσης(22). PA(Παχυμικό οξύ)προστατεύει από το AKI, ωστόσο, αυτός ο προστατευτικός μηχανισμός μένει να διερευνηθεί περαιτέρω. PA(Παχυμικό οξύ)έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιεί το NRF2 σε μια μελέτη νεφρικής βλάβης στη σήψη(21). Συγκεκριμένα, οι δύο πρώτοι παράγοντες που προκαλούν φερρόπτωση (RSL-3 και ελαστίνη) που ταυτοποιήθηκαν σε μελέτες φερρόπτωσης ξεκινούν τον καταρράκτη της φερρόπτωσης μέσω της αναστολής της υπεροξειδάσης γλουταθειόνης 4 (GPX4) και του συστήματος μεταφορέα κυστίνης/γλουταμινικού (xC-/xCT), αντιστοίχως, και οι δύο είναι στόχοι κατάντη του NRF2 (23). PA(Παχυμικό οξύ)Υποτίθεται ότι ρυθμίζει τις κατάντη πρωτεΐνες του, GPX4 και xCT ενεργοποιώντας το NRF2 και παρεμβαίνοντας στη φερρόπτωση στο AKI. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει την επίδραση της ΠΑ(Παχυμικό οξύ)σχετικά με τη φερρόπτωση σε ποντικούς με νεφρική βλάβη ισχαιμίας-επαναιμάτωσης και να προσδιορίσουν τον υποκείμενο μοριακό μηχανισμό δράσης του για την παροχή νέων ιδεών για τη θεραπεία της κλινικής ΑΚΙ.
Υλικά και μέθοδοι
Αντιδραστήρια και ζώα.
PA(Παχυμικό οξύ)(λευκή κρυσταλλική σκόνη με καθαρότητα μεγαλύτερη ή ίση με 99,9 τοις εκατό) αγοράστηκε από τη MedChemExpress (αρ. κατ. HY-N0371) και αποθηκεύτηκε μακριά από το φως στους 4 C. Συνολικά 30 C57BL/6 αρσενικά ποντίκια (8-10 εβδομάδες,20-25g σωματικού βάρους) αγοράστηκαν από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο Chongqing (Chongqing, Κίνα). Οι συνθήκες στέγασης ήταν οι εξής: 12 ώρες φως/12 ώρες σκοτάδι, ~60 τοις εκατό υγρασία, 25 βαθμούς, δωρεάν πρόσβαση σε πόσιμο νερό και φαγητό και αντικατάσταση κλινοσκεπασμάτων κάθε 3 ημέρες. το πόσιμο νερό και τα υλικά κλινοστρωμνής απολυμάνθηκαν πριν από τη χρήση. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων, που εκδόθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας το 1996(24). Η παρούσα μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου Chongqing (Chongqing, Κίνα, αρ. έγκρισης2018-019).
Κάκωση ισχαιμίας-επαναιμάτωσης-Μοντέλο AKI.
Τα ποντίκια τράφηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες για 1 εβδομάδα για να παραχθεί το μοντέλο του νεφρούτραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (25). Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με 50-60 mg/kg πεντοβαρβιτάλης νατρίου (αρ. κατ. P3761, Sigma-Aldrich, Merck KGaA) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση. το δέρμα στην χειρουργική περιοχή σκουπίστηκε με 70 τοις εκατό αλκοόλ. Η τομή τοποθετήθηκε στην αριστερή και δεξιά πλευρά της σπονδυλικής στήλης (0,5 cm) και το μήκος της τομής ήταν 1-1,5 cm κατά μήκος της πλάτης. Οι νεφροί στη συνέχεια τραβήχτηκαν έξω από την τομή για να αποκαλυφθεί το νεφρικό μίσχο. Χρησιμοποιήθηκε ένα κλιπ μικροανευρύσματος για να σφίξει το μίσχο για να εμποδίσει τη ροή του αίματος στο νεφρό και να προκαλέσει νεφρική ισχαιμία. Πλήρης ισχαιμία όπως υποδεικνύεται από αλλαγή στο χρώμα του νεφρού από κόκκινο σε σκούρο μωβ μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα. Μετά από 40 λεπτά ισχαιμίας, τα κλιπ μικροανευρύσματος απελευθερώθηκαν για να επιτρέψουν σε κάθε νεφρό να ξεκινήσει επαναιμάτωση, κάτι που υποδεικνύεται από την αλλαγή του χρώματος του νεφρού σε κόκκινο. Το μυϊκό δέρμα συρράφτηκε αφού το χρώμα των νεφρών επανήλθε στο φυσιολογικό. Ολόκληρη η διαδικασία νεφρικής ισχαιμίας ολοκληρώθηκε σε ένα θερμοστατικό επίθεμα και η θερμοκρασία του σώματος των ποντικών διατηρήθηκε σταθερή στους 36.{11}} βαθμούς . Συνολικά 0,8 ml θερμού αποστειρωμένου αλατούχου ορού χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε κάθε ποντικό. Κάθε ζώο τοποθετήθηκε σε ένα μαξιλάρι θέρμανσης μέχρι να ανακτήσει πλήρως τις αισθήσεις του και στη συνέχεια επέστρεψε στο κλουβί του. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν μέσω εξάρθρωσης του τραχήλου της μήτρας 24 ώρες μετά την επέμβαση και το αίμα συλλέχθηκε από τον κόγχο κόλπο. Το ένα τρίτο του νεφρικού ιστού χρησιμοποιήθηκε για ιστοπαθολογικές αναλύσεις και τα υπόλοιπα δύο τρίτα αποθηκεύτηκαν γρήγορα σε βαθμό -80.
Ομάδες ζώων.
Τα ποντίκια C57BL/6 χωρίστηκαν σε πέντε ομάδες (n=6/ομάδα) σύμφωνα με έναν πίνακα τυχαίων αριθμών, ως εξής: Sham ομάδα (Sham), ομάδα μοντέλου (IRI), ομάδα χαμηλής δόσης (IRI συν PA)) , ομάδα μέτριας δόσης (IRI συν PAw) και ομάδα υψηλής δόσης (IRI συν PAg). Τα ζώα στις τρεις πειραματικές ομάδες θεραπείας έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή ένεση με ΡΑ(Παχυμικό οξύ)σε δόσεις των 5, 10 και 20 mg/kg. αλλά για 3 ημέρες, πριν το μοντέλο προκληθεί. Η προσποίηση και η IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης) οι ομάδες εγχύθηκαν με τον ίδιο όγκο διμεθυλοσουλφοξειδίου για 3 ημέρες πριν από την επαγωγή του μοντέλου. Η μέθοδος μοντελοποίησης εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (25). Οι αμφοτερόπλευροι νεφρικοί μίσχοι των ποντικών στην εικονική ομάδα εκτέθηκαν και αντιμετωπίστηκαν όπως προαναφέρθηκε, αλλά δεν σφίχτηκαν. Η χειρουργική τομή συρράφτηκε μετά από 40 λεπτά.
Βιοχημική ανάλυση ορού.
Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 24 ώρες μετά το χειρουργείο και 0. Συλλέχτηκε 8-1 ml αίματος από τον κόγχο, αφέθηκε να ηρεμήσει για 30 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στα 900 xg για 10 λεπτά στους 4 C. Το ανώτερο στρώμα ορού συλλέχθηκε, συσκευάστηκε και αποθηκεύτηκε σε -80 βαθμό . Η κρεατινίνη ορού (Scr; cat.no.c011-2-1) και το άζωτο ουρίας αίματος (BUN: cat.no.cO13-2-1) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίων, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute ).
Ιστοπαθολογική εξέταση.
Στις 24 ώρες μετά το IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης), τμήματα των ιστών των νεφρών σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος 10 τοις εκατό για 24-48 h σε θερμοκρασία δωματίου, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία τακτικά με ενσωμάτωση σε παραφίνη. Τα στερεωμένα με παραφίνη δείγματα ιστού κόπηκαν σε τμήματα πάχους 4 μm, τα οποία τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ηωσίνη για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ένα μικροσκόπιο φωτός BX51 (Olympus Corporation) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των νεφρικών ιστοπαθολογικών αλλαγών (μεγέθυνση, x200 και x400). Η βαθμολογία Paller χρησιμοποιήθηκε για τη βαθμολόγηση της νεφρικής σωληναριακής νέκρωσης σε νεφρική IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)(26). Συνολικά 10 μη επικαλυπτόμενες περιοχές επιλέχθηκαν τυχαία υπό υψηλή μεγέθυνση χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο φωτός (μεγέθυνση, x400) και 10 νεφρικά σωληνάρια επιλέχθηκαν τυχαία σε κάθε οπτικό πεδίο. Τα τμήματα νεφρικής παθολογίας τριών ποντικών σε κάθε πειραματική ομάδα επιλέχθηκαν τυχαία για παρατήρηση. Συνολικά επιλέχθηκαν τυχαία 10 οπτικά πεδία για κάθε παθολογική τομή και βαθμολογήθηκαν 10 νεφρικά σωληνάρια σε κάθε οπτικό πεδίο. Παρατηρήθηκαν συνολικά 100 σωληνάρια για κάθε ποντίκι, δίνοντας συνολικά 300 νεφρικά σωληνάρια που παρατηρήθηκαν σε κάθε ομάδα. Όσο υψηλότερη είναι η βαθμολογία, τόσο πιο σοβαρός είναι ο βαθμός βλάβης των νεφρικών σωληναρίων.
Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM).
Ο νεφρικός ιστός συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την επέμβαση. Μετά την αναισθησία, 1 mm² νεφρικός ιστός αφαιρέθηκε in vivo και εμποτίστηκε σε διάλυμα στερέωσης ιστού που αποτελείται από 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη και ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού οξέος (αρ. κατ. G7776, Sigma-Aldrich, Merck KGaA) για 2 ώρες στους 4 βαθμούς, αφυδατώθηκε σε βαθμιαία αιθανόλη (50-100 τοις εκατό) και οξείδιο προπυλενίου, ενσωματωμένα στο Epon 812 (αρ. κατ. GP18{{20}}}10; Bejing Zhonngjingkeyi Technology Co.Ltd. για 1 ώρα στους 35 βαθμούς και στερεοποιήθηκε για 24 ώρες στους 60 βαθμούς. Υπερλεπτές τομές (πάχος, 50-70 nm) τοποθετήθηκαν σε 200-πλέγματα χαλκού και χρωματίστηκαν με 2 τοις εκατό οξικό ουρανύλιο για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και 0,04 τοις εκατό κιτρικό μόλυβδο για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα εξετάστηκαν κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (JEM-1400 plus, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; μεγέθυνση, x5,000 και x10,{{27} Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας κάμερα συσκευής συζευγμένης με φόρτιση SlowScan και λογισμικό TEM analySIS5.0 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Ανίχνευση αντιοξειδωτικής γλουταθειόνης (GSH) και μηλονοδιαλδεΰδης υπεροξείδωσης λιπιδίων (MDA).
Συλλέχθηκε νεφρικός ιστός (50-100mg) και προστέθηκε στον ιστό φυσιολογικό αλατούχο διάλυμα (αρ. κατ. B020, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) σε αναλογία βάρους (g): όγκος (ml). Ο ιστός ομογενοποιήθηκε, για να παραχθεί 10 τοις εκατό ομογενοποίηση ιστού, το οποίο φυγοκεντρήθηκε στα 13.800 xg για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και η συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του υπερκειμένου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο δικινχονικού οξέος(21). Το GSH(αριθ. κατ.Α006-2-1) και το MDA(αρ. κατ.Α003-2-2) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τα κιτ αντιδραστηρίων, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).
Western blotting.
Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από ιστούς νεφρού ποντικού χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων RIPA (αρ. κατ. WO{{0}}· Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν μέσω ανάλυσης BCA (αρ. κατ. Α{ {1}}; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute）. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών （50μug) διαχωρίστηκαν μέσω SDS-PAGE(Cox-2,10.0 ;NRF2,10.0;xCT,12.5;HO-1, 12.5; GPx4.15.0 τοις εκατό ) και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF (GE Healthcare Life Sciences). Οι μεμβράνες στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκε με πρωτογενή αντισώματα έναντι των ακόλουθων: Cyclooxygenase 2(COX-2;1:1,000; Cat no.ab179800;Abcam), GPX4( 1:5,000;cat.no.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;cat.no.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 ,000 cat.no.101147;Gentex)και NRF2 (1:1,000;cat.no.D1Z9C;CST) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν με TBST (0,1 τοις εκατό Tween -20)τρεις φορές. Μετά την κύρια συμπ ubation, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου (1:10,000;40295G; BIOSS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν ξανά τρεις φορές με TBST και οπτικοποιήθηκαν με BeyoECLPlus (αρ. κατ. P00185; Beyotime Institute of Biotechnology), χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης Chemi Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Η ένταση των ζωνών πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Λογισμικό ImageJ v1.8.0 (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.
Αντίστροφη μεταγραφή-ποσοτική (RT-g)PCR.
Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα νεφρά ποντικών σε διαφορετικές ομάδες χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol (Takara Bio, Inc.) και το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου RT PrimeScript με γόμα gDNA (αρ. κατ. RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) Τα σχετικά επίπεδα των γονιδίων-στόχων προσδιορίστηκαν μέσω qPCR χρησιμοποιώντας Μίγμα Ultra SYBR (Takara Biotechnology Co., Ltd.). Η RT-qPCR πραγματοποιήθηκε σε όγκο 25 ul με 2 μΙ cDNA, 400 nM κάθε νόημα και αντιπληροφοριακό εκκινητή, και 12,5 μΙ Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. σε σύστημα ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems Ther; Scientific, Inc). ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' και αντίστροφα,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 προς τα εμπρός,5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' και αντίστροφα,5'-GTTGAACAACTAGG {28}}';xCT εμπρός, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' και αντίστροφη,5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 προς τα εμπρός,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'και αντίστροφα,5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3';HO-1 προς τα εμπρός.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' και αντίστροφα,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; και -ακτίνη προς τα εμπρός,5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' και αντίστροφα,5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3'.
Μια μέση τιμή γονιδιακής έκφρασης μετά την κανονικοποίηση της ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως βαθμονομητής για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων των γονιδίων-στόχων. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων-στόχων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-△C (27).
Στατιστική ανάλυση.
Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, Inc.) και το λογισμικό SPSS 23 (IBM Corp..Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση± τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων επαναλήψεων, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. Μονόδρομος Η ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμασία post hoc του Tukey χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση διαφορών μεταξύ πολλαπλών ομάδων<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Αποτελέσματα
PA(Παχυμικό οξύ)μειώνει τη νεφρική βλάβη σε ποντίκια με IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης). Το Scr και το BUN είναι δύο σημαντικοί δείκτες της νεφρικής λειτουργίας(5). Τα επίπεδα Scr και BUN ήταν σημαντικά υψηλότερα στην IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα σε σύγκριση με εκείνα της εικονικής ομάδας (Π<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Παχυμικό οξύ)μετρίασε σημαντικά τις αυξήσεις στην κρεατινίνη και την ουρία ορού σε σύγκριση με την IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα (Π<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Παχυμικό οξύ)ομάδα θεραπείας και η IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης) group (P>0.05; Εικ. 1Α και Β).
Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 1D, η χρώση Η&Ε των ιστών των νεφρών στην ψευδή ομάδα δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές στη δομή του νεφρικού ιστού. Αντίθετα, το IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)Η ομάδα εμφάνισε οίδημα και απώλεια νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων, διαστολή σωληναρίων, διάμεση φλεγμονή, διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, εναπόθεση κολλαγόνου και υλικό νέκρωσης του σωλήνα εναπόθεσης (Εικ. 1D). Η βαθμολογία Paller, ένας δείκτης βλάβης νεφρικού ιστού(26), ήταν σημαντικά υψηλότερη στην IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδες σε σύγκριση με την εικονική ομάδα (Π<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Παχυμικό οξύ)Η θεραπεία βελτίωσε σημαντικά αυτές τις βλάβες και η βαθμολογία Paller ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με αυτή στην IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα (Π<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης) model group and the low-dose group (P>0.05; Εικ. 1C).
Εικόνα 1. PA(Παχυμικό οξύ)ανακουφίζει τη νεφρική βλάβη μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση.(Α) BUN και (Β) κρεατινίνη ορού μετρήθηκαν σε ποντίκια στο Sham, IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης), IRI συν PAL, IRI συν PAM και ομάδες IRI συν PAH (40 λεπτά νεφρική ισχαιμία ακολουθούμενη από 24 ώρες επαναιμάτωσης, n=6/ομάδα). (Γ) Οι βαθμολογίες χλωμότητας χρησιμοποιήθηκαν για να βαθμολογηθεί η νεφρική σωληναριακή βλάβη στις ομάδες Sham, IRI, IRI συν PAL, IRI συν PAM και IRI συν PAH (n=3/ομάδα). (Δ) Εικόνες αιματοξυλίνης και ηωσίνης των νεφρών από ποντίκια στο Sham, IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης), IRI συν PAL, IRI συν PAM και ομάδα IRI συν PAH. Μπάρα κλίμακας, 50 μm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση. * Π<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Παχυμικό οξύ), παχυδερμικό οξύ; BUN, άζωτο ουρίας αίματος; IRI,τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης; L, ομάδα χαμηλής δόσης. Μ, ομάδα μέτριας δόσης; Η, ομάδα υψηλής δόσης.
Επιδράσεις της ΠΑ(Παχυμικό οξύ)σχετικά με τις μορφολογικές αλλαγές στα μιτοχόνδρια στον νεφρικό ιστό ποντικών μετά από νεφρική IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης). Το TEM δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές στη μιτοχονδριακή δομή του νεφρικού ιστού στην εικονική ομάδα. Στην ομάδα του μοντέλου, παρατηρήθηκαν μιτοχονδριακές αλλαγές που σχετίζονται με τη φερρόπτωση, όπως μειωμένος όγκος μιτοχονδρίων, αυξημένη πυκνότητα μεμβράνης και μειωμένοι ή απών μιτοχονδριακών κριστών, στον νεφρικό ιστό (Εικ. 2Α). Σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας μοντέλου, τα μιτοχόνδρια της ομάδας μέτριας δόσης εμφάνιζαν κυρίως οίδημα και οι συγκεκριμένες αλλαγές που ήταν χαρακτηριστικές της φερρόπτωσης ήταν σπάνιες (Εικ.2Α). Ωστόσο, στην υψηλή δόση ΠΑ(Παχυμικό οξύ)ομάδα, δεν παρατηρήθηκαν χαρακτηριστικές αλλαγές φερρόπτωσης στα μιτοχόνδρια του νεφρικού ιστού και παρουσιάστηκε μόνο ήπιο οίδημα (Εικ. 2Α). Οι αλλαγές στα μιτοχόνδρια στην ομάδα χαμηλής δόσης ήταν ίδιες με εκείνες στην ομάδα του μοντέλου (Εικ.2Α).
Επιδράσεις της ΠΑ(Παχυμικό οξύ)στην έκφραση GSH και MDA σε νεφρική IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης). Η GSH είναι ένας απαραίτητος συμπαράγοντας για τη λειτουργία GPX4. Η σύνθεση GSH επηρεάζει άμεσα τη δραστηριότητα της GPX4. Το MDA είναι προϊόν οξείδωσης λιπιδίων, το οποίο αντανακλά τον βαθμό ενδοκυτταρικής υπεροξείδωσης λιπιδίων και έμμεσα αντανακλά την εμφάνιση φερρόπτωσης(28,29). Όπως παρουσιάζεται στο Σχ. 2Β, οι ιστοί των νεφρών είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα GSH στο IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα σε σύγκριση με την εικονική ομάδα. Μεταξύ των ομάδων θεραπείας με φάρμακα, η έκφραση της GSH ήταν σημαντικά υψηλότερη στις ομάδες IRI συν PA και IRI συν PAn σε σύγκριση με τις ομάδες IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα μοντέλων (Σ<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Αντίθετα, όπως παρουσιάζεται στο Σχ. 2Γ, η υπεροξείδωση των λιπιδίων των ιστών ήταν μεγαλύτερη (με βάση τα επίπεδα MDA) στην IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα σε σύγκριση με την εικονική ομάδα. Μεταξύ των ομάδων θεραπείας με φάρμακα, τα επίπεδα MDA ήταν σημαντικά χαμηλότερα στις ομάδες IRI συν PA και IRI συν PAu σε σύγκριση με τις ομάδες IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα (Π<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
Εικόνα 2. PA(Παχυμικό οξύ)μειώνει τη φερρόπτωση στην IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)-οξεία νεφρική βλάβη.(Α) Εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης στο Sham, IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης), ομάδες IRI συν PAL, IRI συν PAM και IRI συν PAH (40 λεπτά νεφρική ισχαιμία ακολουθούμενη από 24 ώρες επαναιμάτωσης). Μεγέθυνση, x20,000; ράβδος κλίμακας, 1 μm. Τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν ότι ο όγκος των μιτοχονδρίων μειώθηκε, η πυκνότητα της μεμβράνης αυξήθηκε και μειώθηκε, ή ότι εξαφανίστηκαν μιτοχονδριακά cristae παρατηρήθηκαν στον νεφρικό ιστό. Τα μπλε βέλη δείχνουν μιτοχονδριακό οίδημα. Τα επίπεδα (Β) GSH και (C) MDA στους νεφρικούς ιστούς αξιολογήθηκαν (n=6/ομάδα). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση. * Π<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα. PA(Παχυμικό οξύ), παχυδερμικό οξύ; IRI,τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης; L, ομάδα χαμηλής δόσης. Μ, ομάδα μέτριας δόσης; Η, ομάδα υψηλής δόσης; GSH, γλουταθειόνη; MDA, μηλονοδιαλδεΰδη.
PA(Παχυμικό οξύ)ρυθμίζει την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη φερρόπτωση στη νεφρική IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης). Στην παρούσα μελέτη, τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών GPX4, xCT και HO-1 που σχετίζονται με τη φερρόπτωση ανιχνεύθηκαν μέσω αναλύσεων western blotting (Εικ.3Α και Β) και RT-qPCR (Εικ.3C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης των GPX4, xCT και HO-1 ήταν σημαντικά μειωμένα στο IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα σε σύγκριση με την εικονική ομάδα (Π<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Παχυμικό οξύ)αύξησε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης και mRNA των GPX4, xCT και HO-1 σε σύγκριση με το IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα (Π<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)και χαμηλής δόσης PA(Παχυμικό οξύ) treatment groups (P>0.05; Εικ.3Β και Γ).
Εικόνα 3. ΠΑ(Παχυμικό οξύ)αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη φερρόπτωση, GPX4, xCT και HO‑1.(Α) Πραγματοποιήθηκε κηλίδωση Western για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη φερρόπτωση, GPX4, xCT και HO‑1 στο IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)‑ποντίκια με οξεία νεφρική βλάβη (n=3). (Β) Σχετική έκφραση των τιμών του γκρι για GPX4, xCT και HO‑1. (Γ) Πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση PCR ανάστροφης μεταγραφής για τον εντοπισμό των επιπέδων έκφρασης mRNA των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη φερρόπτωση (n=3). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση. * Π<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα. PA(Παχυμικό οξύ), παχυδερμικό οξύd; GPX4, υπεροξειδάση γλουταθειόνης 4; xCT, σύστημα μεταφοράς γλουταμικού. HO‑1, αίμη οξυγενάση 1; IRI,τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσηςy; L, ομάδα χαμηλής δόσης. Μ, ομάδα μέτριας δόσης; Η, ομάδα υψηλής δόσης.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA της πρωτεΐνης υπεροξείδωσης των λιπιδίων που σχετίζεται με τη φερρόπτωση, COX-2 αυξήθηκαν σημαντικά κατά τη διάρκεια της IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)(Εικ.4). Θεραπεία με μέτρια δόση και υψηλή δόση PA(Παχυμικό οξύ)μείωσε σημαντικά την έκφραση COX-2 σε σύγκριση με την IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα (Π<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)και χαμηλής δόσης PA(Παχυμικό οξύ) treatment groups (P>0.05; Εικ.4).
Εικόνα 4. ΠΑ(Παχυμικό οξύ)μειώνει τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης που σχετίζεται με τη φερρόπτωση, COX-2.(Α) Πραγματοποιήθηκε στύπωμα Western για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης δείκτη λιπιδικής υπεροξείδωσης ferroptosis, COX-2 σε ποντικούς με οξεία νεφρική βλάβη IRI. (Β) Σχετική έκφραση των τιμών του γκρι για COX-2. (Γ) Πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση PCR ανάστροφης μεταγραφής για την ανίχνευση της έκφρασης mRNA COX-2 (n=3). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση. * Π<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα. PA(Παχυμικό οξύ), παχυδερμικό οξύ; COX-2, κυκλοοξυγενάση 2; IRI,τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης; L, ομάδα χαμηλής δόσης. Μ, ομάδα μέτριας δόσης; Η, ομάδα υψηλής δόσης.
PA(Παχυμικό οξύ)προάγει την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης NRF2 στη νεφρική IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης).Να διερευνηθεί η επίδραση της ΠΑ(Παχυμικό οξύ)στο μονοπάτι σηματοδότησης NRF2, αξιολογήθηκαν τα επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA του NRF2 (Εικ. 5). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση NRF2 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα σε σύγκριση με την εικονική ομάδα. Επιπλέον, η έκφραση NRF2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στις ομάδες IRI συν PAw και IRI συν PAH σε σύγκριση με την IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)ομάδα (Π<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Επιπλέον, θεραπεία με PA(Παχυμικό οξύ)αύξησε επίσης την έκφραση NRF2 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ.5).
Εικόνα 5. ΠΑ(Παχυμικό οξύ)ενεργοποιεί το μονοπάτι σηματοδότησης NRF2.(Α) Πραγματοποιήθηκε στύπωμα Western για την ανίχνευση της έκφρασης πρωτεΐνης NRF2 σε IRI(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης)- ποντίκια με οξεία νεφρική βλάβη. (Β) Σχετική έκφραση των τιμών του γκρι για NRF2 (n=3). (Γ) Πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση PCR ανάστροφης μεταγραφής για την ανίχνευση έκφρασης mRNA NRF2 (n=3). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση. *Π<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης) group. PA(Παχυμικό οξύ), παχυδερμικό οξύ; NRF2, πυρηνικός παράγοντας που προέρχεται από ερυθροειδή 2 όπως 2; IRI,τραυματισμός ισχαιμίας-επαναιμάτωσης; L, ομάδα χαμηλής δόσης. Μ, ομάδα μέτριας δόσης; Η, ομάδα υψηλής δόσης.
